Test adhezji przepływowej do badania rekrutacji leukocytów do ludzkiego śródbłonka sinusoidalnego wątroby w warunkach naprężeń ścinających

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie mechanizmów rekrutacji leukocytów przez komórki śródbłonka ludzkiej wątroby w obecności fizjologicznych poziomów czystego stresu. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw zlewającej się monowarstwy ludzkich sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby w mikroszkiełku, które jest następnie stymulowane cytokinami zapalnymi. Drugim krokiem jest wyizolowanie limfocytów z krwi obwodowej.

Następnie mikroszkiełko jest podłączane do systemu do oznaczania przepływu i perfundowane za pomocą limfocytów w obecności fizjologicznie istotnego zwykłego stresu. Ostatnim krokiem jest wizualizacja oddziaływań limfocytów w warunkach przepływu za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym. Ostatecznie analiza offline obrazów kontrastu fazowego uzyskanych podczas testu przepływu służy do porównania wpływu różnych inhibitorów na rekrutację limfocytów w komórkach śródbłonka wątroby.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hepatologii, takie jak to, które kombinacje białka adhezyjnego i receptora chemokiny są ważne dla rekrutacji różnych populacji komórek odpornościowych w śródbłonku sinusoidalnym i do miąższu wątroby. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię przewlekłych chorób zapalnych wątroby, z których większość jest napędzana przez rekrutację limfocytów do tkanki wątroby. Zrozumienie mechanizmów molekularnych może doprowadzić do opracowania nowych terapii przeciwzapalnych.

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w rekrutację komórek zapalnych do ludzkiej wątroby. Może być również stosowany do innych typów komórek, takich jak komórki śródbłonka, izolowane z żyły pępowinowej lub innych łożysk naczyniowych. Na początek przygotuj roztwór roboczy 200 mikrogramów na mililitr kolagenu z ogona szczura, wpisz jeden, rozcieńczając go z roztworu podstawowego do sterylnego PBS.

Następnie wstrzyknij 30 mikrolitrów rozcieńczonego kolagenu do każdego kanału sześciokanałowego mikroszkiełka i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj kompletną pożywkę, uzupełniając ludzkie śródbłonkowe podłoża podstawowe L-glutaminą, penicyliną i streptomycyną inaktywowaną termicznie ab, ludzkim czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego surowicy i czynnikiem wzrostu hepatocytów. Następnie, używając trypsyny EDTA, zbierz hodowane ludzkie sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby z kolby zlewającej się T 75, osadź komórki w PBS, a następnie ponownie zawiesij je w trzykrotności 10 szóstych komórek na mililitr w pełnym pożywce.

Następnie umyj mikroszkiełko trzykrotnie PBS, a następnie dodaj 30 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego kanału mikroszkiełka pokrytego kolagenem. Pozostaw komórki do przylegania na godzinę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% CO2. Po przyleganiu komórek napełnij porty po obu stronach każdego kanału kompletnym podłożem i umieść je z powrotem w inkubatorze na 24 godziny.

Po 24 godzinach użyj mikroskopu kontrastowego z odwróconymi fazami, aby ocenić, czy wzrost komórek osiągnął 80% płynności CO. Następnie przygotuj cytokiny do stymulacji komórek, dodając 10 nanogramów na mililitr TNF alfa i 10 nanogramów na mililitr interferonu gamma do jednego mililitra kompletnej pożywki. Następnie 24 godziny przed wykonaniem testu adhezyjnego zastąp pożywkę wzrostu komórek 0,1 mililitra pożywki uzupełnionej cytokinami w celu stymulacji komórek, oczyszczenia frakcji jednojądrowej z krwi pełnej przez wirowanie w gradiacji gęstości nad odpowiednią separacją komórek, odwirowanie pożywki, takiej jak światło limficzne, przez 25 minut przy 800-krotności grawitacji.

Następnie przenieś frakcję jednojądrzastą do nowej probówki i uzupełnij ją PBS zawierającym 0,1% objętości na objętość, BSA odwirowuje probówkę przez 10 minut przy 125-krotności grawitacji, aby zubożyć roztwór płytek krwi. Następnie przemyj osad PBS zawierającym 0,1% objętości na objętość BSA, a następnie odwiruj przez 10 minut przy 800-krotności grawitacji. Resus zawiesić osad w 10 mililitrach RPMI zawierających 0,1% objętości na objętość, BSA umieścić komórki w kolbie T 75 poddanej hodowli tkankowej i inkubować przez jedną godzinę, aby umożliwić przyleganie monocytów do frakcji.

Następnie ostrożnie usuń supernatant wzbogacony w limfocyty i osadzaj komórki pod ciśnieniem 800-krotności grawitacji przez 10 minut. Następnie wstępnie potraktuj wyizolowane limfocyty za pomocą resus, zawieszając je w roztworze RPMI zawierającym 0,1% objętości na objętość BSA i 200 nanogramów na mililitr przeciwciał blokujących funkcję specyficznych dla toksyny krztuścowej lub małocząsteczkowych inhibitorów receptorów chemokin. Inkubować limfocyty w roztworze inhibitora przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie osadzać komórki i myć je w PBS z 0,1% objętości na objętość BSA.

Następnie ponownie zagnieździć komórki, a następnie ponownie zawiesić je w podłożu przepływowym w stężeniu od jednego razy 10 do szóstego ogniwa na mililitr. Podgrzej termostatycznie sterowaną przezroczystą komorę środowiskową do 37 stopni Celsjusza. W komorze powinny znajdować się porty do wprowadzenia silikonowej rurki oraz elektroniczne zasilanie elektrozaworu.

Napełnij szklaną strzykawkę o pojemności 50 mililitrów z blokadą przynęty 10 mililitrami sterylnej wody destylowanej. Następnie przymocuj silikonową rurkę o długości 25 centymetrów do portu strzykawki i włóż strzykawkę do pompy strzykawkowej. Dostosuj szybkość poboru pompy zgodnie z instrukcjami producenta mikroszkiełka, aby utrzymać czyste naprężenie na poziomie 0.05 paskali lub 0.5 dinów na centymetr kwadratowy.

Wyrzuć tłoki z dwóch pięciomililitrowych strzykawek i przymocuj lufy do dwóch portów dopływowych elektronicznego zaworu elektromagnetycznego za pomocą jednego centymetra silikonowej rurki. Następnie przymocuj 12 centymetrów silikonowej rurki do zaworu odpływowego. Włóż bezkomórkowy bufor płuczący do obu zaworów strzykawkowych i przepłucz elektroniczny zawór elektromagnetyczny.

Upewnij się, że bufor przepływa z jednej beczki przez zawór i do silikonowej rurki odpływowej. Następnie przekręć przełącznik zaworu na drugą beczkę i upewnij się, że bufor nadal płynie. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza z systemu.

Następnie zastąp bufor do płukania w jednej z beczek zawiesiną limfocytów zawierającą od jednego razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Podłącz silikonową rurkę z pompy strzykawkowej do jednego portu wybranego kanału mikrosuwaka za pomocą adaptera micros. Następnie podłącz rurkę silikonową z zaworu odpływowego do przeciwległego portu na tym samym kanale mikrosuwakowym, również za pomocą adaptera mikrosuwakowego.

Następnie zabezpiecz mikroszkiełko na stoliku mikroskopu klipsami lub taśmą, aby zapobiec przemieszczaniu się. Ustaw mikroskop na obiektyw 10x z odpowiednim ustawieniem fazy przed rozpoczęciem perfuzji. Upewnij się, że kamera jest prawidłowo podłączona do mikroskopu i gotowa do przekazywania obrazów do monitora w celu nagrywania.

Upewnij się, że monowarstwa śródbłonka jest wyostrzona za pomocą pompy strzykawkowej, przetapiać warstwę śródbłonka za pomocą bezkomórkowego buforu do płukania przez dwie minuty, rozpoczynając wyjmowanie pompy strzykawkowej w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń lub niezwiązanego przeciwciała blokującego. Następnie przełącz zawór, aby umożliwić pięciominutowy bolus roztworu limfocytów o stałej ściance. Czysty stres 0,05 paskali podczas ostatnich dwóch minut bolusa limfocytów.

Nagraj 10 losowych pól wzdłuż długości mikroszkiełka przez 10 sekund. Każdy ruch pomiędzy nagraniami powinien być wykonywany w kierunku przeciwnym do kierunku przepływu. Aby uniknąć dwukrotnego rejestrowania tej samej toczącej się komórki, po bolusie limfocytów przywróć zawór do pozycji początkowej, a następnie nałóż pięciominutowy bolus bezkomórkowego buforu do płukania.

Nagraj drugi przebieg składający się z 10 losowo wybranych pól przez pięć sekund każde. W ciągu ostatnich dwóch minut tego bolusa ruch toczenia limfocytów można łatwo zobrazować za pomocą tej techniki oznaczania przepływu. Toczące się komórki są identyfikowane na podstawie zmniejszonej prędkości na powierzchni śródbłonka w porównaniu z komórkami płynącymi.

W tym teście przepływu. Mniej niż 10% przylegających limfocytów trwale przewracało się po stymulowanych komórkach śródbłonka, co potwierdza, że test przepływu odzwierciedla środowisko sinusoid wątrobowych. Zapis z bolusa buforu płuczącego służy do oceny całkowitego przylegania limfocytów.

Komórki ściśle przylegające są definiowane jako komórki, które są nieruchome lub zmieniają kształt z powolnym pełzaniem. Pokazano tutaj reprezentatywne pola ze szkiełka kontrolnego i szkiełka wstępnie potraktowanego cząsteczką adhezyjną międzykomórkową, jednym przeciwciałem blokującym. Stopień przylegania limfocytów w każdym stanie jest wyrażony jako przylegające komórki na milimetr kwadratowy na milion perfundowanych komórek.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak dokładna przyczyna migracji śródbłonka trans lub zmiany cytoszkieletu, które zachodzą podczas rekrutacji pod wpływem stresu po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom badającym stan zapalny w wątrobie lub innych narządach w celu zbadania, w jaki sposób specyficzne dla narządów populacje komórek śródbłonka regulują proces rekrutacji leukocytów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić rekrutację limfocytów w ludzkich komórkach śródbłonka wątroby i zliczyć komórki odpornościowe na różnych etapach kaskady adhezji.