Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Ogólnym celem poniższej procedury jest ocena zdolności inwazyjnej komórek nowotworowych za pomocą trójwymiarowego testu inwazji. Osiąga się to poprzez pierwszą hodowlę komórek rakowych w macierzy błony podstawnej. Inwazję komórkową macierzy obserwuje się następnie przez pięć lub więcej dni za pomocą mikroskopii świetlnej.

W ostatnim etapie komórki są znakowane przeciwciałami fluorescencyjnymi w celu lokalizacji interesujących białek. Ostatecznie szybkość inwazji komórek nowotworowych i wynikające z niej zmiany w ekspresji białek można przeanalizować za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi technikami, takimi jak test inwazji w komorze Transwella, jest to, że test inwazji 3D głównego żelu lepiej naśladuje środowisko in vivo, które rak rozwiązuje wzrost.

Implikacją tej techniki jest terapia raka, w której w badaniu można zidentyfikować nowe białka, które są zaangażowane w inwazję raka i przerzuty. Przed rozpoczęciem procedury hodowli należy umieścić matrycę błony podstawnej a pipetę P 200 i końcówki pipet na lodzie na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia użyj końcówki lodowatej pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby rozprowadzić 50 mikrolitrów matrycy spiralnie na dnie konfokalnego naczynia ze szklanym dnem numer jeden.

Następnie umieść naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na co najmniej 30 minut, podczas gdy matryca przechodzi krzepnięcie oczu trypsynowych, 70 do 80% zlewających się 100-milimetrowych płytek komórek, gdy komórki zaczną się odłączać. Dezaktywuj trypsynę za pomocą 10 mililitrów pożywki, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Wirować komórki przez trzy minuty w temperaturze 100 g i czterech stopniach Celsjusza, podczas gdy komórki się obracają.

Podzielić 50 mikrolitrów matrycy na jedną mililitrową mikroprobówkę wirówkową na naczynie matrycy membrany podstawnej i umieścić probówki na lodzie, gdy komórki zakończą wirowanie. Odessać supernatant bez naruszania osadu, a następnie zreusować. Zawieś komórki w jednym mililitrze podłoża i policz je dalej.

Przenieś 2,5 razy 10 do czwartej komórki do nowej probówki mikrowirówki, uzupełniając zawiesinę komórek pożywką do końcowej objętości 50 mikrolitrów. Następnie dodaj 50 mikrolitrów lodowatej matrycy błony podstawnej do komórek w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać końcową objętość 100 mikrolitrów. Delikatnie umieść mieszaninę matrycy do komórki na zestalonej matrycy błony podstawnej i pozwól komórkom osadzić się w matrycy w inkubatorze hodowli komórkowych.

Po 30 minutach przykryj matrycę dwoma mililitrami pożywki i umieść naczynie z powrotem w inkubatorze, zmieniając pożywkę codziennie przez czas trwania eksperymentu, używaj obiektywu 10 x mikroskopu świetlnego raz dziennie przez czas trwania eksperymentu, aby wykonać 20 interferencji różnicowych. Kontrastowe obrazy kolonii zawieszonych w macierzy błony podstawnej. Analizuj obrazy na ślepo, aby określić tworzenie się gwiaździstej kolonii komórek.

Kolonię uważa się za gwiaździstą, jeśli obserwuje się jedną lub więcej wypustek komórek ze steroidu. Aby zbadać cechy morfogeniczne kolonii 3D, wyjmij komórki z inkubatora i umieść je na tacy z lodem. Odessać pożywkę, a następnie umyć kolonię trzykrotnie dwoma mililitrami zimnego PBS.

Po ostatnim umyciu utrwal komórki w dwóch mililitrach 20% roztworu acetonu, 80% metanolu przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie przywróć naczynia do temperatury pokojowej. Gdy matryca błony podstawnej osiągnie temperaturę pokojową, odessać utrwalacz i trzykrotnie umyć płytkę PBS, jak pokazano. Po ostatnim myciu zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania na komórkach za pomocą dwóch mililitrów 3% BSA przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie inkubować komórki w pierwotnych przeciwciałach będących przedmiotem zainteresowania, rozcieńczonych w 3% BSA w temperaturze pokojowej. Po godzinie usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego po trzykrotnym wypłukaniu niezwiązanego przeciwciała pierwszorzędowego PBS, dodać przeciwciało drugorzędowe rozpuszczone w 3% BSA w odpowiednim rozcieńczeniu i inkubować komórki przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Po wypłukaniu niezwiązanego przeciwciała drugorzędowego PBS wybarwić jądra komórek w dwóch mililitrach hekstu 3, 3, 2, 5, 8 w PBS przez pięć minut w ciemności.

Następnie przemyj niezwiązany sześciokąt z komórek pięciokrotnie PBS. Po piątym przemyciu dodać pożywkę montażową bezpośrednio na mieszaninę matrycy do komórek i ostrożnie przykryć podłoże montażowe szklanym szkiełkiem nakrywkowym, aby zapobiec zakłóceniom integralności mieszaniny matrycy błony podstawnej do komórek. Wysuszyć naczynie przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie uzyskać obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o odpowiednich długościach fal laserowych dla przeciwciał użytych na tych obrazach.

Zilustrowano komórki MDA MB 2 3 1 atakujące matrycę 3D. Komórki zagnieździły się w macierzy pierwszego dnia i zaczęły tworzyć inwazyjne struktury gwiaździste w trzecim dniu. Piątego dnia można było zaobserwować całkowitą inwazję matrycy.

Liczba utworzonych kolonii gwiaździstych została następnie policzona i wyrażona jako procent całkowitej liczby inwazyjnych i nieinwazyjnych kolonii na talerzu. Dodatkowo, ponieważ pomiary były wykonywane codziennie przez pięć dni, szybkość inwazji można było również ocenić na tych obrazach immunofluorescencyjnych. Reprezentatywne inwazyjne kolonie gwiaździste komórek MDA MB 2 3 1 wykazujące utratę integralności błony i rozproszoną lokalizację białka błony podstawnej lamininy pięć są pokazane w wyraźnym kontraście do tego, co obserwuje się w komórkach raka piersi MDA MB 2 31.

Piąta laminina była zlokalizowana w nienaruszonej warstwie błony podstawnej otaczającej asyninę pamięci nieleczonych niezłośliwych komórek MCF 10 A. Po tej procedurze można przeprowadzić wspólną hodowlę z komórkami zrębu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy komórki rakowe komunikują się z komórkami zrębu w mikrośrodowisku po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie onkologii do badania inwazji i migracji raka, które są niezbędne do przerzutowego rozprzestrzeniania się komórek rakowych.