Name: Obrazowanie deformacji błony plazmatycznej za pomocą pTIRFM (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T16:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Poznaj technikę pTIRFM do obrazowania dynamiki błon komórkowych podczas egzocytozy w czasie rzeczywistym. Metoda umożliwia bezpośrednią obserwację zmian krzywizny membrany i remodelowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Te badania są wspierane przez National Scientist Development Grant (13SDG14420049) dla AA od American Heart Association oraz fundusze startowe z Wayne State University. Jesteśmy wdzięczni dr Ronaldowi W. Holzowi i dr Mary Bittner za udzielenie porad dotyczących preparatów nadnerczy bydlęcych oraz dr Danielowi Axelrodowi za pomoc w konfiguracji pTIRFM i pomocne komentarze do manuskryptu. Syt-1 pHluorin został użyty za zgodą Dr. Gero Miesenbock (University of Oxford). GCAMP5G uzyskano za pomocą Addgene. Dziękujemy Jamesowi T. Taylorowi, Tejeshwarowi Rao, Rachel L. Aikman i Praneeth Katrapti za pomoc w optymalizacji różnych etapów opisanych procedur.

1. Ustawienia systemu PTIRF
Technika pTIRFM zbudowana jest na platformie odwróconego mikroskopu. Wiązki laserowe są kierowane przez boczny port oświetleniowy i niepolaryzacyjną boczną kostkę filtrującą, a następnie skupiane są na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu 60X 1,49 NA TIRF. Dwie dodatkowe soczewki (1,6X i 2X) w ścieżce emisji między mikroskopem a kamerą EMCCD dają końcowy rozmiar piksela około 80 nm. Wiązki laserowe są kierowane za pomocą sterowanych programowo luster galwanometrycznych do szybkiego przełączania między oświetleniem epi- i całkowitym odbiciem wewnętrznym (TIR). Opisany poniżej protokół zakłada, że optyka TIRF jest już umieszczona na stole powietrznym w optymalnych pozycjach do wzbudzenia fluoroforu i obrazowania. Opisano w nim, w jaki sposób optyka polaryzacyjna jest dodawana do istniejącego zestawu mikroskopu TIRF, aby umożliwić obrazowanie deformacji błony komórkowej. Schemat konfiguracji optycznej naszego laboratorium do generowania zarówno TIR, jak i TIR opartego na polaryzacji pokazano na rysunku 1A. Protokół zakłada użycie lasera o długości fali 488 nm do wzbudzania fluorescencyjnych białek pęcherzykowych oraz lasera o długości fali 561 nm do obrazowania barwnika karbocyjaninowego, diD.
<ol>
	<li>Włącz wszystkie elementy mikroskopu, lasery i komputery.</li>
	<li>Skieruj wiązkę z lasera o długości fali 488 nm na tylną płaszczyznę ogniskowej (BFP) soczewki 1.49 NA, jak pokazano na rysunku 1A. Jeśli wiązka laserowa zostanie skupiona na BFP, wyjdzie skolimowana i pojawi się jako mały, dobrze zdefiniowany punkt na suficie bezpośrednio nad obiektywem.</li>
	<li>Wyreguluj lustro galwanometru X (lustro znajdujące się w równoważnej płaszczyźnie próbki) tak, aby wiązka lasera była przesuwana poza oś i wychodziła z obiektywu pod coraz bardziej stromymi kątami do normalnej obiektywu.</li>
	<li>Następnie sprawdź, czy TIR został osiągnięty. Dodać 10 μl fluorescencyjnych mikrosfer do 1 ml objętości PSS w naczyniu ze szklanym dnem. Powinna być wykrywana tylko fluorescencja z mikrosfer znajdujących się na dnie naczynia, najbliżej granicy faz TIR. Wykrywanie unoszących się mikrosfer wskazuje, że kąt między padającym światłem a normalną obiektywu jest niewystarczający. 
	 
	Poniższa sekcja opisuje konfigurację komponentów optycznych niezbędnych do obrazowania opartego na polaryzacji.</li>
	<li>Używając wyrównanej wiązki 488 nm jako przewodnika, dostosuj położenie surowej wiązki laserowej 561 nm tak, aby poruszała się po identycznej ścieżce optycznej. Laser o długości fali 561 nm będzie wykorzystywany do obrazowania barwnika karbocyjaninowego, diD.</li>
	<li>Włóż soczewkę rozbieżną i lustra za laserem 561 nm. Za pomocą luster wyreguluj wiązkę tak, aby była wyrównana z wiązką 488 nm, a punkt był ostry na suficie, gdy lustra galwanometru znajdują się w pozycji "0".</li>
	<li>Wyśrodkuj płytkę ćwierćfalową (QW) na ścieżce wiązki bezpośrednio za aperturą lasera. Użyj QW, który jest achromatyczny lub dostrojony do długości fali wzbudzenia. QW spolaryzuje kołowo każde spolaryzowane liniowo światło, które wpada pod kątem 45° z osią optyczną. Niektóre elementy optyczne, takie jak kostki polaryzacyjne, mają odchylenie tłumienia w kierunku jednej osi polaryzacji. QW można obrócić, aby skompensować to odchylenie. Ta regulacja spowoduje powstanie wiązki spolaryzowanej eliptycznie. QW jest konieczne, ponieważ sama wiązka laserowa jest wysoce spolaryzowana liniowo (pionowo), gdy wyłania się z apertury.</li>
	<li>Umieść kostkę polaryzacyjną (PC1) za wiązką spolaryzowaną eliptycznie. Kostka polaryzacyjna odbija składową pionową (y) pola elektrycznego i przechodzi przez składową poziomą (x). Kostkę polaryzacyjną umieszcza się na małym stoliku translacyjnym, aby ułatwić późniejsze wyrównanie ścieżek wiązki polaryzacyjnej.</li>
	<li>Użyj drugiego sześcianu polaryzacyjnego (PC2) i luster (Rysunek 1A), aby ponownie połączyć wiązki.</li>
	<li>Umieść przesłonę między pierwszą kostką polaryzacyjną (PC1) a lustrem składowym pionowym. Umieść drugą przesłonę między zwierciadłem składowym poziomym a drugą kostką polaryzacyjną (PC2). Migawki te są sterowane przez oprogramowanie do obrazowania, które umożliwia użytkownikowi szybki wybór między polaryzacjami wiązki.</li>
	<li>Użyj filtra polaryzacyjnego, aby sprawdzić orientację pola elektrycznego w każdej ścieżce wiązki. Filtr polaryzacyjny pozwoli na transmisję tylko w linii z osią filtra.</li>
	<li>Sprawdź, czy pionowe i poziome składowe wiązki laserowej są wyrównane ze sobą i wiązką 488 nm. W razie potrzeby wprowadź poprawki. Wszystkie trzy wiązki powinny być skupione na BFP i wyłaniać się skolimowane od celu do tego samego miejsca na suficie. To miejsce można oznaczyć znakiem X, aby ułatwić przyszłe wyrównanie.</li>
	<li>Umieść kroplę olejku immersyjnego na obiektywie. Umieść naczynie zawierające mikrosfery fluorescencyjne (patrz krok 4 powyżej) na obiektywie.</li>
	<li>Wejdź do TIR, przesuwając lusterko galwanometru X. W TIR składową pionową belki jest teraz s-pol, a składową poziomą belki jest teraz p-pol. Dostosuj względną intensywność między belkami, obracając płytę QW. Wyświetl każde spolaryzowane ulotne pole z próbką rodaminy, która według prognoz jest zorientowana losowo. Obróć płytkę QW, aby dopasować ją do średniej intensywności pikseli. W razie potrzeby dodaj filtr o neutralnej gęstości w jednej spolaryzowanej ścieżce wiązki, aby złagodzić jego intensywność.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek chromafinowych
Procedura izolowania zdrowych komórek chromochłonnych z nadnerczy cielęcia jest podana poniżej. Jest on adaptacją wcześniej opublikowanych protokołów przez Wicka, Sentera i wsp. 19 oraz O'Connor, Mahata i wsp. 20 Po izolacji komórki są elektroporowane plazmidem (plazmidami) będącym przedmiotem zainteresowania przy użyciu systemu elektroporacji. W wyniku tego układu 20-30% komórek wykazuje ekspresję pożądanych białek fluorescencyjnych. Zazwyczaj 70% ogniw przeżywa proces elektroporacji. Szczegółowe informacje na temat komponentów PSS i nośników znajdują się w tabelach 2, 3 i 4.
<ol>
	<li>Dwa dni przed przygotowaniem komórek potraktuj naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm (0,17 mm grubości) 1 ml poli-D-lizyny (0,1 mg / ml), a następnie 1,25 ml kolagenu bydlęcego. Pozostaw naczynia do wyschnięcia na powietrzu w kapturze do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Pozyskać nadnercza bydlęce z rzeźni. Utrzymuj gruczoły na lodzie podczas transportu z powrotem do laboratorium. Nadnercza bydła mogą być pokryte grubą warstwą tłuszczu. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby usunąć nadmiar tłuszczu i odsłonić otwór żyły nadnerczy. Kilkakrotnie wykonuj perfuzję żyły za pomocą prep-PSS, aż gruczoł zostanie oczyszczony z krwi.</li>
	<li>Następnie powoli odpipetuj pipetą 2 ml roztworu TH-PSS do otworu żylnego, aż gruczoł stanie się puchnięty. Inkubować napompowane gruczoły w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Powtórzyć zabieg TH-PSS i ponownie inkubować.</li>
	<li>Przetnij nożyczkami zewnętrzną korę nadnerczy wokół krawędzi gruczołu i oderwij gruczoł, aby odsłonić rdzeń. Użyj skalpela, aby delikatnie zeskrobać i oddzielić rdzeń od tkanki korowej.</li>
	<li>Miel rdzeń za pomocą ostrzy skalpela przez 5-10 minut.</li>
	<li>Ostatni etap trawienia jest niezbędny do wyizolowania poszczególnych komórek chromochłonnych. Wlać zawiesinę z komórek mielonych do kolby wirowej. Częściowo napełnić kolbę w stosunku 2:1 TH-PSS (30 ml) do TL-PSS (15 ml) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, wirując z prędkością około 100 obr./min.</li>
	<li>Oddziel poszczególne komórki chromochłonne od niestrawionej tkanki, filtrując przez siatkę 400 μm. Zebrać filtrat. Odwirować przy 200 x g, aby zagnieździć komórki, a następnie ponownie zawiesić w lodowatym PSS.</li>
	<li>Przefiltruj ogniwa przez siatkę 250 μm, osad i na koniec ponownie zawieś w buforze elektroporacyjnym (patrz krok 2.9).</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj się do transfekcji.</li>
	<li>Ogniwa transfekcyjne z systemem elektroporacji zgodnie z zaleceniami producenta. Dokładne warunki elektroporacji muszą być określone empirycznie. Uwaga: Ustawienia, które zapewniają najlepszą równowagę między wydajnością transfekcji a wskaźnikiem przeżycia komórek dla tego preparatu bydlęcych komórek chromochłonnych, to 1,100 V, 40 ms i 1 impuls. Szacujemy, że w tych warunkach 20-30% komórek ulega transfekcji. Około 30% ogniw nie przeżywa procesu elektroporacji.</li>
	<li>Delikatnie ułóż komórki na naczyniach poddanych działaniu poli-D-lizyny i kolagenu w 1 ml podgrzanego podłoża elektroporacyjnego.</li>
	<li>Umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 °C (5% CO2 ). Dodaj 1 ml 2x pożywki antybiotykowej do każdego naczynia po 6 godzinach. Następnego dnia zmień nośnik na normalny.</li>
	<li>Ogniwa chromochłonne są zwykle obrazowane 2-5 dni po elektroporacji.</li>
</ol>
3. Akwizycja obrazu pTIRF
<ol>
	<li>Włącz system obrazowania i uruchom oprogramowanie do akwizycji.</li>
	<li>Sprawdź, czy lasery są wyrównane. Sprawdź profil pola ulotnego za pomocą mikrosfer.</li>
	<li>Przygotuj globalny i lokalny system perfuzji. Oczyść zbiorniki roztworu przefiltrowanym dejonizowanymH2Oi napełnij podstawowymi i stymulującymi roztworami PSS.</li>
	<li>Przed obrazowaniem komórek chromochłonnych sprawdź, czy wzbudzenia p-pol i s-pol oświetlają ten sam obszar pola widzenia i czy intensywności oświetlenia są w przybliżeniu równoważne. Aby to zrobić, napełnij naczynie ze szklanym dnem 2 ml PSS zawierającego rodaminę o końcowym stężeniu 10 mM. Sekwencyjnie wzbudzić próbkę rodaminy światłem p-pol i s-pol i uchwycić obrazy. W praktyce emisje P i S z diD są znormalizowane do średniej emisji rodaminy P i S. Więcej informacji można znaleźć w sekcjach Analiza obrazu i Dyskusja.</li>
	<li>Teraz przystąp do barwienia bydlęcych komórek chromochłonnych za pomocą diD. Wypłukać pożywkę hodowlaną z naczynia zawierającego komórki chromochłonne i zastąpić 2 ml basel-PSS. Dodać 10 μl 10 mM diD (rozcieńczonego w etanolu) bezpośrednio do naczynia zawierającego komórki. Delikatnie mieszaj naczynie przez 2-10 sekund i usuń roztwór diD + PSS.</li>
	<li>Umyj naczynie 3-4 razy za pomocą basal-PSS, aby usunąć wszelkie pozostałości diD. Komórki są teraz wybarwione i gotowe do użycia.</li>
	<li>Dodaj kroplę olejku immersyjnego do obiektywu. Umieść naczynie zawierające komórki chromochłonne barwione diD na wierzchu obiektywu.</li>
	<li>Oglądając naczynie przez obiektyw lub na kamerze, znajdź komórkę, która jest transfekowana interesującym białkiem i wybarwiona diD. Dobrze wybarwiona komórka wykazuje emisję P, która wyraźnie podkreśla krawędzie komórki; emisja S powinna być w przybliżeniu jednolita w całym śladzie ogniwa (tj. w obszarze ogniwa, który jest przyklejony do szkła i zobrazowany w TIRF).</li>
	<li>Umieść igłę do perfuzji miejscowej tak, aby znajdowała się w odległości około 100 μm od komórki.</li>
	<li>Skoncentruj się na błonie komórkowej i aktywuj sprzęt autofokusa bezpośrednio przed stymulacją komórki/akwizycją obrazu.</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję obrazu. Perfuzjować komórki przez 10 sekund roztworem podstawowym, a następnie przez 60 sekund depolaryzującym roztworem KCl o stężeniu 56 mM. Rejestruj obrazy podczas szybkiego zamykania migawki między 561 nm p-pol, 561 nm s-pol (w celu monitorowania zmian emisji P i S diD) a wzbudzeniem 488 nm (w celu zobrazowania transfekowanej sondy pęcherzykowej). Przykłady obrazów uzyskanych podczas eksperymentów pokazano na rys. 2 i ryc. 3.</li>
</ol>
4. Analiza obrazu
Obliczenia do przetwarzania obrazów mogą być wykonywane za pomocą ImageJ, ale użycie skryptów w elastycznym języku programowania, takim jak IDL lub Matlab, może znacznie zwiększyć wydajność analizy poprzez automatyzację zadania. Aby uzyskać informacje topologiczne z surowych obrazów emisji, należy obliczyć dwa typy obrazów - P/S i P+2S. P/S informuje o lokalnych deformacjach membrany, podczas gdy suma P+2S informuje o całkowitym barwniku membranowym w danym regionie pola.
<ol>
	<li>Wszystkie obrazy powinny być odjęte tło. Wybierz ROI poza komórką, zmierz średnią intensywność pikseli w ROI, a następnie odejmij tę wartość od wszystkich pikseli w stosie obrazów.</li>
	<li>Aby obliczyć współczynnik P/S, podziel każdą ramkę emisji "P" przez kolejną ramkę emisji "S" (piksel-piksel). P/S zmienia się wraz ze względną intensywnością wzbudzeń p- i s-pol, odchyleniami w układzie optycznym i prążkami interferencyjnymi. Aby zmniejszyć te efekty, należy znormalizować współczynniki P/S z uzyskanych z emisji diD do stosunku uzyskanego roztworem zawierającym 10 mM rodaminy18.</li>
	<li>Egzocytoza poszczególnych DCV jest widoczna w wyniku nagłej zmiany intensywności białka pęcherzyka fluorescencyjnego, takiego jak pHluorin Synaptotagmin-1 (Figura 2B). Określ zmiany w P/S i P+2S, uśredniając piksele w promieniu 240 nm ROI wyśrodkowane nad zlokalizowanymi wzrostami stosunku P/S w miejscach egzocytozy. Gdy fuzja zachodzi bez widocznego wzrostu P/S, ROI jest wyśrodkowany w regionie fuzji DCV.</li>
	<li>Symulacje komputerowe mogą być wykonywane w celu interpretacji zmian intensywności membrany P/S i P+2S pod względem prostych geometrii rozszerzających się porów fuzyjnych. Szczegółowe informacje na temat symulacji można znaleźć w Anantharam et al. Rozdział 18</li>
</ol>

<ol><li>Chernomordik, L. V., Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. Membranes of the world unite! Cell Biol. 175, 201-207 (2006).</li>
<li>Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+does+synaptotagmin+trigger+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">How does synaptotagmin trigger neurotransmitter release.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 615-641 (2008).</li>
<li>Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+and+its+role+in+membrane+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamin and its role in membrane fission.</a> Annu. Cell Dev. Biol. 16, 483-519 (2000).</li>
<li>Lang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-triggered+peptide+secretion+in+single+cells+imaged+with+green+fluorescent+protein+and+evanescent-wave+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ca2+-triggered peptide secretion in single cells imaged with green fluorescent protein and evanescent-wave microscopy.</a> Neuron. 18 (6), 857-863 (1997).</li>
<li>Steyer, J. A., Horstman, H., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport%2C+docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> Nature. 388, 474-478 (1997).</li>
<li>Allersma, M. W., Wang, L., Axelrod, D., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+regulated+exocytosis+with+a+granule-membrane+probe+using+total+internal+reflection+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of regulated exocytosis with a granule-membrane probe using total internal reflection microscopy.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 4658-4668 (2004).</li>
<li>Toomre, D., Steyer, J. A., Keller, P., Almers, W., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+constitutive+membrane+traffic+with+the+cell+surface+observed+by+evanescent+wave+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fusion of constitutive membrane traffic with the cell surface observed by evanescent wave microscopy.</a> J. Cell Biol. 149, 33-40 (2000).</li>
<li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li>
<li>Heinemann, C., Chow, R. H., Neher, E., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+secretory+response+in+bovine+chromaffin+cells+following+flash+photolysis+of+caged+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the secretory response in bovine chromaffin cells following flash photolysis of caged Ca2.</a> Biophys. J. 67, 2546-2557 (1994).</li>
<li>Heidelberger, R., Heinemann, C., Neher, E., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dependence+of+the+rate+of+exocytosis+in+a+synaptic+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium dependence of the rate of exocytosis in a synaptic terminal.</a> Nature. 371 (6497), 513-515 (1994).</li>
<li>Chow, R. H., Klingauf, J., Heinemann, C., Zucker, R. S., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+determining+the+time+course+of+secretion+in+neuroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mechanisms determining the time course of secretion in neuroendocrine cells.</a> Neuron. 16, 369-376 (1996).</li>
<li>Thompson, N. L., McConnell, H. M., Burhardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+in+supported+phospholipid+monolayers+detected+by+the+dichroism+of+fluorescence+excited+with+polarized+evanescent+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Order in supported phospholipid monolayers detected by the dichroism of fluorescence excited with polarized evanescent illumination.</a> Biophys. J. 46, 739-747 (1984).</li>
<li>Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+orientation+visualized+by+polarized+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence.</a> Biophys. J. 77, 2266-2283 (1999).</li>
<li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Feldman, M. E., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+membrane+marker+leaves+synaptic+vesicles+in+milliseconds+after+exocytosis+in+retinal+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A membrane marker leaves synaptic vesicles in milliseconds after exocytosis in retinal bipolar cells.</a> Neuron. 35, 1085-1097 (2002).</li>
<li>Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+plasma+membrane+deformations+reveals+pre-fusion+membrane+curvature+changes+and+a+role+for+dynamin+in+the+regulation+of+fusion+pore+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of plasma membrane deformations reveals pre-fusion membrane curvature changes and a role for dynamin in the regulation of fusion pore expansion.</a> J. Neurochem. , 10-1111 (2012).</li>
<li>Anantharam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+role+for+the+dynamin+GTPase+in+the+regulation+of+fusion+pore+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A new role for the dynamin GTPase in the regulation of fusion pore expansion.</a> Mol. Biol. Cell. 22, 1907-1918 (2011).</li>
<li>Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+TIRFM+reveals+changes+in+plasma+membrane+topology+before+and+during+granule+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Polarized TIRFM reveals changes in plasma membrane topology before and during granule fusion.</a> Cell Mol. Neurobiol. 30, 1343-1349 (2010).</li>
<li>Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+topological+changes+of+the+plasma+membrane+upon+exocytosis+visualized+by+polarized+TIRFM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell%22%5BJournal%5D)">Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM.</a> J. Cell. 188, 415-428 (2010).</li>
<li>Wick, P. W., Senter, R. A., Parsels, L. A., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+studies+of+secretion+in+bovine+chromaffin+cells+and+PC12+cells%3A+generation+of+kainate-sensitive+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transient transfection studies of secretion in bovine chromaffin cells and PC12 cells: generation of kainate-sensitive chromaffin cells.</a> J. Biol. Chem. 268, 10983-10989 (1993).</li>
<li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nat. Protoc. 2, 1248-1253 (2007).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca2%2B+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca2+ composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Oparty na polaryzacji TIRFM wykrywa szybkie, submikroskopijne zmiany w topologii membrany. Wdrożenie tej techniki jest stosunkowo proste, zwłaszcza jeśli optyka TIRF jest już na miejscu. Wystarczy płyta ćwierćfalowa, dwie kostki polaryzacyjne oraz przesłony do wydzielenia torów świetlnych p-pol i s-pol. Dokładne położenie tych komponentów na stole jest zwykle podyktowane dostępną przestrzenią.
W celu uzyskania informacji topologicznych membrany, zastosowana sonda fluorescencyjna powinna interkalować ze stałą lub znaną orientacją. Technika, opisana w tym artykule, zakłada użycie barwników karbocyjaninowych, ale można również stosować inne barwniki, takie jak FM1-4314. Sama procedura barwienia membrany jest prosta. Hodowane komórki wymagają jedynie bardzo krótkiej ekspozycji (mniej niż 10 sekund) na niewielką ilość diI/diD, aby uzyskać bujne znakowanie błony. Dodanie nadmiaru barwnika prowadzi do rozpraszania światła na szkle, co pogarsza jakość obrazu. Nadmierna inkubacja komórek z barwnikiem prowadzi do internalizacji barwnika, co ma szkodliwy wpływ na jakość obrazu i prawdopodobnie żywotność komórek. Jeśli komórka jest dobrze zabarwiona, na obrazach emisyjnych P i S będzie wyraźne rozróżnienie. Jak pokazano na rysunku 2A, emisja P będzie wyraźnie podkreślać obszary błony, które są ukośne szkiełkiem nakrywkowym (tj. krawędzie śladu komórki), podczas gdy intensywność emisji S będzie w przybliżeniu jednolita na powierzchni komórki. Jeśli wyraźne rozróżnienie między P i S nie jest widoczne, możliwe, że komórka jest słabo przylegająca do substratu lub błona komórkowa nie jest zdrowa i komórka nie jest używana do eksperymentów.
Nasze poprzednie badania opisujące pTIRFM wykorzystywały diI jako fluorescencyjną sondę membranową. W tym przypadku używamy diD, ponieważ nadaje się do eksperymentów obrazowania dwukolorowego, w których wykorzystuje się GFP / pHluorin jako drugi fluorofor. Wzbudzamy diD laserem o długości fali 561 nm, a nie laserem o długości fali 640 nm (który jest bliższy szczytowi wzbudzenia), ponieważ fluorofor blednie szybciej przy długości fali 640 nm. Pomimo tego, że laser o długości fali 561 nm znajduje się na końcu opublikowanego przez diD widma wzbudzenia, fluorescencja jest skutecznie emitowana. Kolejną zaletą lasera 561 nm jest to, że wzbudza on zarówno diI, jak i diD, co pozwala nam na użycie tej samej konfiguracji polaryzacji dla obu sond. Należy pamiętać, że orientacja fluoroforu w membranie będzie miała wpływ na interpretację topologii membrany. Na przykład, jeśli fluorofor byłby zorientowany tak, aby jego dipole przejściowe były prostopadłe do płaszczyzny błony (a nie równolegle lub prawie równolegle, jak ma to miejsce w przypadku diI lub diD), wówczas niepłaskie obszary błony będą łatwiej uwydatnione przez emisję S niż P.
Opisaliśmy również techniki izolacji i elektroporacji komórek chromochłonnych nadnerczy bydlęcych. Komórka chromafinowa bydlęca jest doskonałym modelem wydzielniczym. Ma tę zaletę, że jest łatwy do utrzymania w hodowli, reaguje na różne sekretogogi i posiada duże pęcherzyki wydzielnicze, które można łatwo uwidocznić za pomocą konwencjonalnej mikroskopii świetlnej. Aby uzyskać ekspresję białek fluorescencyjnych, komórki są elektroporowane w zawiesinie przed posiewem na szalkach hodowlanych traktowanych kolagenem. Z naszego doświadczenia wynika, że skuteczność wyrażania jest znacznie wyższa w przypadku elektroporacji niż w przypadku odczynników Ca2+-fosforanu lub lipofeektaminy. Wadą elektroporacji jest to, że wymaga większej liczby ogniw (ponieważ wiele z nich nie przeżywa tego procesu) i drogich komercyjnych odczynników. Z niejasnych dla nas powodów nie każda membrana zawiera diD. Ponadto tylko część komórek na naczyniu jest transfekowana. Znalezienie komórek, które są transfekowane ORAZ są dobrze wybarwione diD, może być czasochłonne, dlatego optymalizacja warunków barwienia i elektroporacji jest warta wysiłku.
Podsumowując, w tym artykule opisano, w jaki sposób pTIRFM jest wdrażany do monitorowania szybkich i miejscowych deformacji błony, które występują podczas fuzji gęstych pęcherzyków rdzeniowych w bydlęcych komórkach chromochłonnych. Chociaż omówiono tylko jedno zastosowanie, technika ta idealnie nadaje się do badania innych procesów biologicznych, które obejmują zmiany kształtu błony, w tym endocytozy, cytokinezy i ruchliwości komórek.

Prawidłowe przeprowadzenie egzocytozy wymaga ekstremalnych zmian w kształcie dwuwarstwowej błony, które mają być precyzyjnie zaaranżowane. Przed fuzją następuje miejscowe wygięcie błony plazmatycznej pod granulką, częściowo w celu zmniejszenia bariery energetycznej dla interakcji dwuwarstw. Później, gdy membrany się łączą, generowane są obszary o dużej krzywiźnie, które muszą zostać ustabilizowane. Na koniec stopione membrany muszą zostać wygięte z ich pierwotnego kształtu, aby rozszerzyć pory fuzyjne i umożliwić uwolnienie zawartości1. Ponieważ jest mało prawdopodobne, aby same błony ulegały tak dramatycznym i skoordynowanym zmianom, białka są niezbędne do pośredniczenia w zdarzeniach. Jednak to, w jaki sposób wpływają one na zmiany topologii błony podczas procesu fuzji, pozostaje w dużej mierze kwestią otwartą.
Istnieją doskonałe modele in vitro do wizualizacji krzywizny błony. Na przykład zastosowanie EM o ujemnym barwieniu było ważne dla kształtowania obecnych modeli molekularnych działania dwóch głównych białek transportowych - synaptotagminy i dynaminy (przeglądy, patrz Chapman2 i Henshaw3). Większość testów egzocytozy w czasie rzeczywistym nie wykrywa bezpośrednio krzywizny. Zamiast tego krzywiznę wnioskuje się z testów, które informują o kinetyce uwalniania ładunku świetlnego4-8 lub zmian w obszarze błony9-11. PTIRFM wypełnia lukę między badaniami in vivo i in vitro, umożliwiając bezpośrednie pomiary zmian w mikromorfologii błon w czasie rzeczywistym.
PTIRFM, w trybie nieobrazowania, został zapoczątkowany przez Axelroda i współpracowników do pomiaru orientacji NPD-PE wbudowanego w modelową membranę12. Technika ta została następnie zastosowana do wizualizacji dynamicznych zmian w żywych komórkach oznaczonych diI i FM1-4313-18. W pTIRFM do sekwencyjnego wzbudzania sondy osadzonej w membranie stosuje się dwie polaryzacje pola ulotnego: polaryzacja p (w płaszczyźnie padania) i polaryzacja s (prostopadła do płaszczyzny padania). Przed obrazowaniem sonda - w tym przypadku diD - jest na krótko dodawana do podłoża zewnątrzkomórkowego i może interkalować w błonach plazmatycznych badanych komórek. W obszarach, w których membrana jest nierównoległa do szkła nakrywkowego (jak w przypadku falbowania lub wgłębienia membrany), diD również będzie nierównoległe. Dlatego takie obszary będą pobudzone przez wiązkę p-pol. Wiązka p-pol będzie mniej skutecznie wzbudzać diD w obszarach membrany, które są w większości równoległe do szkła nakrywkowego. Obrazy o stosunku pikseli do pikseli (P/S) informujące o emisji z sekwencyjnego wzbudzenia p- i s-pol diD będą zatem wyraźnie podkreślać obszary deformacji błony. Teoretycznie obrazy współczynnika P/S są wrażliwe nawet na niewielkie kąty odchylenia błony plazmatycznej od szkła nakrywkowego, przy amplitudzie zmian przewidywanej przez symulacje komputerowe18. Obrazy P/S są również niezależne od odległości fluoroforu od powierzchni szkła nakrywkowego i lokalnego stężenia fluoroforu. Lokalne stężenie fluoroforu jest natomiast dostarczane przez obrazy informujące o sumie emisji P między pikselami i 2-krotności emisji S (P+2S). Pomiar P+2S jest czuły na dokładną geometrię wgłębienia, z niewielką, niewielką lub żadną możliwą zmianą. Można to wykazać za pomocą symulacji komputerowych, które modelują przejścia poru fuzyjnego od stanu wczesnego (tj. z wąską szyjką) do późniejszego16,18. Przewiduje się, że P+2S stopionego pęcherzyka przyczepionego do błony plazmatycznej za pomocą wąskiej szyjki (i z większą ilością diD blisko granicy) będzie na przykład większe niż w przypadku stopionego pęcherzyka ze znacznie szerszymi porami (gdzie diD znajduje się w najciemniejszej części pola ulotnego).
W tym artykule omawiamy, jak pTIRFM jest wdrażany i wykorzystywany do badania szybkich, miejscowych zmian w kształcie membrany, które zachodzą podczas rozszerzania porów fuzji. Chociaż tylko jedno zastosowanie jest wyraźnie omówione, metody można uogólnić na wiele innych procesów biologicznych komórek, które bezpośrednio lub pośrednio wiążą się z przebudową błony.

<table><tbody><tr><td>Kamera iXon3 EMMCD</td><td>Andor</td><td>897</td><td></td></tr><tr><td>IX81 Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td></td><td>Boczny zespół kostki filtracyjnej</td></tr><tr><td>Laser Ar-Ion serii 43</td><td>CVI Milles Griot Laser Optyka</td><td>543-AP-A01</td><td>Przestrajany do 488nm</td></tr><tr><td>Sapphire 561 LP Diodowy</td><td>laserowy spójny</td><td></td><td>561nm</td></tr><tr><td>skanujący system luster Galvo</td><td>Thorlabs</td><td>GVS102</td><td></td></tr><tr><td>VC3 Kanałowy system perfuzji ogniskowej</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA VC3X4PP</td><td></td></tr><tr><td>QMM Mikrokolektor kwarcowy</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA QMM-4</td><td></td></tr><tr><td>10 PSI Regulator ciśnienia</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA PR10</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Burleigh</td><td>TS 5000-150</td><td></td></tr><tr><td>Zamontowany achromatyczny Ćwierćfalowa płyta</td><td>Thorlabs</td><td>AQWP05M-600</td><td></td></tr><tr><td>420-680nm Polaryzacyjny rozdzielacz wiązki Cube</td><td>Thorlabs</td><td>PBS201</td><td></td></tr><tr><td>Sześciopozycyjne koło o neutralnej gęstości</td><td>Thorlabs</td><td>FW1AND</td><td></td></tr><tr><td>napędzane silnikiem krokowym SmartShutter</td><td>Sutter Instruments</td><td>IQ25-1219</td><td></td></tr><tr><td>HQ412lp Filtr dichroiczny</td><td>Chroma</td><td>NC255583</td><td>Łączy wiązki 488nm i 561nm</td></tr><tr><td>Powlekana soczewka płasko-wklęsła</td><td>Edmund Optics</td><td>PCV 100mm VIS 0</td><td>Diverges 488nm beam</td></tr><tr><td>Powlekana soczewka plano-wklęsła</td><td>Edmund Optics</td><td>PCV 250mm VIS 0</td><td>Rozbieżna wiązka 561nm</td></tr><tr><td>Powlekana soczewka plano-wypukła</td><td>Edmund Optics</td><td>PCX 125mm VIS 0</td><td>Skupia obie wiązki</td></tr><tr><td>Powlekana soczewka płasko-wypukła</td><td>Edmund Optics</td><td>PCX 50mm VIS 0</td><td>Cementowany do zespołu kostki filtracyjnej</td></tr><tr><td>z488/561rpc Dichroic</td><td>Chroma</td><td>z488/561rpc</td><td>Filtercube dichroic</td></tr><tr><td>z488/561_TIRF Filtr emisyjny</td><td>Chroma</td><td>z488/561m_TIRF</td><td>Emisja Filtercube</td></tr><tr><td>UIS2 60x Obiektyw</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td>NA 1.37</td></tr><tr><td>System transfekcji neonowej</td><td>Invitrogen</td><td>MPK 5000</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania MetaMorph</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DiI Membrane Dye</td><td>Invitrogen</td><td>V-22885</td><td>do celów wyrównania</td></tr><tr><td>TH Liberase</td><td>Roche</td><td>5401135001</td><td></td></tr><tr><td>TL Liberse</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNAzyda I typu IV z bydlęcego</td><td>Hemocytometru Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>DiD Membrane Dye</td><td>Invitrogen</td><td>D-7757</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina</td><td>Invitrogen</td><td>R634.22</td><td></td></tr> <tr><td>&mu; m Membranowy filtr strzykawkowy</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite Polichromatyczne czerwone mikrosfery</td><td>Polysciences</td><td>19507</td><td>0,5 mikrona</td></tr><tr><td>Olejek immersyjny</td><td>Sigma</td><td>56822</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Controlls Lustra galvo</td></tr><tr><td>Kolba obrotowa</td><td>Bellco</td><td>1965-00250</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie deformacji błony plazmatycznej za pomocą ptirfm

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Aby uzyskać nowe informacje na temat dynamiki egzocytozy, nasza grupa skupia się na zmianach w kształcie dwuwarstw lipidowych, które muszą być precyzyjnie regulowane podczas fuzji błon pęcherzykowych i plazmatycznych. Te szybkie i zlokalizowane zmiany osiąga się dzięki dynamicznym interakcjom między lipidami a wyspecjalizowanymi białkami, które kontrolują krzywiznę błony. Brak takich interakcji miałby nie tylko katastrofalne konsekwencje dla fuzji pęcherzyków, ale także dla wielu innych funkcji komórkowych, które obejmują kontrolę kształtu błony. W ostatnich latach ustalono tożsamość szeregu białek o właściwościach kształtowania błony. To, czego jeszcze brakuje, to mapa drogowa określająca, kiedy, gdzie i w jaki sposób będą działać wraz z postępem fuzji i wydawania zawartości.
Nasze zrozumienie zdarzeń molekularnych, które umożliwiają przebudowę błony, było historycznie ograniczone przez brak metod analitycznych, które byłyby wrażliwe na krzywiznę błony lub mają rozdzielczość czasową pozwalającą śledzić szybkie zmiany. PTIRFM spełnia oba te kryteria. Omówiliśmy, w jaki sposób pTIRFM jest wdrażany do wizualizacji i interpretacji szybkich, submikronowych zmian w orientacji błon komórkowych chromochłonnych podczas fuzji pęcherzyków gęstych (DCV). Stosowane przez nas komórki chromochłonne są izolowane z nadnerczy bydlęcych. Membrana jest barwiona lipofilowym barwnikiem karbocyjaninowym, 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenosulfonianem lub diD. DiD interkaluje w płaszczyźnie membrany o "ustalonej" orientacji i dlatego jest wrażliwy na polaryzację pola ulotnego. Błona komórkowa wybarwiona diD jest sekwencyjnie wzbudzana polaryzacją ortogonalną lasera o długości fali 561 nm (p-pol, s-pol). Laser o długości fali 488 nm służy do wizualizacji składników pęcherzyków i pomiaru czasu momentu fuzji. Egzocytoza jest wywoływana przez miejscową perfuzję komórek depolaryzującym roztworem KCl. Analiza jest wykonywana w trybie offline przy użyciu specjalnie napisanego oprogramowania, aby zrozumieć, w jaki sposób zmiany intensywności emisji diD odnoszą się do dylatacji porów fuzyjnych.

Konwencjonalne i polaryzowane techniki obrazowania TIRFM są zaimplementowane na tym samym stole optycznym. Konfiguracja elementów optycznych jest podobna, przy czym główną różnicą jest polaryzacja światła wzbudzenia (Rysunek 1A). Światło spolaryzowane preferencyjnie wzbudza fluorofory, których dipole absorpcyjne są zorientowane zgodnie z kierunkiem polaryzacji. Zatem, aby pTIRFM była skuteczna w monitorowaniu zmian topologicznych błony, stosowana sonda musi wbudowywać się w błonę z ustaloną orientacją. Fluorescencyjne barwniki karbocyjaninowe (diI, diD) wbudowują się w lipidowe dwuwarstwy w sposób zorientowany, z dipolami przejścia w płaszczyźnie błony (Rysunek 1B). Oświetlenie polaryzacją p (Rysunek 1C) błon znakowanych diD selektywnie wzbudza fluorofory ustawione ukośnie do szkiełka podstawowego (kolor CZERWONY na Rysunku 1B i 1D).
Obfite znakowanie błony komórkowej komórek chromafinowych uzyskuje się po krótkiej inkubacji z diD. Rysunek 2A przedstawia przykład dobrze zabarwionej błony komórkowej. Zdrowa, przylegająca komórka wykaże wyraźne różnice w emisjach P i S. Obraz emisji P wykazuje jaśniejszy brzeg komórki w stosunku do reszty komórki. Obraz emisji S wykazuje w przybliżeniu jednorodną fluorescencję w obrębie śladu komórki. Obrazy P/S oraz P+2S obliczone z piksela na piksel są odpowiednio czułe na krzywiznę błony oraz stężenie barwnika. Przedstawiona komórka chromafinowa została również przetransfekowana Synaptotagminą-1 pHluorin (Syt-1) w celu znakowania pęcherzyków wydzielniczych (Rysunek 2B).
Komórkę chromafinową stymuluje się za pomocą 56 mM KCl, aby zdepolaryzować błonę komórkową i wywołać egzocytozę. W miarę zlewania się DCV nagle pojawia się szereg jasnych fluorescencyjnych punktów Syt-1 pHluorin (Rysunek 2B, panel prawy). Białą ramką zaznaczono jedno zdarzenie fuzji (Rysunek 2B, panel prawy). Zdarzenie to jest analizowane na Rysunkach 2C i 2D. Rysunek 2C przedstawia zmiany klatka po klatce w intensywności obrazów Syt-1-pHluorin, P/S oraz P+2S. Intensywność fluorescencji Syt-1 szybko spada w miarę dyfuzji białka z miejsca fuzji (Rysunek 2D). Wklęsłość reprezentująca kompleks zlanej pęcherzyka i błony komórkowej zmniejsza się w stosunkowo wolniejszym tempie (patrz wykresy na Rysunku 2D). Ilustracja (Rysunek 2E) przedstawia jedną z interpretacji tych pomiarów.
Szybkie i lokalne deformacje błony przedstawione na Rysunku 2 są wynikiem wywołanego bodźcem napływu Ca2+. Zostało to pokazane na Rysunku 3A. Komórka chromafinna została przetransfekowana genetycznym wskaźnikiem Ca2+ GCaMP5G21,22 i stymulowana 56 mM KCl. Depolaryzacja błony powoduje znaczny wzrost fluorescencji GCaMP5G (Rysunki 3A i 3B), co oznacza wzrost poziomu Ca2+ w obszarze subplazmalemmalnym. Wybrano obszar komórki o wielkości 30 x 20 pikseli, a zmiany intensywności pikseli GCaMP5G, P/S oraz P+2S klatka po klatce przedstawiono na obrazach (Rysunek 3B) i wykresach (Rysunek 3C). Czas „0” oznacza klatkę przed wystąpieniem widocznej zmiany P/S (t.j. klatkę przed egzocytozą). Białe groty strzałek wskazują, że deformacji błony (wzrostowi P/S) towarzyszy spadek emisji P+2S. Cytozolowe białko GCaMP5G jest wypierane z tego obszaru przez przylegające DCV. Należy również zwrócić uwagę na nagły spadek intensywności GCaMP5G w czasie 0 na Rysunku 3C, panel lewy. Długotrwały wzrost P/S i spadek P+2S sugerują obecność poru fuzyjnego, który rozszerza się powoli (Rysunek 3D).
<img alt="Układ lasera szafirowego i argonowego do badania błon z diD; obejmuje sterowanie wiązką i wzbudzenie optyczne." src="/files/ftp_upload/51334/51334fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Ilustracje techniki pTIRFM. A) Przedstawiono schemat łączący konwencjonalne obrazowanie TIRF z obrazowaniem opartym na polaryzacji. Przed laserem szafirowym o długości fali 561 nm umieszczono płytkę ćwierćfalową (QW), aby nadano wiązce lasera polaryzację eliptyczną. Kostka polaryzacyjna (PC1) służy do rozdzielenia polaryzacji na liniowe składowe pionową (v) i poziomą (h). Składowe pionowa i pozioma stają się odpowiednio wiązkami wzbudzenia p-pol i s-pol na powierzchni TIR. Ścieżki p-pol i s-pol są niezależnie przerywane za pomocą migawek (S1 i S2). Są one ponownie łączone za pomocą luster i drugiej kostki polaryzacyjnej (PC2). Dołączają one do wiązki 488 nm (również niezależnie przerywanej, S3) poprzez element sterujący wiązką składający się z lustra i niepolaryzującego lustra dichroicznego (DC). Soczewki (L) są wykorzystywane do rozszerzania i ogniskowania wiązek. Połączone wiązki 488 nm i 561 nm są kierowane do bocznego portu oświetleniowego mikroskopu za pomocą luster galwanometrycznych (GM). Są one ogniskowane w tylnej płaszczyźnie ogniskowej (BFP) obiektywu. Fotony emitowane przez fluorofory są rejestrowane przez kamerę EMCCD podłączoną do komputera PC. B) Znakowanie diD wykonuje się poprzez krótką inkubację komórek z barwnikiem i wielokrotne przemywanie w celu usunięcia nadmiaru. DiD interpoluje się w błonie, a jego momenty dipolowe przejścia znajdują się w przybliżeniu w płaszczyźnie błony. C) Światło padające spolaryzowane w płaszczyźnie padania (p-pol) tworzy pole ewanescentne, które jest w przeważającej mierze spolaryzowane prostopadle do powierzchni styku, jak pokazano. D) Oświetlenie błony znakowanej diD światłem p-spolaryzowanym będzie selektywnie wzbudzać te fluorofory, które są skośne względem szkiełka podstawowego (CZERWONY). Gdyby było to pole ewanescentne s-spolaryzowane, zamiast tego wzbudzone zostałyby fluorofory równoległe do szkiełka podstawowego (CZARNY).
<img alt="Lokalizacja synaptotagminy-1 w odpowiedzi na bodziec; mikroskopia fluorescencyjna; analiza aktywacji białek." src="/files/ftp_upload/51334/51334fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Monitorowanie deformacji błony komórkowej za pomocą pTIRFM. A) Przedstawiono surowe obrazy emisji P i S wraz z obliczonymi obrazami emisji P/S oraz P+2S. Pasek skali, 3.2 μm. B) Komórka chromafinna wykazująca ekspresję Syt-1 pHluorin zostaje zdepolaryzowana KCl. Liczne, intensywnie fluorescencyjne punkty (panel prawy) wskazują na fuzję pojedynczych DCV. Pasek skali, 3.2 μm. C) Obrazy klatka po klatce fuzującego DCV z Syt-1 pHluorin. Czas (powyżej obrazów) podano w sekundach. Czas 0 oznacza klatkę przed fuzją DCV. Przedstawiono również odpowiadające im obrazy emisji P/S i P+2S. Pasek skali wynosi 1 μm. D) Wykresy dla obrazów z punktu C. Linia przerywana oznacza czas 0 – klatkę fuzji. E) Przedstawiono jedną z możliwych interpretacji wyników z punktów C i D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51334/51334fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazowanie wapnia z użyciem GCaMP5G po stymulacji KCl; wykresy, obrazy mikroskopowe, analiza sygnału." src="/files/ftp_upload/51334/51334fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Deformacje są wynikiem napływu Ca2+ wywołanego stymulacją. A) Komórka chromafinna przetransfekowana GCaMP5G zostaje zdepolaryzowana za pomocą 56 mM KCl. Wynikający z tego wzrost fluorescencji GCaMP5G oznacza wzrost poziomu Ca2+ w obszarze podplazmalemmalnym. B) Obrazy klatka po klatce obszaru komórki o rozmiarach 30 x 20 pikseli przedstawionej na rys. A. Czas powyżej obrazów podano w sekundach. Białe groty strzałek wskazują region wzrostu P/S i spadku P+2S. Cytosolowe białko GCaMP5G jest wypierane z tego regionu przez fuzjonujący DCV. Pasek skali, 1 μm. C) Wykresy dla obrazów przedstawionych w punkcie B. D) Przedstawiono jedną z możliwych interpretacji wyników z punktów B i C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51334/51334fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kamera iXon3 EMMCD</td>
			<td>Andor</td>
			<td>897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odwrócony mikroskop IX81</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Montaż bocznego modułu filtra (Filtercube)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser argonowy z jonami serii 43</td>
			<td>CVI Milles Griot Laser Optics</td>
			<td>543-AP-A01</td>
			<td>Strojona do 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser diodowy Sapphire 561 LP</td>
			<td>Spójny</td>
			<td></td>
			<td>561 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System skanujących luster galwanometrycznych</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC3 System ogniskowej perfuzji kanałowej</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA VC3X4PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QMM Quartz MicroManifold (Krzemionkowy Mikrokolektor QMM)</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA QMM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator ciśnienia 10 psi</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA PR10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>TS 5000-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montowana achromatyczna płytka ćwierćfalowa</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AQWP05M-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polaryzacyjny kostkowy dzielnik wiązki 420-680 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sześciostanowy koło filtrów neutralnej gęstości</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FW1AND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inteligentna migawka SmartShutter napędzana silnikiem krokowym</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>IQ25-1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtr dichroiczny HQ412lp</td>
			<td>Chromatografia</td>
			<td>NC255583</td>
			<td>Łączy wiązki o długości fal 488 nm i 561 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powlekana soczewka płasko-wklęsła</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCV 100 mm VIS 0</td>
			<td>Rozprasza wiązkę 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powlekana soczewka płasko-wklęsła</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCV 250mm VIS 0</td>
			<td>Rozpraszanie wiązki 561 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soczewka płasko-wypukła z powłoką</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCX 125 mm VIS 0</td>
			<td>Ogniskuje obie wiązki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powlekana soczewka plano-konweksyjna</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCX 50mm VIS 0</td>
			<td>Przyklejono do zestawu kostki filtrującej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroiczny z488/561rpc</td>
			<td>Chromatografia</td>
			<td>z488/561rpc</td>
			<td>Kostka filtru dichroicznego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtr emisyjny TIRF z488/561</td>
			<td>Chromatyczność</td>
			<td>z488/561m_TIRF</td>
			<td>Emisja kostki filtrującej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obiektyw UIS2 60X</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 60XO</td>
			<td>NA 1,37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System transfekcji Neon</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oprogramowanie do obrazowania MetaMorph</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barwnik do błon DiI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V-22885</td>
			<td>W celach wyrównania</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401135001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TL Liberse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaza I typu IV z bydlęcej*</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komora countingowa (hemocytometr)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barwnik do błon DiD</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodamina</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 μm Jednostka membranowego filtra strzykawkowego</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wielobarwne czerwone mikrosfery Fluoresbrite</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19507</td>
			<td>0.5 μm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olej imersyjny</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Steruje lustrami galwanometrycznymi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolba do hodowli w zawiesinie</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>1965-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Wyposażenie do mikroskopii pTIRF.
<table>
	<tbody >
		<tr>
			<td>Skład</td>
			<td>Prep-PSS</td>
			<td>Basal-PSS</td>
			<td>Stim-PSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>145 mM</td>
			<td>145 mM</td>
			<td>95 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>5.6 mM</td>
			<td>5.6 mM</td>
			<td>56 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>-</td>
			<td>0.5 mM</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>-</td>
			<td>2.2 mM</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>15 mM</td>
			<td>15 mM</td>
			<td>15 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>7.4</td>
			<td>7.4</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukoza</td>
			<td>2.8 mM</td>
			<td>5.6 mM</td>
			<td>5.6 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>1x</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Roztwory do perfuzji i przygotowania komórek chromafinowych.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Składniki</td>
			<td>Pożywka do elektroporacji</td>
			<td>Standardowa pożywka do hodowli</td>
			<td>Pożywka z 2x antybiotykiem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DMEM/F-12</td>
			<td>1 ml/plate</td>
			<td>2 ml/plate</td>
			<td>1 ml/plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>10%</td>
			<td>10%</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine Arabinofuranoside (CAF)</td>
			<td>-</td>
			<td>1 μl/ml z zapasu 10 mM</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicylina</td>
			<td>-</td>
			<td>100 units/ml</td>
			<td>200 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycyna</td>
			<td>-</td>
			<td>100 μg/ml</td>
			<td>200 μg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycyna</td>
			<td>-</td>
			<td>25 μg/ml</td>
			<td>50 μg/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3. Pożywka dla komórek chromafinowych.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spis treści</td>
			<td>TH-PSS</td>
			<td>TL-PSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TH</td>
			<td>2 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TL</td>
			<td>-</td>
			<td>0,85 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przygotowanie PSS</td>
			<td>98,0 ml</td>
			<td>84,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaza</td>
			<td>8,75 mg</td>
			<td>7,4 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4. Roztwory TH-PSS i TL-PSS.

Mikroskopia fluorescencyjna z pełnym wewnętrznym odbiciem (pTIRFM) oparta na polaryzacji umożliwia wykrywanie dynamiki błony komórkowej w czasie rzeczywistym. W artykule opisano implementację pTIRFM do badania przebudowy błony podczas regulowanej egzocytozy. Technikę tę można uogólnić na inne procesy w biologii komórki, które bezpośrednio lub pośrednio wiążą się ze zmianami kształtu błony.

Obrazowanie deformacji błony plazmatycznej za pomocą pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Celem niniejszej procedury jest przedstawienie sposobu implementacji mikroskopii fluorescencyjnej w odbiciu całkowym z wykorzystaniem polaryzacji do badania przebudowy błon podczas regulowanej egzocytozy. Jest to realizowane poprzez upewnienie się w pierwszej kolejności, że elementy optyczne, a mianowicie płytka ćwierćfalowa i kostki polaryzacyjne, są prawidłowo ustawione w celu generowania dyskretnych polaryzacji wzbudzenia p i s. Drugim krokiem jest weryfikacja, czy wiązki p i s są współosiowe, przechodzą przez oś optyczną mikroskopu i oświetlają ten sam obszar pola widzenia podczas pracy w trybie fluorescencji w odbiciu całkownym (TIRF).Następnie komórki przeznaczone do obrazowania barwi się barwnikiem węglowo-cyjanidowym (barwnik D) i stymuluje bodźcem depolaryzującym w celu wywołania egzocytozy. Ostatnim krokiem jest wykonanie zdjęć fuzujących pęcherzyków o gęstym rdzeniu podczas obrazowania TIRF. W końcowym etapie P-T-I-R-F służy do pozyskiwania obrazów w czasie rzeczywistym, aby monitorować zmiany topologiczne błony wynikające z egzocytozy komórek chrominowych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pyrometria i pojemność błony, jest to, że ptro F bezpośrednio informuje o krzywiźnie błony, a co za tym idzie, o rozszerzeniu otworu fuzji. Najtrudniejszym etapem nauki tej techniki jest początkowe opanowanie wyrównywania polaryzacji wzbudzeń p i s, tak aby biegły one współliniowo wzdłuż osi optycznej mikroskopu i oświetlały ten sam obszar pola obrazowania. Drugim często pojawiającym się problemem jest barwienie komórek, a konkretnie czas ekspozycji komórek na dd oraz kryteria odróżnienia komórki dobrze zabarwionej od komórki o słabym zabarwieniu.Procedurę zaprezentuje TA square row, doktorant z naszego laboratorium. Aby rozpocząć, należy włączyć wszystkie komponenty mikroskopu, lasery oraz komputery, a następnie skierować wiązkę z lasera 488 nanometr na tylną płaszczyznę ogniskową obiektywu o aperturze numerycznej 1,49. Jeśli wiązka lasera zostanie skupiona na tylnej płaszczyźnie ogniskowej, wyjdzie ona skolonowana i pojawi się jako mały, wyraźny punkt na suficie bezpośrednio nad obiektywem.Następnie wyreguluj lustro galwanometru X tak, aby wiązka lasera została przesunięta poza oś i wychodziła z obiektywu pod coraz większymi kątami w stosunku do normalnej obiektywu. Następnie sprawdź, czy uzyskano całkowite wewnętrzne odbicie (TIR). Dodaj 10 µL fluorescencyjnych mikrosfer do 1 mL soli fizjologicznej i do naczynia z szklanym dnem; powinna być wykrywana wyłącznie fluorescencja mikrosfer znajdujących się na dnie naczynia najbliżej granicy TIR.Wykrycie unoszących się mikrosfer wskazuje, że kąt między światłem padającym a normalną obiektywu jest niewystarczający. W przypadku obrazowania opartego na polaryzacji, należy użyć wyrównanej wiązki 488 nanometr jako prowadnika i dostosować pozycję surowej wiązki lasera 561 nanometr tak, aby biegła ona wzdłuż identycznej ścieżki optycznej. Laser 561 nanometr zostanie wykorzystany do obrazowania barwnika karbo-cyjanidowego.Za laserem o długości fali 561 nanometrów znajdują się soczewka rozpraszająca i lustra. Za pomocą pokręteł regulacyjnych na lustrach należy ustawić wiązkę tak, aby była współosiowa z wiązką o długości fali 488 nanometrów, a plamka była w ognisku na suficie. Gdy lustra galwanometryczne znajdują się w pozycji zerowej, kostka polaryzacyjna odbija pionową składową pola elektrycznego i przepuszcza składową poziomą.Zostaje on umieszczony za wiązką spolaryzowaną eliptycznie na niewielkiej podstawie przesuwnej. Aby ułatwić późniejsze dopasowanie polaryzacji ścieżek wiązek, zastosowano drugi kostkę polaryzacyjną i lustra w celu ponownego połączenia wiązek. Przesłona znajduje się pomiędzy pierwszą kostką polaryzacyjną a lustrem składowej pionowej.Drugą przysłonę umieszcza się pomiędzy lustrem komponentu poziomego a drugim kostką polaryzacyjną. Przysłony te są sterowane przez oprogramowanie do obrazowania, co pozwala użytkownikowi na szybki wybór między polaryzacjami wiązki. Należy użyć filtra polaryzacyjnego, aby zweryfikować orientację pola elektrycznego w każdej ścieżce wiązki.Filtr polaryzacyjny dopuszcza transmisję światła jedynie wzdłuż osi filtra. Należy sprawdzić, czy składowe pionowa i pozioma wiązki lasera są wyrównane względem siebie oraz względem wiązki o długości 488 nanometrów, a następnie wprowadzić niezbędne korekty. Wszystkie trzy wiązki powinny być skupione na tylnej płaszczyźnie ogniskowej i wychodzić z obiektywu w sposób kolimowany, trafiając w ten sam punkt na suficie.Miejsce to można oznaczyć znakiem X, aby ułatwić późniejsze wyrównanie. Następnie nanieś kroplę olejku immersyjnego na obiektyw. Umieść szalkę zawierającą fluorescencyjne mikrosfery.Na obiektywie ustaw TIR, przesuwając zwierciadło galwanometru X w oprogramowaniu do przesuwania zwierciadeł w trybie TIR. Pionowa składowa wiązki to polaryzacja S, a pozioma składowa wiązki to obecnie centrum polaryzacji P. W torze wiązki umieść płytkę ćwierćfalową lub qw. Bezpośrednio za przysłoną laserową obserwuj każde spolaryzowane pole ewanescentne z próbką prętkową, która według przewidywań jest zorientowana losowo.Obrócić płytkę qw tak, aby dopasować ją do średnich intensywności pikseli. Wyizolować zdrowe komórki chromafinowe z nadnerczy kota zgodnie z opisem w protokole tekstowym, policzyć komórki za pomocą hemosytometru i przygotować je do transfekcji. Przeprowadzić transfekcję komórek DNA kodującym białko zainteresowania, wykorzystując system elektroporacji zgodnie z zaleceniami producenta. Ustawienia te zapewniają najlepszą równowagę między wydajnością transfekcji a przeżywalnością komórek.Do przygotowania tych komórek chrominowych bydlęcych stosuje się 1 100 V, 40 ms i jeden impuls. Po transfekcji delikatnie wysiej komórki na płytkach potraktowanych poli-L-lizyną i kolagenem w 1 ml ogrzanej pożywki do elektroporacji. Umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Do każdej płytki dodaj 1 ml pożywki z 2x antybiotykiem. Po sześciu godzinach, następnego dnia, wymień pożywkę na standardową.Komórki chrominowe są zazwyczaj obrazowane od 48 godzin do pięciu dni po elektroporacji przy użyciu oprogramowania start acquisition systemu obrazowania. Należy sprawdzić, czy lasery są odpowiednio ustawione. Należy zweryfikować profil pola ewanescentnego za pomocą mikrosfer.Przygotuj globalny i lokalny system perfuzji. Oczyść zbiorniki z roztworami za pomocą filtrowanej wody dejonizowanej, a następnie napełnij je podstawową i stymulującą fizjologiczną solą fizjologiczną. Przed obrazowaniem komórek chrominowych upewnij się, że wzbudzenie polaryzacją P i polaryzacją S oświetla ten sam obszar pola widzenia oraz że natężenia oświetlenia są w przybliżeniu równoważne, zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym.Przejdź teraz do barwienia bydlęcych komórek chromatycznych DD. Wypłucz pożywkę hodowlaną z naczynia zawierającego komórki chrominowe i zastąp ją dwoma mililitrami podstawowego roztworu soli fizjologicznej. Dodaj 10 µL 10 mM DD bezpośrednio do naczynia z komórkami. Delikatnie potrząśnij naczyniem przez 2 do 10 sekund przed usunięciem roztworu.Przepłucz naczynie trzy lub cztery razy podstawowym roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć wszelkie pozostałości DD; komórki są teraz zabarwione i gotowe do użycia. Nałóż kroplę olejku immersyjnego na obiektyw. Umieść naczynie zawierające zabarwione Dai D komórki chrominowe na obiektywie.Ustaw igłę do perfuzji lokalnej w taki sposób, aby znajdowała się w odległości około 100 mikronów od komórki. Ustaw ostrość na błonę komórkową i aktywuj sprzętowy autofokus bezpośrednio przed akwizycją obrazu stymulacji komórki. Rozpocznij akwizycję obrazu, perfundując komórki przez 10 sekund roztworem podstawowym, a następnie przez 60 sekund depolaryzującym 56 milimolowym roztworem chlorku potasu.Należy pozyskiwać obrazy, szybko przełączając migawkę między polaryzacją P 561 nanometr a polaryzacją s 561 nanometr, aby monitorować zmiany w emisjach p i s DD oraz wzbudzeniem 488 nanometr. Aby obrazować sondę pęcherzykową po transfekcji, uzyskano obfite znakowanie błony komórek chrominowych po krótkiej inkubacji z Dai D. W tym przykładzie błona komórkowa jest dobrze zabarwiona. Zdrowa komórka adherentna będzie wykazywać wyraźne różnice w emisjach p i s.Obraz emisji P wykazuje jaśniejszą krawędź komórki w stosunku do pozostałej części komórki. Obraz emisji S wykazuje w przybliżeniu jednorodną fluorescencję w obrębie obszaru komórki; obliczono stosunek P do S oraz p plus dwa s dla każdego piksela. Obrazy są odpowiednio czułe na krzywiznę błony oraz na stężenie barwnika.Przedstawiona komórka CHRO została również przetransfekowana synaptofizyną-GFP w celu znakowania pęcherzyków wydzielniczych. Komórkę CHRO stymuluje się chlorkiem potasu, aby zdepolaryzować błonę komórkową i wywołać egzocytozę. Wraz z fuzją pęcherzyków o gęstym rdzeniu nagle stają się widoczne liczne, silnie fluorescencyjne punkty.Biała ramka otacza jedno zdarzenie fuzji. Aby przeanalizować to zdarzenie fuzji klatka po klatce, badano zmiany intensywności obrazów CIT 1 fluoresceiną, VS oraz p plus dwa s. Intensywność fluorescencji CIT 1 szybko maleje w miarę jak białko dyfunduje z miejsca fuzji. Wklęsłość reprezentująca kompleks błony plazmatycznej z fuzyjnym pęcherzykiem znika w stosunkowo wolniejszym tempie.Ilustracja ta przedstawia jedną z interpretacji tych pomiarów. Szybka i zlokalizowana deformacja błony jest wynikiem wywołanego bodźcem napływu jonów wapnia; depolaryzacja błony powoduje znaczny wzrost fluorescencji G Camp 5G, co sygnalizuje wzrost poziomu wapnia w obszarze podplazmalemowym. Wybrano obszar komórki o rozmiarach 30 na 20 pikseli i analizowano zmiany G camp 5G PS oraz p plus two s klatka po klatce.Intensywności pikseli przedstawiono na obrazach i wykresach. Czas zero oznacza klatkę sprzed momentu, w którym widoczna jest zmiana w PS. Białe groty strzałek wskazują, że deformacji błony towarzyszy spadek emisji p plus two S.Cytosolowe białko G CAMP 5G jest wykluczone z obszaru zajmowanego przez pęcherzyk z gęstym rdzeniem. Zauważalny jest również gwałtowny spadek intensywności G camp 5G w czasie zero. Długotrwały wzrost w POS i spadek w p plus dwa s sugerują powolne rozszerzanie się poru fuzyjnego, jak przedstawiono na ilustracji.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiąść wiedzę na temat budowy układu PTU F oraz obrazowania komórek w celu obserwacji zmian topologicznych błony w trakcie jej rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii komórki do eksploracji zmian kształtu błony podczas egzocytozy, endocytozy, cytokinezy oraz motylości komórek w żywych organizmach.

imaging-plasma-membrane-deformations-with-ptirfm

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy sposób pomiaru dynamiki wapnia wewnątrzkomórkowego w pobliżu błony oraz w całej objętości komórki w hodowlach astrocytów, wykorzystując mikroskopię całkowitego wewnętrznego odbicia oraz epifluorescencyjną.

Pomiar dynamiki wapnia w pobliżu błony plazmatycznej oraz w całej przestrzeni wewnątrzkomórkowej astrocytów

Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) to potężna metoda obserwacji struktur znajdujących się blisko powierzchni komórki przy wysokim kontraście i rozdzielczości czasowej. Demonstrujemy, w jaki sposób TIRF może być wykorzystany do badania dynamiki białek w korze bakterii i grzybów otoczonych ścianą komórkową.

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Opisujemy protokół przygotowania dwuwarstw lipidowych i jego charakterystyki za pomocą mikroskopii sił atomowych i spektroskopii sił.

Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych

PI(4,5)P2 reguluje różne funkcje komórkowe, ale jego nanoskalowa organizacja w błonie komórkowej jest słabo poznana. Znakując PI(4,5)P2 dwukolorową sondą fluorescencyjną połączoną z domeną homologii Pleckstrin, opisujemy nowatorskie podejście do badania rozkładu przestrzennego PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej w skali nanometrowej.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia analizy ilościowej poziomu asocjacji plazmato-błonowej dla fluorescencyjnie oznakowanego białka związanego obwodowo. Metoda opiera się na obliczeniowej dekompozycji błonowej i cytoplazmatycznej składowej sygnału obserwowanej w komórkach znakowanych markerem fluorescencyjnym błony plazmatycznej.

Oznaczanie partycjonowania błony plazmatycznej dla białek związanych obwodowo

Makropinocytoza to wysoce konserwatywny proces endocytarny, zainicjowany przez tworzenie bogatych w F-aktynę warstwowych wypustek błonowych, znanych również jako falbany błonowe. Zwiększona szybkość internalizacji substancji rozpuszczonej makropinocytozy jest związana z różnymi stanami patologicznymi. W protokole tym przedstawiono metodę ilościowego określania powstawania falban błonowych in vitro przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej.

Wizualizacja powstawania falban błony za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Metoda nakłuwania termoplazmonicznego łączy mikroskopię konfokalną, pęsetę optyczną i nanocząstki złota do badania reakcji białek podczas naprawy błony plazmatycznej w komórkach i gigantycznych pęcherzykach jednopłytkowych. Technika ta umożliwia szybkie i miejscowe nakłucie błony, co pozwala na identyfikację kluczowych białek i ich ról funkcjonalnych w skomplikowanej maszynerii naprawy błony plazmatycznej.

Termoplazmoniczne podejście do badania naprawy błon plazmatycznych w żywych komórkach i błonach modelowych

Poznaj technikę pTIRFM do obrazowania dynamiki błon komórkowych podczas egzocytozy w czasie rzeczywistym. Metoda umożliwia bezpośrednią obserwację zmian krzywizny membrany i remodelowania.

Obrazowanie deformacji błony plazmatycznej za pomocą pTIRFM

Przeglądaj więcej filmów