Name: Zewnątrzkomórkowy zapis tetrody drutowej w mózgu swobodnie chodzących owadów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T16:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Naucz się techniki zewnątrzkomórkowego zapisu tetrodą drutową w mózgu swobodnie chodzących owadów. Ta metoda pozwala rejestrować aktywność neuronalną i synchronizować ją z zachowaniem w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Nickowi Kathmanowi za sugestie i pomoc w przygotowaniu rękopisu. Technika ta została opracowana w połączeniu z pracami wspieranymi przez AFOSR w ramach grantu FA9550-10-1-0054 oraz National Science Foundation w ramach grantu nr FA9550-1-0054. IOS-1120305 do RER.

1. Przygotowanie drutów tetrodowych
<ol>
	<li>Wyciągnij bardzo cienki drut nichromowy (średnica 12 μm, powłoka PAC) o długości około 1,1 m. Przymocuj przywieszkę do każdego końca. Zawieś drut na poziomym pręcie gwintowanym tak, aby oba końce znajdowały się na tej samej wysokości w pobliżu blatu.</li>
	<li>Powtórz krok 1.1 dla drugiego drutu, wykonując dwa kolejne końce, co daje w sumie 4, i umieść go obok pierwszego drutu (około 1 cm pomiędzy nimi).</li>
	<li>Sklej cztery końce razem za pomocą taśmy i przymocuj tag do zmotoryzowanego obrotowego urządzenia do nawijania. To urządzenie może być wykonane z niedrogiego silnika prądu stałego.</li>
	<li>Nawiń tetrodę w jednym kierunku przez 2 min (60 obr./min) i rozwijaj ją w przeciwnym kierunku przez 30 sekund.</li>
	<li>Użyj opalarki, aby połączyć ze sobą przewody. Nie dotykaj przewodów pistoletem. Użyj trzech przejść w górę iw dół z naprzemiennych kierunków, przy czym każde przejście zajmuje około 10 sekund.</li>
	<li>Przetnij górną i dolną część nawiniętych drutów. Cztery przewody są skręcone i połączone ze sobą na jednym końcu, ale oddzielone na drugim.</li>
	<li>Dodaj rurkę nośną. Wytnij rurkę polietylenową o długości 30 cm (średnica: wewnętrzna 0,28 mm, zewnętrzna 0,61 mm). Bardzo powoli i ostrożnie wkręć tetrodę w rurkę nośną, aby się nie załamywała.</li>
	<li>Gdy bezpiecznik wyjdzie z drugiej strony, przeciągnij go tak, aby na obu końcach rurki prowadzącej znajdowała się równa długość drutu.</li>
	<li>Chwyć oddzielny koniec każdego drutu za pomocą kleszczy. Używając podstawy płomienia palnika gazowego, ostrożnie spal izolację z ostatnich 2 lub 3 mm każdego drutu. Podgrzej drut, aż zacznie się żarzyć, ale nie zwija.</li>
	<li>Podłącz tetrodę do adaptera gniazda IC męsko-żeńskiego, który pasuje do Twojego urządzenia nagrywającego. Włóż odizolowany koniec każdego przewodu do innego gniazda adaptera za pomocą kleszczyków. Ustabilizuj przewód w gnieździe za pomocą małego mosiężnego kołka. Użyj cienkiej lutownicy punktowej i napełnij gniazdo stopionym lutowiem. Uważaj, aby nie zetknąć delikatnego drutu z lutownicą.</li>
	<li>Sprawdź impedancję każdego przewodu i impedancję wewnętrzną każdej pary przewodów.
	<ol>
		<li>Umieść stopiony, skręcony koniec w pojemniku z solą fizjologiczną i podłącz przewód z drutu miedzianego od soli fizjologicznej do omomierza.</li>
		<li>Podłącz drugi koniec miernika do styku gniazda zawierającego przewód. Impedancja każdego przewodu powinna być poniżej 3 MΩ. </li>
		<li>Jeśli powyższe wartości nie zostaną osiągnięte, spróbuj ponownie wykonać połączenia lutowane.</li>
		<li>Wyjmij przewody z soli fizjologicznej, spłucz końcówki wodą i przetestuj impedancję między przewodami dla każdej pary (n = 6). Impedancja wewnętrzna powinna wynosić powyżej 5 MΩ.</li>
		<li>Jeśli powyższe wartości nie zostaną osiągnięte, odetnij niewielką ilość końcówki na stopionym końcu i przetestuj ponownie. </li>
		<li>Wyrzuć każdy zestaw przewodów, który nie spełnia obu wymagań dotyczących impedancji dla wszystkich przewodów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zabezpiecz tetrodę.
	<ol>
		<li>Złóż małe prostokątne pudełko papierowe nieco większe niż adapter gniazda.</li>
		<li>Przenieś adapter do pudełka tak, aby męska strona znajdowała się na dole. Przebij pudełko tak, aby wszystkie kołki po stronie męskiej znajdowały się na zewnątrz pudełka, podczas gdy reszta adaptera znajdowała się wewnątrz pudełka.</li>
		<li>Przyklej rogi pudełka na zewnątrz. Użyj małych kawałków dwustronnej taśmy klejącej po wewnętrznej stronie pudełka, aby ustabilizować pojedyncze pasma drutu. Przewód powinien być zabezpieczony w momencie wychodzenia z pudełka.</li>
		<li>Wymieszaj szybko ustawioną 2-częściową żywicę epoksydową i wlej do pudełka, aby zabezpieczyć adapter i wszystkie przewody.</li>
		<li>Przymocuj bliski koniec rurki prowadzącej do jednej strony pudełka za pomocą wosku dentystycznego, ale pozostaw rurkę otwartą, tak aby tetroda mogła być swobodnie przeciągana na obu końcach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naostrz tetrodę.
	<ol>
		<li>Przed każdym eksperymentem odetnij czubek tetrody ostrym ostrzem skalpela, a nie nożyczkami. Zapobiega to zgniecaniu i rozsuwaniu końcówek drutu, zapewniając jednocześnie czystą, płaską krawędź do następnego kroku.
		<ol>
			<li>Użyj małego narzędzia obrotowego zamontowanego pionowo z tarczami szlifierskimi o średniej i drobnej ziarnistości (można je połączyć na jednej platformie), aby wypolerować tetrodę i usunąć część izolacji końcówki. Przytrzymaj pakiet w pobliżu jego końca za pomocą kleszczy. Przechyl koniec zestawu drutu pod kątem 45° w stosunku do tarczy szlifierskiej i delikatnie przyłóż go do wirującej tarczy o umiarkowanej prędkości przez około 1 lub 2 sekundy na podłożu, a następnie na drobnym ziarnie. Powtórz to jeszcze trzy razy, za każdym razem obracając wiązkę osiowo o 90°. Bardzo ważne jest, aby kierunek wirowania tarcz szlifierskich był oddalony od płytkiego kąta końców drutu, w przeciwnym razie może dojść do rozdzielenia drutów.</li>
			<li>Pożądany rezultat przekształca koniec wiązki z prostej krawędzi w spiczastą końcówkę z niewielką ilością izolacji usuniętą z końca każdego drutu. Sprawdź punkt za pomocą mikroskopu preparacyjnego przed poszyciem tetrody. Jeśli na końcówce wystąpi strzępienie, ponownie przyciąć i wypolerować.</li>
			<li>Jeśli test impedancji podczas kolejnego etapu powlekania wykaże wyjątkowo niskie wartości między drutami (mniej niż 4 MΩ), oznacza to, że zbyt dużo materiału usunięto podczas etapu polerowania. Wytnij ponownie i ponownie wypoleruj tetrodę.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieść tetrodę na talerzu. Umieść końcówkę tetrody w nasyconym roztworze siarczanu miedzi (85 ml wody, 5 ml kwasu siarkowego, 50 g siarczanu miedzi). Płytkę na każdy przewód prądem 2,5 μA za pomocą izolatora bodźców. Wstrzyknij prąd na 1 sekundę, zatrzymaj się na 1 sekundę i powtórz ten proces 4 razy.</li>
		<li>Sprawdź impedancję każdego przewodu i impedancję każdej pary przewodów. Impedancja każdego przewodu powinna wynosić od 0,5 do 1 MΩ, a impedancja pośrednia powinna przekraczać 4 MΩ.</li>
		<li>Zamontuj adapter na scenie czołowej wielokanałowego systemu nagrywania.</li>
		<li>Przymocuj wygiętą szpilkę do owadów do mikromanipulatora. Przymocuj końcówkę tetrody do szpilki przeciw owadom za pomocą wosku dentystycznego</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Znieczulij karalucha lodem.</li>
	<li>Gdy karaluch przestanie się poruszać, przymocuj karalucha pionowo do płaskiej powierzchni korka za pomocą dużych kołków siodłowych, które siedzą okrakiem na owadzie, ale nie penetrują żadnej części jego ciała.</li>
	<li>Przenieś preparat do plastikowego pojemnika i umieść lód wokół zwierzęcia, aby zminimalizować przepływ krwi i ruchy ciała.</li>
	<li>Umieść plastikowy kołnierz na szyi, aby podeprzeć głowę i umieść wosk dentystyczny wokół głowy, aby ją ustabilizować.</li>
	<li>Wytnij małe okienko między oczkami żyletką i usuń naskórek z głowy.</li>
	<li>Usuń tkankę łączną i tłuszcz za pomocą kleszczy, aby odsłonić mózg.</li>
	<li>Umieść trochę soli fizjologicznej z karaluchów w torebce głowy, aby pokryć tkankę mózgową.</li>
	<li>Aby usunąć pochewkę mózgu, użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie chwycić osłonkę na górze mózgu i użyj innych cienkich kleszczy, aby rozerwać osłonkę w obszarze wszczepionego drutu.</li>
	<li>Otwórz mały otwór w torebce głowy przed mózgiem za pomocą szpilki przeciw owadom. Włóż do otworu oplot z trzech izolowanych drutów miedzianych o większej średnicy (56 μm), aby służył jako elektroda odniesienia/uziemiająca.</li>
	<li>Opuść końcówkę tetrody na powierzchnię mózgu za pomocą mikromanipulatora i umieść ją w pobliżu obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Ostrożnie umieść dwa małe kawałki cienkiego arkusza octanu (2 mm x 1 mm), nieco większe niż otwór w torebce głowy, przed i za tetrodą.</li>
	<li>Włącz system nagrywania.</li>
	<li>Powoli opuść tetrodę 150-250 μm poniżej powierzchni mózgu, w zależności od jakości nagrania.</li>
	<li>Wyłącz system nagrywania.</li>
	<li>Przesuń dwa kawałki arkusza octanu jak najbliżej tetrody, nie dotykając jej (Rysunek 1A).</li>
	<li>Podgrzej małą szpatułkę lub spłaszczoną igłę podskórną i włóż ją do wosku dentystycznego tak, aby na końcu szpatułki znajdował się płynny wosk. Ostrożnie dotknij szpatułką drugiego końca każdego kawałka arkusza octanu od tetrody, aby płynny wosk mógł spłynąć na każdy kawałek i uszczelnić szczelinę między nim a naskórkiem głowy.</li>
	<li>Powtórz krok 2.16. Za każdym razem upuść niewielką ilość płynnego wosku na arkusz octanu. Rozpocznij proces z dala od tetrody i stopniowo zbliżaj się do niej. Ostatecznie tetroda zostanie zakotwiczona w wosku dentystycznym. Unikaj dostania się gorącego wosku do jamy ustnej i na mózg.</li>
	<li>Użyj tej samej metody, co w krokach 2.16 i 2.17, aby zakotwiczyć elektrodę odniesienia/uziemiającą za pomocą wosku.</li>
	<li>Podgrzej wosk, który mocuje tetrodę do mikromanipulatora, aby uwolnić z niego tetrodę.</li>
	<li>Zapętl tetrodę w wosku dentystycznym na głowie, aby zapewnić odciążenie (ryc. 1B).</li>
	<li>Przykryj pętlę odciążającą woskiem dentystycznym (Rysunek 1C).</li>
	<li>Ostrożnie usuń ograniczenia i przenieś preparat na szalkę Petriego. Ogranicz preparat grzbietową stroną do góry za pomocą dużych kołków siodłowych.</li>
	<li>Przymocuj pręt do przedplecza za pomocą pistoletu do klejenia. Jest to drewniany kij, który rozciąga się od przedplecza nad brzuchem.</li>
	<li>Przymocuj końcówkę rurki tetrody do tylnego końca pręta za pomocą wosku dentystycznego.</li>
	<li>Zakotwicz tetrodę i elektrodę referencyjną/uziemiającą do przedniego końca pręta za pomocą wosku dentystycznego.</li>
	<li>Wyciągnij tetrodę z końcówki gniazda rurki tak bardzo, jak to możliwe, ale nie ciągnij jej, aby wyeliminować ryzyko, że zwierzę może uszkodzić część tetrody na zewnątrz rurki (rysunek 1D).</li>
	<li>Usuń wszystkie ograniczenia. Przymocuj elektrodę referencyjną/uziemiającą do rurki tetrody za pomocą wosku dentystycznego.</li>
	<li>Przed jakimkolwiek eksperymentem należy odczekać co najmniej 60 minut, aż zwierzę dojdzie do siebie po znieczuleniu lodowym.</li>
</ol>
3. Procedury eksperymentalne
<ol>
	<li>Podłącz komputer zarówno z systemem nagrywania, jak i diodą LED za pomocą USB do portu szeregowego.</li>
	<li>Rozpocznij nagrania neuronowe.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie wideo z szybkością 20 klatek na sekundę do eksperymentów chodzących za pomocą pakietu akwizycji obrazu Motmot16 lub 120 kl./s do eksperymentów wspinaczkowych przy użyciu szybkiej kamery.</li>
	<li>Umieść karalucha na arenie z pleksiglasu o wymiarach 40 cm x 40 cm do eksperymentów z chodzeniem lub na arenie o długości 58 cm, szerokości 5 cm i wysokości 5 cm do eksperymentów wspinaczkowych. Arena spacerowa posiada przezroczystą barierę rozciągającą się od środka prawej ściany do środka areny, nad którą znajduje się scena główna. Bariera służy do uniemożliwienia zwierzętom chodzenia w miejscach, w których widok kamery jest zasłonięty przez scenę główną. Arena wspinaczkowa ma akrylowy blok (o wysokości 1,2 cm lub 1,8 cm i szerokości 5 cm) lub półce umieszczonej na porównywalnej wysokości pośrodku.</li>
	<li>Wygeneruj impuls TTL z komputera za pomocą dostosowanego polecenia MATLAB. (s=serial('COM4'); fopen(s); s.RequestToSend='off'/s.RequestToSend='on'/; fclose(s); delete(s);). Impuls TTL generuje znacznik czasu dla systemu nagrywającego i włącza lub wyłącza diodę LED. </li>
	<li>Pozwól karaluchowi eksplorować arenę, dopóki nie przestanie się poruszać na dłużej niż 30 sekund w celu przeprowadzenia eksperymentów z chodzeniem. Pozwól karaluchowi wspiąć się na blok/półkę lub tunel przez półkę w celu eksperymentów wspinaczkowych. </li>
	<li>Zatrzymaj nagrywanie wideo.</li>
	<li>Zatrzymaj nagrania neuronowe.</li>
	<li>Zapisz znacznik czasu wygenerowany przez impuls TTL.</li>
	<li>Usuń karalucha z areny i odczekaj co najmniej 3 minuty.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.2-3.10 dla następnej próby.</li>
	<li>Po zakończeniu wszystkich nagrań przepuść przez 5 sekund prąd stały o natężeniu 5 μA przez jedną z końcówek drutu (anodę) i elektrodę odniesienia (katodę), aby wprowadzić miedź do mózgu na końcówce drutu.</li>
</ol>
4. Analiza offline
<ol>
	<li>Synchronizuj dane wideo i neuronowe, łącząc klatkę, w której przełączane jest światło LED, ze znacznikiem czasu zarejestrowanym przez system nagrywania w tym momencie.</li>
	<li>Zaznacz lokalizacje końcówek przewodów. Zastosować procedury intensyfikacji Timms do wytrącania i obserwacji miedzi w sekcjach szeregowych12 μm 17. Wydatne osady powinny być widoczne w 3-8 sąsiadujących ze sobą odcinkach (około 18-48% długości grzbietowej płaszczyzny brzusznej obszaru, z którego nagrywamy) (ryc. 2).</li>
	<li>Koreluj określone impulsy elektryczne z aktywnością pojedynczych neuronów. Postępuj zgodnie z procedurami sortowania spajków szczegółowo opisanymi w innym miejscu10,14,18. Użyj programu KlustaKwik (wersja 1.5, autor K. Harris, Rutgers University) do generowania początkowego, automatycznego grupowania. Zaimportuj je do programu MClust (wersja 3.5, autorzy A.D. Redish i wsp., University of Minnesota) w celu dalszego udoskonalenia i analizy (Rysunek 3).</li>
	<li>Śledź ruchy karalucha. W przypadku eksperymentów z chodzeniem wyodrębnij pozycję (wizualnego) środka ciężkości karalucha i jego orientację ciała w każdej klatce nagrań wideo za pomocą Caltech Multiple Fly Tracker (wersja 0.1.5.6; http://ctrax.sourceforge.net/) i powiązanego zestawu narzędzi FixErrors dla MATLAB19. W przypadku eksperymentów wspinaczkowych wyodrębnij pozycję bloku oraz głowy i przedplecza karalucha w każdej klatce filmu za pomocą pakietu oprogramowania do analizy ruchu.</li>
</ol>

<ol><li>Strauss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+complex+and+the+genetic+dissection+of+locomotor+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The central complex and the genetic dissection of locomotor behaviour.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 633-638 (2002).</li>
<li>Pick, S., Strauss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goal-driven+behavioral+adaptations+in+gap-climbing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Goal-driven behavioral adaptations in gap-climbing Drosophila.</a> Curr. Biol. 15, 1473-1478 (2005).</li>
<li>Triphan, T., Poeck, B., Neuser, K., Strauss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+targeting+of+motor+actions+in+climbing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visual targeting of motor actions in climbing Drosophila.</a> Curr. Biol. 20, 663-668 (2010).</li>
<li>Heinze, S., Gotthardt, S., Homberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+polarized+light+information+in+the+central+complex+of+the+locust%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuorosci%22%5BJournal%5D)">Transformation of polarized light information in the central complex of the locust.</a> J. Neuorosci. 29, 11783-11793 (2009).</li>
<li>Heinze, S., Homberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maplike+representation+of+celestial+E-vector+orientations+in+the+brain+of+an+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maplike representation of celestial E-vector orientations in the brain of an insect.</a> Science. 315, 995-997 (2007).</li>
<li>Heinze, S., Homberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroarchitecture+of+the+central+complex+of+the+desert+locust%3A+Intrinsic+and+columnar+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroarchitecture of the central complex of the desert locust: Intrinsic and columnar neurons.</a> J. Comp. Neurol. 511, 454-478 (2008).</li>
<li>Heinze, S., Homberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+the+input+to+the+output%3A+new+sets+of+neurons+complement+the+polarization+vision+network+in+the+locust+central+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Linking the input to the output: new sets of neurons complement the polarization vision network in the locust central complex.</a> J. Neurosci. 29, 4911-4921 (2009).</li>
<li>Heinze, S., Reppert, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sun+compass+integration+of+skylight+cues+in+migratory+monarch+butterflies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies.</a> Neuron. 69, 345-358 (2011).</li>
<li>Brill, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+via+a+dual+olfactory+pathway+in+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing via a dual olfactory pathway in the honeybee.</a> J Neurosci. 33, 2443-2456 (2013).</li>
<li>Guo, P., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+in+the+central+complex+of+the+cockroach+brain+is+linked+to+turning+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural activity in the central complex of the cockroach brain is linked to turning behaviors.</a> J. Exp. Biol. 216, 992-1002 (2013).</li>
<li>Ritzmann, R. E., Ridgel, A. L., Pollack, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-unit+recording+of+antennal+mechanosensitive+units+in+the+central+complex+of+the+cockroach%2C+Blaberus+discoidalis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Multi-unit recording of antennal mechanosensitive units in the central complex of the cockroach, Blaberus discoidalis.</a> J. Comp. Physiol. A. 194, 341-360 (2008).</li>
<li>Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+recording+of+neuronal+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale recording of neuronal ensembles.</a> Nature Neurosci. 7.5, 446-445 (2004).</li>
<li>Huston, S. J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+sensorimotor+integration+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Studying sensorimotor integration in insects.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21, 527-534 (2011).</li>
<li>Bender, J. A., Pollack, A. J., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+in+the+central+complex+of+the+insect+brain+is+linked+to+locomotor+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural activity in the central complex of the insect brain is linked to locomotor changes.</a> Curr. Biol. 20, 921-926 (2010).</li>
<li>Harrison, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+Neural%2FEMG+telemetry+systems+for+small+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE%22%5BJournal%5D)">Wireless Neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals.</a> IEEE. 5, 103-111 (2011).</li>
<li>Straw, A. D., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motmot%2C+an+open-source+toolkit+for+realtime+video+acquisition+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis.</a> Source Code Biol. Med. 4, 5(2009).</li>
<li>Strausfeld, N. J., Miller, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTyrer%2C+NM+%22Neuroanatomical+Techniques.+Insect+Nervous+System%22">Neuroanatomical Techniques. Insect Nervous System</a>. , Springer Verlag. (1980).</li>
<li>Daly, K., Wright, G., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+features+of+odorants+systematically+influence+slow+temporal+responses+across+clusters+of+coordinated+antennal+lobe+units+in+the+moth%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophsyiol%22%5BJournal%5D)">Molecular features of odorants systematically influence slow temporal responses across clusters of coordinated antennal lobe units in the moth, Manduca sexta.</a> J. Neurophsyiol. 92, 236-254 (2004).</li>
<li>Branson, K., Robie, A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nat Methods. 6, 451-457 (2009).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podczas gdy wcześniejsze badania elektrofizjologiczne nad CC lub innymi obszarami mózgu owadów dostarczyły nam wglądu w centralną kontrolę zachowania, większość z nich przeprowadzono w preparatach z ograniczeniami9,11 lub na uwięzi10,14. W rezultacie doznania sensoryczne i stan fizjologiczny zwierzęcia mogą bardzo różnić się od tych w środowisku naturalnym. Co więcej, zadania behawioralne, które zwierzę może wykonać, są w takich sytuacjach ograniczone do jednej płaszczyzny. Tutaj przedstawiliśmy met...

Ten artykuł opisuje udany system rejestracji z neuronów w centralnym kompleksie (CC) karalucha, Blaberus discoidalis, gdy owad chodzi po arenie i ma do czynienia z obiektami, które powodują, że się obraca, tuneluje pod nim lub wspina się na przeszkody. Przewody można również podłączyć do stymulatora, aby wywołać aktywność w otaczającym neuropilu, a w konsekwencji zmiany w zachowaniu.

W ciągu ostatniej dekady wiele uwagi poświęcono rolom, jakie odgrywają różne regiony mózgu w kontrolowaniu zachowania owadów. Duża część tego skupienia została skierowana w stronę neuropils w linii środkowej mózgu, które są zbiorczo określane jako kompleks centralny (CC). Postęp został osiągnięty w wyniku szerokiej gamy technik ukierunkowanych na pytania o rolę CC w zachowaniu. Techniki te obejmują zarówno manipulacje neurogenetyczne, głównie u Drosophila, w połączeniu z analizą behawioralną1-3, jak i techniki elektrofizjologiczne, które monitorują aktywność neuronalną w CC i próbują powiązać tę aktywność z parametrami istotnymi behawioralnie. 

Techniki elektrofizjologiczne obejmują zapis wewnątrzkomórkowy z indywidualnie zidentyfikowanych neuronów4-9 oraz zapis zewnątrzkomórkowy, często z wielokanałowymi sondami10,11. Te dwie techniki są komplementarne. Zapis wewnątrzkomórkowy z ostrymi elektrodami lub plastrem całej komórki dostarcza bardzo szczegółowych danych na temat zidentyfikowanych neuronów, ale jest ograniczony do jednej lub dwóch komórek jednocześnie, wymaga ograniczonego ruchu lub nie wymaga go wcale i może być utrzymywany przez stosunkowo krótki okres czasu. Nagrania zewnątrzkomórkowe można łatwo ustawić, nie wymagają ograniczeń i mogą być przechowywane przez wiele godzin. Dzięki tetrodom wielokanałowym i cięciu klastrów można jednocześnie analizować dość duże populacje neuronów9,12. Podczas gdy łatka z całych komórek została z powodzeniem wykorzystana u owadów na uwięzi13, uważamy, że istnieje również zapotrzebowanie na techniki, które pozwolą nam rejestrować aktywność neuronalną w mózgu przez długi czas u swobodnie zachowujących się owadów, które radzą sobie z barierami w poruszaniu się do przodu.

Potrzeba nagrywania, gdy owad porusza się i podskakuje w górę i w dół, popchnęła nas w kierunku pozakomórkowych metod nagrywania. Odnieśliśmy duży sukces w nagrywaniu w preparatach powściągliwych za pomocą dostępnych na rynku 16-kanałowych sond krzemowych11, jednak niewielkie rozmiary nawet dużych karaluchów oznaczają, że sondy muszą być montowane poza ciałem. To, w połączeniu z delikatnością zębów sondy, sprawiło, że nie nadawały się one do przygotowania do swobodnego chodzenia. W dwóch poprzednich projektach użyliśmy wiązek cienkich drutów tworzących tetrodę, aby uzyskać podobne właściwości nagrywania, ale w bardziej wytrzymałym układzie. Te wiązki tetrody pozwoliły nam zarejestrować z uwiązanych karaluchów i powiązać aktywność jednostki CC ze zmianami prędkości chodzenia14 i skrętu wynikającymi z kontaktu anteny z prętem10.

Jakkolwiek użyteczne były i będą te preparaty na uwięzi, to jednak mają pewne ograniczenia. Po pierwsze, zachowania, które może wykonywać owad, są ograniczone do jednej płaszczyzny. Oznacza to, że z łatwością mogliśmy wywołać zmiany prędkości chodzenia lub skręcania, ale wspinanie się i drążenie tuneli nie było możliwe, przynajmniej przy typowym układzie uwięzi. Po drugie, nasze preparaty na uwięzi są "otwartą pętlą". Oznacza to, że nie pozwalają na normalne sprzężenie zwrotne związane z ruchem do systemu. Tak więc, gdy karaluch włączył naszą więź, jego świat wizualny nie został odpowiednio zmieniony. Możliwe jest zbudowanie systemów uwięzi w pętli zamkniętej, aby wprowadzić tego rodzaju sprzężenie zwrotne. Są one jednak ograniczone przez złożoność programowania i sprzętu symulowanego środowiska wizualnego. Niemniej jednak czuliśmy, że możemy ulepszyć nasze istniejące metody nagrywania na uwięzi, rejestrując zwierzę, które swobodnie porusza się po arenie lub torze i napotyka obiekty, tak jak robiłoby to w swoim naturalnym otoczeniu.

Chociaż bezprzewodowe systemy do rejestrowania aktywności mózgu15 byłyby idealne, obecne systemy mają ograniczenia w liczbie kanałów nagrywania, czasie pozyskiwania danych, żywotności baterii i wadze. W związku z tym zdecydowaliśmy się spróbować dostosować nasz system nagrywania na uwięzi do użytku w preparatach do swobodnego przemieszczania się. W miarę pojawiania się lepszych systemów bezprzewodowych, technikę tę można łatwo dostosować do takich urządzeń. System opisany w tym artykule jest lekki, działa bardzo dobrze i wydaje się, że ma niewielki szkodliwy wpływ na zachowanie karalucha. Dzięki niedrogiej, szybkiej kamerze i oprogramowaniu do cięcia klastrów, aktywność poszczególnych neuronów mózgowych może być powiązana z ruchem. W tym miejscu opisujemy przygotowanie drutów tetrody i ich wszczepienie do mózgu owada, a także techniki rejestrowania aktywności elektrycznej i ruchu oraz sposób, w jaki dane te można zebrać w celu późniejszej analizy.

<table><tbody><tr><td>Drut nichromowy&nbsp;</td><td>Sandvik Heating Technology</td><td>Kanthal RO-800</td><td>Zastosowanie do tetrody</td></tr><tr><td>Biomedyczne rurki polietylenowe</td><td>AM Systems</td><td>800700</td><td>Zastosowanie do rurek tetrodowych</td></tr><tr><td>Lynx-8</td><td>Neuralynx</td><td></td><td>Służy do nagrywania wielu jednostek</td></tr><tr><td>Cheetah 32</td><td>Neuralynx</td><td></td><td>Służy do nagrywania wielu jednostek</td></tr><tr><td>Szybka kamera</td><td>Basler</td><td>A602f</td><td>Służy do nagrywania wideo dla eksperymenty z chodzeniem</td></tr><tr><td>Szybka kamera</td><td>Casio</td><td>EX-FC150</td><td>Służy do nagrywania wideo do eksperymentów wspinaczkowych</td></tr><tr><td>WINanalyze</td><td></td><td>Winanalyze wersja 1.4 3D Służy</td><td>do śledzenia wideo&nbsp;</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>MATLAB R2012b</td><td>Służy do generowania impulsów TTL i analizy danych offline</td></tr></tbody></table>

zewnątrzkomórkowy zapis tetrody drutowej w mózgu swobodnie chodzących owadów

Extracellular Wire Tetrode Recording in Brain of Freely Walking Insects

Rosnące zainteresowanie rolą aktywności mózgu w kontroli motorycznej owadów wymaga od nas możliwości monitorowania aktywności neuronalnej, podczas gdy owady zachowują się naturalnie. Wcześniej opracowaliśmy technikę wszczepiania drutów tetrody do centralnego kompleksu mózgów karaluchów, która pozwoliła nam rejestrować aktywność wielu neuronów jednocześnie, podczas gdy karaluch na uwięzi obracał się lub zmieniał prędkość chodzenia. Chociaż jest to duży postęp, preparaty na uwięzi zapewniają dostęp do ograniczonych zachowań i często brakuje im procesów sprzężenia zwrotnego, które zachodzą u swobodnie poruszających się zwierząt. Prezentujemy teraz zmodyfikowaną wersję tej techniki, która pozwala nam nagrywać z centralnego kompleksu swobodnie poruszających się karaluchów, gdy chodzą po arenie i radzą sobie z barierami poprzez skręcanie, wspinanie się lub drążenie tuneli. W połączeniu z szybkim nagrywaniem wideo i wycinaniem klastrów, możemy teraz powiązać aktywność mózgu z różnymi parametrami ruchu swobodnie zachowujących się owadów.

Zarejestrowaliśmy aktywność neuronalną 50 jednostek z CC w 27 preparatach podczas eksperymentów dotyczących chodzenia. Dla 15 z tych preparatów (23 jednostki) przeprowadzono również eksperymenty dotyczące wspinania się. Poszczególne jednostki są nazwane zgodnie z numerami preparatów i jednostek (np. „unit 1-2” oznacza preparat 1, jednostkę 2).
Klatki z filmu przedstawiające jedną próbę wspinaczki pokazano na Rysunku 4. Cały film jest dostępny w dodatkowym Film...

Wcześniej opracowaliśmy technikę wszczepiania drutów tetrodowych do centralnego kompleksu mózgów karaluchów, która pozwala nam monitorować aktywność w poszczególnych jednostkach karaluchów na uwięzi. Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną wersję tej techniki, która pozwala nam również rejestrować aktywność mózgu u swobodnie poruszających się owadów.

Zewnątrzkomórkowy zapis tetrody drutowej w mózgu swobodnie chodzących owadów

Increasing interest in the role of brain activity in insect motor control requires that we be able to monitor neural activity while insects perform ...

Ogólnym celem tej procedury jest rejestracja złożonej aktywności neuronalnej w mózgu i skoordynowanie jej z zachowaniami swobodnie poruszających się owadów zarejestrowanymi na wideo. Jest to osiągane poprzez uprzednie wykonanie elastycznych elektrod rejestrujących z niezwykle cienkiego drutu, ostrzenie, testowanie i powlekanie końcówki oraz materiału do znakowania jej lokalizacji i stabilizacji drutu w rurce polietylenowej. Drugim krokiem jest wprowadzenie elektrody rejestrującej do mózgu, ustabilizowanie jej za pomocą octanu i wosku oraz przymocowanie do głowy pętli odciążającej.Następnie rejestruje się aktywność neuronalną wraz z nagraniem wideo zachowań lokomocyjnych. Synchronizuje się wideo z zapisem za pomocą impulsu synchronizującego skierowanego do diody LED oraz wzmacniacza. Ostatnim krokiem jest osadzanie miedzi przy użyciu stałego prądu elektrycznego i intensyfikacja barwienia metodą Tima w celu wizualizacji miejsca rejestracji.Ostatecznie techniki wysokogęstościowego wielokanałowego sortowania pozakomórkowego pozwalają na identyfikację jednostek neuronalnych, podczas gdy analiza jednoczesnego zapisu wideo zachowań umożliwia precyzyjną korelację aktywności neuronalnej z z

extracellular-wire-tetrode-recording-brain-freely-walking

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestracja za pomocą czujników zewnątrzkomórkowych w mózgu wolno chodzących owadów

Opisujemy metodę rejestracji aktywności motorycznej, zsynchronizowaną z elektrycznie rejestrowanym sygnałem kontaktu stopowego u uwięzionego owada chodzącego po śliskiej powierzchni. Metoda ta jest wykorzystywana do badania neuronalnych podstaw adaptacyjnego zachowania przy zredukowanym wpływie oddziaływań mechanicznych między odnóżami a podłożem.

Badanie neuronowych podstaw adaptacyjnego zachowania lokomocyjnego u owadów

Film demonstruje procedurę wszczepienia bezprzewodowej dwukierunkowej wielokanałowej elektrody do mózgu szczura w celu nagrywania i stymulowania wielokanałowych sieci neuronowych.

Wszczepienie bezprzewodowego dwukierunkowego systemu mikroelektrod do mózgu szczura

Wideo demonstruje zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej z ośrodkowego układu nerwowego (OUN) larw Drosophila. Przecięty OUN jest umieszczany w komorze rejestracyjnej, a aktywność elektryczna z nerwu zstępującego jest rejestrowana w celu ustalenia podstawowej częstotliwości wypalania. Następnie wprowadza się czynnik testowy i rejestruje się zmianę częstotliwości wypalania w celu określenia działania pobudzającego lub hamującego czynnika.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności elektrycznej w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

Ten artykuł opisuje sekcję brzusznego rdzenia nerwowego karalucha oraz pozakomórkowe nagrania z nerwu szyjnego i łączników. Reakcje wywołane są generowane przez elektryczną stymulację nerwu szyjnego lub bezpośrednią mechaniczną stymulację szyjki macicy.

Zapis obwodu neuronalnego z nienaruszonego układu nerwowego karalucha

U pszczół miodnych ustalono jednoczesne zewnątrzkomórkowe długoterminowe zapisy z dwóch różnych neuropile mózgowych lub dwóch różnych dróg anatomicznych. Nagrania te pozwalają na badanie czasowych aspektów przetwarzania neuronalnego w różnych obszarach mózgu zarówno na poziomie pojedynczego neuronu, jak i na poziomie zespołu u zachowującego się zwierzęcia.

Jednoczesne długoterminowe zapisy na dwóch etapach przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych

Ta metoda tworzy namacalne, znajome środowisko dla myszy do nawigacji i eksploracji podczas obrazowania mikroskopowego lub jednokomórkowych zapisów elektrofizjologicznych, które wymagają mocnego unieruchomienia głowy zwierzęcia.

Płaska podłoga podniesiona powietrznie: nowa metoda łączenia zachowania z mikroskopią lub elektrofizjologią na obudzonych, swobodnie poruszających się gryzoniach

Prezentujemy metody budowy elektrod do jednoczesnego rejestrowania zewnątrzkomórkowej aktywności neuronalnej i uwalniania wielu substancji neuroaktywnych w pobliżu miejsc rejestracji u obudzonych myszy. Technika ta pozwala na szczegółową analizę przypuszczalnych lokalnych wejść synaptycznych do neuronu będącego przedmiotem zainteresowania.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej w połączeniu z mikrojonoforowym zastosowaniem substancji neuroaktywnych u obudzonych myszy

Prezentujemy trzy nowe metody do nauki kodowania smakowego. Posługując się prostym zwierzęciem, Manduca sexta (Manduca), opisujemy protokół preparacji, użycie zewnątrzkomórkowych tetrod do rejestrowania aktywności wielu neuronów receptorów smakowych oraz system dostarczania i monitorowania precyzyjnie wymierzonych impulsów degustacji.

Nowe metody badania kodowania smaku

Wprowadzono bezprzewodowy, dwukierunkowy system do wielokanałowych zapisów neuronowych i stymulacji u swobodnie zachowujących się szczurów. System jest lekki i kompaktowy, dzięki czemu ma minimalny wpływ na repertuar behawioralny zwierzęcia. Co więcej, ten dwukierunkowy system zapewnia wyrafinowane narzędzie do oceny związków przyczynowo-skutkowych między wzorcami aktywacji mózgu a zachowaniem.

Bezprzewodowy, dwukierunkowy interfejs do rejestrowania in vivo i stymulacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się szczurów

Prezentowana jest nowatorska technika bezprzewodowa do rejestrowania zewnątrzkomórkowych sygnałów nerwowych z mózgu swobodnie pływających złotych rybek. Urządzenie rejestrujące składa się z dwóch tetrod, mikronapędu, rejestratora danych neuronowych i wodoodpornej obudowy. Wszystkie części są wykonywane na zamówienie, z wyjątkiem rejestratora danych i jego złącza.

Bezprzewodowa elektrofizjologiczna rejestracja neuronów przez ruchome tetrody u swobodnie pływających ryb

Naucz się techniki zewnątrzkomórkowego zapisu tetrodą drutową w mózgu swobodnie chodzących owadów. Ta metoda pozwala rejestrować aktywność neuronalną i synchronizować ją z zachowaniem w czasie rzeczywistym.

Zewnątrzkomórkowy zapis tetrody drutowej w mózgu swobodnie chodzących owadów

Przeglądaj więcej filmów