Szybki i specyficzny test mikropłytkowy do oznaczania wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego askorbinianu w hodowanych komórkach

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie wewnątrzkomórkowych lub zewnątrzkomórkowych poziomów askorbinianu w hodowanych lub izolowanych komórkach. Osiąga się to poprzez inkubację ekstraktów komórkowych lub całych komórek z oksydazą punktową w celu selektywnego zubożenia wyniku BA w kolejnych krokach. W pierwszej metodzie ekstrakty komórkowe inkubuje się z cyjankiem w celu wytworzenia żelazocyjanku w sposób zależny od askorbinianu, co daje bezpośrednie odzwierciedlenie ilości askorbinianu w ekstraktach.

Następnie ilość cyjanku żelaza powstającego w ekstraktach komórkowych określa się poprzez ilościowe utlenianie cyjanku żelaza z dodatkiem żelaza w celu wytworzenia żelaza Ferrisa w celu wytworzenia chromogenicznego kompleksu żelaza dwufrankowego S, który można określić ilościowo spektrometrycznie fotometrycznie. W drugiej metodzie wszystkie komórki są bezpośrednio inkubowane z chelatorem żelaza dwa ferne S i cytrynianem żelaza. Wyniki pokazują różnice w wewnątrzkomórkowych lub zewnątrzkomórkowych poziomach askorbinianu w oparciu o ilościową i specyficzną redukcję zewnątrzkomórkowych kompleksów żelaza, które można wykryć.

Spektrometrycznie. Główną zaletą obecnej techniki w porównaniu z już stosowanymi metodami, takimi jak detekcja oparta na HBLC, jest to, że ten wysoce specyficzny test mikropłytek można przeprowadzić bardzo szybko, a wszystkie próbki i wzorce mogą być przetwarzane równolegle, a nie w sposób szeregowy Przed rozpoczęciem tej procedury. Hodować K 5 62 komórki zawiesinowe i tworzyć w nacięciu BA zawierającym ekstrakt komórkowy.

Następnie przygotuj roztwór podstawowy 10 milimolowego kwasu askorbinowego w lodowatym PBS. Następnie ostrożnie przygotuj serię wzorców askorbinianu o gęstości od zera do 20 mikromolów. Ostrożnie usuń cztery podwielokrotności po 100 mikrolitrów z każdego wzorca i dodaj je do poziomej sekwencji studzienek.

W 96-dołkowej płaskiej płycie dennej, która zawiera 25 mikrolitrów na studzienkę PBS lub 45,5 jednostki na mililitr. Roztwór podstawowy oksydazy L-askorbinianowej lub AO w PBS przykryj 96-dołkową płytkę folią i orbitalem. Mieszaj z prędkością 550 obr./min w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Po zakończeniu dodaj 50 mikrolitrów 3,5-milimolowego cyjanku żelaza potasu w PBS do wszystkich studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie cyjanku żelaza wynoszące jeden milimol po orbitalnym wymieszaniu płytki 96-dołkowej, w tych samych warunkach, co poprzednio. Natychmiast dodać 25 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu zawierającego 50% kwasu octowego i 30% kwasu trichlorooctowego. Następnie dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu do oznaczania cyjanku faraona do każdego orbitalu studzienki.

Mieszaj płytkę w ciemności z prędkością 550 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odczytaj wartości absorbancji studzienek przy 593 nanometrach. Aby rozpocząć test.

Najpierw utlenić zewnątrzkomórkowy askorbinian w wybranych studzienkach, dodając 50 mikrolitrów 120 jednostek na mililitr AO lub HBSD do sparowanych studzienek w trzech powtórzeniach, aby uzyskać końcowe stężenie AO wynoszące 10 jednostek na mililitr. Podążając za tą etykietą, sparowane studnie jako minus AO i plus ao. Po wymieszaniu płytek z delikatnym mieszaniem orbitalnym przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, dodać 50 mikrolitrów 2,4 milimolowego Ferne S do wszystkich studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie Ferne s 200 mikromolowych, mieszać płytki jak powyżej przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego 120-mikromolowego cytrynianu żelaza do wszystkich studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie żelaza i cytrynianu odpowiednio 10 mikromolowych żelaza i 50 mikromolowych cytrynianów. Dobrze wymieszać na końcu testu askorbinianu FLX. Szybko odessać leżącą na wierzchu pożywkę z każdej studzienki i dodać do odpowiednio oznakowanych studzienek na płytce 24-dołkowej.

Następnie dodaj trzy mikrolitrowe porcje supernatantu do 96-dołkowej płytki, aby oznaczyć zewnątrzkomórkowy askorbinian. Odczytać wartości absorbancji studzienek przy 593 nanometrach w spektrofotometrze mikropłytkowym. Na koniec oblicz ilość zewnątrzkomórkowego askorbinianu jako m askorbinianu na miligram białka.

Oto typowa krzywa standardowa dla zestawu wzorców askorbinianu, od zera do 20 mikromoli lub od zera do dwóch askorbinianów NMO na studzienkę. Z 96-dołkowej płytki, chociaż nie pokazano tutaj, liniowość jest utrzymywana do ośmiu askorbinianów NMO na studzienkę, co odpowiada stężeniu askorbinianu próbki około 80 mikromolów. Test może być stosowany do skutecznego wykrywania poziomów askorbinianu poniżej 0,25 ole askorbinianu na studzienkę.

Komórki K 5 62 szybko gromadzą wewnątrzkomórkowy askorbinian z zewnątrzkomórkowego dehydro kwasu L-askorbinowego, ale nie askorbinian. W tym reprezentatywnym eksperymencie myte przez PBS komórki K 5 62 inkubowano w PBS z 500 mikromolami dehydro askorbinianu, L, kwasu askorbinowego, dehydro L, kwasu askorbinowego, plus 50 mikromolowych cyto B, askorbinianu plus pięć milimolowych cyjanków lub askorbinianu plus 50 jednostek na mililitr AO przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wewnątrzkomórkowy askorbinian oznaczono zgodnie z wcześniejszym opisem.

Wychwyt dehydro L kwasu askorbinowego przez komórki K 5 62 zachodzi poprzez ułatwiający transport pośladków za pośrednictwem transportera glukozy w celu oceny udziału pośladków w wychwytywaniu dehydro L kwasu askorbinowego. W tym reprezentatywnym eksperymencie komórki K 5 62 inkubowano ze zwiększonymi stężeniami cyto B lub dihydrocyto B przed inkubacją z dehydro L kwasem askorbinowym. Ważne jest, aby zauważyć, że podczas gdy zarówno cyto callin B, jak i dihydrocyto B hamują procesy ruchliwe przy stężeniach mikromolowych, tylko cyto callin B, która różni się od dihydrocyto B obecnością pojedynczego wiązania podwójnego, hamuje transport zależny od pośladków przy niskich stężeniach mikromolowych.

W związku z tym, jako dehydro L kwas askorbinowy, wychwyt był hamowany przez cyto B z IC 50 mniejszym niż 2,5 mikromola, ale nie był hamowany przez dihydrocyto. B dehydro. Wychwyt kwasu L-askorbinowego prawdopodobnie następuje przez transport za pośrednictwem pośladków.

Alternatywnie, umyte komórki wystawiono na działanie rosnących stężeń przenośnego pośladka, ale niemetabolizowanego analogu glukozy trzech O metylo-D glukozy lub nieprzewoźnego izomeru glukozy stereo L glukozy bez pośladków podczas inkubacji z dehydro L kwasem askorbinowym. Ponownie, wyniki wskazują na udział glu w imporcie dehydro L-kwasu askorbinowego, ponieważ hamowanie wewnątrzkomórkowej akumulacji askorbinianu zachodzi tylko w obecności analogu glukozy do transportu pośladków. W drugim teście.

Można określić szybkość wypływu askorbinianu z hodowanych komórek. Ten specyficzny test jest ważny, ponieważ uwalnianie askorbinianu z komórek wydaje się mieć kluczowe znaczenie dla regulowanego przez askorbinian wychwytu komórkowego żelaza niezwiązanego z transferyną przez komórki. Uważa się, że wychwyt żelaza niezwiązanego z transferyną ma znaczenie dla patofizjologii zaburzeń związanych z przeciążeniem żelazem, takich jak hemochromatoza, a także dla wymiany żelaza i homeostazy neuronów astrocytów w mózgu ssaków.

Rzeczywiście, główny neuroprzekaźnik pobudzający glutaminian L wyzwala uwalnianie askorbinianu dla astrocytów w sposób, który zależy od L-glutaminianu, wychwytu przez szkło i prawdopodobnie GLT i późniejszego obrzęku komórkowego, który wyzwala uwalnianie askorbinianu przez domniemane VSO. Analogicznie, uwalnianie bate A score z astrocytów obciążonych A score B może być stymulowane przez pobudzający aminokwas L asparaginian, ale nie przez niepobudzający aminokwas L glutaminę. Efekt ten jest przedstawiony tutaj, który pokazuje krzywe odpowiedzi na dawkę dla stymulacji uwalniania askorbinianu przez asparaginian i glutaminę z pierwotnych kultur astrocytów myszy obciążonych askorbinianem Po opanowaniu.

Ta technika może być wykonana w ciągu zaledwie dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.