Name: Konfiguracja prostego mikroskopu z arkuszami świetlnymi do obrazowania in toto rozwoju C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj konfigurację mikroskopu z arkuszami świetlnymi do obrazowania in toto rozwoju embrionów C. elegans. Ta metoda umożliwia szybsze obrazowanie z niższą fototoksycznością niż mikroskopia konfokalna.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom laboratoriów Lenne i Bertrand, w szczególności Olivierowi Blancowi za rozwój oprogramowania i Jérémie Capoulade za dyskusję. Dziękujemy również ośrodkowi obrazowania PICsL-IBDM, w szczególności Claude'owi Morettiemu i Brice'owi Detailleurowi za wsparcie techniczne.
Ta praca była wspierana przez granty ATIP od CNRS (dla P.-F. L. i V.B.), grant Labex INFORM (dla P.-F.L. i V.B.) oraz grant od Sanofi-Aventis (dla V.B.). Wyrażamy uznanie dla infrastruktury France-BioImaging wspieranej przez Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-INSB-04-01, nazwa "Investissements d'Avenir").

1. Konfiguracja arkusza świetlnego i ścieżki wykrywania
Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat układu optycznego.
<ol>
	<li>Umieść i zamocuj mikroskop i lasery na stole optycznym.</li>
	<li>Połącz lasery 488 nm, 561 nm i 405 nm z odpowiednimi zwierciadłami dichroicznymi. Po zwierciadłach dichroicznych lasery muszą być precyzyjnie ustawione. Należy zauważyć, że wybór długości fal laserowych, zwierciadeł dichroicznych i filtrów optycznych jest określany na podstawie widm absorpcyjnych określonych znaczników fluorescencyjnych użytych w eksperymentach.</li>
	<li>Umieść przestrajalny filtr akustyczno-optyczny (AOTF). Skorzystaj z arkusza testowego dostarczonego przez dostawcę, aby dostosować częstotliwość i moc AOTF. Przy dobrym ustawieniu około 90% mocy lasera jest przesyłane przy maksymalnym strojeniu, mierzonym przez miernik mocy. Należy pamiętać, że niektóre lasery mogą być w pełni kontrolowane przez oprogramowanie, co może sprawić, że AOTF stanie się niepotrzebny.</li>
	<li>Umieść i zamocuj teleskop. Należy pamiętać, że teleskop składa się z dwóch soczewek, które rozszerzają wiązkę do szerokości równej lub większej niż średnica tylnego otworu soczewki obiektywu oświetlającego. Na pierwszym miejscu powinien znaleźć się obiektyw o najmniejszej ogniskowej.</li>
	<li>Umieść, wyrównaj i zamocuj peryskop, zbliżając ścieżkę optyczną do tylnego otworu cylindrycznej soczewki. Należy zauważyć, że dwa zwierciadła peryskopu są zamontowane w taki sposób, że ich długa oś leży na nachyleniu lustra, aby odbijać w pełni rozciągniętą wiązkę.</li>
	<li>Umieść soczewkę cylindryczną obok wyjścia z peryskopu. Zwróć uwagę, że soczewka cylindryczna skupia wiązkę w jednym kierunku i pozostawia ją skolimowaną w drugim kierunku, tworząc w ten sposób arkusz światła.</li>
	<li>Ponownie ustaw ostrość powstałego arkusza światła za pomocą soczewki obiektywu oświetlającego. Należy pamiętać, że ogniskowy obrazu obiektywu oświetleniowego powinien pokrywać się z punktem ogniskowym obiektu wykrywania. Rzuć wiązkę na ekran (np. ścianę) z dużej odległości. Przesuń obiektyw oświetlający wzdłuż osi wiązki świetlnej, aby uzyskać na ekranie ostre kontury arkusza świetlnego.</li>
	<li>Umieść filtr emisyjny z poczwórną linią (405/488/561/638) w miejscu zarezerwowanym w mikroskopie (kostce).</li>
	<li>Umieść kamerę EMCCD w porcie wyjściowym mikroskopu.</li>
	<li>Zamocuj pierwszy ręczny stolik translacyjny na stoliku mikroskopu za pomocą w otworach wywierconych w stoliku mikroskopu. Należy pamiętać, że krawędź stolika translacyjnego musi być umieszczona w odległości około 2 cm od środka stolika mikroskopu, tak aby kuweta była wyśrodkowana poniżej soczewki obiektywu detekcyjnego.</li>
	<li>Napraw drugi etap ręcznego tłumaczenia na pierwszym. Kierunki obu etapów muszą być prostopadłe (translacje X i Y).</li>
	<li>Zamocuj stopień piezoelektryczny Z na górze dwóch poprzednich etapów. Należy pamiętać, że zamiast stopnia piezoelektrycznego można użyć stopnia zmotoryzowanego.</li>
	<li>Zamocuj uchwyt kuwety (patrz rysunek 2) w górnej części stages. Kuweta zostanie zatem umieszczona na przecięciu ścieżki oświetlenia i ścieżki detekcji, które są do siebie prostopadłe.</li>
</ol>
2. Sprawdzanie arkusza świetlnego
<ol>
	<li>Napełnij szklaną kuwetę roztworem fluorescencyjnym i umieść ją na uchwycie próbki na przecięciu dwóch ścieżek optycznych. Arkusz świetlny jest więc widoczny. Musi być poziomy i symetryczny/wyśrodkowany w stosunku do soczewki obiektywu detekcyjnego.</li>
	<li>Zdejmij cylindryczną soczewkę i uzyskaj obraz, aby zmierzyć grubość arkusza światła. Należy pamiętać, że grubość arkusza światła zależy od apertury numerycznej (NA) soczewki obiektywu oświetlającego (około 3-4 μm dla NA = 0,3). Należy pamiętać, że dla danej soczewki grubość arkusza światła można zwiększyć, zmniejszając rozmiar wiązki wchodzącej przez szczelinę do tylnego otworu. Należy pamiętać, że mikrosfery fluorescencyjne mogą być używane do pomiaru rozdzielczości osiowej i bocznej mikroskopu.</li>
	<li>Włóż z powrotem cylindryczną soczewkę przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
</ol>
3. Montaż zarodków C. elegans
Następujące kroki są pokazane na rysunku 3.
<ol>
	<li>Za pomocą pisaka do znakowania diamentów wyciąć kawałek szkiełka o wymiarach 10 x 20 x 1 mm.</li>
	<li>Przygotuj 5% bakto-agar w wodzie, zagotuj go i przechowuj w bloku grzewczym w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Dodaj 50 μl poli-L-lizyny po jednej stronie wyciętego kawałka szkiełka, pozostaw do wyschnięcia.</li>
	<li>Umieść szkiełko mikroskopowe na stole i zamocuj je.</li>
	<li>Porównaj wycięty kawałek szkiełka ze szkiełkiem stałym i dodaj kroplę stopionego agaru na wierzch. Ściśnij agar za pomocą innego czystego szkiełka mikroskopowego, aby uzyskać cienką podkładkę agarową.</li>
	<li>Poczekaj, aż podkładka agarowa wyschnie przed wyjęciem górnego szkiełka.</li>
	<li>Odciąć podkładkę agarową z boku szkiełka stałego, aby pozostawić nadmiar około 3 mm agaru i delikatnie usunąć szkiełko stałe.</li>
	<li>Dodaj 50 μl poli-L-lizyny na agar i pozostaw do całkowitego wyschnięcia.</li>
	<li>Umieść robaki gravid w podłożu M9 w szkiełku zegarkowym.</li>
	<li>Przetnij robaki na poziomie sromu skalpelem, aby uwolnić zarodki.</li>
	<li>Pod lornetką zidentyfikuj zarodki na etapie zainteresowania i zbierz je za pomocą pipety mikrokapilarnej.</li>
	<li>Umieść zarodki na części agaru pokrytej poli-L-lizyną, która wystaje z wyciętego kawałka szkiełka. Umieść zarodki tuż przy granicy szkiełka. Nie umieszczaj zarodków na granicy agaru, ponieważ nie będą wystarczająco stabilne. Delikatnie usuń płyn, aby zarodki przykleiły się do warstwy poli-L-lizyny.</li>
	<li>Szybko wyrównaj zarodki, aby uniknąć wysuszenia.</li>
	<li>Umieść wycięte szkiełko na plastikowej szalce Petriego i delikatnie dodaj podłoże M9, aby przykryć szkiełko.</li>
	<li>Sprawdź przez lornetkę, czy jaja nadal utknęły na agarze</li> .
</ol>
4. Rejestracja rozwoju C. elegans
<ol>
	<li>Umieścić poprzedni preparat (wycięte szkiełko, agar i zarodki) w uchwycie na próbkę i umieścić go w kuwecie. Rysunek 4 przedstawia uchwyt domowej roboty, a rysunek 5 przedstawia widok kuwety w kontekście obserwacji.</li>
	<li>Zamocuj kuwetę na stoliku piezoelektrycznym.</li>
	<li>Zidentyfikuj położenie zarodków przy jasnym oświetleniu pola.</li>
	<li>Uruchom domowe oprogramowanie sterujące AOTF, kamerą i stolikiem piezoelektrycznym. Pamiętaj, że można również użyć darmowego oprogramowania, takiego jak mikromenedżer.</li>
	<li>Wybierz linię i moc lasera (AOTF).</li>
	<li>Dostosuj położenie arkusza świetlnego za pomocą stolika w 3 kierunkach podtrzymującego soczewkę cylindryczną i soczewkę oświetleniową. Przesuń stolik w kierunku bocznym (X), aby uzyskać najjaśniejszy sygnał. Następnie wyreguluj pozycję Z arkusza świetlnego i pozycję wzdłużną (Y), aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu. Należy pamiętać, że może być konieczne dostosowanie położenia ostrości arkusza świetlnego z jednego zarodka na drugi, aby skorygować różnice w długościach ścieżki światła.</li>
	<li>Aby uzyskać zdjęcia poklatkowe, wybierz czas ekspozycji, wzmocnienie, czas między dwoma obrazami, a także liczbę obrazów do uzyskania oraz moc lasera. W przypadku akwizycji 2 kolorów wybierz drugą linię lasera. Dwa kolorowe obrazy są rejestrowane kolejno.</li>
	<li>Aby uzyskać stos z, wybierz również odległość między dwoma wycinkami oraz pozycję początkową i końcową piezoelektryka.</li>
</ol>

<ol><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li>
<li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet-based+fluorescence+microscopy%3A+more+dimensions%2C+more+photons%2C+and+less+photodamage%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+J%22%5BJournal%5D)">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li>
<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li>
<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+%28iSPIM%29+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li>
<li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li>
<li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li>
<li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li>
<li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+%28mSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje łatwą konfigurację mikroskopii arkuszowej światła do obrazowania in vivo zarodków C. elegans . Elementy optyczne niezbędne do stworzenia i wyrównania arkusza świetlnego, w tym lasery, ekspander wiązki, soczewki kolimacyjne i skupiające, można łatwo zamontować na stole optycznym. W połączeniu z pionowym mikroskopem dla ścieżki detekcji i kamerą zapewnia to proste rozwiązanie do konfiguracji mikroskopu z arkuszami świetlnymi.
Ta geometria sprawia, że przykładowe środowisko jest proste. Żywy okaz umieszcza się w szklanej kuwecie, która jest trzymana, ustawiana i przesuwana przez mały zestaw mechanicznych elementów. Ponieważ mikroskopia oświetlenia arkuszy jest techniką szerokokątną z możliwością cięcia, do obrazowania 3D wymagany jest tylko jednoosiowy ruch zmotoryzowany. Ogranicza to wymóg synchronizacji do jednego elementu skanującego i ułatwia tworzenie oprogramowania. W porównaniu z iSPIM6 nasza pionowa geometria pozwala na użycie soczewki obiektywu o wysokiej NA do detekcji. W porównaniu z konfiguracjami SPIM z soczewkami obiektywowymi w płaszczyźnie poziomej, montaż próbki i obrazowanie serii zarodków są łatwiejsze. Ogólnie rzecz biorąc, wdrożenie tej techniki jest proste i można je osiągnąć przy niewielkiej wiedzy z zakresu optyki. Jest to tańsza alternatywa dla mikroskopów konfokalnych, której zaletą jest większa prędkość i zmniejszona fototoksyczność, ale wadą jest niższa rozdzielczość osiowa.
Opracowaliśmy również łatwy i powtarzalny sposób montowania zarodków C. elegans do obrazowania in vivo za pomocą tego systemu. Procedura montażu jest szybka (15 min) i nadaje się do codziennych eksperymentów. W przypadku obrazowania C. elegans zalety tej prostej konfiguracji są co najmniej dwojakie: (i) obrazowanie in toto jest możliwe bez rotacji, a zatem rekonstrukcja 3D jest prosta; (ii) montaż próbki jest łatwy, a wiele zarodków można sekwencyjnie obrazować na tym samym szkiełku. Pokazaliśmy przykłady filmów poklatkowych z wystarczającą rozdzielczością czasową, aby zaobserwować podziały komórek i zmiany kształtu komórek. Moc mikroskopii arkuszowej światła w badaniu rozwoju C. elegans została również niedawno zilustrowana przez innych6, 7, 8. Dlatego ta technika będzie bardzo przydatna do badania morfogenezy i wzorca zarodka C. elegans .
Czy system ten może być również wykorzystywany do analizy rozwoju innych organizmów modelowych? Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że wdrożenie mikroskopii oświetlenia arkuszowego dla małych i przezroczystych organizmów, takich jak C. elegans, jest mniej rygorystyczne niż dla większych organizmów, takich jak zarodki Drosophila . Obrazowanie in toto Drosophila zwykle wymaga rekonstrukcji rotacyjnych i wielowidokowych9, 10. Wzbudzenie z dwóch stron za pomocą współliniowych soczewek obiektywowych wzbudzenia może również zmniejszyć efekty cienia spowodowane tłumieniem światła11. Jednak przedstawiona tutaj konfiguracja jest nadal przystosowana do obrazowania jednej strony zarodków Drosophila , z niskim poziomem bielenia i niską fotoksycznością. Ta konfiguracja może być również przydatna do obrazowania małych i przezroczystych zarodków, takich jak workowate lub danio pręgowany.

Formowanie i kształtowanie organizmu obejmuje ruchy komórek, zmiany kształtu komórki, podział komórek i różnicowanie komórek. Zrozumienie postępu i koordynacji tych procesów wymaga szybkich narzędzi do obrazowania z możliwością trójwymiarowości i rozdzielczością subkomórkową. Wśród technik wykorzystujących te możliwości obrazowania in vivo, mikroskopia oświetlenia arkuszami świetlnymi, zwana również mikroskopią oświetlenia pojedynczego/selektywnego płaszczyzny, ma wyjątkową zaletę polegającą na wytwarzaniu efektów o niskiej toksyczności i niskim poziomie fotowybielania1,2.

W mikroskopii z oświetleniem arkuszy, próbka jest oświetlana z boku przez arkusz świetlny, który wykonuje sekcję optyczną. Ścieżka oświetlenia i ścieżka wykrywania są prostopadłe do siebie, a arkusz świetlny jest wyrównany tak, aby pokrywał się z płaszczyzną ogniskową obiektu soczewki obiektywu detekcji. Próbka jest umieszczana na przecięciu dwóch ścieżek i może być przesuwana wzdłuż osi detekcji, aby umożliwić obrazowanie 3D. Oświetlona jest tylko płaszczyzna zainteresowania i wszystkie punkty tej płaszczyzny są wykrywane w tym samym czasie. To znacznie zwiększa szybkość akwizycji i zmniejsza fotowybielanie, a także fototoksyczność w porównaniu z mikroskopią konfokalną3.

Praktycznie, mikroskopia z oświetleniem arkuszy jest łatwa do ustawienia i wyrównania: dla obrazowania dwuwymiarowego nie jest konieczne skanowanie ani dla części detekcyjnej, ani dla części oświetleniowej; jako technika szerokokątna z możliwością cięcia, trójwymiarowe obrazowanie można uzyskać poprzez pojedynczy ruch osi stolika trzymającego próbkę.

Tutaj prezentujemy ustawienie prostego mikroskopu z arkuszem świetlnym i jego implementację do obrazowania in toto zarodków C. elegans. Zarodki C. elegans są dobrze przystosowane do obrazowania in vivo ze względu na ich przezroczystość, niezmienniczą linię genealogiczną i stereotypowe pozycje komórek4,5. Opracowany układ arkuszy świetlnych opiera się na standardowym mikroskopie pionowym do detekcji. Przedstawiony poniżej protokół szczegółowo opisuje, jak zbudować i wyrównać moduł/ścieżkę wzbudzenia, przetestować i scharakteryzować arkusz świetlny oraz zamontować próbkę do obrazowania 3D. Zawiera również przykłady filmów poklatkowych uzyskanych za pomocą konfiguracji na różnych szczepach wyrażających markery fluorescencyjne.

<table><tbody><tr><td>SPIM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Pionowy mikroskop detekcyjny</td></tr><tr><td></td><td>Obiektyw ZEISS</td><td>Axiophot 1</td><td></td></tr><tr><td>100x W (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&nbsp;</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCD podświetlany tylnie</td><td>ANDOR</td><td>DU-885K-CS0-#VP</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Illumination</td></tr><tr><td>LASER 488 nm / 60 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam smart</td><td></td></tr><tr><td>LASER 405 nm / 120 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam smart</td><td></td></tr><tr><td>LASER 561 nm / 500 mW</td><td>COBOLT</td><td>JIVE 500</td><td>&nbsp; do obrazowania poklatkowego wystarczy filtr 50 lub 100 mW</td></tr><tr><td>Poczwórny liniowy laser odrzucający ZET 405/488/561/638</td><td>AHF</td><td>F57-405</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 405</td><td>AHF</td><td>F38-405</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 488</td><td>SEMROCK</td><td>Di01-R488</td><td></td></tr><tr><td>AOTF</td><td>AA</td><td>AOTFnC-400.650-TN</td><td></td></tr><tr><td>lustrzana soczewka 50</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mm</td><td>THORLABS</td><td></td><td>teleskop 5X</td></tr><tr><td>obiektyw 200 mm</td><td>THORLABS</td><td></td><td>teleskop 5X</td></tr><tr><td>peryskop</td><td>THORLABS</td><td>RS99/M</td><td></td></tr><tr><td>soczewka cylindryczna f=100mm</td><td>THORLABS</td><td>ACY254-100-A</td><td></td></tr><tr><td>10X NA 0,3</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xyz stage</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Próbka</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Bectkton Dickinson</td><td>214010</td><td>5% w wodzie</td></tr><tr><td>roztwór poli-L-lizyny&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary GC100F-10, 1.0mm ød, 0,58mm ID, 100 mm L</td><td>Havard Appartus</td><td>30-0019</td><td></td></tr><tr><td>Rurka aspiracyjna (pipeta doustna)</td><td>Dutsher</td><td>55005</td><td></td></tr><tr><td>M9 medium:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (3g/L)</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (6g/L)</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCL (5g/L)</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (1 mM final)</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>uchwyt na kuwetę</td><td>HOME MADE</td><td></td><td>made by Brice Detailleur&nbsp;</td></tr><tr><td>uchwyt na próbki</td><td>HOME MADE</td><td></td><td>wykonany przez Claude'a Morettiego&nbsp;</td></tr><tr><td>x stage</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szkiełko nakrywkowe 50x20x1 mm</td><td>MARIENFELD</td><td></td><td>następnie cięte w 10x20x1mm</td></tr><tr><td>stolik piezoelektryczny ze wzmacniaczem/sterownikiem</td><td>PI</td><td>P-622. Kuweta ZCD / E-625.CR</td><td></td></tr><tr><td>40mmx40mmx10mm</td><td>HELLMA</td><td>704.002-OG.40 mm- Ołówek</td> do znakowania szkła diamentowego o wysokości <td></td>10mm</tr><tr><td></td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>C++ (Qt) domowe oprogramowanie</td><td></td><td></td><td>opracowane przez Oliviera Blanca i Claire Chard&egrave; s, dostępne na zamówienie. Alternatywne rozwiązania: mikromenedżer lub labview&nbsp;</td></tr></tbody></table>

konfiguracja prostego mikroskopu z arkuszami świetlnymi do obrazowania in toto rozwoju c. elegans

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Szybkie i nisko stosowane techniki obrazowania fototoksycznego są niezbędne do badania rozwoju organizmów in toto. Mikroskopia oparta na arkuszach świetlnych zmniejsza efekty fotowybielania i fototoksyczności w porównaniu z mikroskopią konfokalną, zapewniając jednocześnie obrazy 3D o rozdzielczości subkomórkowej. Tutaj przedstawiamy konfigurację mikroskopu opartego na arkuszu świetlnym, który składa się z mikroskopu pionowego i niewielkiego zestawu elementów optomechanicznych do generowania arkusza świetlnego. Protokół opisuje, jak zbudować, ustawić mikroskop i scharakteryzować arkusz świetlny. Ponadto szczegółowo opisano, w jaki sposób można wdrożyć metodę obrazowania in toto zarodków C. elegans przy użyciu prostej komory obserwacyjnej. Metoda ta pozwala na uchwycenie dwukolorowych filmów poklatkowych 3D w ciągu kilku godzin wywoływania. Powinno to ułatwić śledzenie kształtu komórki, podziałów komórkowych i znakowanych białek w długich okresach czasu.

Trzy eksperymenty z rejestracją time-lapse w 3D z trzech różnych szczepów C. elegans ilustrują rodzaj danych, jakie można uzyskać przy użyciu opisanego powyżej zestawu mikroskopu z arkuszem światła. Sprawdziliśmy, że w tych warunkach zarodki rozwijają się z normalną prędkością i przeżywają obrazowanie, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami wskazującymi, że obrazowanie SPIM powoduje jedynie niski poziom fototoksyczności w zarodkach C. elegans6,7.
Pierwszy szczep wykazuje ekspresję histonu połączonego z GFP (zuIs178;stIs10024). Rejestracja była prowadzona przez 2 godziny z wykorzystaniem stosu 20 przekrojów (odległość między przekrojami 1 μm) wykonywanych co 37 sec. Rysunek 6 przedstawia jedną płaszczyznę stosu w różnych punktach czasowych. Wyraźnie widoczne są zarówno jądra w fazie interfazy (strzałka), jak i skondensowana chromatyna mitotyczna (grot strzałki).
Drugi szczep wykazuje ekspresję tubuliny połączonej z GFP (ruIs57) oraz histony połączonej z mCherry (itIs37; stIs10226). Rejestracja była prowadzona przez 16 min przy użyciu stosu 20 warstw (odległość między warstwami 1 μm) pobieranych co 105 sec. Rysunek 7 przedstawia różne płaszczyzny stosu oraz różne punkty czasowe. Powiązany film 1 ukazuje rekonstrukcje 3D w 3 kolejnych punktach czasowych. Podczas podziału wrzeciono mitotyczne (zielone) i skondensowane chromosomy (czerwone) są wyraźnie widoczne, co pozwala na śledzenie orientacji podziałów komórkowych podczas rozwoju.
Trzeci szczep wykazuje ekspresję apolipoproteiny VIT-2 połączonej z GFP (pwIs23) oraz mCherry związanej z błoną (ltIs44). Rejestracja była prowadzona przez 25 min przy użyciu stosu 10 warstw (odległość między warstwami 1 μm) pobieranych co 30 sec. Rysunek 8 przedstawia różne płaszczyzny stosu oraz różne punkty czasowe. Można łatwo śledzić szybkie ruchy cząsteczek lipoprotein żółtkowych (zielone) wewnątrz komórek.
<img alt="Schemat optyki laserowej; układ mikroskopowy; detekcja fluorescencji; ścieżka wzbudzenia; kamera EMCCD." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Układ optyczny SPIM składający się z jednostki oświetlenia i detekcji, widok z przodu i z dołu. W jednostce oświetlenia lasery łączone za pomocą luster dichroicznych wchodzą do AOTF, który niezależnie kontroluje moc każdego lasera. Następnie teleskop powiększa wiązkę 4-krotnie, a peryskop wprowadza ją na wysokość mikroskopu. Soczewka cylindryczna tworzy arkusz światła, który jest refokusowany przez obiektyw oświetlający. Jednostka detekcji jest zintegrowana z mikroskopem prostym i składa się głównie z soczewki detekcyjnej, filtra, soczewki tubusowej oraz EMCCD. Próbka jest umieszczona na przecięciu ścieżek oświetlenia i detekcji. Stolik piezoelektryczny umożliwia przemieszczanie próbki w pionie (Z) w celu akwizycji 3D.
<img alt="Schemat stopnia piezoelektrycznego, układ z kuwetą szklaną do wzbudzenia optycznego i absorpcji przejściowej." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Uchwyt kuwety. Uchwyt składa się z 3 aluminiowych płytek i jest przykręcony do stopnia piezoelektrycznego. Kuweta szklana jest utrzymywana przez sprężynę (zaznaczona na czerwono).
<img alt="Przygotowywanie preparatów mikroskopowych z agarem do badania embrionów, schemat przedstawia aplikację poli-L-lizyny." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Protokół montażu embrionów C. elegans do eksperymentów SPIM. Odcięty kawałek szkła jest powlekany poli-L-lizyną. Na powlekanej powierzchni umieszcza się plaster agarowy. Następnie na plaster agarowy nanosi się poli-L-lizynę. Na koniec embriony C. elegans są ustawiane w rzędzie na powlekonym poli-L-lizyną plastrze agarowym.
<img alt="Schemat równowagi statycznej; oznaczone śruby i sprężyna; badanie rozkładu obciążeń mechanicznych." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Uchwyt do próbek. Uchwyt jest dopasowany do wymiarów wewnętrznych kuwety szklanej. Dwie sprężyny (zaznaczone na czerwono) utrzymują szkiełko przedmiotowe (opisane na Rysunku 3). Następnie uchwyt ten umieszcza się wewnątrz kuwety szklanej.
<img alt="Schemat mikroskopii arkusza światła; kuweta szklana, zarodki, soczewka detekcyjna, układ wzbudzenia optycznego." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Uchwyt próbki w kontekście obserwacyjnym. Zarodki zostają unieruchomione na szkiełku przedmiotowym zgodnie z protokołem przedstawionym na Rysunku 3. Szkiełko jest trzymane przez uchwyt próbki opisany na Rysunku 4. Uchwyt próbki jest włożony do szklanej kuwety, trzymanej przez uchwyt opisany na Rysunku 2. Arkusz światła przebiega poziomo i oświetla zarodki z boku. Obiektyw detekcyjny jest ustawiony pionowo, nad próbką.
<img alt="Time-lapse podziału komórek, mikroskopia fluorescencyjna, przedstawiająca stadia mitozy w ciągu 120 minut." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Nagranie zarodka C. elegans wyrażającego fuzję histonu::GFP. Obrazy pojedynczej płaszczyzny transgenicznego zarodka wyrażającego fuzję histonu::GFP (zuIs178; stIs10024) w różnych punktach czasowych. Obrazy wyekstrahowane z trójwymiarowego nagrania time-lapse: stosy składające się z 20 przekrojów (odległość między przekrojami 1 µm); czas ekspozycji na przekrój: 30 msec; odstęp czasu między stosami: 37 sec; całkowity czas akwizycji: 2 hr. Strzałka: jądro w interfazie, grot strzałki: skondensowana chromatyna mitotyczna. W t = 0 min zarodek znajduje się w stadium 2 komórek, a w t = 120 min zarodek zawiera około 70 komórek, co jest zgodne z normalną prędkością rozwoju (należy zauważyć, że na zdjęciach widoczne są tylko komórki znajdujące się w jednej płaszczyźnie, a nie wszystkie komórki zarodka). Moc oświetlenia wynosiła 30 µW przy 488 nm (mierzona na wyjściu z obiektywu oświetlającego). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, obrazowanie komórek, time-lapse, analiza wielokolorowa, dynamiczne zmiany komórkowe." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Rejestracja zarodka C. elegans wykazującego ekspresję fuzji Tubulin::GFP oraz fuzji Histone::mCherry. Obrazy wyekstrahowane z trójwymiarowego nagrania time-lapse zarodka C. elegans wykazującego ekspresję fuzji Tubulin::GFP (ruIs57) oraz fuzji Histone::mCherry (itIs37 ; stIs10226). Warunki rejestracji: akwizycja stosu 20 przekrojów (odległość między przekrojami 1 µm) co 105 sec; całkowity czas akwizycji: 16 min; czas ekspozycji: 200 msec dla każdego kanału. Panel a przedstawia 10 przekrojów z tego samego stosu. Panel b przedstawia ten sam przekrój co 210 sec. Moc oświetlenia wynosiła odpowiednio 30 µW i 300 µW dla laserów 488 i 561 nm (mierzona na wyjściu obiektywu oświetlającego). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające dynamikę komórkową w czasie i przy różnych głębokościach ogniskowania." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Rejestracja zarodka C. elegans wyrażającego fuzję VIT-2::GFP oraz mCherry skierowaną do błony komórkowej. Obrazy wyodrębnione z 3D time-lapse rejestracji zarodka C. elegans wyrażającego fuzję VIT-2::GFP (pwIs23) oraz mCherry skierowaną do błony komórkowej (ltIs44). Warunki rejestracji: akwizycja stosu 10 warstw (odległość między warstwami 1 µm) co 30 sec; całkowity czas akwizycji: 25 min; czas ekspozycji na kanał: 200 msec. Panel a przedstawia 5 pierwszych warstw tego samego stosu. Panel b przedstawia tę samą warstwę co 30 sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo.</a>

Ten protokół opisuje konfigurację mikroskopu z arkuszem świetlnym i jego implementację do obrazowania in vivo zarodków C. elegans.

Konfiguracja prostego mikroskopu z arkuszami świetlnymi do obrazowania in toto rozwoju C. elegans

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obrazowanie rozwoju C Allergan z wykorzystaniem fluorescencyjnej mikroskopii arkusza światła. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez wstępne skonfigurowanie mikroskopu opartego na arkuszu światła, składającego się z mikroskopu prostego oraz niewielkiego zestawu elementów optomechanicznych służących do generowania arkusza światła. Drugim krokiem procedury jest zamocowanie embrionu.Ostatnim etapem jest ustawienie arkusza światła na embrionie i rejestracja jego rozwoju. Wyniki mogą ukazać dynamikę białek znakowanych fluorescencyjnie podczas rozwoju C. elegans poprzez analizę obrazów 3D i filmów poklatkowych. Główną zaletą mikroskopii arkusza światła w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna, jest możliwość szybszego obrazowania przy niższej fototoksyczności.Po trzecie, metoda ta może dostarczyć wglądu w rozwój fok. Może ona zostać zastosowana również w innych systemach, takich jak szczur czy zebrafish. Zaprezentowanie tej procedury będzie przejrzyste.Shales, inżynier z mojego laboratorium oraz Pauline Linac, inżynier z laboratorium van. Ta sekcja opisuje montaż układu, który może pozostać złożony podczas wszystkich eksperymentów. Po ustawieniu laserów, filtrów, teleskopu i peryskopu na stole optycznym, zamocuj soczewkę cylindryczną w celu wygenerowania arkusza światła.Kolejny obiektyw zostaje ustawiony pod kątem ostrości. Ogniskowa obiektywu oświetlającego powinna pokrywać się z ogniskiem przedmiotowym obiektywu detekcyjnego. Następnie należy rzucić wiązkę na ścianę lub ekran i przesuwać obiektyw oświetlający wzdłuż osi wiązki, aż kontury projekcji staną się ostre.W konfiguracji mikroskopu należy zamontować filtr emisyjny czteroliniowy oraz kamerę E-M-C-C-D. Drugi manualny zespół przesuwczy należy przytwierdzić prostopadle do pierwszego. Cały zestaw należy przykręcić do istniejącego stolika mikroskopu.Po zdjęciu zamontowanego obiektywu oświetlającego z soczewką cylindryczną, umieść zespół na mikroskopie i przywróć zestaw oświetlenia na stolikach. Przymocuj uchwyt qve w punkcie prostopadłego przecięcia ścieżki oświetlenia i ścieżki detekcji. Następnie sprawdź arkusz światła.Napełnij szklaną kuwetę roztworem fluoresceiny i umieść ją w uchwycie na stoliku. Arkusz światła powinien być widoczny. Powinien on być poziomy i wycentrowany względem obiektywu detekcyjnego.Następnie wyjmij soczewkę cylindryczną. Zoptymalizuj arkusz światła za pomocą trójwymiarowego przemieszczania obiektywu iluminacyjnego, a następnie wykonaj obraz, aby zmierzyć grubość arkusza światła. Zależy ona od apertury soczewki obiektywu.Następnie należy wymienić soczewkę cylindryczną. Najpierw należy wyciąć kawałek szkła o grubości 1 mm i wymiarach 10 mm na 20 mm. Należy użyć diamentowego rylca.Następnie nanieś 20 µL poli-L-lizyny na jedno szkiełko i po jego wyschnięciu przyłóż je do drugiego szkiełka. W ustalonej pozycji nanieś kroplę 5% agaru i wyrównaj go, kładąc na wierzchu trzecie szkiełko w celu dociśnięcia. Po wyschnięciu agaru zdejmij trzecie szkiełko i wytnij obszar agaru w odległości 3 mm od krawędzi dwóch pozostałych szkiełek, nad szkiełkiem bez poli-L-lizyny.Następnie wyjmij utrwalony preparat, pozostawiając wystający fragment agaru. Pokryj agar 20 µL poli-L-lizyny i pozostaw do wyschnięcia. Teraz umieść nicienie GR w szalku zegarkowym wypełnionym pożywką M9 pod mikroskopem stereoskopowym.Przetnij nicienie skalpelem na wysokości sromu, aby uwolnić jaja. Następnie zidentyfikuj embriony w stadium, które jest przedmiotem zainteresowania, i zbierz je za pomocą mikrokapilary. Przenieś embriony na nawis agarowy przygotowanego szkiełka, tuż przy krawędzi szkiełka, unikając kładzenia ich na brzegu agaru.Następnie należy ustawić zarodki za pomocą mikrokapilary, jednocześnie usuwając ciecz. Dzięki aspiracji zarodki przylegają do poli-L-lizyny. Bardzo ważne jest odpowiednie ustawienie zarodków w celu uzyskania dobrego nagrania, co wymaga zastosowania kapilary o właściwej średnicy otworu.Jeśli będzie zbyt małe, trudno będzie uwolnić embriony. Jeśli zbyt duże, utrudnione będzie ścisłe kontrolowanie przepływu i ustawienie embrionów. Przykryj preparat medium M nine w szalce Petriego i potwierdź pod powiększeniem, że embriony nadal przylegają do agaru. Teraz przymocuj przygotowany preparat z embrionami do uchwytu na próbki pasującego do vete.Uchwyt jest urządzeniem wykonanym wewnętrznie, zaprojektowanym tak, aby pasował do vete. Następnie należy przymocować vete do stolika piezoelektrycznego i pod oświetleniem w polu jasnym zlokalizować embrion. Teraz należy uruchomić pakiet oprogramowania sterujący akusto-optycznym modulatorem częstotliwości.Przefiltruj obraz z kamery i obraz z platformy. Niniejsze oprogramowanie zostało opracowane wewnętrznie, lecz można również skorzystać z darmowego programu MicroManager. Najpierw wybierz linię lasera.Następnie przesuń stolik wzdłuż osi x, aż arkusz światła osiągnie maksymalną jasność. Następnie wyreguluj pozostałe dwa wymiary, Y i Z, aż stosunek sygnału do szumu będzie optymalny. Operację tę może być konieczne powtórzyć dla każdego zarodka.Kluczem jest optymalizacja stosunku sygnału do szumu w celu uzyskania dobrego zapisu, tłumacząc etap wolny, wspierający i eliminujący cel, gdy tylko relacja pozwoli na uzyskanie wiernej symulacji embrionu i najlepszego kontrastu. Aby uzyskać obrazy time-lapse, należy ustawić moc lasera, czas ekspozycji, wzmocnienie (gain) oraz interwał obrazowania zgodnie z poziomem fluorescencji embrionu i prędkością analizowanego procesu biologicznego. Dla Zacka.Podczas obrazowania ustawiono odległość między przekrojami oraz ich pozycje początkowe i końcowe w komórkach elgan wykazujących ekspresję konstruktu GFP histonu. Dwugodzinne obrazowanie time-lapse wykonano przy użyciu stosów 20 przekrojów rejestrowanych co 37 sekund. Podziały komórkowe były wyraźnie widoczne w szczepie wykazującym ekspresję tubuliny połączonej z GFP oraz histonu połączonego z m cherry. Nagrania prowadzono przez 16 minut co 105 sekund.Przedstawiono renderingi 3D w trzech punktach czasowych. Wrzeciona podziałowe i skondensowane chromosomy są wyraźnie widoczne i łatwo śledzić je podczas podziałów komórkowych. W trzecim szczepie obrazowano apolipoproteinę vit dwa połączoną z GFP, przy jednoczesnym znakowaniu błony komórkowej mCherry.Przez ponad 13 minut, co 27 sekund pobierano stosy 10 przekrojów. Szybko poruszające się cząsteczki lipoprotein były łatwe do śledzenia. Tutaj wykorzystujemy arkusz światła utworzony za pomocą bardziej złożonych metod produkcji.W celu dalszej poprawy rozdzielczości przestrzennej można zastosować arkusz światła.

setting-up-simple-light-sheet-microscope-for-toto-imaging-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Konfiguracja prostej mikroskopii arkuszowej dla In Toto Obrazowania C. elegans Rozwoju

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Przezroczyste jelito C. elegans może służyć jako "komora tkankowa in vivo" do badania biogenezy błony wierzchołkowej i światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórkowej podczas tubulingenezy wielokomórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe znakowanie, genetykę utraty funkcji/RNAi i podejścia mikroskopowe w celu przeanalizowania tych procesów na poziomie molekularnym.

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i montażu zarodków Caenorhabditis elegans, rejestrowania rozwoju pod mikroskopem 4D i śledzenia linii komórkowej.

Mikroskopia 4D: odkrywanie rozwoju embrionalnego Caenorhabditis elegans za pomocą mikroskopii Nomarskiego

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Mikroskopia superrozdzielcza może dostarczyć szczegółowych informacji na temat organizacji komponentów w kompleksie synaptonemalnym w mejozie. Tutaj demonstrujemy protokół rozwiązywania poszczególnych białek kompleksu synaptonemalnego Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej Epon po osadzeniu przy użyciu białka fluorescencyjnego o nazwie mScarlet. Ta metoda może jednocześnie utrzymać fluorescencję i ultrastrukturę. Ta technika jest podatna na szeroką gamę zastosowań biologicznych.

Epon Post Osadzanie korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej

Poznaj konfigurację mikroskopu z arkuszami świetlnymi do obrazowania in toto rozwoju embrionów C. elegans. Ta metoda umożliwia szybsze obrazowanie z niższą fototoksycznością niż mikroskopia konfokalna.

Konfiguracja prostego mikroskopu z arkuszami świetlnymi do obrazowania in toto rozwoju C. elegans

Przeglądaj więcej filmów