Name: Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj metodę trójwymiarowych testów inwazyjności komórek raka piersi z wykorzystaniem matrycy błony podstawnej. Technika ta pozwala na dokładną kwantyfikację zachowań inwazyjnych i zmian ekspresji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została przeprowadzona dzięki funduszom dla M.B. z grantu MOP Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR) 107972. M.B. jest laureatem CIHR New Investigator Salary Award. D.C. jest laureatem stypendiów z Translational Breast Cancer Research Unit oraz CIHR Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer, London Regional Cancer Program. C.G. jest stypendystą Translational Breast Cancer Research Unit, Londyński Regionalny Program Walki z Rakiem oraz CIHR - Strategiczny Program Szkoleniowy w zakresie Badań nad Rakiem i Transferu Technologii. Sgd.

1. Trójwymiarowa hodowla komórek raka piersi w macierzy błony podstawnej (technika zatopienia)
<ol>
	<li>Obsługa macierzy błony podstawnej Matrigel: rozmrażać na lodzie przez noc w temperaturze 4 °C. Macierz błony podstawnej jest ciekła w niskiej temperaturze, ale krzepnie w temperaturze pokojowej. Przechowywać macierz błony podstawnej na lodzie (Ryciny 1A-B).</li>
	<li>Pokryć naczynko z przeszklonym dnem Confocal nr 1 50 μl macierzy błony podstawnej, rozprowadzając ją za pomocą końcówki pipety P-200 Pipetman ruchem spiralnym (Rycina 1C). Należy zachować ostrożność podczas rozprowadzania macierzy błony podstawnej, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza. Podobnie, należy unikać rozprowadzania macierzy zbyt blisko krawędzi naczynka z przeszklonym dnem, aby zapobiec powstaniu menisku. W przypadku braku doświadczenia w obchodzeniu się z macierzą błony podstawnej, naczynko, pipeta P-200 Pipetman i końcówki mogą być schłodzone na lodzie (alternatywnie pozostawione na noc w lodówce w temperaturze 4 °C). Ten krok zapewnia dodatkowy czas na rozprowadzenie macierzy błony podstawnej przed jej krzepnięciem. Umieścić naczynko(a) w inkubatorze do hodowli komórkowych (w temperaturze 37 °C przy 5% CO2) na co najmniej 30 min, aby macierz błony podstawnej mogła zestalić się (Rycina 1D).</li>
	<li>Podczas krzepnięcia macierzy należy poddać trypsynizacji płytkę 100-mm z komórkami o konfluencji 70-80%. Gdy komórki zaczną odklejać się od płytki, resuspenderować je w 10 ml pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), aby zneutralizować trypsynę (Rycina 1E). Następnie przenieść resuspenderowane komórki do probówki stożkowej 15 ml (Rycina 1F).</li>
	<li>Wirować komórki (znajdujące się w probówce stożkowej) przy 100 x g przez 3 min w dedykowanej wirówce do hodowli komórkowych (Ryciny 1G-H).</li>
	<li>Podczas wirowania komórek odmierzyć 50 μl macierzy do probówki mikrocentryfużowej 1 ml (uwaga: każdemu naczynku z przeszklonym dnem przypisana jest jedna probówka mikrocentryfużowa; zatem, jeśli eksperyment wymaga 3 naczynek, konieczne są również 3 probówki mikrocentryfużowe), a następnie umieścić probówkę na lodzie (Rycina 1B).</li>
	<li>Odssać pożywkę z probówki stożkowej z kroku 1.4, pozostawiając osad nienaruszony (Rycina 1I). Resuspenderować komórki (po wirowaniu) w 1 ml pożywki RPMI uzupełnionej FBS (Rycina 1J).</li>
	<li>Po policzeniu komórek za pomocą komory countingowej (Rycina 1K) lub liczniku cząstek komórkowych, odmierzyć 2,5 x 104 komórek do probówki mikrocentryfużowej i uzupełnić odpowiednią pożywką, aby uzyskać całkowitą objętość 50 μl (Rycina 1L).</li>
	<li>Wymieszać komórki z kroku 1.7 (25 000 komórek w 50 μl) z probówką mikrocentryfużową zawierającą macierz z kroku 1.5 w stosunku 1:1; objętość końcowa wyniesie 100 μl (Rycina 1M).</li>
	<li>Ostrozną nanieść 100 μl mieszaniny macierz:komórki z kroku 1.8 na naczynko pokryte zestaloną macierzą błony podstawnej z kroku 1.2 (Rycina 1N). Pozwala to na zatopienie komórek w macierzy błony podstawnej.</li>
	<li>Przenieść naczynko(a) do inkubatora do hodowli komórkowych (w temperaturze 37 °C przy 5% CO2) i pozwolić mieszaninie macierz:komórki krzepnąć przez co najmniej 30 min.</li>
	<li>Po zastaleniu się mieszaniny macierz:komórki dodać do naczynka 2 ml pożywki RPMI uzupełnionej FBS (Rycina 1O) i przenieść naczynko z powrotem do inkubatora, gdzie będzie przechowywane przez resztę eksperymentu (Rycina 1P).</li>
	<li>Wymieniać pożywkę codziennie przez okres 5 dni (lub zgodnie z wymaganiami analizy; czas trwania analizy dla komórek MDA-MB-231 wynosi 5 dni).</li>
	<li>Używając mikroskopu świetlnego, wykonać obrazy w kontraście różnicowym (DIC) kolonii MDA-MB-231 zawieszonych w macierzy błony podstawnej (Rycina 3A). Obrazować 20 reprezentatywnych obszarów przy użyciu obiektywu 10X raz dziennie przez pięć dni, aby określić morfogenezę kolonii (Rycina 3C).</li>
	<li>Analizować obrazy ślepo, aby określić formowanie się gwiaździstych kolonii komórkowych (Rycina 3B). Kolonię uznaje się za gwiaździstą, jeśli zauważone zostaną jedno lub więcej wypustek wychodzących ze sferoidu komórek. Aby określić procent inwazyjnych kolonii gwiaździstych, podzielić liczbę kolonii gwiaździstych przez całkowitą liczbę kolonii komórkowych na każdym obrazie, a następnie obliczyć średni procent kolonii gwiaździstych z 20 obrazów dla każdego dnia.</li>
</ol>
<img alt="Schemat procesu hodowli komórkowej; układ eksperymentalny; etapy powlekania macierzą, wirowania i resuspensji." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51341/51341fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Trójwymiarowa hodowla komórek raka piersi MDA-MB-231 w macierzy błony podstawnej (technika zatapiania). A-B) Schemat układu eksperymentalnego (wykonanego w dygestorium). C) Dołek naczynia z szklanym dnem powleczony 50 μl macierzy błony podstawnej. D) Naczynie(nia) umieszczone w inkubatorze do hodowli komórkowych (w 37 °C z 5% CO2), aby umożliwić zestalenie macierzy przez co najmniej 30 min. E) Komórki zostały poddane trypsynizacji. F) Komórki zostały resuspensowane w 15 ml probówce stożkowej. G-H) Komórki (znajdujące się w probówce stożkowej) zostały odwirowane przy 100 x g przez 3 min w wirówce do hodowli tkankowych. I) Osad komórkowy. J) Komórki (po odwirowaniu) zostały resuspensowane w 1 ml pożywki RPMI uzupełnionej o FBS. K) Komórki zostały policzone przy użyciu hemocytometru. L) 2,5 x 104 komórek odmierzono do probówki do mikrocentryfugi i uzupełniono odpowiednią pożywką, aby uzyskać objętość całkowitą 50 μl. M) Zmieszać komórki z kroku 1.7 (25 000 komórek w 50 μl) z probówką do mikrocentryfugi zawierającą macierz z kroku 1.5 w stosunku 1:1; objętość końcowa wyniesie 100 μl. N) Ostrożnie nanieść 100 μl mieszaniny macierz:komórki z kroku 8 na zestaloną macierz w naczyniu z kroku 1.2. O) Po zestaleniu mieszaniny macierz:komórki, dodać do naczynia 2 ml pożywki RPMI uzupełnionej o FBS. P) Umieścić naczynie w inkubatorze, gdzie będzie przechowywane do końca eksperymentu.
2. Badanie cech morfogenicznych kultur 3D z wykorzystaniem immunofluorescencji
<ol>
	<li>Przed wyjęciem naczyń z inkubatora przygotuj tace z lodem, zimny roztwór buforu fosforanowego (PBS), 20% aceton: 80% metanol (roztwór utrwalający) oraz 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA; roztwór blokujący) (Rycina 2A).</li>
	<li>Umieść naczynia na tacy z lodem i odessij medium, następnie przemyj 3x 2 ml zimnego PBS (Rycina 2B).</li>
	<li>Po odessaniu ostatniego przemycia PBS dodaj do naczyń 2 ml roztworu 20% aceton: 80% metanol (Rycina 2C), aby utrwalić komórki przez 20 min w temperaturze 4 °C (na lodzie lub w lodówce) (Rycina 2D).</li>
	<li>Po zakończeniu 20-minutowej utrwalania pozostaw naczynia w temperaturze pokojowej, odessij utrwalacz, a następnie przemyj 3x PBS. Po odessaniu końcowego przemycia PBS dodaj do naczyń 2 ml 3% BSA, aby zablokować wiązania przez co najmniej 30 min w temperaturze pokojowej (Rycina 2E).</li>
	<li>Podczas okresu blokowania przygotuj rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych (laminina V 1:100) i drugorzędowych (w odpowiednim rozcieńczeniu) rozpuszczonych w buforze blokującym 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Należy pamiętać, że 400-500 μl roztworu „BSA + przeciwciało pierwszorzędowe” należy dodać bezpośrednio na mieszaninę macierzy i komórek.</li>
	<li>Po upływie 30 min blokowania dodaj przeciwciała pierwszorzędowe i inkubuj przez co najmniej 1 h w temperaturze pokojowej (Rycina 2F). Należy pamiętać, aby nie wykonywać przemyć PBS po 30-minutowym okresie blokowania.</li>
	<li>Po zakończeniu kroku 2.6 usuń roztwór „BSA + przeciwciało pierwszorzędowe” i przemyj 3x PBS.</li>
	<li>Dodaj przeciwciało drugorzędowe rozpuszczone w 3% BSA (w odpowiednim rozcieńczeniu) bezpośrednio na mieszaninę macierzy i komórek, przykryj naczynia i inkubuj przez 1 h w temperaturze pokojowej (Rycina 2G).</li>
	<li>Usuń roztwór „BSA + przeciwciało drugorzędowe” i przemyj 3x PBS.</li>
	<li>Dodaj 2 ml Hoechst 33258 (1:10 000) rozpuszczonego w PBS do barwienia jąder komórkowych i inkubuj przez 5 min pod folią aluminiową (lub przykryj nieprzezroczystym pojemnikiem, aby ograniczyć fotoblaknięcie) (Rycina 2H).</li>
	<li>Po upływie 5 min inkubacji z Hoechst 33258 przemyj naczynia 5x PBS.</li>
	<li>Dodaj medium montażowe bezpośrednio na mieszaninę macierzy i komórek w naczyniu do mikroskopii konfokalnej i ostrożnie przykryj szklaną lamelką, aby nie naruszyć integralności kolonii w mieszaninie macierzy błony podstawnej i komórek (Rycina 2I).</li>
	<li>Pozostaw naczynia do wyschnięcia przez noc (lub 24 h) w temperaturze pokojowej (Rycina 2I). Po wyschnięciu naczynia można przechowywać w temperaturze -20 °C, jednak wysoce zaleca się obrazowanie ich tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>Wykonaj zdjęcia przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z zastosowaniem odpowiednich długości fal laserowych dla użytych przeciwciał (Ryciny 3D-E).</li>
</ol>
<img alt="Metoda barwienia immunofluorescencyjnego; płukanie PBS, inkubacja z przeciwciałami, Hoechst; ustawienie eksperymentalne." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51341/51341fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Badanie hodowli 3D za pomocą immunofluorescencji. A) Schemat ustawienia eksperymentalnego. B) Naczynie(nia) umieszczone na tacy z lodem i odessanie medium; następnie komórki trzykrotnie płukano 2 ml zimnego PBS. C) Do naczynia(ń) dodano 2 ml roztworu 20% acetonu i 80% metanolu. D) Fixację komórek przeprowadzono przez 20 min w 4 °C (na lodzie lub w lodówce). E) Do naczynia(ń) dodano 2 ml 3% BSA w celu blokowania przez co najmniej 30 min w temperaturze pokojowej. F) Po upływie 30 min blokowania dodano przeciwciała pierwszorzędowe i inkubowano przez co najmniej 1 hr w temperaturze pokojowej. G) Przeciwciała drugorzędowe rozpuszczone w 3% BSA (w odpowiednim rozcieńczeniu) dodano bezpośrednio do mieszaniny macierzy błony podstawnej i komórek; następnie naczynia przykryto i inkubowano przez 1 hr w temperaturze pokojowej. H) Do naczynia(ń) dodano 2 ml Hoechst (1:10 000; rozpuszczonego w PBS) i inkubowano komórki przez 5 min pod folią aluminiową. I) Medium montażowe dodano bezpośrednio do mieszaniny macierzy i komórek w naczyniu do konfokalnego mikroskopu, a następnie naczynie przykryto szkiełkiem nakrywnym. Naczynia pozostawiono do wyschnięcia na noc (lub przez 24 hr) w temperaturze pokojowej.

<ol><li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutat Res. 752, 10-24 (2013).</li>
<li>Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+three-dimensional+basement+membrane+cultures+to+model+oncogene-induced+changes+in+mammary+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).</li>
<li>Eccles, S. A., Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+recent+discoveries+and+novel+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies.</a> Lancet. 369, 1742-1757 (2007).</li>
<li>Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+invasion+by+tumour+cells%3A+a+focus+on+MT1-MMP+trafficking+to+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia.</a> Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).</li>
<li>Bissell, M. J., Labarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context%2C+tissue+plasticity%2C+and+cancer%3A+are+tumor+stem+cells+also+regulated+by+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment.</a> Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).</li>
<li>Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Profiling+of+Cellular+Invasion+in+3D+Cell+Culture+Models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li>
<li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).</li>
<li>Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+of+human+breast+epithelial+cells%3A+the+how+and+the+why%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why.</a> Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).</li>
<li>Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+architecture%3A+the+ultimate+regulator+of+breast+epithelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function.</a> Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).</li>
<li>Debnath, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+apoptosis+in+creating+and+maintaining+luminal+space+within+normal+and+oncogene-expressing+mammary+acini%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini.</a> Cell. 111, 29-40 (2002).</li>
<li>Weaver, V. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+culture+models+to+study+mechanisms+governing+apoptosis+in+normal+and+malignant+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).</li>
<li>Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+functionally+relevant+cell+culture+model+of+progressive+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer.</a> Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).</li>
<li>Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+novel+3D+culture+model+to+elucidate+the+role+of+mesothelial+cells%2C+fibroblasts+and+extra-cellular+matrices+on+adhesion+and+invasion+of+ovarian+cancer+cells+to+the+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum.</a> Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+leukocytes+and+macrophages+of+various+phenotypes+have+distinct+abilities+to+form+podosomes+and+to+migrate+in+3D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments.</a> European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).</li>
<li>Sung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Impact+of+2D+and+3D+Fibroblast+Cultures+on+In+Vitro+Breast+Cancer+Models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models.</a> PLoS One. , (2013).</li>
<li>Li, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-arrestin%2FRal+signaling+regulates+lysophosphatidic+acid-mediated+migration+and+invasion+of+human+breast+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells.</a> Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).</li>
<li>Zajac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR54+%28KISS1R%29+transactivates+EGFR+to+promote+breast+cancer+cell+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Underwood, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+MCF-10A+acini%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of MCF-10A acini.</a> J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).</li>
<li>Lelievre, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+phenotype+depends+on+reciprocal+interactions+between+the+extracellular+matrix+and+the+structural+organization+of+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).</li>
<li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).</li>
<li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta4+integrin-dependent+formation+of+polarized+three-dimensional+architecture+confers+resistance+to+apoptosis+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium.</a> Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).</li>
<li>Cvetkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KISS1R+Induces+Invasiveness+of+Estrogen+Receptor-Negative+Human+Mammary+Epithelial+and+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells.</a> Endocrinology. , 1999-2014 (2013).</li>
<li>Alemayehu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Arrestin2+regulates+lysophosphatidic+acid-induced+human+breast+tumor+cell+migration+and+invasion+via+Rap1+and+IQGAP1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1.</a> PLoS One. , (2013).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Rozwój technik hodowli komórkowych 3D pozwolił naukowcom zbadać transformację komórek nabłonka piersi, co pozwoliło nam zobrazować dramatyczne zmiany morfologiczne. Oprócz analizy inwazji komórek, jedno- lub wielokomórkowe sferoidy nabłonka sutka można wykorzystać do oceny zmian w adhezji komórkowej, proliferacji, wielkości i polarności podstawno-wierzchołkowej. W przeciwieństwie do wcześniej zgłoszonych metodologii, w których komórki są nakładane na ECM8, nasza metoda osadza komórki w ECM18,19,24, ...

Migracja i inwazja pojedynczych lub zbiorowych komórek to dwie cechy charakterystyczne raka i są niezbędne do przerzutowego rozprzestrzeniania się komórek rakowych1-4. Zdolność komórek nowotworowych do inicjowania przerzutów zależy od ich zdolności do migracji i inwazji do sąsiedniej tkanki za pomocą inwadopodiów w celu degradacji błony podstawnej komórek. Inwadopodia to dynamiczne, bogate w aktyny wypukłości degradacji macierzy, które umożliwiają degradację macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez uwalnianie proteaz degradujących macierz5. Inwazja komórek nowotworowych polega na degradacji macierzy, po której następuje migracja komórek nowotworowych, a towarzyszy temu reorganizacja trójwymiarowego (3D) środowiska macierzy2. Tak więc, aby przeniknąć przez macierz, komórka musi przekształcić swój kształt i oddziaływać z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM)2.
Utrzymanie integralności tkanki piersi zależy od ściśle kontrolowanej architektury tkanki, ponieważ połączenia adhezyjne komórka-ECM i komórka-komórka wpływają na ekspresję genów, a zakłócenie polaryzacji nabłonka może prowadzić do wystąpienia raka6-10. Jednak większość testów migracji i inwazji in vitro, takich jak testy w komorze transwellowej lub testy zadrapań rany, jest dwuwymiarowa (2D) i dlatego pomijają skomplikowane interakcje między komórkami i ich sąsiednim środowiskiem3,6,8,11-14. Znaczne różnice morfologiczne i funkcjonalne, w tym różnice w morfologii komórek, różnicowaniu komórek, adhezjach macierzy komórkowej i wzorcach ekspresji genów, zostały wykryte przez hodowlę komórek w kulturach 3D, których powszechnie brakuje w testach 2D2,6,8,11. W związku z tym zastosowania testów 3D są niezwykle korzystne w rekapitulacji bardziej fizjologicznych warunków in vivo, co prowadzi do lepszego przełożenia przełomowych wyników badań podstawowych na klinikę6-10. Należy jednak zauważyć, że pomimo wielu zalet uzyskanych dzięki zastosowaniu kultur 3D, model ten nie jest w stanie uchwycić całej złożoności mikrośrodowiska guza in vivo, które obejmuje różne typy komórek. Możliwe jest jednak włączenie komórek zrębu do modeli 3D (na przykład fibroblastów, leukocytów i makrofagów) w celu zbadania wpływu interakcji guz-zręb na adhezję i inwazję komórek rakowych15-17.
Komórki nabłonka piersi w hodowli rosną najefektywniej, gdy obecne są białka ECM, takie jak laminina i kolagen. Mając to na uwadze, dostępna na rynku mieszanina macierzy została uzyskana z mysiego guza Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) i jest znana jako macierz błony podstawnej Matrigel2,8. Ustalono szereg technik hodowli komórek nabłonkowych jako kolonii 3D w macierzy błony podstawnej2,8. Model macierzy błony podstawnej 3D jest skuteczny w ustalaniu zarówno złośliwego, jak i niezłośliwego wzrostu komórek piersi, przypominając to, co dzieje się w środowisku in vivo 18,19. Komórki MCF10A to niezłośliwe komórki nabłonka sutka. Hodowane w macierzy błony podstawnej komórki te wykazują in vivo cechy normalnych komórek piersi i podlegają kontrolowanej proliferacji komórek, polaryzacji komórek i apoptozie w celu ustalenia przestrzeni światła8,12,20. Co więcej, wygląd jąder komórkowych komórek MCF10A tworzących acini w hodowlach 3D bardziej przypomina wygląd komórek nabłonka sutka w tkance niż tych hodowanych w monowarstwie21. Badania Bissella i współpracowników były pierwszymi, które ujawniły, że złośliwe komórki piersi można odróżnić od niezłośliwych komórek piersi, gdy są hodowane w otoczeniu bogatym w lamininę, ponieważ komórki nowotworowe wykazują wysoce zdezorganizowany fenotyp, zwiększoną proliferację, zmniejszoną adhezję komórkową, zwiększoną ekspresję markerów mezenchymalnych i wzrost liczby utworzonych struktur inwazyjnych3,6,22.
Nieprawidłowości środowiska komórkowego mogą wpływać na powstawanie nowotworów20. Metoda hodowli 3D może być wykorzystana do skutecznego badania komunikacji zachodzącej między komórkami nowotworowymi a otaczającym je środowiskiem oraz określenia, w jaki sposób ekspresja białek wpływa na taką komunikację14,20,21,23. W artykule przedstawiono szczegółową metodologię hodowli komórek raka piersi MDA-MB-231 w kulturach 3D w celu analizy inwazyjności oraz badania utraty morfologii nabłonka przy użyciu markera nabłonkowego lamininy, składnika błony podstawnej komórki18,19,24,25. Szczegółowe procedury zapewniają możliwość dokładnego i powtarzalnego ilościowego określenia tworzenia struktury gwiaździstej (inwazyjnej) przez dowolną inwazyjną komórkę nowotworową i nie ograniczają się do powszechnych linii komórkowych raka piersi (takich jak MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7 lub T47D). W związku z tym test ten może służyć jako platforma do oceny, w jaki sposób ekspresja białek w komórkach lub leczenie związkami pro- lub przeciwinwazyjnymi regulują degradację macierzy zewnątrzkomórkowej przez jedną lub wiele komórek.

<table><tbody><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>CA10011-700</td><td>Sterylne, jednorazowe</td></tr><tr><td>naczynie hodowlane 100 mm BD353003</td><td>VWR</td><td>CABD353003</td><td>Sterylne, jednorazowe</td></tr><tr><td>15 ml Probówka Falcon</td><td>VWR</td><td>CA21008-918</td><td>Sterylne,</td></tr><tr><td>jednorazowe końcówki z filtrem 1 ml</td><td>VWR</td><td>10011-350</td><td>Sterylne, jednorazowe</td></tr><tr><td>200 &#956; l końcówki z filtrem</td><td>VWR</td><td>22234-016</td><td>Sterylne, jednorazowe</td></tr><tr><td>20 &#956; l końcówki z filtrem</td><td>VWR</td><td>22234-008</td><td>Sterylne, jednorazowe</td></tr><tr><td>35-milimetrowe naczynia do hodowli konfokalnych nr 1 ze szklanym dnem&nbsp;</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td>Wstępnie schłodzony przed użyciem</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>BioShop</td><td>ALB003.100</td><td>Stosowany w stężeniu 3% dla IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Przeciwciało, wysoce adsorbowane</td><td>krzyżowo Life Technologies</td><td>&nbsp; A11029</td><td>1:250 dla IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Anti-Rabbit Life Technologies</td><td>&nbsp; A11011</td><td>1:1,200 dla</td></tr><tr><td>IF Anti-Beta-Catenin&nbsp;</td><td>Laboratoria Transdukcji BD</td><td>610153</td><td>Mysz monoklonalna; Stosowany w 1:100 dla IF</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td>Stosowany w 10% (v/v)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33258, Pentahydrat (bis-benzimid) - 10 mg&frasl; ml Roztwór w Water</td><td>Life Technologies</td><td>H3569</td><td>Stosowany w stężeniu 0,1% (rozcieńczenie 1:10 000)</td></tr><tr><td>Zestaw analizatorów InVivo&nbsp;</td><td>Cybernetyka</td><td></td> mediów <td>stosowana do obrazowania kultur 3D (obrazy DIC przy 10x i 40x)</td></tr><tr><td>Kisspeptin-10 (KP-10)</td><td>EZ Biolabs</td><td>PT0512100601</td><td>stosowana przy 100 nM&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-Laminina&nbsp;</td><td>Cedarlane</td><td>AB19012(CH)</td><td>Królik poliklonalny człowieka o pełnej długości; Używany w skali 1:100 do</td></tr><tr><td>laserowego mikroskopu skaningowego IF LSM-510 META&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Używany w obiektywie 63X; soczewki olejowe</td></tr><tr><td>Matrigel bez czerwieni fenolowej (BD356237)</td><td>VWR</td><td>CACB356237</td><td>&nbsp; Nr działki 2180819; Mikroskop Olympus IX-81 10,4 mg/ml</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Używany do obrazowania hodowli 3D (obrazy DIC przy 10-krotnym i 40-krotnym</td></tr> powiększeniu)<tr><td>Penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Antybiotyk (dodawany do pożywki; stosowany w stężeniu 0,01%)Pipeta</td></tr> <tr><td>10 ml</td><td>VWR</td><td>CA53300-523</td><td>Sterylny, jednorazowy</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Podłoże z glutaminą</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td>Używane do hodowli komórek</td></tr> <tr><td>MDA-MB-2310,25% Trypsyna-EDTA (1x), Phenol Red</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td>Służy do trypsynizacji komórek MDA-MB-231</td></tr><tr><td>MEGM (zestaw pocisków): MEBM (CC3151) + pojedyncze cytaty (CC4136)</td> <td>Lonza</td><td>CC-3150</td><td>Służy do hodowli komórek MCF10A</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3d)

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Teraz dobrze wiadomo, że mikrośrodowisko komórkowe i tkankowe są kluczowymi regulatorami wpływającymi na inicjację i progresję nowotworu. Ponadto wykazano, że macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) jest krytycznym regulatorem zachowania komórek w hodowli i homeostazy in vivo. Obecne podejście polegające na hodowli komórek na dwuwymiarowych (2D), plastikowych powierzchniach powoduje zakłócenie i utratę złożonych interakcji między komórkami a ich mikrośrodowiskiem. Dzięki zastosowaniu trójwymiarowych (3D) testów hodowli ustala się warunki interakcji komórka-mikrośrodowisko przypominające mikrośrodowisko in vivo. W artykule przedstawiono szczegółową metodologię hodowli komórek raka piersi w matrycy białkowej błony podstawnej 3D, ilustrując potencjał hodowli 3D w ocenie inwazji komórek do otaczającego środowiska. Ponadto omawiamy, w jaki sposób te testy 3D mogą potencjalnie badać utratę cząsteczek sygnałowych, które regulują morfologię nabłonka przez procedury barwienia immunologicznego. Badania te pomagają zidentyfikować ważne szczegóły mechanistyczne w procesach regulujących inwazję, niezbędną do rozprzestrzeniania się raka piersi.

Przykład naciekania komórek MDA-MB-231 w macierzy 3D przedstawiono na Rysunku 3C. Komórki zostają osadzone w macierzy (Dzień 1), zaczynają tworzyć struktury naciekające (gwiaździste) do Dnia 3, a do Dnia 5 całkowicie naciekają macierz (Rysunek 3C). Liczbę utworzonych kolonii gwiaździstych przelicza się i wyraża jako procent całkowitej liczby kolonii na płytce (naciekających i nienaciekających). Ponadto, ponieważ pomiary są wykonywane codziennie przez pięć dni, można również ocenić tempo ...

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Ogólnym celem poniższej procedury jest ocena zdolności inwazyjnej komórek nowotworowych z wykorzystaniem trójwymiarowego testu inwazji. Osiąga się to poprzez wstępne hodowanie komórek nowotworowych w matrycy błony podstawnej. Następnie inwazję komórkową w matrycy obserwuje się przez pięć lub więcej dni za pomocą mikroskopii świetlnej.W ostatnim kroku komórki są znakowane przeciwciałami fluorescencyjnymi w celu lokalizacji białek zainteresowania. W efekcie szybkość inwazji komórek nowotworowych oraz wynikające z niej zmiany w ekspresji białek mogą zostać przeanalizowane za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test inwazji w komorach Transwell, jest fakt, że test inwazji w żelu 3D lepiej naśladuje środowisko in vivo, w którym rozwijają się nowotwory.Zastosowanie tej techniki ma znaczenie dla terapii nowotworowej, umożliwiając identyfikację nowych białek biorących udział w inwazji i przerzutowaniu raka. Przed rozpoczęciem procedury hodowli, macierz błony podstawnej, pipetę P 200 oraz końcówki do pipet należy umieścić na lodzie na noc w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza. Następnego dnia, używając

quantification-breast-cancer-cell-invasiveness-using-three

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Określenie stopnia inwazyjności komórek raka piersi przy użyciu trójwymiarowego (3D) modelu

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Ten film przedstawia szczegółową metodologię hodowli komórek raka piersi w matrycy białkowej błony podstawnej 3D, ilustrując potencjał hodowli 3D w ocenie inwazji komórek do otaczającego środowiska.

Test błony podstawnej hodowli 3D: hodowla komórek rakowych na matrycy białkowej błony podstawnej 3D w celu zbadania inwazji komórek

Źródło: Guyon, J., et al. Model sferoidalny 3D glejaka. J. Vis. Exp. (2020)Film demonstruje generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych. Sferoidy są tworzone z ludzkich komórek nowotworowych mózgu i osadzone w macierzy kolagenowej. Komórki nowotworowe na obrzeżach sferoidy przyjmują fenotyp inwazyjny, wydzielając proteazy w celu degradacji kolagenu i posuwając się do inwazji na otaczającą macierz.

Generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Pokazujemy metodę generowania 3D surogatek raka piersi, które mogą być hodowane za pomocą systemu bioreaktora perfuzyjnego do dostarczania tlenu i składników odżywczych. Po wzroście surogaty są utrwalane i przetwarzane na parafinę w celu oceny parametrów będących przedmiotem zainteresowania. Wyjaśniono ocenę jednego z takich parametrów, gęstości komórek.

Przygotowanie i analiza trójwymiarowych substytutów raka piersi in vitro

Komórki rakowe są umieszczane w żelu kolagenowym, a następnie umieszczane w bezkomórkowym żelu fibrynowym w celu wygenerowania systemu hodowli 3D, w którym można monitorować inwazyjność i powstawanie nowotworów satelitarnych.

Trójwymiarowy test hodowli w celu zbadania inwazyjności komórek rakowych i tworzenia guzów satelitarnych

Procesy rządzące inwazją raka pęcherza moczowego stanowią okazję do rozwoju biomarkerów i terapii. Poniżej przedstawiamy model inwazji raka pęcherza moczowego, który obejmuje hodowlę 3D sferoid guza, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną. Technika ta jest przydatna do definiowania cech procesu inwazyjnego oraz do badań przesiewowych środków terapeutycznych.

System hodowli komórkowych 3D do badania inwazji i oceny terapii w raku pęcherza moczowego

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Prezentowany tutaj jest protokół produkcji urządzenia do obrazowania sferoidowego. Urządzenie to umożliwia dynamiczne lub podłużne obrazowanie fluorescencyjne sferoid komórek nowotworowych. Protokół oferuje również prostą procedurę przetwarzania obrazu do analizy inwazji komórek rakowych.

Czasowo-rozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne i analiza inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3D

Poznaj metodę trójwymiarowych testów inwazyjności komórek raka piersi z wykorzystaniem matrycy błony podstawnej. Technika ta pozwala na dokładną kwantyfikację zachowań inwazyjnych i zmian ekspresji białek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Przeglądaj więcej filmów