Name: Otrzymywanie usieciowanych DNA hydrożeli poliakrylamidowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metodę otrzymywania usieciowanych DNA hydrożeli poliakrylamidowych do badania wpływu sztywności podłoża na funkcje komórkowe. Technika umożliwia dynamiczną modulację elastyczności bez stosowania promieniowania UV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować: Dr. Frankowi Jiangowi, Dr. Davidowi Linowi, Dr. Bernardowi Yurke i Dr. Udayowi Chippadzie za ich wkład w rozwój technologii żelu DNA; Dr. Norellowi Hadzimichalisowi, Smitowi Shahowi, Kimberly Peterman, Robertowi Arterowi za komentarze i edycje tego rękopisu; źródłom finansowania, w tym New Jersey Commission on Spinal Cord Research (Grant #07A-019-SCR1, N.A.L.) oraz New Jersey Neuroscience Institute (M.L.P.); oraz wydawcom Tissue Engineering, Part A o zgodę na przedruk rysunków 2 i 4 oraz Biomaterials o zgodę na przedruk ryciny 3.

<ol><li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly+A+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
<li>Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+equilibrium+swelling+behaviour+of+ph-sensitive+hydrogels+containing+2-hydroxyethyl+methacrylate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate.</a> Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).</li>
<li>Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+elastomeric+biomaterials+based+on+resilin-like+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides.</a> Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).</li>
<li>Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+behavior+on+shape+memory+polymer+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates.</a> Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repositioning+of+cells+by+mechanotaxis+on+surfaces+with+micropatterned+youngs+modulus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus.</a> J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).</li>
<li>Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ions+on+the+dynamic+behavior+of+an+electrodriven+ionic+polymer+hydrogel+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane.</a> Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).</li>
<li>Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+swelling+of+polyacrylate+hydrogels+in+physiological+salt+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).</li>
<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+on+a+DNA+crosslinked+hydrogel+with+tunable+stiffnesses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses.</a> Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).</li>
<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dynamic+stiffness+of+the+substrates+on+neurite+outgrowth+by+using+a+DNA-crosslinked+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).</li>
<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+fibroblast+growth+and+the+dynamic+stiffnesses+of+a+DNA+crosslinked+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel.</a> Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).</li>
<li>Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+photodegradable+hydrogels+as+dynamically+tunable+cell+culture+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms.</a> Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).</li>
<li>Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+a+reversible%2C+DNA-crosslinked+polyacrylamide+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel.</a> J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).</li>
<li>Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+rigid+spherical+inclusions+in+young%27s+moduli+determination%3A+Application+to+DNA-crosslinked+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels.</a> J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).</li>
<li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+immobilization+of+biomolecules+to+agarose+hydrogels+for+controlled+cellular+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response.</a> Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).</li>
<li>Marklein, R. A., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+controlled+hydrogel+mechanics+to+modulate+stem+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions.</a> Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).</li>
<li>Pelham Jr, R. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+DNA-crosslinked+polyacrylamide+hydrogels+with+increasing+crosslinker+density%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density.</a> BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).</li>
<li>Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+and+cell+density+on+primary+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures.</a> J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).</li>
<li>Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendrite+arborization+by+substrate+stiffness+is+mediated+by+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors.</a> Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).</li>
<li>Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+morphology+on+dynamic+softening+of+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels.</a> Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+characterization+of+the+injured+spinal+cord+after+lateral+spinal+hemisection+injury+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat.</a> J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+growth+in+3d+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).</li>
<li>Wozniak, M. A., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+in+development+A+growing+role+for+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction in development A growing role for contractility.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).</li>
<li>Wuerfel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mr-elastography+reveals+degradation+of+tissue+integrity+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis.</a> Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).</li>
<li>Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photopolymerization+in+microfluidic+gradient+generators+Microscale+control+of+substrate+compliance+to+manipulate+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response.</a> Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zdolność żeli DNA do zmiękczania lub usztywniania przed i po adhezji komórek sprawia, że są one idealnym modelem do badania roli dynamicznej sztywności tkanek na funkcję komórki. Wszystkie trzy konstrukcje zostały wykorzystane w badaniach mechanicznych i biologicznych. Jednak wszystkie trzy projekty mają podobną elastyczność przy różnych procentach usieciowania, co wskazuje, że długość usieciowania nie wpływa na elastyczność żelu DNA (Tabela 2). Natomiast stężenie akrylamidu wpływa na elastyczność. Konst...

Podłoża statyczne i dynamiczne to dwie kategorie biomateriałów opracowanych w celu badania wpływu elastyczności lub sztywności tkanki na funkcje komórkowe. Podłoża statyczne nie mogą zmieniać swoich właściwości fizycznych po ich wytworzeniu i/lub po wysianiu komórek. Żele poliakrylamidowe (PA) były pierwszymi dwuwymiarowymi, statycznymi podłożami zsyntetyzowanymi na potrzeby badań z zakresu mechanobiologii 5,17. Żele PA są łatwe w przygotowaniu, niedrogie, wszechstronne i mogą być wytwarzane w szerokim zakresie modułów sprężystości. Choć te zalety techniczne sprawiają, że żele PA są powszechnie stosowanym podłożem, podłoża statyczne nie oddają dynamicznej natury macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i otaczającego środowiska komórkowego in vivo. Na przykład ECM ulega zmianom sztywności w wyniku urazu, rozwoju lub choroby. Dlatego w badaniach z zakresu mechanobiologii preferowane są podłoża dynamiczne jako modele podłoży naśladujące tkanki 22,24,25.
Opracowano liczne syntetyczne, naturalne, dwuwymiarowe, trójwymiarowe, statyczne i dynamiczne biomateriały naśladujące sztywność tkanek 1,3,6,16,23,26. Niektóre dynamiczne podłoża wymagają zastosowania ciepła, promieniowania UV, prądu elektrycznego, jonów lub zmian pH w celu modyfikacji ich właściwości mechanicznych 2,4,7,8,12,15,16, jednak bodźce te mogą ograniczać zastosowania biologiczne hydrożelu. Hydrożele poliakrylamidowe sieciowane DNA (żele DNA) są dynamicznymi, dwuwymiarowymi podłożami elastycznymi. Sieciowania DNA umożliwiają czasową, przestrzenną i odwracalną modulację sztywności żelu DNA poprzez dodanie do pożywki lub buforu jednoniciowego DNA (ssDNA) 9-11,13,14,18,21. W przeciwieństwie do wspomnianych wcześniej żeli dynamicznych, w których do modulacji elastyczności stosuje się bodźce, żele DNA opierają się na dyfuzji wprowadzonego ssDNA w celu zmiany elastyczności. W związku z tym górna powierzchnia żelu, na której hodowane są komórki, jest obszarem modyfikowanym w pierwszej kolejności, ponieważ szybkość modulacji elastyczności zależy od grubości żelu.
Żele DNA są podobne do swoich odpowiedników z żelu PA pod względem szkieletu z poliakryloamidu, jednakże wiązania sieciujące bis-akryloamidu zostały zastąpione wiązaniami sieciującymi złożonymi z DNA (Rysunek 1). Dwa ssDNA (SA1 i SA2) hybrydyzują z nicią sieciującą (L2), tworząc wiązania sieciujące DNA w żelu. SA1 i SA2 mają odrębne sekwencje, z których każda zawiera modyfikację Acrydite na końcu 5´ w celu efektywnego włączenia do sieci PA. Do przygotowania żeli SA1 i SA2 są oddzielnie polimeryzowane w szkielet PA, a następnie spolimeryzowane SA1 i SA2 są ze sobą mieszane. Do mieszaniny SA1 i SA2 dodaje się L2, czyli czynnik sieciujący. Sekwencja zasad L2 jest komplementarna do sekwencji SA1 oraz SA2, a L2 hybrydyzuje z SA1 i SA2, tworząc wiązania sieciujące DNA. Początkowa elastyczność żelu DNA jest określona zarówno przez stężenia L2, jak i stopień sieciowania (Tabele 1 i 2). Żele DNA zawierające równe ilości stechiometryczne L2, SA1 i SA2 są najsztywniejszymi żelami, ponieważ SA1 i SA2 są w 100% sieciowane przez L2 (oznaczane jako żele 100%). Niższe stężenia L2 skutkują niższym procentem sieciowania DNA, a tym samym miększymi żelami DNA. Skonstruowano żele o stopniu sieciowania tak niskim jak 50% (oznaczane jako żele 50%) 9-11.
<img alt="Sekwencyjny proces edycji DNA; schemat; etapy z użyciem SA1, SA2, R2; analiza spektrogramowa." src="/files/ftp_upload/51323/51323fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat sieciowania i odsieciowania żelu DNA 9-11,13,14,18,21. Krok 1: SA1 (czerwony) i SA2 (niebieski) są oddzielnie polimeryzowane w szkielecie poliakryloamidowym (czarny). Po polimeryzacji roztwory spolimeryzowanego SA1 i SA2 są ze sobą mieszane. Krok 2: Dodaje się L2 (zielony), który hybrydyzuje z SA1 oraz SA2, tworząc sieciowania żelu. Krok 3: R2 hybrydyzuje z regionem toehold L2. Krok 4: Hybrydyzacja toehold R2 powoduje rozplecenie L2 z SA1 i SA2.
W przeciwieństwie do żeli z PA, żele z DNA mogą twardnieć i mięknąć po syntezie. Z tego powodu komórki hodowane na żelach z DNA mogą być poddawane dynamicznym zmianom sztywności. Aby utwardzić żele z przytwierdzonymi komórkami, do pożywki kultur żeli o niskim procencie można dodać L2, aby zwiększyć stopień sieciowania. Aby zmiękczyć żele z przytwierdzonymi komórkami, można usunąć L2, aby zmniejszyć stopień sieciowania 10,13,21. L2 posiada dodatkową sekwencję toehold na końcu 3´, która umożliwia odłączenie L2 od SA1 i SA2 (Tabela 1). Usunięcie L2 odbywa się poprzez hybrydyzację z nicią odwracającą zwaną R2. R2 jest komplementarna do pełnej długości L2 i hybrydyzuje najpierw z sekwencją toehold L2. Hybrydyzacja toehold inicjuje rozplatanie L2 od SA1 i SA2, co eliminuje wiązanie sieciujące i zmniejsza sztywność żelu.
W niniejszym raporcie i filmie przedstawiono instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania twardniejących i mięknących żeli DNA. Choć opisano przygotowanie żeli o stopniu sieciowania 100% i 80%, protokół ten można dostosować w celu stworzenia żeli DNA o innych początkowych i końcowych wartościach procentowych sieciowania. Generalnie żele 100% i 80% są przygotowywane, unieruchamiane na szklanych lamellkach, funkcjonalizowane, a następnie zasiewane komórkami. 48 h po wysianiu do pożywki żeli 80% dodaje się L2, a do pożywki żeli 100% dodaje się R2. Dodanie L2 do pożywki utwardza żele 80% do poziomu sieciowania 100%, podczas gdy dodanie R2 do pożywki zmiękcza żele 100% do poziomu 80%. Żele utwardzone są w tekście oznaczane jako żele 80→100%, a żele zmiękczone jako żele 100→80%. W przypadku żeli kontrolnych lub statycznych, do innego zestawu żeli 100% i 80% dostarcza się ssDNA składające się z T lub A. Po upływie minimum dwóch dni od modulacji elastyczności komórki mogą zostać poddane dalszej obróbce i analizie.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody align="center">
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Szycie DNA</td>
			<td rowspan="2">Liczba zasad</td>
			<td>Sekwencja (Toehold)</td>
			<td rowspan="2">Modyfikacja</td>
			<td rowspan="2">Temperatura topnienia (Tm, °C)</td>
			<td rowspan="2">Komentarze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5'→3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Projekt 1</td>
			<td>SA1</td>
			<td>10</td>
			<td>GCA CCT TTG C</td>
			<td>5' Acrydite</td>
			<td>34.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA2</td>
			<td>10</td>
			<td>GTC AGA ATG A</td>
			<td>5' Acrydite</td>
			<td>23.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2</td>
			<td>30</td>
			<td>TCA TTC TGA CGC AAA GGT GCG CTA CAC TTG</td>
			<td></td>
			<td>56</td>
			<td>Uwzględniono 10 bp sekwencję toehold. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R2</td>
			<td>30</td>
			<td>CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>R2 jest komplementarny do L2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Projekt 2</td>
			<td>SA1</td>
			<td>14</td>
			<td>CGT GGC ATA GGA CT</td>
			<td>5' Acrydite</td>
			<td>46.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA2</td>
			<td>14</td>
			<td>GTT TCC CAA TCA GA</td>
			<td>5' Acrydite</td>
			<td>40.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2</td>
			<td>40</td>
			<td>TCT GAT TGG GAA ACA GTC CTA TGC CAC GGT TAC CTT CAT C</td>
			<td></td>
			<td>65.9</td>
			<td>Uwzględniono 12 bp sekwencję toehold. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R2</td>
			<td>40</td>
			<td>GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A</td>
			<td></td>
			<td>65.9</td>
			<td>R2 jest komplementarny do L2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Projekt 3</td>
			<td>SA1</td>
			<td>20</td>
			<td>ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC</td>
			<td>5' Acrydite</td>
			<td>55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA2</td>
			<td>20</td>
			<td>CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA</td>
			<td>5' Acrydite</td>
			<td>56.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2</td>
			<td>40</td>
			<td>TCC AGT CGT CCC TAA GCA TGG ACA TTG CAT ACA CCT CCG T</td>
			<td></td>
			<td>68.8</td>
			<td>Toehold nie został uwzględniony.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kontrola</td>
			<td rowspan="2">Kontrola</td>
			<td rowspan="2">20-40</td>
			<td>AAA AAA (itp.) lub</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTT TTT (itp.)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Sekwencje zasad dla ssDNA 9-11,13,14,18,21. W badaniach komórkowych i mechanicznych wykorzystano kilka różnych projektów wiązań krzyżowych w celu wytworzenia żeli DNA o różnych statycznych i dynamicznych właściwościach mechanicznych. Parametrami modyfikowanymi w projekcie wiązań krzyżowych są sekwencja zasad oraz długość sekwencji lub długość wiązania krzyżowego. Pogrubiona i kursywa czcionka ilustrują odpowiednio parowanie zasad między SA1 a L2 oraz między SA2 a L2.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody align="center">
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td colspan="8">Projekt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">1</td>
			<td colspan="3">2</td>
			<td colspan="2">3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stężenie akryloamidu (%)</td>
			<td colspan="3">10</td>
			<td colspan="3">10</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA1 plus SA2 zhybrydyzowane z L2 (% sieciowania)</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastyczność (kPa, Średnia±SEM)</td>
			<td>6.6 ± 0.6</td>
			<td>17.1 ± 0.8</td>
			<td>29.8 ± 2.5</td>
			<td>5.85± 0.62</td>
			<td>12.67 ± 1.33</td>
			<td>22.88 ± 2.77</td>
			<td>25.2 ± 0.5</td>
			<td>10.4 ± 0.6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Moduł Younga (E) żeli DNA 9-11,13,14,18,21. Stężenie akryloamidu, procent sieciowania oraz długość wiązań sieciujących mogą być modulowane w żelach DNA. Projekty 1, 2 i 3 mają odpowiednio długości wiązań sieciujących 20, 28 i 40 bp. Żele 100% dla wszystkich projektów mają zbliżone moduły, co wskazuje, że długość wiązania sieciującego nie wpływa na elastyczność żelu. Jednakże zmiany stężenia akryloamidu zmieniają elastyczność żelu DNA.

<table><tbody><tr><td>ssDNA</td><td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com</td><td></td><td>Nie wirować ssDNA. Delikatnie odwrócić fiolkę i/lub roztwór pipety do wymieszania.</td></tr><tr><td>PBS z wapniem i magnezem</td><td></td><td></td><td>Dowolna marka.</td></tr><tr><td>100x Bufor Tris-EDTA (bufor TE)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor Tris-Borate-EDTA (Bufor TBE)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>93290</td><td>TBE jest toksyną reprodukcyjną.</td></tr><tr><td>40% roztwór akrylamidu</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>BP14021</td><td>Akrylamid jest toksyną.</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>A3678</td><td>Przygotować 2% roztwór w buforze TE. APS jest toksyną i środkiem drażniącym.</td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>T9281</td><td>Przygotować 20% roztwór w buforze TE. TEMED jest łatwopalny, i toksyczny.</td></tr><tr><td>Okrągłe szkło nakrywkowe o średnicy 12 mm</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Klej optyczny Norland 72</td><td>Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com</td><td>NOA72</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td></td><td></td> do hodowli tkankowej <td>Dowolna marka.</td></tr><tr>Probówki <td></td><td></td><td>do mikrowirówek</td><td>Dowolna marka.</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>ProteoChem lub Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com lub thermofisher.com</td><td>C111 lub 22589</td><td>Przygotować roztwór 0,315 mg/ml w wodzie bezpośrednio przed użyciem. Rozpuścić w temperaturze 37 stopni; C i sterylizować filtr. Normalne jest obserwowanie nierozpuszczonego sulfo-SANPAH w filtrze. Sulfo-SANPAH jest wrażliwy na światło, dlatego roztwór należy chronić przed światłem do momentu ekspozycji na promieniowanie UV.</td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>P6407</td><td>Przygotować roztwór 0,2 mg/ml w wodzie i przefiltrować sterylizować.</td></tr><tr><td>Kolagen typu I</td><td>Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com</td><td>13813</td><td>Przygotować roztwór 0,2 mg/ml w 0,2 N kwasie octowym. Roztwór musi pozostać zimny przez cały czas, aby uniknąć polimeryzacji. Kwas octowy jest substancją łatwopalną, toksyczną i.</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe 22 x 60</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wyporowa</td><td>Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com</td><td>F148504</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Źródło</td><td></td><td></td> światła UV <td>Żele należy umieszczać jak najbliżej światła UV. Światło UV może spowodować obrażenia skóry lub oczu.</td></tr><tr><td>Termometr</td><td></td><td></td><td>dowolnej marki.</td></tr><tr><td>Azot gazowy</td><td>GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/</td> <td>NI 5.0UH-R</td><td></td></tr></tbody></table>

otrzymywanie usieciowanych dna hydrożeli poliakrylamidowych

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiologia to rozwijająca się dziedzina nauki, która zajmuje się kluczową rolą fizycznych wskazówek w kierowaniu morfologią i funkcją komórki. Na przykład wpływ elastyczności tkanek na funkcję komórek jest głównym obszarem badań mechanobiologicznych, ponieważ sztywność tkanek moduluje się wraz z chorobą, rozwojem i urazem. Statyczne materiały naśladujące tkankę lub materiały, które nie mogą zmienić sztywności po platerowaniu komórek, są głównie używane do badania wpływu sztywności tkanki na funkcje komórki. Chociaż informacje uzyskane z badań statycznych są cenne, badania te nie wskazują na dynamiczny charakter mikrośrodowiska komórkowego in vivo. Aby lepiej przyjrzeć się wpływowi sztywności dynamicznej na funkcjonowanie komórek, opracowaliśmy system hydrożelu poliakrylamidowego usieciowanego DNA (żele DNA). W przeciwieństwie do innych dynamicznych substratów, żele DNA mają zdolność zmniejszania lub zwiększania sztywności po wytworzeniu bez bodźców. Żele DNA składają się z wiązań krzyżowych DNA, które są polimeryzowane w szkielet poliakrylamidowy. Dodawanie i usuwanie usieciowań poprzez dostarczanie jednoniciowego DNA umożliwia czasową, przestrzenną i odwracalną kontrolę elastyczności żelu. Wykazaliśmy w poprzednich raportach, że dynamiczna modulacja elastyczności żelu DNA wpływa na zachowanie fibroblastów i neuronów. W tym raporcie i filmie przedstawiamy schemat opisujący mechanizmy sieciowania żelu DNA oraz instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania żeli DNA.

Przed naszymi badaniami oddziaływania między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) obserwowano na statycznych, podatnych biomateriałach lub na nieodwracalnych i jednokierunkowych podłożach dynamicznych. Podłoża te nie odzwierciedlają dokładnie dynamicznego charakteru mikrośrodowiska komórkowego. Nasza praca zmienia istniejące paradygmaty techniczne, dostarczając bardziej fizjologiczny model badania oddziaływań komórka-ECM na dynamicznych biomateriałach ulegających zmiękczaniu i utwardzaniu. W poprzednich badaniach...

Nasze laboratorium opracowało usieciowane DNA hydrożele poliakrylamidowe, dynamiczny system hydrożelowy, aby lepiej zrozumieć wpływ modulacji sztywności tkanek na funkcjonowanie komórek. Tutaj podajemy schematy, opisy i protokoły przygotowania tych hydrożeli.

Otrzymywanie usieciowanych DNA hydrożeli poliakrylamidowych

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie hydrożeli poliakrylamidowych sieciowanych DNA, których sztywność można zwiększać lub zmniejszać poprzez pipetowanie jednoniciowych cząsteczek DNA do pożywki hodowlanej po wysianiu na nich komórek. Osiąga się to najpierw poprzez resuspensję liofilizowanych jednoniciowych DNA: SA one, SA two, L two, R two oraz kontrolnego w buforze, a następnie indywidualną polimeryzację roztworów SA one i SA two w obrębie szkieletu poliakrylamidowego. W drugim kroku polimeryzowane roztwory SA one i SA two miesza się z roztworem L two w celu utworzenia żelu DNA.Następnie roztwór żelu DNA jest immobilizowany na szkiełkach podstawkowych za pomocą kleju optycznego. Ostatnim etapem jest funkcjonalizacja żeli poprzez ich potraktowanie sulfo-SAMPA, a następnie PDL. Ostatecznie komórki są wysiewane na żele DNA, a elastyczność żelu jest modulowana poprzez dodatek R2L2 lub kontrolnego jednoniciowego DNA, aby odpowiednio zmiękczyć, utwardzić lub nie zmieniać elastyczności żelu.Wyniki tych eksperymentów wykazują, że dynamiczny charakter podłoża steruje zachowaniem komórek. Przewagą zastosowania tej techniki nad innymi metodami, takimi jak CRO, lingo czy hydr

preparation-of-dna-crosslinked-polyacrylamide-hydrogels

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie żeli poliakryloamidowych skutych DNA

Prezentujemy protokoły trójwymiarowej (3D) enkapsulacji komórek w syntetycznych hydrożelach. Procedura enkapsulacji została opisana dla dwóch powszechnie stosowanych metod sieciowania (addycji typu Michaela oraz mechanizmów wolnorodnikowych inicjowanych światłem), a także dla szeregu technik oceny zachowania enkapsulowanych komórek.

Enkapsulacja komórkowa w trójwymiarowych hydrożelach w inżynierii tkankowej

Wpływ sztywności podłoża na funkcje komórkowe można modelować in vitro, wykorzystując hydrożele poliakryloamidowe o różnym stopniu podatności.

Badanie wpływu sztywności macierzy na funkcje komórkowe z wykorzystaniem hydrożeli na bazie akrylamidu

W tym filmie prezentujemy techniki eksperymentalne wykorzystywane do wytwarzania elastycznych podłoży powleczonych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), które nadają się do hodowli komórkowej oraz pozwalają na zastosowanie mikroskopii sił trakcyjnych i obserwację wpływu sztywności ECM na zachowanie komórek.

Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Prezentujemy nowy hydrożel poliakrylamidowy, zwany hydroksy-PAAm, który umożliwia bezpośrednie wiązanie białek ECM przy minimalnych kosztach i specjalistycznej wiedzy. Połączenie hydrożeli hydroksy-PAAm z nadrukiem mikrokontaktowym ułatwia niezależną kontrolę wielu sygnałów naturalnego mikrośrodowiska komórkowego w celu badania mechanostransdukcji komórkowej.

Przygotowanie hydrożeli hydroksy-PAAm do rozprzęgania efektów sygnałów mechanotransdukcji

Mechaniczna sztywność w mikrośrodowisku guza odgrywa kluczową rolę w napędzaniu złośliwych zachowań poprzez zwiększanie aktywności inwadopodii i kurczliwości aktomiozyny. Za pomocą żeli poliakrylamidowych (PAA), testy inwadopodiów i siły trakcyjnej można wykorzystać do badania właściwości inwazyjnych i kurczliwych komórek rakowych w odpowiedzi na sztywność matrycy.

Żele poliakryloamidowe do oznaczania inwadopodiów i siły trakcyjnej na komórkach nowotworowych

Tutaj opisana jest metoda, która umożliwia szybkie, efektywne i niedrogie przygotowanie żeli poliakrylamidowych w formacie wielodołkowej płytki. Metoda nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być z łatwością zaadoptowana przez każde laboratorium badawcze. Byłoby to szczególnie przydatne w badaniach skoncentrowanych na zrozumieniu odpowiedzi komórek zależnych od sztywności.

Prosty test sztywności wielodołkowej na bazie poliakrylamidu do badania odpowiedzi komórek zależnych od sztywności

Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.

Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

Ten protokół opisuje charakterystykę syntezy modyfikowanego DNA przez polimerazę DNA poprzez obserwację zmian w DNA znakowanym fluorescencyjnie w bliskiej podczerwieni za pomocą elektroforezy żelowej i obrazowania żelowego. Żele akrylamidowe są używane do obrazowania w wysokiej rozdzielczości separacji krótkich kwasów nukleinowych, które migrują z różną szybkością w zależności od wielkości.

Test aktywności polimerazy DNA przy użyciu znakowanego fluorescencyjnie DNA w bliskiej podczerwieni wizualizowanego za pomocą elektroforezy w żelu akrylowym

Tradycyjnie w pionie kawałek i cały montażu przygotowanie siatkówce były używane w badaniach funkcji siatkówki obwodów. Poniżej opiszemy powieści krojenia metody zachowania dendrytycznych morfologii neuronów siatkówki nienaruszone.

Poziome Przygotowanie Kromka Retina

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania kultur neuronalnych z kory mózgu myszy w późnym stadium embrionalnym i wczesnym okresie postnatalnym. Kultury te mogą być wykorzystywane do immunocytochemii, biochemii, elektrofizjologii, obrazowania wapnia i sodu, a także stanowią platformę do badania rozwoju neuronalnego zwierząt transgenicznych posiadających postnatalnie letalną mutację genu.

Przygotowanie dysocjowanych kultur neuronów korowych myszy

Poznaj metodę otrzymywania usieciowanych DNA hydrożeli poliakrylamidowych do badania wpływu sztywności podłoża na funkcje komórkowe. Technika umożliwia dynamiczną modulację elastyczności bez stosowania promieniowania UV.

Otrzymywanie usieciowanych DNA hydrożeli poliakrylamidowych

Przeglądaj więcej filmów