Konfiguracja prostego mikroskopu z arkuszami świetlnymi do obrazowania in toto rozwoju C. elegans
May 5th, 2014
Ten protokół opisuje konfigurację mikroskopu z arkuszem świetlnym i jego implementację do obrazowania in vivo zarodków C. elegans.
Ogólnym celem tej procedury jest zobrazowanie rozwoju C Allergana za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej. Osiąga się to poprzez uprzednie ustawienie mikroskopu opartego na arkuszu świetlnym, składającego się z mikroskopu pionowego i małego zestawu elementów optomechanicznych w celu wygenerowania arkusza świetlnego. Drugim etapem zabiegu jest zamontowanie zarodka.
Ostatnim krokiem jest dopasowanie arkusza światła do zarodka i zarejestrowanie jego rozwoju. Wyniki mogą pokazać dynamikę białek znakowanych fluorescencyjnie podczas rozwoju CL egan poprzez analizę filmów 3D i poklatkowych. Główną zaletą mikroskopii statków morskich w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna, jest to, że umożliwia szybsze obrazowanie przy niższej fototoksyczności.
Po trzecie, ta metoda może zapewnić wgląd w uszczelnienie przed rozwojem. Może być również stosowany do innych systemów, takich jak roil lub danio pręgowany. Demonstracja procedury będzie jasna.
Shales, inżynier z mojego laboratorium i Pauline Linac, inżynier z laboratorium vana. W tej sekcji opisano zestaw instalacyjny i można go pozostawić zmontowany dla wszystkich eksperymentów. Gdy lasery, filtry, teleskop i peryskop zostaną umieszczone na stole optycznym, zabezpiecz cylindryczną soczewkę, aby wygenerować arkusz świetlny.
Inny obiektyw jest regulowany do ustawiania ostrości. Ognisko obiektywu oświetlającego powinno pokrywać się z ogniskiem obiektu obiektywu wykrywania. Teraz rzuć wiązkę na ścianę lub ekran i przesuwaj obiektyw oświetlający wzdłuż osi wiązki, aż kontury projekcji będą ostre.
Dołącz poczwórny filtr emisyjny i kamerę E-M-C-C-D w konfiguracji mikroskopu. Przyporządkuj drugi etap tłumaczenia ręcznego do pierwszego w sposób prostopadły. Przykręć zespół do istniejącego stolika mikroskopu.
Po zdjęciu ustawionego cylindrycznego obiektywu oświetlającego soczewkę, umieść zespół na mikroskopie i umieść zestaw oświetleniowy z powrotem na stolikach. Zamocuj uchwyt qve na prostopadłym przecięciu ścieżki oświetlenia i ścieżki wykrywania. Teraz sprawdź arkusz świetlny.
Napełnij szklankę roztworem fluoresceiny i umieść ją w uchwycie na stolikach. Jasny arkusz powinien być widoczny. Powinien być poziomy i wyśrodkowany w stosunku do soczewki obiektywu detekcji.
Następnie zdejmij cylindryczną soczewkę. Zoptymalizuj arkusz świetlny za pomocą translacji 3D obiektywu oświetleniowego i uzyskaj obraz, aby zmierzyć grubość arkusza świetlnego. Zależy to od przysłony soczewki obiektywu.
Następnie należy wymienić soczewkę cylindryczną. Najpierw wytnij kawałek szkła o grubości jednego milimetra o wymiarach 10 milimetrów na 20 milimetrów. Użyj pisaka do znakowania diamentów.
Następnie dodaj 20 mikrolitrów poli L lizyny z jednej strony, a po wyschnięciu porównaj ją z drugim szkiełkiem. W ustalonej pozycji dodaj kroplę 5% agaru i wygładź ją ciężarkiem trzeciego szkiełka umieszczonego na wierzchu. Po wyschnięciu agaru usuń trzecie szkiełko i odetnij podkładkę agarową trzy milimetry od krawędzi dwóch pozostałych szkiełek nad szkiełkiem bez poli L lizyny.
Następnie usuń stałe szkiełko, pozostawiając zwis agaru. Posmaruj agar 20 mikrolitrami poli L lizyny i pozostaw do wyschnięcia. Teraz umieść robaki GR w szkiełku zegarkowym wypełnionym pożywką M nine pod mikroskopem preparacyjnym.
Przetnij robaki skalpelem na poziomie sromu, uwalniając w ten sposób jaja. Następnie zidentyfikuj zarodki, które są w stadium zainteresowania i zbierz je za pomocą pipety mikrokapilarnej. Przenieś zarodki na zwis agaru z przygotowanego szkiełka tuż przy krawędzi szkiełka, a nie na granicy agaru.
Następnie wyrównaj zarodki za pomocą pipety mikrokapilarnej, jednocześnie usuwając płyn. Poprzez aspirację zarodki przykleją się do polioli lizyny. Bardzo ważne jest dobre ułożenie zarodków, aby uzyskać dobry zapis, a to wymaga naczynia włosowatego z odpowiednim apturą.
Jeśli są zbyt małe, trudno będzie uwolnić zarodki. Jeśli są zbyt duże, trudno będzie ściśle kontrolować wyciekający przepływ i wyrównać zarodki, Przykryj szkiełko pożywką M nine na szalce Petriego i potwierdź, że zarodki są nadal przymocowane do agaru za pomocą powiększenia. Teraz przymocuj przygotowane szkiełko z zarodkami do uchwytu na próbkę, który pasuje do vete.
Uchwyt jest urządzeniem wykonanym we własnym zakresie, które zostało zaprojektowane tak, aby pasowało do weterynarza. Następnie przymocuj vete do stolika elektrycznego Pizo i w jasnym świetle zlokalizuj zarodek. Teraz uruchom pakiet oprogramowania sterującego akustycznym strojeniem optycznym.
Filtruj kamerę i scenę. To oprogramowanie zostało tutaj napisane wewnętrznie, ale można również użyć darmowego oprogramowania micromanager. Najpierw wybierz linię lasera.
Następnie dostosuj stolik wzdłuż osi x, aż arkusz świetlny będzie najjaśniejszy. Następnie dostosuj pozostałe dwa wymiary, Y i Z, aż sygnał do szumu będzie najlepszy. Może być konieczne powtórzenie tego dla każdego zarodka.
Jest to klucz do optymalizacji stosunku sygnału do uzyskania dobrego nagrania, które przekłada się na wolny etap, wspierając cel i eliminacji, gdy tylko reluję, aby uzyskać symulację zarodka i najlepszy kontrast. Teraz uzyskaj obrazy poklatkowe Ustaw moc lasera, ekspozycję na moc lasera, zysk czasu i interwał obrazowania zgodnie z poziomem fluorescencji zarodka i szybkością analizowanego procesu biologicznego. Dla Zacka.
Obrazowanie ustawia odległość między warstwami oraz ich pozycję początkową i końcową w c elgan wyrażającym konstrukt GFP histonu. Wykonano dwugodzinne obrazowanie poklatkowe z 20 stosami warstw wykonywanych co 37 sekund. Podziały komórkowe były wyraźnie widoczne w szczepie eksprymującym tubulinę połączoną z GFP, a jego kamień zrośnięty z m wiśnią Nagrania prowadzono przez 16 minut co 105 sekund.
Renderingi 3D są wyświetlane w trzech punktach czasowych. Wrzeciona mitotyczne i skondensowane chromosomy są wyraźnie widoczne i łatwe do śledzenia poprzez podziały komórkowe. W trzecim szczepie lipoproteiny APO vit two sprzężone z GFP zobrazowano za pomocą znakowania mCherry błony komórkowej
.W ciągu 13 minut co 27 sekund pobierano 10 stosów plasterków. Szybko poruszające się cząsteczki lipoprotein były łatwe do śledzenia. Tutaj używamy lekkiego arkusza utworzonego bardziej złożonymi metodami do produkcji.
Arkusz świetlny może zostać zaimplementowany w celu dalszej poprawy rozdzielczości przestrzennej.
Przegląd
Ten protokół opisuje konfigurację mikroskopu światłowodowego i jego zastosowanie do obrazowania in vivo zarodków C. elegans. Metoda ta umożliwia szybsze obrazowanie przy niższej fototoksyczności w porównaniu z mikroskopem konfokalnym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Mikroskopia
Tło
- Mikroskopia światłowodowa zapewnia unikalne podejście do obrazowania próbek biologicznych.
- Ta technika jest szczególnie przydatna do obserwacji żywych zarodków.
- Minimalizuje uszkodzenia wywołane światłem, umożliwiając szybkie obrazowanie.
- Zastosowania obejmują różne organizmy modelowe poza C. elegans.
Cel badania
- Wizualizacja rozwoju zarodków C. elegans za pomocą fluorescencyjnej mikroskopi światłowodowej.
- Analiza dynamiki białek znakowanych fluorescencyjnie w trakcie rozwoju.
- Wykazanie zalet mikroskopi światłowodowej w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
Stosowane metody
- Konfiguracja mikroskopu światłowodowego z elementami optomechanicznymi.
- Umieszczenie zarodków na przygotowanych szkiełkach z podkładkami agarowymi.
- Optymalizacja wyrównania warstwy światła dla obrazowania.
- Przedziałowe obrazowanie zarodków w celu uchwycenia procesów rozwojowych.
Główne wyniki
- Udane obrazowanie podziałów komórkowych i dynamiki białek w zarodkach C. elegans.
- Uzyskano 3D renderowania wrzecion mitotycznych i chromosomów.
- Wykazano zdolność do śledzenia szybko ruchomych białek.
- Dostarczono wglądu w procesy rozwojowe organizmu.
Wnioski
- Mikroskopia światłowodowa jest potężnym narzędziem do obrazowania in vivo.
- Ta metoda zwiększa zrozumienie rozwoju zarodków.
- Może być dostosowana do zastosowania z innymi organizmami modelowymi.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Light sheet microscopy enables high-resolution, low-phototoxicity imaging of whole-organism development, supporting target validation in early discovery by providing quantitative, dynamic phenotypic data. This approach reduces biological uncertainty in preclinical models by allowing longitudinal tracking of cellular processes and protein dynamics in live systems. The method enhances predictive confidence in lead identification by delivering reproducible, scalable imaging outputs compatible with high-content screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through subcellular-resolution visualization of protein dynamics and cell divisions in developing embryos.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing reproducible, quantitative readouts of developmental phenotypes under low-phototoxic conditions.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating longitudinal, multi-parameter datasets that correlate molecular perturbations with developmental outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, 3D time-lapse imaging with subcellular resolution, enabling reliable compound effect assessment in whole-organism contexts.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through precise light sheet alignment and stabilization, minimizing variability in longitudinal imaging sessions.
- Scalability: Compatible with multi-well observation chambers and automated stage control, supporting medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling consistent phenotypic assessment across model systems using standardized imaging protocols.
- Mechanistic De-risking: Allows direct observation of target engagement effects on developmental processes, reducing ambiguity in mechanism-of-action studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative thresholds for go/no-go decisions based on developmental toxicity and phenotypic normalization metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead optimization, offering a non-destructive, quantitative imaging modality for phenotypic screening and mechanistic studies in whole-organism models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time tracking of fluorescently labeled proteins and cellular structures during embryogenesis.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation, light sheet characterization, and embryo mounting protocols that ensure imaging consistency.
- Analytics: Generates quantitative 3D and time-lapse readouts (e.g., mitotic spindle dynamics, protein trafficking) that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing disease-relevant phenotypic readouts in C. elegans, a validated model for conserved developmental pathways.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular, left-assembled system on an optical table, enabling repeated use across projects with minimal recalibration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, longitudinal observation of protein dynamics and cellular behavior.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized opto-mechanical alignment, slide preparation, and embryo mounting procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of developmental toxicity, reducing late-stage attrition due to unidentified biological risks.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative, imaging-based phenotypic scores that inform advancement decisions across target classes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, fluorescence microscopy, and sample preparation for live imaging.
- Needs stable optical table, laser sources, objectives, translation stages, and EM-CCD or sCMOS camera for detection.
- Demands cross-team standardization of slide preparation, embryo staging, and imaging parameters to ensure reproducibility across users and sites.
- Adaptation considerations include embryo size, optical clearing, and mounting medium compatibility when extending to other model systems (e.g., zebrafish, Drosophila).
- Practical limitations include embryo immobilization efficiency and light sheet uniformity over large fields of view, which may require optimization for longer imaging sessions.
