Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Ogólnym celem poniższej procedury jest ocena zdolności inwazyjnej komórek nowotworowych z wykorzystaniem trójwymiarowego testu inwazji. Osiąga się to poprzez wstępne hodowanie komórek nowotworowych w matrycy błony podstawnej. Następnie inwazję komórkową w matrycy obserwuje się przez pięć lub więcej dni za pomocą mikroskopii świetlnej.

W ostatnim kroku komórki są znakowane przeciwciałami fluorescencyjnymi w celu lokalizacji białek zainteresowania. W efekcie szybkość inwazji komórek nowotworowych oraz wynikające z niej zmiany w ekspresji białek mogą zostać przeanalizowane za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test inwazji w komorach Transwell, jest fakt, że test inwazji w żelu 3D lepiej naśladuje środowisko in vivo, w którym rozwijają się nowotwory.

Zastosowanie tej techniki ma znaczenie dla terapii nowotworowej, umożliwiając identyfikację nowych białek biorących udział w inwazji i przerzutowaniu raka. Przed rozpoczęciem procedury hodowli, macierz błony podstawnej, pipetę P 200 oraz końcówki do pipet należy umieścić na lodzie na noc w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza. Następnego dnia, używając schłodzonej końcówki pipety 200 µL, należy nanieść 50 µL macierzy ruchem spiralnym na dno szklanej szalki konfokalnej nr 1.

Następnie umieść szalkę w inkubatorze do hodowli komórek w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na co najmniej 30 minut, aby matryca uległa zestaleniu. Gdy komórki zaczną się odrywać, potraktuj trypsyną płytkę 100 mm z komórkami o konfluencji 70-80%. Inaktywuj trypsynę za pomocą 10 mL pożywki, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 mL. Wirowarkuj komórki przez trzy minuty przy 100 ×g i 4 °C do czasu osadzenia komórek.

Odmiarz 50 µL matrycy do jednej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1 ml na każdą szalkę z matrycą błony podstawnej i umieść probówki w lodzie po zakończeniu wirowania komórek. Odessaj nadsącz, nie naruszając osadu, a następnie resuspenduj. Zawieś komórki w 1 ml pożywki, a następnie je policz.

Przenieś 2,5 × 10⁴ komórek do nowej probówki do mikrocentryfugi, uzupełniając zawiesinę komórkową pożywką do końcowej objętości 50 µL. Następnie dodaj do komórek 50 µL lodowatej macierzy błony podstawnej w stosunku jeden do jednego, tak aby końcowa objętość wyniosła 100 µL. Delikatnie nanieś mieszaninę macierzy i komórek na zestaloną macierz błony podstawnej, a następnie pozostaw komórki w inkubatorze do hodowli komórkowej, aby wbudowały się w macierz.

Po 30 minutach pokryć matrycę dwoma mililitrami pożywki i umieścić szalkę z powrotem w inkubatorze, wymieniając pożywkę codziennie przez cały czas trwania eksperymentu. Raz dziennie przez cały okres badania użyć obiektywu 10x mikroskopu świetlnego, aby wykonać 20 obrazów kolonii zawieszonych w matrycy błony podstawnej przy użyciu kontrastu interferencyjnego z różnicowaniem faz. Przeanalizować obrazy w sposób zaślepiony, aby określić formowanie się struktur gwiaździstych w koloniach komórek.

Kolonię uznaje się za gwiaździstą, jeśli zaobserwowano jedno lub więcej wypustek z centrum komórek. Aby zbadać cechy morfogenetyczne kolonii 3D, należy wyjąć komórki z inkubatora i umieścić je na tacy z lodem. Odessać medium, a następnie trzykrotnie przemyć kolonię dwiema mililitrami zimnego PBS.

Po ostatnim płukaniu utrwal komórki w dwóch mililitrach roztworu 20%acetonu i 80%metanolu przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie pozostaw naczynia do osiągnięcia temperatury pokojowej. Gdy macierz błony podstawnej osiągnie temperaturę pokojową, odessaj utrwalacz i wypłucz płytkę trzy razy w PBS, tak jak pokazano przed chwilą. Po końcowym płukaniu zablokuj nieswoiste wiązania na komórkach, stosując dwa mililitry 3%BSA przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie inkubować komórki w odpowiednich przeciwciałach pierwszorzędowych rozcieńczonych w 3% BSA w temperaturze pokojowej. Po godzinie usunąć roztwór przeciwciał pierwszorzędowych, wypłukując nie związane przeciwciała pierwszorzędowe trzykrotnie za pomocą PBS, a następnie dodać przeciwciała drugorzędowe rozpuszczone w 3% BSA w odpowiednim rozcieńczeniu i inkubować komórki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Po wypłukaniu nie związanych przeciwciał drugorzędowych za pomocą PBS, zabarwić jądra komórkowe w dwóch mililitrach hext 3, 3, 2, 5 8 w PBS przez pięć minut w ciemności.

Następnie pięciokrotnie wypłucz niezwiązany hekst z komórek za pomocą PBS. Po piątym płukaniu nanieś medium montażowe bezpośrednio na mieszaninę macierzy błony podstawnej i komórek, a następnie ostrożnie przykryj medium montażowe szkiełkiem podstawowym, aby zapobiec naruszeniu integralności mieszaniny. Pozostaw szalkę do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie wykonaj zdjęcia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy długościach fal lasera odpowiednich dla przeciwciał użytych w tych obrazach.

Przedstawiono komórki MDA MB 2 3 1 naciekające macierz 3D. Komórki osadzono w macierzy pierwszego dnia, a do trzeciego dnia zaczęły one tworzyć inwazyjne struktury gwiaździste. Piątego dnia można było zaobserwować całkowity naciek macierzy.

Następnie policzono liczbę utworzonych kolonii gwieździstych i wyrażono ją jako procent całkowitej liczby kolonii inwazyjnych i nieinwazyjnych na płytkę. Ponadto, ponieważ pomiary wykonywano codziennie przez pięć dni, na tych obrazach immunofluorescencyjnych można było również ocenić tempo inwazji. Reprezentatywne inwazyjne kolonie gwieździste komórek MDA MB 2 3 1 wykazujące utratę integralności błony oraz rozproszoną lokalizację białka błony podstawnej lamininy pięć są przedstawione w wyraźnym kontraście do tego, co obserwuje się w komórkach raka piersi MDA MB 2 31.

Laminina pięć zlokalizowana była w nienaruszonej warstwie błony podstawnej otaczającej macierz nieleczonych, niezłośliwych komórek MCF 10 A. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać kokulturę z komórkami zrębu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy komórki nowotworowe komunikują się z komórkami zrębu w mikrośrodowisku po jego wytworzeniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie onkologii do badania inwazji i migracji nowotworów, z których oba procesy są niezbędne do przerzutowania komórek rakowych.