Name: Szybki i specyficzny test mikropłytkowy do oznaczania wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego askorbinianu w hodowanych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Poznaj szybki test mikropłytkowy do oznaczania wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego askorbinianu w hodowanych komórkach. Ta specyficzna metoda spektrofotometryczna umożliwia badanie metabolizmu komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni dr Stephenowi Robinsonowi i Pani Hani Czerwińskiej (Monash University) za hojne dostarczenie kultur astrocytów.

1. Określ wewnątrzkomórkowy askorbinian w hodowanych komórkach
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa i zbiór
	<ol>
		<li>Hoduj zawiesinę (np. ludzką erytroluksemię, K562) lub komórki adherentne (np. pierwotne astrocyty) przy użyciu standardowych procedur hodowli19-21,32,38. Uwaga: aby upewnić się, że komórki zawierają askorbinian, należy obciążyć hodowane komórki askorbinianem jako askorbinianem lub DHA33,39.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stwórz ekstrakt komórkowy zawierający askorbinian
	<ol>
		<li>Inkubować odpowiednią liczbę zawiesiny lub przylegających komórek przemytych roztworem soli fizjologicznej (PBS) z 450 μl lodowatego buforu do permeabilizacji komórek [CPB; 0,1% (w/v) saponiny w PBS; 4 °C]. Uwaga: Określić empirycznie przez użytkownika końcowego liczbę komórek wymaganą do uzyskania wartości absorbancji w zakresie liniowym testu (patrz poniżej). Uwaga: można również stosować ekstrakty tkankowe (więcej szczegółów w Dyskusji).</li>
		<li>Mieszaj komórki na lodzie przez 10 minut, aby zapewnić dokładną lizę komórkową.</li>
		<li>Stworzyć oczyszczony ekstrakt wewnątrzkomórkowy zawierający askorbinian, usuwając resztki komórkowe przez odwirowanie surowego lizatu o sile 16 000 × g przez 5 minut w schłodzonej mikrowirówce (4 °C).</li>
		<li>Ostrożnie usunąć 4 x 100 μl podwielokrotności z każdej próbki i dodać do poziomej sekwencji studzienek w 96-dołkowej płaskiej płytce dennej, która zawiera albo 25 μl/basenik tylko PBS ("-AO"), albo 25 μl/basenik 45,5 U/ml roztworu podstawowego <klasa rozpiętości="smallcaps">oksydaza L-askorbinianu (AO) w PBS ("+AO"). Uwaga: należy to zrobić równolegle z przygotowaniem norm (patrz poniżej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konstrukcja standardowej krzywej askorbinianu (musi być skonstruowana na nowo dla każdego testu)
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 10 mM kwasu askorbinowego w lodowatym PBS. Uwaga: Sprawdzić stężenie askorbinianu spektrofotometrycznie przy użyciu kuwety kwarcowej o długości drogi 1 cm przy długości fali 265 nm (współczynnik ekstynkcji = 14,5 mM-1 cm-1)40.</li>
		<li>Ostrożnie przygotuj serię wzorców askorbinianu o wielkości od 0 do 20 μM.</li>
		<li>Równolegle z krokiem 1.2.4 ostrożnie usunąć 4 × 100 μl podwielokrotności z każdego wzorca i dodać do poziomej sekwencji studzienek na 96-dołkowej płaskiej płytce dennej, która zawiera 25 μl/basenik PBS ("-AO") lub 45,5 U/ml roztworu podstawowego AO w PBS ("+AO"). Uwaga: 100 μl powyższych wzorców askorbinianu będzie zawierało 0-2 nmol askorbinianu. Należy pamiętać, że celem AO jest kontrola udziału reduktorów niezawierających askorbinianu w redukcji żelazocyjanków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ askorbinian wewnątrzkomórkowy - Krok 1: selektywnie usuń askorbinian i ilościowo utlenić askorbinian żelazocyjankiem
	<ol>
		<li>Orbitalnie mieszać 96-dołkową płytkę z prędkością 550 obr./min w temperaturze pokojowej przez 5 minut w ciemności, przykrywając płytkę folią. Uwaga: Ten krok powinien utlenić cały askorbinian w studzienkach "+ AO" do DHA. Studzienki "-AO" powinny pozostać nienaruszone.</li>
		<li>Dodać 50 μl 3,5 mM żelazocyjanku potasu (zwanego dalej "żelazocyjankiem") w PBS do wszystkich studzienek. Końcowy [żelazocyjanek] = 1 mM. Uwaga: Należy użyć multipipettora.</li>
		<li>Mieszaj orbitalnie płytkę z prędkością 550 obr./min w temperaturze pokojowej przez kolejne 5 minut w ciemności. Uwaga: Ten etap powinien skutkować redukcją żelazocyjanku do żelazocyjanku przez askorbinian w stosunku stechiometrycznym 2 cząsteczek żelazocyjanku zredukowanych na 1 cząsteczkę utlenionego askorbinianu.</li>
		<li>Natychmiast dodać 25 μl świeżo przygotowanego roztworu zawierającego 50% (v/v) kwasu octowego i 30% (w/v) kwasu trichlorooctowego (TCA). Uwaga: Należy użyć multipipettora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ wewnątrzkomórkowy askorbinian - Krok 2: określ ilościowo ilość utworzonego żelazocyjanku37
	<ol>
		<li>Do każdej studzienki dodać 100 μl roztworu do oznaczania żelazocyjanków37. Uwaga: Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować roztwór roboczy: 2 ml 3 M octanu Na, (pH 6,0); 0,5 ml lodowatego kwasu octowego (~17,4 M kwasu octowego); 2 ml 0,2 M kwasu cytrynowego; 2 ml 3,3 mM FeCl3 w 0,1 M kwasie octowym; 1 ml 30 mM feren-S. Ostateczna objętość tego roztworu roboczego powinna wynosić 7,5 ml.</li>
		<li>Orbitalnie mieszaj płytkę w ciemności z prędkością 550 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odczytać wartości absorbancji studzienek przy 593 nm (tj. maksimum absorbancji kompleksu Fe(II)(ferene-S)3).</li>
		<li>Obliczyć ilość wewnątrzkomórkowego askorbinianu jako nmoli askorbinianu na milion komórek, początkowo odejmując wartości A593 nm dla studzienek "+ AO" od odpowiednich studzienek "- AO" dla każdej próbki, a następnie interpolując od krzywej wzorcowej askorbinianu (patrz krok 1.3). Konstruując krzywą standardową, należy wykreślić tę "wartość różnicy" dla każdego wzorca w stosunku do ilości askorbinianu na studzienkę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oznaczanie wypływu askorbinianu z hodowanych komórek
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa i zbiór
	<ol>
		<li>Hodować zawiesinę lub przylegające komórki, jak powyżej (patrz krok 1.1). Uwaga: aby uzyskać najlepsze wyniki, przeprowadzić poniższy test w formacie 24-dołkowej płytki z zawiesiną i przylegającymi komórkami.</li>
		<li>Zawiesić komórki zawiesinowe lub komórki przylegające do ciała za pomocą 400 μl wstępnie podgrzanego roztworu soli fizjologicznej buforowanego przez HEPES, z wapniem i magnezem lub bez, i zawierającego 5 mM <klasa rozpiętości = "smallcaps">D-glucose (HBS/D; pH 7,3, 37 °C) w studzienkach na płytce 24-dołkowej. Dodać taką samą objętość HBS/D do określonych studzienek bezkomórkowych na każdej 24-dołkowej płytce, która ma być zbadana. Uwaga: te ostatnie będą służyć jako bezkomórkowe kontrole dla reakcji wyjściowej (patrz poniżej).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Określ ilość uwalnianego askorbinianu
<ol>
	<li>Wcześniej należy przygotować następujące roztwory podstawowe: 120 U/ml AO w HBS/D (przygotować świeże); 2,4 mM Ferene-S w HBS/D; 120 μM FeCl3 i 600 μM Na-cytrynian w HBS/D (przygotować natychmiast z bardziej stężonych roztworów podstawowych).</li>
	<li>Aby rozpocząć reakcję ferriredukcji (końcowa objętość na studzienkę powinna wynosić 600 μl), należy dodać następujące objętości odczynników do poszczególnych studzienek zawierających już 400 μl HBS/D:
	<ol>
		<li>Dodać 50 μl AO (120 U/ml) lub HBS/D do sparowanych studzienek w trzech egzemplarzach. Końcowe stężenie AO powinno wynosić 10 U/ml. Uwaga: Oznacz sparowane studzienki jako "- AO" i "+ AO".</li>
		<li>Mieszać płytki z delikatnym mieszaniem orbitalnym przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodaj 50 μl 2,4 mM ferene-S do wszystkich studzienek. Końcowe stężenie ferenu-S powinno wynosić 200 μM. Mieszać płytki jak powyżej przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 50 μl świeżo przygotowanego 120 μM cytrynianu żelaza. Końcowe stężenia żelaza i cytrynianu powinny wynosić 10 μM żelaza i 50 μM cytrynianu. Dobrze wymieszaj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W trzech potrójnych studzienkach kontrolnych odessać leżące powyżej podłoże i dodać 600 μl HBS/D zawierającego 0,1% saponiny. Uwaga: Będą one służyć jako kontrole "100% lizy komórek" dla testu uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH), który ma być prowadzony równolegle (patrz poniżej).</li>
	<li>Inkubować przez 60 minut w ciemności w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Na zakończenie testu wypływu askorbinianu należy szybko odessać 500 μl z każdej studzienki i dodać do odpowiednio oznakowanych studzienek na 24-dołkowej płytce. Uwaga: w przypadku komórek zawiesiny należy początkowo usunąć komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 300 μl podwielokrotności supernatantu do płytki 96-dołkowej, a następnie odczytać przy długości fali 593 nm.</li>
</ol>
4. Oznaczanie zewnątrzkomórkowego askorbinianu
<ol>
	<li>Odczytać wartości absorbancji studzienek przy 593 nm.</li>
	<li>Obliczyć ilość askorbinianu zewnątrzkomórkowego jako nmoli askorbinianu na mg białka (lub na milion komórek), jak opisano dla oznaczania askorbinianu wewnątrzkomórkowego w kroku 1.5.4. Uwaga: użytkownik końcowy powinien zoptymalizować warunki tak, aby uwalnianie askorbinianu nie było ograniczone przez askorbinian wewnątrzkomórkowy.</li>
</ol>
5. Określenie uwolnienia LDH
<ol>
	<li>Z pozostałymi 200 μl roztworu zewnątrzkomórkowego z każdej próbki przeprowadzić test uwalniania LDH32,41 w celu określenia zakresu lizy komórkowej. Uwaga: obliczyć jako % całkowitego uwalnianego LDH. Oznaczyć uwalnialny LDH z próbek, które zostały potraktowane 0,1% saponiną.</li>
</ol>

<ol><li>Buettner, G. R., Schafer, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albert+Szent-Gy%C3%B6rgyi%3A+vitamin+C+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification.</a> Biochem. J. , (2006).</li>
<li>Padayatty, S. J., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+physiology+and+pharmacology+of+vitamin%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Can.+Med.+Assoc.+J%22%5BJournal%5D)">New insights into the physiology and pharmacology of vitamin.</a> C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).</li>
<li>Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+dependence+of+the+hypoxia-inducible+factor+hydroxylases+%28factor+inhibiting+HIF+and+prolyl+hydroxylase+domain+2%29+on+ascorbate+and+other+reducing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents.</a> Biochem. J. 427, 135-142 (2010).</li>
<li>Manning, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+Promotes+Maturation+of+T-Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells.</a> Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).</li>
<li>Asard, H., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAsard%2C+H+%22Redox+Biochemistry%22">Redox Biochemistry</a>. Banerjee, R., et al. , John Wiley & Sons. 22-37 (2007).</li>
<li>Aguirre, R., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+the+vascular+bed%3A+Importance+of+vitamin%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin.</a> C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).</li>
<li>May, J. M., Qu, Z. -c, Mendiratta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+and+recycling+of+a-tocopherol+in+human+erythrocytes+by+intracellular+ascorbic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid.</a> Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).</li>
<li>Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+some+major+functions+of+vitamin+C+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis and some major functions of vitamin C in animals.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).</li>
<li>Rumsey, S. C., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption+transport+and+disposition+of+ascorbic+acid+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nutr.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans.</a> J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).</li>
<li>Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+chromosomal+mapping+of+the+human+nonfunctional+gene+for+L-gulono-g-lactone+oxidase%2C+the+enzyme+for+L-ascorbic+acid+biosynthesis+missing+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man.</a> J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).</li>
<li>Challem, J. J., Taylor, E. W. Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChallem%2C+JJ+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22">Free Radic. Biol. Med</a>. 25, 130-132 (1998).</li>
<li>Nishikimi, M., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+the+deficiency+in+humans+of+gulonolactone+oxidase%2C+a+key+enzyme+for+ascorbic+acid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis.</a> Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).</li>
<li>Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. itaminC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((recycling+and+degradation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">recycling and degradation in mammals.</a> FEBS J. 274, 1-22 (2007).</li>
<li>May, J. M., Qu, Z. -c, Qiao, H., Koury, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturational+loss+of+the+vitamin+C+transporter+in+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).</li>
<li>Wilson, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vitamin+C+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Regulation of vitamin C transport.</a> Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).</li>
<li>Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pecking+order+of+free+radicals+and+antioxidants%3A+lipid+peroxidation%2C+a-tocopherol%2C+and+ascorbate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).</li>
<li>May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+ascorbic+acid+an+antioxidant+for+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane.</a> FASEB J. 13, 995-1006 (1999).</li>
<li>Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+-+important+for+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Med.+%28Plovdiv%29%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid - important for iron metabolism.</a> Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-transferrin+iron+reduction+and+uptake+are+regulated+by+transmembrane+ascorbate+cycling+in+K562+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells).</a> J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).</li>
<li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+routes+of+iron+accumulation+in+astrocytes%3A+ascorbate-dependent+ferrous+iron+uptake+via+the+divalent+metal+transporter+%28DMT1%29+plus+an+independent+route+for+ferric+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron.</a> Biochem. J. 432, 123-132 (2010).</li>
<li>Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+iron+uptake+is+stimulated+by+ascorbate+via+an+intracellular+reductive+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).</li>
<li>Lawen, A., Lane, D. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+iron+homeostasis+in+health+and+disease%3A+uptake%2C+storage%2C+transport%2C+and+molecular+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action.</a> Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).</li>
<li>Grünewald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid in the brain.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).</li>
<li>Harrison, F. E., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+function+in+the+brain%3A+vital+role+of+the+ascorbate+transporter+SVCT2%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2.</a> Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).</li>
<li>Rebec, G. V., Pierce, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vitamin+as+neuromodulator%3A+ascorbate+release+into+the+extracellular+fluid+of+the+brain+regulates+dopaminergic+and+glutamatergic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission.</a> Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).</li>
<li>Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+view+at+C%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">New view at C.</a> Nat. Med. 8, 445-446 (2002).</li>
<li>Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid%3A+Chemistry%2C+biology+and+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).</li>
<li>Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+stimulates+ascorbate+transport+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes.</a> Brain Res. 858, 61-66 (2000).</li>
<li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li>
<li>May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -c <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+transport+and+recycling+by+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells%3A+response+to+glutamate+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem.+Res%22%5BJournal%5D)">Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity.</a> Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).</li>
<li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+regulation+and+its+neuroprotective+role+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain.</a> Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glutamate+aspartate+transporter+%28GLAST%29+mediates+L-glutamate-stimulated+ascorbate-release+via+swelling-activated+anion+channels+in+cultured+neonatal+rodent+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes.</a> Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+and+plasma+membrane+electron+transport+-+enzymes+vs+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux.</a> Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).</li>
<li>Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume-sensitive+organic+osmolyte%2Fanion+channels+in+cancer%3A+novel+approaches+to+studying+channel+modulation+employing+proteomics+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).</li>
<li>Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+methods+for+simultaneous+determination+of+ascorbic+and+dehydroascorbic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids.</a> Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).</li>
<li>Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+sensitive+assay+for+ascorbate+using+a+plate+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader.</a> Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+colorimetric+microplate+ferrocyanide+assay+applied+to+ascorbate-stimulated+transplasma+membrane+ferricyanide+reduction+and+mitochondrial+succinate+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation.</a> Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).</li>
<li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Na%2B%2FH%2B+exchangers+and+intracellular+pH+in+regulating+vitamin+C-driven+electron+transport+across+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane.</a> Biochem. J. 428, 191-200 (2010).</li>
<li>Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pathways+for+transport+and+efflux+of+ascorbate+and+dehydroascorbate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).</li>
<li>Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electron+spin+resonance+spectra+of+radical+intermediates+in+the+oxidation+of+ascorbic+acid+and+related+substances%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances.</a> J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).</li>
<li>Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detoxification+of+exogenous+hydrogen+peroxide+and+organic+hydroperoxides+by+cultured+astroglial+cells+assessed+by+microtiter+plate+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplasma+membrane+electron+transport+comes+in+two+flavors%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Transplasma membrane electron transport comes in two flavors.</a> Biofactors. 34, 191-200 (2009).</li>
<li>Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+the+effects+of+cytochalasin+B+on+transport+and+motile+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).</li>
<li>May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+decreases+oxidant+stress+in+endothelial+cells+caused+by+the+nitroxide+tempol%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Res%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol.</a> Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).</li>
<li>Avron, M., Shavit, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+simple+method+for+determination+of+ferrocyanide%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide.</a> Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy przedstawiono dwa szybkie, specyficzne i stosunkowo czułe testy mikropłytkowe kolorymetryczne do oznaczania askorbinianu pochodzącego z przedziałów wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych w hodowanych komórkach. Testy można wykonać z dostępem do standardowego sprzętu laboratoryjnego i odczynników. Jedynym umiarkowanie drogim odczynnikiem wymaganym do testu jest AO, który jest niezbędny, ponieważ nadaje wysoki stopień specyficzności analitu w stosunku do L-askorbinianu. Testy te d...

Odkrycie chemicznej natury kwasu askorbinowego (witaminy C) i jego identyfikacja jako długo poszukiwanego "czynnika przeciwszkorbutowego" przez Alberta Szent-Györgyi i innych w pracach opublikowanych w latach 1928-19341 były przełomowymi wydarzeniami w historii biochemii. Rzeczywiście, odkrycia te przyczyniły się do tego, że Szent-Györgyi otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny w 1937 roku. Stale poszerzający się zakres ról askorbinianu w fizjologii zwierząt i roślin, a także w zdrowiu człowieka, nadal jest przedmiotem aktywnych badań naukowych i kontrowersji.
L-askorbinian jest obfitym fizjologicznym reduktorem i kofaktorem enzymatycznym w systemach ssaków i przyczynia się do wielu dobrze zdefiniowanych reakcji enzymatycznych obejmujących hydroksylację kolagenu, biosyntezę karnityny i noradrenaliny, metabolizm tyrozyny i amid hormonów peptydowych2. Co ciekawe, coraz więcej dowodów sugeruje, że askorbinian odgrywa rolę w stymulowaniu innych dioksygenaz zależnych od żelaza, takich jak prolil i hydroksylazy asparaginylowe zaangażowane w hydroksylację i celowanie w czynniki indukowane hipoksją (HIF) 1α i 2α3. Niedawny raport sugeruje, że askorbinian odgrywa rolę w dojrzewaniu limfocytów T poprzez wpływ na demetylację chromatyny poprzez jego aktywność w stymulowaniu hydroksylaz jądrowych, białek domeny Jumonji C (JmjC); Te ostatnie wydają się wymagać askorbinianu do pełnej aktywności4. Rzeczywiście, stymulacja takich enzymów przez askorbinian wydaje się zachodzić w podobny mechanizm do stymulacji przez askorbinian hydroksylaz HIF i kolagenu. Wśród innych klasycznych efektów, askorbinian znacząco przyczynia się do antyoksydacji komórkowej jako rozpuszczalny w wodzie wymiatacz rodników zrywającychłańcuchy5 oraz do recyklingu α-tokoferolu błony komórkowej (witaminy E) poprzez redukcję rodnika α-tokoferoksylowego6, który jest ważny w ochronie przed peroksydacją lipidów błonowych7. Co ważne, chociaż większość ssaków jest zdolna do syntezy de novo askorbinianu w wątrobie z klasy <span="smallcaps">D-glukozy, wyższe naczelne, świnki morskie i niektóre nietoperze są zależne od dietetycznych źródeł witaminy8. Wynika to z inaktywacji genu GULO, którego ortologie u zdrowych ssaków kodują enzym, oksydazę γ-gulono-laktonową9-13. Enzym ten jest niezbędny do końcowej reakcji biosyntezy askorbinianu z glukozy13.
Po wchłonięciu za pośrednictwem transportera ze światła jelita u ludzi, askorbinian jest rozprowadzany po całym ciele przez układ krążenia. Witamina ta występuje zwykle w postaci zredukowanej w stężeniach milimolowych wewnątrzkomórkowych (z godnym uwagi wyjątkiem erytrocytów, w których stężenia są zazwyczaj podobne do dominującego stężenia w osoczu) oraz w stężeniach mikromolowych (np. 50-200 μM) w większości płynów zewnątrzkomórkowych14,15 .
W warunkach fizjologicznych, askorbinian zazwyczaj ulega odwracalnemu utlenianiu jednoelektronowemu do wolnego rodnika askorbylu (AFR; znanego również jako monodehydroaskorbinian lub semidehydroaskorbinian). Podczas gdy AFR jest stosunkowo stabilnym rodnikiem16, przy braku jego szybkiej jednoelektronowej redukcji enzymatycznej z powrotem do askorbinianu, dwa AFR mogą dalej mutować do jednego askorbinianu i jednego dehydroaskorbinianu (DHA)9,13,17. We wnętrzu komórki dwuelektronowy produkt utleniania askorbinianu, DHA, może zostać szybko zredukowany z powrotem do askorbinianu w wyniku reakcji enzymatycznych i nieenzymatycznych zależnych od glutationu i NAD(P)H13.
Chociaż klasycznie przyjmuje się, że jedyną znaczącą rolą askorbinianu w metabolizmie żelaza jest stymulowanie wchłaniania przez dietę niehemowego żelaza18, my i inni dostarczyliśmy dowody zdecydowanie sugerujące, że askorbinian odgrywa znacznie rozszerzoną rolę w metabolizmie tego metalu. Po pierwsze, askorbinian, który jest uwalniany przez komórki bogate w askorbinian, wydaje się odgrywać ważną rolę w modulowaniu wychwytu żelaza niezwiązanego z transferyną przez komórki19,20, a bardzo najnowsze dowody wskazują, że askorbinian moduluje również wychwyt żelaza związanego z transferyną przez komórki21, z których ten ostatni odpowiada głównej fizjologicznej drodze wychwytu żelaza22.
Askorbinian jest niezbędny do prawidłowego funkcjonowania ośrodkowego układu nerwowego u ssaków23,24. Wraz z korą nadnerczy, przysadką mózgową, grasicą, siatkówką i ciałkiem żółtym mózg zawiera wysokie stężenia askorbinianu w stosunku do innych tkanek ciała23,25-27. Ponadto wiadomo, że narażenie zarówno astrocytów28,29, jak i komórek neuronopodobnych30 na glutaminian powoduje uwalnianie askorbinianu do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, gdzie, jak się uważa, askorbinian pomaga chronić neurony przed dysfunkcją neuronów wywołaną glutaminianem31. Chociaż dokładny mechanizm indukowanego glutaminianem uwalniania askorbinianu z astrocytów nie jest znany, niedawno dostarczyliśmy dowodów wskazujących na udział obrzęku komórek spowodowanego wychwytem glutaminianu przez transporter glutaminianu astrocytów i asparaginianu (GLAST; znany również jako pobudzający transporter aminokwasów izoforma 1 [EAAT1] u ludzi) i wynikającą z tego aktywację wrażliwych objętościowo kanałów osmolitowych i anionowych (VSOAC), które są przepuszczalne dla małych anionów organicznych, takich jak askorbinian32. Tożsamości molekularne przewodów błony komórkowej biorących udział w tworzeniu VSOAC pozostają do zidentyfikowania33,34.
Chociaż opracowano wiele testów do oznaczania askorbinianu w próbkach biologicznych, które obejmują testy spektrofotometryczne, fluorometryczne i chromatograficzne35,36, istnieje duża zmienność w specyficzności, czułości, interferencji przez zanieczyszczenia chemiczne, efektywny zakres liniowy i stabilność końcowego analitu. Ponadto inne istotne czynniki wpływające na wybór testu to szybkość, łatwość użycia i dostęp do stosunkowo specjalistycznego sprzętu, takiego jak aparat do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
Tutaj prezentujemy prosty i bardzo specyficzny test mikropłytki kolorymetrycznej do oznaczania wewnątrzkomórkowego askorbinianu w hodowanych komórkach, a także osobny test do oznaczania wypływu askorbinianu z hodowanych komórek. Ten ostatni test ma na celu obejście problemu niedoszacowania uwalniania askorbinianu z komórek w wyniku szybkiego wychwytu zwrotnego uwolnionego askorbinianu przez transportery askorbinianu zależne od sodu (SVCT). Chociaż obie te metody pojawiły się w niektórych z naszych poprzednich publikacji19,20,32,37,38, ten manuskrypt zawiera wyraźny zestaw instrukcji i wskazówek dotyczących ich skutecznego stosowania.

<table><tbody><tr><td>Nunc 96-dołkowe płytki z płaskim dnem</td><td>Thermo</td><td>269620</td><td>Można użyć dowolnej płaskiej płytki 96-dołkowej</td></tr><tr><td>Mikrowirówka stołowa z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td>Można również użyć mikrowirówki bez chłodzenia, która została zrównoważona do temperatury w chłodni</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Wiadro</td></tr> <tr><td>wahadłoweSpektrofotometr mikropłytkowy Bio-Rad Benchmark Plus</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Można użyć dowolnego spektrofotometru z mikropłytkami zdolnego do odczytu przy 593 nm. Jeśli używany jest czytnik płytek oparty na filtrze, wybierz najbliższą możliwą długość fali i użyj metody krzywej standardowej.</td></tr><tr><td>Ependorf MixMate (mieszalnik orbitalny mikropłytek)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Jest to bardzo wszechstronny i niezawodny mieszalnik mikropłytek, który bardzo dobrze sprawdza się w tych testach</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>ogólnego przeznaczenia</tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana MOPS (MBS); 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7,3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBS + 5 mM D-glukozy (MBS/D)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana HEPES + 5 mM D-glukoza (HBS/D); 137 mM NaCl, 5,2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2&bull; 2 H2O, 0,8 mM MgSO4&bull; 7 H2O, 5 mM D-glukozy, 20 mM HEPES-Na+, pH 7,3)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do przenikania komórek (CPB; 0,1% saponiny w PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ogólne chemikalia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy lub L-askorbinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Należy uzyskać preparaty o najwyższej czystości</td></tr><tr><td>Dimer kwasu dehydro-L-askorbinowego (DHA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30790</td><td>Roztwory wodne teoretycznie dają 2 mole monomeru DHA na mol dimeru DHA</td></tr><tr><td>Cytochalazyna B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td>Roztwory podstawowe przygotowane w DMSO lub etanolu</td></tr><tr><td>Oksydaza askorbinianowa (AO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0157</td><td>Roztwory podstawowe (120 U/ml) można przygotować w PBS lub MBS, a następnie zamrozić w podwielokrotnościach</td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu (FIC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>455989</td><td>Trójwodzian</td></tr><tr><td>Ferene-S (3-(2-pirydylo)-5,6-di(2-furylo)-1,2,4-triazyno-5&,5&; &sól disodowa kwasu disulfonowego)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92940</td><td></td></tr><tr><td>L-glutaminian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td> L-glutamina Sigma-Aldrich <td></td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 47036 Przygotować 0,1% roztwór podstawowy <tr><td>Roztwory podstawowe do wewnątrzkomórkowego</td><td></td><td></td><td></td>oznaczania askorbinianu</tr><tr><td>3 M octan sodu (pH 6,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas</td><td></td><td></td><td></td>octowy</tr><tr><td>0,2 M kwas</td><td></td><td></td><td></td>cytrynowy</tr><tr><td>3,3 mM FeCl3 w 0,1 M kwas</td><td></td><td></td><td></td>octowy</tr><tr><td>30 mM feren-S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% (v/v) kwas octowy + 30% (w/v) kwas trichlorooctowy (TCA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwory podstawowe do testu</td><td></td><td></td><td></td>askorbinianowo-odpływowego</tr><tr><td>AO (120 U/ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,4 mM feren-S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,12 mM FeCl3 w 0,6 mM cytrynianu</td><td></td><td></td><td></td> sodu</tr></tbody></table>

szybki i specyficzny test mikropłytkowy do oznaczania wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego askorbinianu w hodowanych komórkach

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Witamina C (askorbinian) odgrywa wiele ważnych ról w metabolizmie komórkowym, z których wiele wyszło na jaw dopiero w ostatnich latach. Na przykład w mózgu askorbinian działa w sposób neuroprotekcyjny i neuromodulujący, który obejmuje cykle askorbinianu między neuronami a astrocytami vicinal - związek, który wydaje się być kluczowy dla homeostazy askorbinianu w mózgu. Ponadto pojawiające się dowody silnie sugerują, że askorbinian ma znacznie większą rolę w regulacji komórkowego i ogólnoustrojowego metabolizmu żelaza, niż się powszechnie uważa. Coraz powszechniejsze uznawanie integralnej roli askorbinianu w prawidłowej i rozregulowanej fizjologii komórek i organizmów wymaga szeregu technik analitycznych o średniej przepustowości i wysokiej czułości, które można wykonać bez konieczności stosowania bardzo drogiego specjalistycznego sprzętu. W tym miejscu podajemy wyraźne instrukcje dotyczące średnioprzepustowego, specyficznego i stosunkowo niedrogiego testu mikropłytkowego do oznaczania zarówno wewnątrzkomórkowego, jak i zewnątrzkomórkowego askorbinianu w hodowli komórkowej.

Oznaczanie wewnątrzkomórkowego askorbinianu w hodowlach komórek w zawiesinie
W pierwszym teście (Rysunek 1) oznaczany jest wewnątrzkomórkowy askorbinian, po specyficznej dla askorbinianu (t.j. wrażliwej na AO) redukcji ferricyjanku do ferrocyjanku, z wykorzystaniem wysokoczułego oznaczania ferrocyjanku zgodnie z wcześniej opisaną procedurą37. Detekcja askorbinianu opiera się na kolorymetrycznej chelatacji żelaza dwuwartościowego, które powstaje w wyniku zależn...

Askorbinian odgrywa wiele ważnych ról w metabolizmie komórkowym, z których wiele wyszło na jaw dopiero w ostatnich latach. Tutaj opisujemy średnioprzepustowy, specyficzny i niedrogi test mikropłytkowy do oznaczania zarówno wewnątrzkomórkowego, jak i zewnątrzkomórkowego askorbinianu w hodowli komórkowej.

Szybki i specyficzny test mikropłytkowy do oznaczania wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego askorbinianu w hodowanych komórkach

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest oznaczenie wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowych poziomów askorbinianu w hodowlach komórkowych lub izolowanych komórkach. Osiąga się to poprzez inkubację ekstraktów komórkowych lub całych komórek z oksydazą skorową, aby selektywnie usunąć skorowy BA w kolejnych etapach. W pierwszej metodzie ekstrakty komórkowe inkubuje się z cyjankiem w celu generowania ferrocyjanku w sposób zależny od askorbinianu, co stanowi bezpośrednie odzwierciedlenie ilości askorbinianu w ekstraktach.Następnie ilość utworzonego w ekstraktach komórkowych ferrocyjanku jest wyznaczana poprzez ilościowe utlenianie ferrocyjanku dodanym żelazem(III) do utworzenia żelaza(II), w celu wygenerowania chromogennego kompleksu żelaza(II) z ferrozyną S, który można oznaczyć spektrofotometrycznie. W drugiej metodzie wszystkie komórki są bezpośrednio inkubowane z chelatorem żelaza(II) ferrozyną S oraz cytrynianem żelaza(III). Wyniki wykazują różnice w wewnątrzkomórkowych lub zewnątrzkomórkowych poziomach askorbinianu na podstawie ilościowej i specyficznej redukcji zewnątrzkomórkowych kompleksów żelaza, które można wykryć.Spektrometrycznie. Główną zaletą obecnej techniki w porównaniu z metodami już stosowanymi, takimi jak detekcja oparta na HPLC, jest to, że ten wysoce specyficzny test na płytkach mikrotitracyjnych może być przeprowadzony bardzo szybko, a wszystkie próbki i wzorce mogą być przetwarzane równolegle, a nie szeregowo. Przed rozpoczęciem tej procedury należy hodować zawiesinę komórek K 5 62 i przygotować próbkę BA zawierającą ekstrakt komórkowy.Następnie przygotuj roztwór zapasu kwasu askorbinowego o stężeniu 10 millimolar w schłodzonym do temperatury lodowej PBS. Następnie starannie przygotuj szereg standardów askorbinianu o stężeniach od 0 do 20 micromolar. Ostrożnie pobierz cztery alikwoty po 100 microliter z każdego standardu i dodaj je do poziomej serii studzienek.W płytce 96-dołkowej z płaskim dnem, zawierającej 25 µL na dołek PBS lub roztworu zapasu askorbinianowej oksydazy (AO) w PBS o stężeniu 45,5 jednostek na mililitr, przykryć płytkę folią i mieszać na wstrząsarku orbitalnym przy 550 RPM w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Po zakończeniu dodaj do wszystkich studzienek 50 µL 3,5 mM żelazocyjanku potasu w PBS, aby uzyskać końcowe stężenie żelazocyjanku wynoszące 1 mM po wymieszaniu płytki 96-dołkowej na wytrząsarce orbitalnej, stosując te same warunki co poprzednio. Natychmiast dodaj 25 µL świeżo przygotowanego roztworu zawierającego 50% kwasu octowego i 30% kwasu trójchlorooctowego. Następnie do każdej studzienki dodaj 100 µL świeżo przygotowanego roztworu do oznaczania cyjanku w stylu Pharaoh.Mieszaj płytkę w ciemności przy 550 RPM przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odczytaj wartości absorbancji w studziach przy 593 nanometrach, aby rozpocząć analizę.Najpierw utlenij zewnątrzkomórkowy askorbinian w wybranych dołkach, dodając 50 µL AO lub HBSD o stężeniu 120 units/mL do sparowanych dołków w trzech powtórzeniach, aby uzyskać końcowe stężenie AO wynoszące 10 units/mL. Następnie oznacz sparowane dołki jako minus AO i plus AO. Po wymieszaniu płytek za pomocą delikatnego mieszania orbitalnego przez pięć minut w temperaturze 37 °C, dodaj 50 µL 2,4 mM Ferne S do wszystkich dołków, aby uzyskać końcowe stężenie Ferne S wynoszące 200 µM, a następnie wymieszaj płytki w opisany wyżej sposób przez pięć minut w temperaturze 37 °C.Następnie do wszystkich studzienek należy dodać 50 µL świeżo przygotowanego 120 µM cytrynianu żelaza(III), aby uzyskać końcowe stężenia żelaza i cytrynianu wynoszące odpowiednio 10 µM i 50 µM. Po zakończeniu testu FLX z askorbinianem dokładnie wymieszać. Szybko odessać medium znad każdej studzienki i przenieść je do odpowiednio oznakowanych studzienek na płytce 24-dołkowej.Następnie nanieś trzy mikrolitrowe aliquoty supernatantu na płytkę 96-dołkową, aby oznaczyć poziom zewnątrzkomórkowego askorbinianu. Odczytaj wartości absorbancji w dołkach przy 593 nanometrach za pomocą spektrofotometru do mikropłytek. Na koniec oblicz ilość zewnątrzkomórkowego askorbinianu jako m askorbinianu na miligram białka.Oto typowa krzywa standardowa dla zestawu wzorców askorbinianu, od 0 do 20 micromolar lub od zero do dwóch NMO askorbinianu na dołek. W przypadku płytki 96-dołkowej, choć nie jest to tutaj pokazane, liniowość jest zachowana do ośmiu NMO askorbinianu na dołek, co odpowiada stężeniu askorbinianu w próbce wynoszącemu około 80 micromolar. Metoda ta może być skutecznie wykorzystana do wykrywania poziomów askorbinianu poniżej 0,25 ole askorbinianu na dołek.Komórki K 5 62 szybko akumulują wewnątrzkomórkowy askorbinian z pozakomórkowego kwasu dehydro-L-askorbinowego, lecz nie z askorbinianu. W tym reprezentatywnym doświadczeniu komórki K 5 62 przemyte w PBS inkubowano w PBS z 500 µM askorbinianu, kwasu dehydro-L-askorbinowego, kwasu dehydro-L-askorbinowego z dodatkiem 50 µM cyto B, askorbinianu z dodatkiem 5 mM cyjanku lub askorbinianu z dodatkiem 50 U/ml AO przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Zawartość wewnątrzkomórkowego askorbinianu określono zgodnie z wcześniejszym opisem.Wchłanianie kwasu dehydro-L-askorbnowego przez komórki K 5 62 odbywa się poprzez transport zapośredniczony przez ułatwiający transporter glukozy glute; w celu oceny udziału transporterów glute w wchłanianiu kwasu dehydro-L-askorbnowego przeprowadzono badanie. W tym reprezentatywnym eksperymencie komórki K 5 62 inkubowano z rosnącymi stężeniami cyto B lub dihydro cyto B przed inkubacją z kwasem dehydro-L-askorbnowym. Należy zauważyć, że choć zarówno cyto callin B, jak i dihydro cyto B hamują procesy ruchliwe w stężeniach mikromolarnych, tylko cyto callin B, który różni się od dihydro cyto B obecnością pojedynczego wiązania podwójnego, hamuje transport zależny od glute w niskich stężeniach mikromolarnych.Zatem, skoro pobór kwasu dehydro-L-askorbinowego został zahamowany przez cyto B z wartością IC 50 mniejszą niż 2,5 µM, ale nie został zahamowany przez dihydro cyto B, pobór kwasu dehydro-L-askorbinowego prawdopodobnie odbywa się poprzez transport zależny od GLUT.Alternatywnie, wypłukane komórki poddano działaniu wzrastających stężeń 3-O-metyloglukozy, która jest analogiem glukozy transportowalnym przez GLUT, ale niepodlegającym metabolizmowi, lub stereoizomeru glukozy L-glukozy, który nie jest transportowany przez GLUT, podczas inkubacji z kwasem dehydro-L-askorbinowym. Ponownie wyniki wskazują na udział transporterów GLUT w imporcie kwasu dehydro-L-askorbinowego, ponieważ hamowanie wewnątrzkomórkowej akumulacji askorbinianu występuje tylko w obecności transportowalnego przez GLUT analogu glukozy. W drugim teście.Można oznaczyć tempo odpływu askorbinianu z hodowlanych komórek. Ten konkretny test jest istotny, ponieważ wydzielanie askorbinianu z komórek wydaje się być kluczowe dla regulowanego przez askorbinian poboru wolnego żelaza (niezwiązanego z transferyną) przez komórki. Pobór wolnego żelaza uważa się za istotny w patofizjologii zaburzeń związanych z przeładowaniem żelazem, takich jak hemochromatoza, a także w wymianie i homeostazie żelaza między astrocytami a neuronami w mózgu ssaków.Rzeczywiście, główny pobudzający neurotransmiter L-glutaminian wywołuje uwalnianie askorbinianu przez astrocyty w sposób zależny od L-glutaminianu, jego poboru przez glej, a prawdopodobnie przez GLT1 oraz następującego po tym obrzęku komórkowego, który inicjuje uwalnianie askorbinianu przez domniemane VSO. Analogicznie, uwalnianie askorbinianu z astrocytów obciążonych askorbinianem może być stymulowane przez pobudzający aminokwas L-asparaginian, ale nie przez niepobudzający aminokwas L-glutaminę. Efekt ten przedstawiono tutaj, ukazując krzywe zależności dawka-odpowiedź dla stymulacji uwalniania askorbinianu przez asparaginian i glutaminę w pierwotnych kulturach obciążonych askorbinianem astrocytów myszy po opanowaniu techniki.Przy prawidłowym wykonaniu technika ta może zostać zrealizowana w czasie zaledwie dwóch godzin.

a-rapid-specific-microplate-assay-for-determination-intra

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybka i swoista metoda wykorzystująca płytki mikrotytrajecyjne do określania poziomu askorbinianu wewnątrz- i pozakomórkowego w hodowanych komórkach

Ten protokół zapewnia biochemiczne podejście do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) pierwotnych komórek białaczkowych za pomocą testu strumienia zewnątrzkomórkowego. Ocena profilu metabolicznego tych komórek pomaga scharakteryzować ich zapotrzebowanie, co prowadzi do spersonalizowanej terapii.

Test strumienia zewnątrzkomórkowego: metoda pomiaru profilu metabolicznego komórek

Ten film demonstruje technikę kwantyfikacji CO2 uwalnianego podczas utleniania substratu przy użyciu 14substratów znakowanych radioizotopem C. Uwolnione 14CO2 jest uwięzione w roztworze alkalicznym i oznaczane ilościowo za pomocą licznika scyntylacyjnego. Utlenianie różnych substratów różni się w zależności od tkanki i odzwierciedla stan patofizjologiczny tkanki.

Test utleniania substratu w hodowanych komórkach: Test in vitro do ilościowego określania utleniania substratu w komórkach poprzez pomiar sygnałów radioaktywnych z uwięzionego CO2

Ten film demonstruje test do badania skuteczności uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków. Komórki są wystawione na działanie bakteryjnej toksyny tworzącej pory, która tworzy pory w błonie komórkowej. W obecności zewnątrzkomórkowych jonów wapnia pory powodują napływ wapnia, wywołując zdarzenia ponownego uszczelniania błony. Skuteczność ponownego zamykania ocenia się za pomocą barwnika jodku propydyny wiążącego DNA, który dostaje się do komórek tylko bez ponownie uszczelnionej błony.

Test fluorescencyjny in vitro do pomiaru skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej

Związki terapeutyczne są często najpierw badane in vitro za pomocą testów żywotności. Zliczanie ślepych komórek przez ludzkiego obserwatora może być bardzo wrażliwe na niewielkie zmiany liczby komórek, ale nie ocenia funkcji. Komputerowe testy żywotności, jak opisano tutaj, mogą ocenić zarówno strukturę, jak i funkcję w obiektywny sposób.

Testy żywotności komórek w hodowli

Dostosowaliśmy zestaw protokołów do pomiaru reaktywnych form tlenu (ROS), które mogą być stosowane w różnych modelach komórkowych ameb i ssaków do badań jakościowych i ilościowych.

Wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu Amoeba

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Glikoliza jest definiującym markerem metabolicznym w wielu systemach biologicznych. Monitorowanie glikolizy poprzez pomiar zewnątrzkomórkowego strumienia H+ jest powszechne, ale wymaga korekty, aby była ilościowa i jednoznaczna. W tym miejscu pokazujemy, jak zbierać i korygować dane dotyczące strumienia zewnątrzkomórkowego, aby odróżnić oddechowe i glikolityczne źródła zakwaszenia zewnątrzkomórkowego.

Pomiar i analiza produkcji kwasu zewnątrzkomórkowego w celu określenia szybkości glikolitycznej

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Celem tego protokołu jest spektrofotometryczne monitorowanie transportu elektronów przez błonę transplazmatyczną za pomocą zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów i analiza oddziaływań enzymatycznych, które mogą wystąpić z tymi zewnątrzkomórkowymi akceptorami elektronów.

Pomiar transportu elektronów w błonie transplazmatycznej przez miorurki C2C12

Przedstawiona tutaj metoda podsumowuje zoptymalizowane protokoły oceny bioenergetyki komórkowej w nieprzylegających mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i prymitywnych komórkach progenitorowych (HSPC) przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) HSPC w czasie rzeczywistym.

Ocena bioenergetyki komórkowej w krwiotwórczych komórkach macierzystych myszy i prymitywnych komórkach progenitorowych przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Status metaboliczny ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (H-RPE) odzwierciedla ich zdrowie i funkcję. Przedstawiono zoptymalizowany protokół badania strumienia metabolicznego H-RPE w czasie rzeczywistym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Analiza bioenergetyki w czasie rzeczywistym w pierwotnych komórkach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Poznaj szybki test mikropłytkowy do oznaczania wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego askorbinianu w hodowanych komórkach. Ta specyficzna metoda spektrofotometryczna umożliwia badanie metabolizmu komórkowego.

Szybki i specyficzny test mikropłytkowy do oznaczania wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego askorbinianu w hodowanych komórkach

Przeglądaj więcej filmów