Otrzymywanie usieciowanych DNA hydrożeli poliakrylamidowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie hydrożeli poliakrylamidowych sieciowanych DNA, których sztywność można zwiększać lub zmniejszać poprzez pipetowanie jednoniciowych cząsteczek DNA do pożywki hodowlanej po wysianiu na nich komórek. Osiąga się to najpierw poprzez resuspensję liofilizowanych jednoniciowych DNA: SA one, SA two, L two, R two oraz kontrolnego w buforze, a następnie indywidualną polimeryzację roztworów SA one i SA two w obrębie szkieletu poliakrylamidowego. W drugim kroku polimeryzowane roztwory SA one i SA two miesza się z roztworem L two w celu utworzenia żelu DNA.

Następnie roztwór żelu DNA jest immobilizowany na szkiełkach podstawkowych za pomocą kleju optycznego. Ostatnim etapem jest funkcjonalizacja żeli poprzez ich potraktowanie sulfo-SAMPA, a następnie PDL. Ostatecznie komórki są wysiewane na żele DNA, a elastyczność żelu jest modulowana poprzez dodatek R2L2 lub kontrolnego jednoniciowego DNA, aby odpowiednio zmiękczyć, utwardzić lub nie zmieniać elastyczności żelu.

Wyniki tych eksperymentów wykazują, że dynamiczny charakter podłoża steruje zachowaniem komórek. Przewagą zastosowania tej techniki nad innymi metodami, takimi jak CRO, lingo czy hydrożele kuliste, jest fakt, że żele DNA nie wymagają bodźca, np. promieniowania UV, do modulacji ich elastyczności. Zamiast tego żele DNA są utwardzane i zmiękczane odpowiednio poprzez dyfuzję jednoniciowego DNA L dwa lub R dwa przez żel. Najpierw liofilizowane jednoniciowe DNA SA jeden odwiruj przy 2000 ×g przez 15 sekund, aby upewnić się, że całe jednoniciowe DNA znajduje się na dnie probówki.

Po wirowaniu przygotować 3 mM roztwór SA one, dodając do probówki 107 µL buforu 1x Tris-EDTA lub TE. Podgrzewać bufor SA one NTE w temperaturze 70 °C przez pięć minut lub do całkowitego rozpuszczenia osadu jednoniciowego DNA. Następnie przygotować spolimeryzowany roztwór SA one, dodając 45 µL 40% akryloamidu oraz 18 µL buforu 10x Tris-borat-EDTA lub TBE, a następnie wirować mieszaninę, aby ułatwić jej wymieszanie.

Załóż końcówkę P 200, podłącz ją do źródła azotu, zanurz w roztworze i powoli przepuszczaj gaz azotowy przez roztwór przez dwie do trzech minut. Następnie wiruj próbkę przez 15 sekund przy 2000 Gs, aby zebrać roztwór. Po zakończeniu dodaj do próbki 4,5 µL 2%siarczanu amonu (APS), aby zainicjować polimeryzację żelu, a następnie kilkakrotnie odwróć probówkę, aby wymieszać zawartość. Po odwirowaniu próbki w celu zebrania roztworu do jednorodnej polimeryzacji, dodaj do próbki 4,5 µL 20%tetrametyleno-diaminy (TEMED), aby skatalizować polimeryzację. Gdy próbka zostanie wymieszana i odwirowana, odgazuj roztwór azotem przez trzy do pięciu minut, aby dokończyć polimeryzację i zminimalizować ilość nieprzereagowanych monomerów.

Następnie inkubować roztwór przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby dokończyć polimeryzację i otrzymać jeden spolimeryzowany roztwór SA. Powtórzyć poprzednie kroki z liofilizowanym jednoniciowym DNA SA dwa, dodając odpowiednio 45 µL akryloamidu, 18 µL Bis, 4 µL APS, 0,5 µL TEMED i 4,5 µL TBE do 108 µL roztworu SA dwa. Aby przygotować roztwory L dwa, R dwa oraz roztwory kontrolne, odwirupować liofilizowane jednoniciowe DNA i dodać następujące ilości buforu TE do odpowiednich liofilizowanych jednoniciowych DNA, zgodnie z wcześniejszym opisem; podgrzewać roztwór aż do rozpuszczenia w celu przygotowania roztworu do żelu.

Podgrzać spolimeryzowane roztwory SA one oraz SA two w temperaturze 70 °C przez około jedną minutę, aż do zmniejszenia lepkości roztworów. Dodać 10 µL lub 10 części spolimeryzowanego roztworu SA one do 10 µL lub 10 części spolimeryzowanego roztworu SA two.

Następnie wymieszać spolimeryzowane roztwory SA one i SA two, stosując naprzemienne ogrzewanie przez 15 sekund w temperaturze 70 °C oraz mieszanie końcówką pipety przez 15 sekund, przez łącznie jedną minutę. Po wymieszaniu dodać 6 µL lub sześć części roztworu 100%L two, aby utworzyć 100%gel. Gdy próbka zostanie wymieszana w opisany wcześniej sposób, przenieść 100%gel pipetą do 60 mm szalki Petriego i ogrzewać żel przez jedną godzinę w optymalnej temperaturze wyżarzania.

Następnie należy pozwolić na dalszą rehybrydyzację wiązań krzyżowych DNA poprzez inkubację żeli przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Po całonocnej inkubacji w temperaturze pokojowej żel należy przykryć buforem PBS zawierającym wapń i magnez, usunąć pozostały bufor z szalki Petriego i umieścić żel w probówce do mikrowirówki. W tym momencie należy podgrzać 100% żelu w temperaturze 70°C przez około 30 sekund lub do momentu, aż żel stanie się mniej lepki.

W celu pipetowania należy umieścić szkiełka nakrywkowe na bloku grzejnym ustawionym na 70 °C i pozostawić je do nagrzania przez jedną do dwóch minut. Na każde szkiełko nakrywkowe nanieść kroplę kleju optycznego. Następnie nanieść 20 µL 100% żelu na każde szkiełko nakrywkowe i pozwolić żelowi roztopić się i rozprzestrzenić po ich powierzchni.

Wyjmij każde szkiełko z żelem z bloku grzejnego i umieść je w 24-dołkowej płytce do hodowli tkanek. Naświetl żele światłem UV o długości fali 365 nanometrów przez 15 minut. Po podgrzewaniu żelu przez jedną godzinę w optymalnej temperaturze odbytowej i odczekaniu czterech godzin na rehybrydyzację wiązań krzyżowych DNA, dodaj do nich PBS.

Następnie inkubować żele przez noc w temperaturze four degrees Celsius. Po inkubacji usunąć bufor z dołków za pomocą pipety, uważając, aby nie odessać żelu. Następnie dodać sulfa sampa, aby przykryć każdy żel.

Po naświetlaniu żeli światłem UV o długości fali 365 nm przez 15 minut, należy usunąć sulfa sampa. Po powtórzeniu poprzednich kroków żele należy przepłukać raz roztworem PBS w celu usunięcia nadmiaru sulfa sampa, a następnie inkubować żele w około 300 µL poli-L-lizyny o stężeniu 0,2 mg/mL przez noc w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu inkubacji żele należy przemyć dwukrotnie roztworem PBS przez 5 minut, aby usunąć nadmiar poli-L-lizyny, a następnie dodać pożywkę. Po 30-minutowej inkubacji żeli w pożywce, należy ją niezwłocznie usunąć przed wysianiem komórek do hodowli i obrazowania.

Fibroblasty hodowane na żelach o zwiększającej się sztywności nie wykazały zmian w stosunku boków, ale charakteryzowały się większą powierzchnią projekcji niż fibroblasty hodowane na żelach 100%. Fibroblasty hodowane na żelach 100% miały mniejszą powierzchnię projekcji i większy stosunek boków niż fibroblasty hodowane na żelach 80%. Wyniki te wskazują, że zachowanie fibroblastów zależy od dynamicznego charakteru mikrośrodowiska.

Neurony hodowane na żelach mięknących nie wykazywały różnic w liczbie dendrytów pierwotnych ani w długości aksonów, ale charakteryzowały się krótszymi dendrytami pierwotnymi niż neurony hodowane na żelach 50%. Podobnie jak w badaniach nad fibroblastami, fenotypy neuronów na żelach statycznych różniły się od fenotypów neuronów na żelach dynamicznych. Neurony hodowane na żelach 50% miały mniej dendrytów pierwotnych i dłuższe aksony niż neurony hodowane na żelach 100%.

Podczas wykonywania tej procedury niezwykle ważne jest dokładne pipetowanie lepki żelu, ponieważ zachowanie odpowiednich stężeń jest kluczowe dla uniknięcia pękania żelu; precyzyjne pipetowanie może wymagać kilku prób, a w sekcji dyskusyjnej niniejszego protokołu przedstawiamy kilka innych opcji.