Zewnątrzkomórkowy zapis tetrody drutowej w mózgu swobodnie chodzących owadów

Ogólnym celem tej procedury jest rejestracja złożonej aktywności neuronalnej w mózgu i skoordynowanie jej z zachowaniami swobodnie poruszających się owadów zarejestrowanymi na wideo. Jest to osiągane poprzez uprzednie wykonanie elastycznych elektrod rejestrujących z niezwykle cienkiego drutu, ostrzenie, testowanie i powlekanie końcówki oraz materiału do znakowania jej lokalizacji i stabilizacji drutu w rurce polietylenowej. Drugim krokiem jest wprowadzenie elektrody rejestrującej do mózgu, ustabilizowanie jej za pomocą octanu i wosku oraz przymocowanie do głowy pętli odciążającej.

Następnie rejestruje się aktywność neuronalną wraz z nagraniem wideo zachowań lokomocyjnych. Synchronizuje się wideo z zapisem za pomocą impulsu synchronizującego skierowanego do diody LED oraz wzmacniacza. Ostatnim krokiem jest osadzanie miedzi przy użyciu stałego prądu elektrycznego i intensyfikacja barwienia metodą Tima w celu wizualizacji miejsca rejestracji.

Ostatecznie techniki wysokogęstościowego wielokanałowego sortowania pozakomórkowego pozwalają na identyfikację jednostek neuronalnych, podczas gdy analiza jednoczesnego zapisu wideo zachowań umożliwia precyzyjną korelację aktywności neuronalnej z zachowaniem. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wykorzystanie istniejących procedur do rejestracji wysokogęstościowej aktywności neuronalnej pozakomórkowej z mózgu owada podczas wykonywania przez niego złożonego zachowania. Umożliwia to następnie zidentyfikowanie położenia elektrod Tet w mózgu, a całość procesu może zostać przeprowadzona stosunkowo niskim kosztem.

Ta technika może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuropatologii poprzez korelację czasu i intensywności aktywności neuronalnej w konkretnych obszarach mózgu z zachowaniem swobodnie poruszającego się zwierzęcia. Metoda ta pozwala uzyskać wgląd w sensoryczną kontrolę motoryczną, ale może być również stosowana do wszelkich zachowań wymagających swobodnego poruszania się owada, takich jak nauka orientacji lub nawigacji. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie będą napotykać trudności, ponieważ elektrody rejestrujące są trudne do rozmieszczenia, a ich osadzanie i stabilizacja do rejestracji wymagają bardzo precyzyjnych technik mikrochirurgicznych.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa. Procedury tworzenia i implantacji Tero są trudne do opanowania, ponieważ wykonuje się je z użyciem bardzo małych i delikatnych materiałów, a zachowanie szczególnej ostrożności jest niezbędne, aby nie uszkodzić tkanki mózgowej. Aby przygotować druty Tet Road, umieść dwa wyciągnięte druty rom w zmotoryzowanym urządzeniu do nawijania obrotowego.

Nawijaj tero w jednym kierunku przez dwie minuty przy prędkości 60 obrotów na minutę, a następnie odwijaj w przeciwnym kierunku przez 30 sekund. Następnie użyj opalarki, aby stopić druty, uważając, by nie dotykać ich urządzeniem. Wykonaj trzy przejścia w górę i w dół z naprzemiennych kierunków, przy czym każde przejście powinno trwać około 10 sekund.

Następnie dodaj rurkę wspierającą wykonaną z 30 centymetrowego odcinka rurki polietylenowej. Powoli przećznij tetrę przez rurkę wspierającą, aby zapobiec jej zagięciu. Gdy stopiony koniec pojawi się na drugim końcu rurki, przeciągnij go tak, aby po obu stronach rurki prowadzącej znajdowała się równa długość drutu.

Następnie chwyć pęsetą wolny koniec każdego drutu, wykorzystując podstawę płomienia palnika gazowego. Ostrożnie wypal izolację z ostatnich dwóch lub trzech milimetrów każdego drutu. Podgrzewaj drut, aż zacznie żarzyć się, ale nie zwijaj.

Następnie za pomocą pęsety połącz tero z adapterem gniazd IC typu male-female, który jest dopasowany do urządzenia rejestrującego. Włóż nieizolowany koniec każdego przewodu do innego gniazda adaptera. Dodaj mosiężny pin, aby pomóc utrzymać przewody na miejscu.

Następnie za pomocą lutownicy z cienkim grotem wypełnij gniazdo roztopowanym spoiwem. Następnie sprawdź poprawność połączeń elektrycznych, używając miernika impedancji zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Używając oddzielnego, niewykorzystanego adaptera, wykonaj małą formę papierową z otworami w dnie.

W przypadku pinów męskich przenieś adapter roboczy do pudełka tak, aby strona męska znajdowała się na dnie, a piny wystawały z pudełka. Po zaklejeniu pudełka taśmą zgodnie z opisem w protokole tekstowym, szybko wymieszaj dwuskładnikową żywicę epoksydową i wlej ją do pudełka.

Aby unieruchomić adapter i wszystkie przewody, przymocuj końcową część rurki prowadzącej do jednej strony pudełka za pomocą wosku dentystycznego, pozostawiając jednak rurkę otwartą, tak aby drut tero mógł być swobodnie przeciągany z obu stron. Po utwardzeniu żywicy epoksydowej i wyschnięciu całego zestawu, następnym krokiem jest zaostrzenie tero. Rozpocznij od odcięcia końcówki tero ostrym ostrzem skalpela.

Następnie wypoleruj tero, używając małego urządzenia rotacyjnego zamontowanego pionowo z papierowymi tarczami ściernymi o średniej i drobnej ziarnistości. Ustaw urządzenie rotacyjne na umiarkowaną prędkość obrotową, trzymając wiązkę blisko jej końca. Za pomocą pęsety ustaw koniec z drutem pod kątem 45 stopni w stosunku do tarczy ściernej.

Kluczowe jest, aby kierunek obrotu tarcz szlifierskich był przeciwny do niewielkiego kąta nachylenia końców drutów. W przeciwnym razie może dojść do rozdzielenia drutów. Delikatnie dotknij wiązki tarczy szlifierskiej o średniej ziarnistości przez jedną do dwóch sekund, a następnie dotknij tarczy o drobnej ziarnistości przez kolejne jedną do dwóch sekund.

Powtórz tę czynność jeszcze trzy razy, obracając wiązkę osiowo o 90 stopni przy każdym powtórzeniu. Po zakończeniu użyj mikroskopu dissectingowego, aby sprawdzić, czy koniec wiązki ma spiczasty kształt, a z końców każdego przewodu usunięto niewielkie fragmenty izolacji i czy nie występuje żadne strzępienie. Następnie ponownie sprawdź impedancje zarówno pomiędzy poszczególnymi przewodami, jak i pomiędzy każdym przewodem a płytą uziemiającą.

Zanurzając końcówkę elektrody w nasyconym roztworze siarczanu miedzi, pokryj pierwszy drut warstwą metalu, stosując prąd o natężeniu 2,5 µA. Za pomocą izolatora bodźca podawaj prąd przez jedną sekundę. Odczekaj jedną sekundę i powtórz ten proces trzy razy.

Następnie w ten sam sposób osadź pozostałe trzy druciki. Ponownie sprawdź impedancję. Zamontuj adapter na stopniu głowicy systemu wielokanałowego do rejestracji.

Przymocuj zgiętą szpilkę entomologiczną do mikromanipulatora, a następnie za pomocą wosku dentystycznego przytwierdź koniec drutu tero do szpilki. Po znieczuleniu i unieruchomieniu karaczana zgodnie z opisem w protokole tekstowym, użyj żyletki, aby wyciąć małe okno między okiem a komórką O po usunięciu kutykuli. Za pomocą pęsety usuń tkanki łączną i tłuszcz, aby odsłonić mózg. Następnie wprowadź sól fizjologiczną dla karaczanów do kapsuły głownej, aby pokryć tkankę mózgową i odsłonić mózg z jego pochewek.

Używając precyzyjnej pęsety, delikatnie chwyć osłonkę na górnej części mózgu, a następnie inną precyzyjną pęsetą rozerwij osłonkę w obszarze implantacji drutu. Następnie użyj szpilki entomologicznej, aby wykonać niewielki otwór w torebce głownej przed mózgiem. Do otworu wprowadź splot trzech izolowanych miedzianych drutów o średnicy 56 micron.

Aby służyła jako referencyjna elektroda uziemiająca, opuść końcówkę tetro do powierzchni mózgu za pomocą mikromanipulatora i ustaw ją w pobliżu obszaru zainteresowania. Ostrożnie umieść dwa małe kawałki cienkiej folii octanowej o wymiarach dwa na jeden milimetr, nieco większe niż otwór w torebce czaszkowej, przed i za elektrodą.

Powoli obniż tetrodę na odległość 150 do 250 mikronów poniżej powierzchni mózgu, monitorując jednocześnie jakość rejestracji. Poszukuj spontanicznych impulsów zewnątrzkomórkowych o umiarkowanej lub dużej amplitudzie, co będzie wskazywać zarówno na obszar zainteresowania, jak i ogólną żywotność tkanki nerwowej. Po ustaleniu właściwego położenia tetrody, przesuń dwa arkusze octanu tak blisko niej, jak to możliwe, aby jej nie dotykały.

Podczas sekcji i implantacji należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przerwać przewodów. Używając małej szpatułki wykonanej poprzez spłaszczenie końcówki igły hipodermicznej, należy rozgrzać szpatułkę nad palnikiem alkoholowym. Następnie należy zanurzyć szpatułkę w wosku dentystycznym w taki sposób, aby na jej końcówce znalazł się płynny wosk.

Ostrożnie dotknij płynnym woskiem krawędzi arkusza octanowego znajdującej się najdalej od tero, pozwalając, aby płynny wosk uszczelnił szczelinę między arkuszem octanowym a kutykulą głowy. Kontynuuj podgrzewanie szpatułki i nanieś niewielką ilość płynnego wosku na arkusz octanowy. Przesuwaj się stopniowo w stronę tero, aż w końcu unieruchomisz tero za pomocą niewielkiej ilości wosku dentystycznego.

Należy unikać przedostania się gorącego wosku do jamu oraz na mózg. Następnie w podobny sposób przymocować elektrodę referencyjną za pomocą wosku. Teraz podgrzać wosk łączący tero z mikromanipulatorem, aby zwolnić tero z jego uchwytu.

Następnie zapętlij tero w wosku na głowie, aby zapewnić odciążenie, a następnie pokryj pętlę odciążającą woskiem. W tym momencie ostrożnie usuń mocowania i przenieś preparat na szalkę Petriego umieszczoną na lodzie. Unieruchom preparat stroną grzbietową do góry za pomocą dużych pinów siodłowatych. Używając pistoletu z klejem, przymocuj drewniany patyczek w taki sposób, aby wystawał od pro noum nad odwłokiem.

Następnie przymocuj końcówkę rurki tero do tylnego końca pręta za pomocą wosku dentystycznego. Potem przytwierdź rurkę tero oraz elektrodę odniesienia do przedniego końca pręta, używając wosku dentystycznego. Następnie wyciągnij rurkę tero z końca gniazda tak daleko, jak to możliwe, uważając jednak, aby jej nie szarpać.

Przymocuj go do adaptera za pomocą wosku, aby wyeliminować ryzyko uszkodzenia przez zwierzę wystawionej części tero. Po usunięciu wszystkich ograniczeń, przytwierdź elektrodę odniesienia do rurki tero za pomocą wosku dentystycznego. Przed rozpoczęciem eksperymentów behawioralnych uzyskaj dobre zapisy neurologiczne i wideo, zgodnie z opisem w protokole tekstowym; w przypadku eksperymentów z chodzeniem pozwól karaluchowi zapoznać się z areną z pleksiglasu, a w przypadku eksperymentów z wspinaniem się – z areną do wspinaczki.

Użyj długiej, wąskiej areny z przeszkodą w postaci półki, przez którą zwierzę może przejść górą lub pod którą może przejść dołem, lub bloku z pleksiglasu, na który zwierzę może się wspiąć. Podczas rejestracji wygeneruj impuls TTL z komputera za pomocą dostosowanego polecenia MATLAB. Impuls TTL generuje znacznik czasu dla systemu rejestrującego oraz włącza lub wyłącza światło LED podczas prób stymulacyjnych.

Serie impulsów prądu między przewodami rejestrującymi mogą być wykorzystane do wywołania zachowania po zakończeniu eksperymentu, po podaniu prądu stałego o natężeniu 5 µA przez pięć sekund przez jeden z końców drutu i elektrodę referencyjną w celu osadzenia miedzi w mózgu. Aby zaznaczyć położenie końcówki drutu, przedstawiono tutaj surowe ślady napięcia z pojedynczych elektrod w obrębie jednego wiązka tero. Zwróć uwagę na różnice w przebiegach napięć pomiędzy poszczególnymi elektrodami.

Trzy jednostki zostały posortowane przy użyciu MLU. Przedstawiono tutaj trójwymiarowy widok energii przebiegów zarejestrowanych na trzech z czterech elektrod. Każdy punkt odpowiada pojedynczemu zdarzeniu przekroczenia progu, oznaczonemu kolorem przypisanego do niego klastra.

Ten zrzut ekranu pochodzi z filmu z próby wspinania; nad każdą klatką przedstawiono znormalizowaną prędkość, wysokość karaczana oraz chwilową częstotliwość wyładowań dwóch posortowanych jednostek od pierwszej do aktualnej klatki. Czas zero oznacza moment rozpoczęcia wspinania. W celach prezentacyjnych częstotliwość wyładowań została znormalizowana w zakresie od 0 do 1, a prędkość i wysokość w zakresie od 0 do 0,5. Znaki pod każdą klatką wskazują impulsy dwóch posortowanych jednostek w ciągu jednej sekundy od aktualnej klatki. Pomarańczowa linia oznacza czas objęty każdą klatką, a niebieski prostokąt wskazuje dwukrotną szerokość jądra, które zostało użyte do obliczenia chwilowej częstotliwości wyładowań dla aktualnej klatki.

Nagranie to zostało wykonane w prawym ciele wachlarzowatym. Częstość wyładowań jednostki one one wzrosła podczas wspinania się, a wzrost częstości wyładowań wyprzedził wzrost prędkości. Jednostka one two była nieaktywna przed wspinaniem się, lecz zaczęła emitować wyładowania po rozpoczęciu wspinania.

Na tym ujęciu z Próby Eksploracji Areny czerwona owalna linia wskazuje kształt karalucha w danej klatce, a czerwona przerywana linia oznacza położenie środka masy karalucha w poprzednich 10 klatkach. Przedstawione są tutaj prędkość skręcania i chodzenia do przodu, a także chwilowa częstotliwość wyładowań jednostki dwa jeden. Kolce jednostki dwa, jeden w przedziale czterech sekund od bieżącej klatki są pokazane poniżej kadru.

Podobnie jak wcześniej, pomarańczowa linia wskazuje czas objęty każdą klatką, a niebieski prostokąt oznacza dwukrotność szerokości jądra, które zostało użyte do obliczenia chwilowej częstotliwości wyładowań dla bieżącej klatki. Nagranie to zostało wykonane w środkowej części ciała wachlarza. Pozycja karalucha oraz orientacja jego ciała w każdej klatce zostały wyekstrahowane przy użyciu oprogramowania do śledzenia, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, i wykorzystane do obliczenia prędkości postępowej oraz kierunkowej, a także chwilowej częstotliwości wyładowań.

Częstotliwość wyładowań jednostki 2.1 wzrosła, gdy karaczan zaczął iść, i była skorelowana z prędkością chodu. W przypadku wielu jednostek kompleksu centralnego zwiększona częstotliwość wyładowań była ograniczona do konkretnych stanów lokomocyjnych. Na przykład jednostka 2.1 była dostrojona do chodu do przodu, niezależnie od prędkości skręcania.

Trajektoria karalucha z filmu została tutaj przedstawiona. Duża czarna kropka oznacza punkt startowy karalucha, a każda mała czarna kropka wskazuje jego pozycję w poszczególnych klatkach. Trajektoria została zakodowana kolorami, aby zobrazować chwilową częstotliwość wyładowań jednostki dwa, gdzie kolor niebieski oznacza niską częstotliwość, a czerwony wysoką częstotliwość wyładowań.

Na tej mapie częstotliwości wyładowań jednostki 21 oś X przedstawia prędkość obrotu, a oś Y prędkość chodu do przodu. Dodatnia prędkość obrotu oznacza skręcanie w prawo, a ujemna prędkość obrotu oznacza skręcanie w lewo. Położenie elektrody zostało określone na podstawie złogów miedzi widocznych po procedurze histologicznej opisanej w tekście.

Alternatywnie elektrodę można pokryć barwnikiem fluorescencyjnym i zlokalizować za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jest to złożony zestaw technik, który nawet po opanowaniu wymaga wielu godzin pracy; najlepiej jest podzielić elementy na podzbiory, wyprodukować i przetestować kilka terosów przed rozpoczęciem eksperymentu z implantacją.

Ważne jest, aby pamiętać o wstępnym przetestowaniu tero pod kątem prawidłowej impedancji międzyprzewodowej i indywidualnej oraz o zachowaniu szczególnej ostrożności podczas implantacji i zabezpieczania progów w mózgu. W celu uproszczenia procedury analizy można zastosować metody takie jak zautomatyzowane śledzenie w czasie rzeczywistym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wytwarzać i implantować tero, aby skoordynować aktywność fizjologiczną ze złożonymi zachowaniami swobodnie poruszającego się owada.