Obrazowanie deformacji błony plazmatycznej za pomocą pTIRFM

Celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób mikroskopia fluorescencyjna całkowitego wewnętrznego odbicia oparta na polaryzacji jest wdrażana do badania przebudowy błony podczas regulowanej egzocytozy. Osiąga się to poprzez upewnienie się, że elementy optyczne, a mianowicie płytka ćwierćfalowa i kostki polaryzacyjne, są prawidłowo ustawione w celu generowania dyskretnych polaryzacji wzbudzenia p i s. Drugim krokiem jest sprawdzenie, czy wiązki p i s są kolinem, przechodzą przez oś optyczną mikroskopu i oświetlają tę samą część pola widzenia, gdy są w całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego lub TIRF.

Następnie komórki, które mają być zobrazowane, są barwione matrycą cyjanku karbo, matrycą D i stymulowane bodźcami depolaryzującymi w celu wywołania egzocytozy. Ostatnim krokiem jest wykonanie zdjęć łączących się gęstych pęcherzyków jądrowych podczas przebywania w TIRF. Ostatecznie P-T-I-R-F służy do pozyskiwania obrazów w czasie rzeczywistym w celu monitorowania zmian topologicznych błony, które wynikają z egzocytozy komórek chrominy.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak pirometria i pojemność membrany, jest to, że ptro F zgłasza bezpośrednio krzywiznę membrany, a co za tym idzie, dylatację portu fuzji. Najbardziej stromą częścią krzywej uczenia się tej techniki jest najpierw nauczenie się wyrównywania polaryzacji wzbudzenia p i s, tak aby przemieszczały się one przez oś optyczną mikroskopu i oświetlały tę samą część pola obrazowania. Druga kwestia, która często się pojawia, dotyczy barwienia komórek, a mianowicie, jak długo należy wystawiać komórki na działanie dd i co stanowi dobrze wybarwioną komórkę w porównaniu z taką, która jest słabo wybarwiona.

Procedurę zademonstruje TA square row, doktorant z naszego laboratorium. Aby rozpocząć włączanie wszystkich elementów mikroskopu, lasery i komputery kierują wiązkę z lasera o długości fali 488 nanometrów na tylną płaszczyznę ogniskową obiektywu o aperturze numerycznej 1,49. Jeśli wiązka laserowa zostanie skupiona na tylnej płaszczyźnie ogniskowej, wyłoni się, zestawi i pojawi się jako mały, dobrze zdefiniowany punkt na suficie bezpośrednio nad obiektywem.

Następnie wyreguluj zwierciadło galwanometru X tak, aby wiązka lasera była przesuwana poza oś i wyłaniała się z obiektywu pod coraz bardziej stromymi kątami do normalnej obiektywu. Następnie sprawdź, czy osiągnięto całkowite odbicie wewnętrzne lub TIR. Dodać 10 mikrolitrów mikrosfer fluorescencyjnych do jednego mililitra objętości roztworu soli fizjologicznej i naczynia ze szklanym dnem, w którym powinna być wykryta tylko fluorescencja z mikrosfer znajdujących się najbliżej granicy faz TIR.

Wykrywanie unoszących się mikrosfer wskazuje, że kąt między padającym światłem a normalną obiektywu jest niewystarczający. W przypadku obrazowania opartego na polaryzacji użyj wyrównanej wiązki 488 nanometrów jako przewodnika i dostosuj położenie surowej wiązki laserowej 561 nanometrów tak, aby poruszała się po identycznej ścieżce optycznej. Laser o długości 561 nanometrów będzie wykorzystywany do obrazowania barwnika cyjanku karbo.

Rozbieżna soczewka i lustra znajdują się za laserem o długości fali 561 nanometrów. Za pomocą pokręteł regulacyjnych na lustrach wyreguluj wiązkę tak, aby była zbieżna z wiązką 488 nanometrów, a punkt był ostry na suficie. Gdy lustra galwanometru znajdują się w pozycji zerowej, sześcian polaryzacyjny odbija składową pionową pola elektrycznego i przechodzi przez składową poziomą.

Jest on umieszczony za wiązką spolaryzowaną eliptycznie na małym stoliku translacyjnym. Aby ułatwić późniejsze wyrównanie polaryzacji, ścieżki wiązki wykorzystują drugi sześcian polaryzacyjny i lustra do rekombinacji wiązek. Pomiędzy pierwszym sześcianem polaryzacyjnym a zwierciadłem składowej pionowej umieszcza się przesłonę.

Druga migawka jest umieszczana pomiędzy zwierciadłem składowej poziomej a drugą kostką polaryzacyjną. Migawki te są sterowane przez oprogramowanie do obrazowania, które umożliwia użytkownikowi szybki wybór między polaryzacjami wiązki. Użyj filtra polaryzacyjnego, aby sprawdzić orientację pola elektrycznego w każdej ścieżce wiązki.

Filtr polaryzacyjny pozwoli na transmisję tylko w linii z osią filtra. Sprawdź, czy pionowe i poziome składowe wiązki laserowej są wyrównane ze sobą i z wiązką 488 nanometrów, w razie potrzeby dokonaj regulacji. Wszystkie trzy wiązki powinny być skupione na tylnej płaszczyźnie ogniskowej i wyłaniać się zebrane z obiektywu do tego samego miejsca na suficie.

To miejsce można oznaczyć znakiem X, aby ułatwić przyszłe wyrównanie. Następnie umieść kroplę olejku immersyjnego na celu. Umieść naczynie zawierające fluorescencyjne mikrosfery.

Na celu wprowadź TIR, przesuwając lustro galwanometru X w oprogramowaniu do przesuwania lustra w TIR. Składowa pionowa wiązki to polaryzacja S, a składowa pozioma wiązki to teraz środek polaryzacji P, płyta ćwierćfalowa lub qw na ścieżce wiązki. Bezpośrednio za aperturą lasera obserwuj każde spolaryzowane ulotne pole za pomocą próbki dominy pręcikowej, która według przewidywań będzie zorientowana losowo.

Obróć płytkę qw, aby dopasować ją do średniej intensywności pikseli. Wyizolować zdrowe komórki chrominy z nadnerczy kota zgodnie z opisem w protokole tekstowym, policzyć komórki za pomocą hemocytometru i przygotować do transfekcji komórki transfekcyjne z DNA kodującym interesujące białko za pomocą systemu elektroporacji zgodnie z zaleceniami producenta. Ustawienia, które zapewniają najlepszą równowagę między wydajnością transfekcji a wskaźnikiem przeżywalności komórek.

Do tego przygotowania bydlęcych komórek chrominy wynosi 1, 100 woltów, 40 milisekund i jeden impuls po komórkach płytki transfekcyjnej delikatnie na naczyniach traktowanych poli de lycyną i kolagenem w jednym mililitrze podgrzanego podłoża elektrycznego. Umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj jeden mililitr dwóch x pożywki antybiotykowej do każdego naczynia Po sześciu godzinach następnego dnia zmień pożywkę na normalną.

Komórki chrominowe są zwykle obrazowane od 48 godzin do pięciu dni po elektroporacji za pomocą systemu obrazowania w oprogramowaniu do akwizycji. Sprawdź, czy lasery są wyrównane. Sprawdź profil pola ulotnego za pomocą mikrosfer.

Przygotuj globalny i lokalny system obfitości. Oczyść zbiorniki z roztworem przefiltrowaną wodą dejonizowaną i napełnij podstawowymi i stymulującymi roztworami soli fizjologicznej. Przed obrazowaniem komórek chrominowych sprawdź, czy polaryzacja P i wzbudzenie polaryzacji S oświetlają ten sam obszar pola widzenia i czy intensywności oświetlenia są w przybliżeniu równoważne, jak opisano w protokole tekstowym.

Teraz przystąp do barwienia bydlęcych komórek chrominy DD. Wypłucz pożywkę hodowlaną z naczynia zawierającego komórki chrominy i zastąp dwoma mililitrami podstawowego roztworu soli fizjologicznej. Dodaj 10 mikrolitrów 10 milimolowych DD bezpośrednio do naczynia zawierającego komórki. Delikatnie mieszaj naczynie przez dwie do 10 sekund przed wyjęciem roztworu.

Umyj naczynie trzy do czterech razy podstawowym roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć wszelkie pozostałości DD, komórki są teraz wybarwione i gotowe do użycia. Dodaj kroplę olejku immersyjnego do obiektywu. Umieść naczynie zawierające barwione komórki chrominy Dai D na wierzchu obiektywu.

Ustaw igłę perfuzji miejscowej tak, aby znajdowała się w odległości około 100 mikronów od komórki. Skoncentruj się na błonie komórkowej i aktywuj sprzęt automatycznego ustawiania ostrości bezpośrednio przed akwizycją obrazu stymulacji komórek. Rozpocznij akwizycję obrazu komórek perfuzyjnych przez 10 sekund roztworem podstawowym, a następnie przez 60 sekund depolaryzującym 56-milimolowym roztworem chlorku potasu.

Uzyskuj obrazy podczas szybkiego przełączania między polaryzacją P 561 nanometrów a polaryzacją 561 nanometrów s, aby monitorować zmiany emisji p i s DD i wzbudzenia 488 nanometrów. Aby zobrazować transfekowaną sondę pęcherzykową, wybujałe znakowanie błony komórek chrominy uzyskuje się po krótkiej inkubacji z Dai D.In tym przykładzie błona komórkowa jest dobrze wybarwiona. Zdrowa komórka przylegająca będzie wykazywać wyraźne różnice w emisjach p i s.

Obraz emisji P pokazuje jaśniejszą granicę komórki w stosunku do reszty komórki. Obraz emisji S pokazuje mniej więcej jednolitą fluorescencję na całym śladzie komórki, obliczoną piksel po pikselu P przez S i p plus dwa s. Obrazy są wrażliwe odpowiednio na krzywiznę membrany i stężenie barwnika.

Pokazany CHRO i komórka zostały również transfekowane synapem OIN jeden florin w celu oznaczenia pęcherzyków wydzielniczych. CHRO i komórka są stymulowane chlorkiem potasu w celu depolaryzacji błony komórkowej i wywołania egzocytozy. Wiele prawidłowo fluorescencyjnych plam nagle staje się widocznych, gdy gęste pęcherzyki jądrowe łączą się.

Wokół jednego zdarzenia fuzji narysowana jest biała ramka: Aby przeanalizować to zdarzenie fuzji, zbadano zmiany klatki po klatce w siedzeniu jednego florena po, VS i p plus dwa s, intensywności obrazu. Intensywność fluorescencji fluorescencji CIT one szybko maleje, gdy białko dyfunduje z miejsca fuzji. Wgłębienie reprezentujące kompleks błony plazmatycznej stopionego pęcherzyka zmniejsza się w stosunkowo wolniejszym tempie.

Powyższa ilustracja przedstawia jedną z interpretacji tych pomiarów. Szybka i miejscowa deformacja błony jest wynikiem wywołania bodźcem napływu wapnia, depolaryzacja błony powoduje znaczny wzrost fluorescencji G Camp 5G, co oznacza wzrost subplazmatycznego poziomu wapnia. Zaznaczony jest obszar komórki o wymiarach 30 na 20 pikseli i klatka po klatce zmienia się w obozie G, 5G, PS i p plus dwa s.

Intensywność pikseli jest pokazana na obrazach i wykresach. Razy zero oznacza klatkę, zanim zmiana PS będzie widoczna. Białe groty strzałek wskazują, że deformacji membrany towarzyszy spadek emisji p plus dwa S.

Cytozolowe białko G CAMP 5G jest wykluczane z tego obszaru przez zrośnięty gęsty pęcherzyk rdzeniowy. Zwróć również uwagę na nagły spadek intensywności 5G w obozie G w czasie zero. Długotrwały wzrost POS i spadek p plus dwa s sugeruje pory fuzyjne, które rozszerzają się powoli, jak pokazano na ilustracji.

Tutaj Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbudować system PTU F i obrazować komórki, aby obserwować zmiany topologiczne błony podczas przebywania na murawie po jej rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki do zbadania zmian w kształcie błony podczas egzocytozy, endocytozy, cytokinezy i ruchliwości komórek w żywych komórkach.