Name: Wychwytywanie glikopeptydu w proteomice powierzchni komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Poznaj metodę wychwytywania glikopeptydów do wzbogacania białek błonowych powierzchni komórki. Technika ta umożliwia identyfikację i ilościowe oznaczanie niskostężonych glikoprotein w analizie proteomicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania zostały wsparte przez fundusz startowy Uniwersytetu Simona Frasera.

1. Membrany żniwne
<ol>
	<li>Dodać hipotoniczny bufor (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, pH 8,0) z koktajlem inhibitorów proteazy na osad komórkowy (~108 komórek) i inkubować przez 15-30 minut na lodzie. Poddać komórki lizie, przepuszczając próbkę przez igły strzykawki (5-10 przejść) lub homogenizując próbkę za pomocą homogenizatora Dounce (15-30 uderzeń). Użyj hemocytometru i barwienia na niebiesko trypanem, aby sprawdzić skuteczność lizy.</li>
	<li>Otrzymać frakcję mikrosomalną przez różnicowe odwirowanie lizatu w czasie 3 000 g x 15 min, a następnie po 100 000 g x 2 h. W pierwszym wirowaniu uzyskuje się osad, który jest frakcją jądrową, a późniejsze odwirowanie supernatantu generuje drugi osad, który jest frakcją mikrosomalną, która zawiera błonę plazmatyczną, a także organelle związane z błoną8. Ostatnim supernatantem jest frakcja cytozolowa. Frakcje mikrosomalne należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C do dalszej analizy, jak wskazano poniżej.</li>
</ol>
2. Rozpuszczanie, denaturacja i trawienie białek błonowych
<ol>
	<li>Rozpuścić frakcję mikrosomalną w buforze denaturacyjnym (40 mM Tris, 10 mM EDTA, 10 mM TCEP, 0,5% Rapigest, pH 8), a następnie inkubować roztwór w temperaturze 100 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Schłodzić podgrzany roztwór do temperatury pokojowej, dodać do roztworu proszek mocznikowy o bardzo wysokiej czystości do końcowego stężenia 8 M i inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać roztwór podstawowy jodoacetamidu do próbki do końcowego stężenia 15 mM i inkubować roztwór w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu alkilowania wolnych tioli w próbce. Dodać roztwór podstawowy DTT do próbki do końcowego stężenia 10 mM i inkubować roztwór przez kolejne 10 minut w temperaturze pokojowej w celu stłumienia nadmiaru jodoacetamidu.</li>
	<li>Otrzymany roztwór rozcieńczyć 10x 40 mM buforem Tris o pH 8, a następnie dodać trypsynę do próbki w stosunku 1:20 trypsyny do białka całkowitego. Utrzymuj reakcję trawienia w piecu o temperaturze 37 °C przez noc, aby upewnić się, że reakcja została zakończona.</li>
	<li>Zakończyć trawienie, zakwaszając roztwór próbki do pH 1 za pomocą HCl, co jest stanem, który również rozkłada detergent, tj. Rapigest. Rozkładać Rapigest w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i usuwać powstałe osady przez odwirowanie.</li>
	<li>Oczyścić supernatant zawierający peptydy próbki za pomocą wkładu do ekstrakcji do fazy stałej (SPE) C-18 i wysuszyć otrzymaną próbkę za pomocą speedvac.</li>
	<li>Wykonaj analizę SDS-PAGE próbek przed i po trawieniu trypsyny, aby potwierdzić skuteczność trawienia.</li>
</ol>
3. Wychwyt glikopeptydu
<ol>
	<li>Rozpuścić oczyszczone peptydy w buforze sprzęgającym (100 mM octan sodu, pH 5,5). Dodaj periodynian sodu do roztworu peptydu o końcowym stężeniu 10 mM przez 30 minut w ciemności, w temperaturze pokojowej. Spowoduje to utlenienie grup cis-diolowych w glikanach do aldehydów, które pozwolą glikanom połączyć się z żywicą poprzez chemię hydrazydów. Nadmiar periodatu należy stłumić siarczynem sodu o końcowym stężeniu 20 mM i pH 5 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wprowadzić żywicę derywatyzowaną hydrazydem do roztworu peptydu w stosunku 1:4 (żywica do roztworu), aby połączyć glikopeptydy z żywicą. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1-2 dni z rotacją od końca do końca w celu całkowitego sprzężenia.</li>
	<li>Usunąć niezwiązane peptydy, przemywając żywicę dwukrotnie 1 ml każdego z poniższych: wody demineralizowanej, 1,5 M NaCl, metanolu i 80% acetonitrylu. Na koniec przemyj żywicę 3x 1 ml 100 mM NH4HCO3 o pH 8, aby wymienić bufor systemu na 100 mM NH4HCO3.
	<ol>
		<li>Zebrać supernatant i popłuczyny do analizy niezwiązanych peptydów (fakultatywnie).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uwolnić N-glikopeptydy z żywicy za pomocą PNGazy F w inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C z rotacją od końca do końca. Zbierz uwolnione peptydy przez odwirowanie i przepłukanie 80% acetonitrylem. Wysuszyć otrzymany roztwór w speedvac do analizy LC-MS.</li>
</ol>
4. Dalsza frakcjonowanie (opcjonalnie)
Aby jeszcze bardziej uprościć złożoność próbki, należy frakcjonować otrzymane N-glikopeptydy. Na przykład ponownie rozpuść wysuszone peptydy w 10 mM mrówczanu amoniaku, pH 3 z 20% acetonitrylem i użyj chromatografii silnej kationowymienności (SCX) do frakcjonowania peptydów. Otrzymany eluent wysuszyć, a następnie przeanalizować otrzymane frakcje peptydowe za pomocą LC-MS8,17,18 z odwróconą fazą.
5. Czyszczenie uwolnionych N-glikopeptydów (opcjonalnie)
Jeśli pojawią się obawy co do potencjalnego zanieczyszczenia peptydów, ponownie rozpuść wysuszone peptydy w 0,1% kwasie mrówkowym i użyj kolumny MCX SPE do dalszego oczyszczenia peptydów przed analizą LC-MS w odwrotnej fazie.
Uwaga: Parametry przeszukiwania bazy danych.
Podczas selektywnego oddzielania N-glikopeptydów od żywicy, PNGaza F przekształca asparaginę połączoną z N-glikanem w kwas asparaginowy. W związku z tym następuje przesunięcie masy uwolnionych N-glikopeptydów o 0,9840 Da. Aby dokładnie zidentyfikować te peptydy, modyfikacja ta musi zostać dodana do parametrów wyszukiwania wraz z powszechnymi modyfikacjami, takimi jak karbamidomemetylacja cysteiny i utlenianie metioniny.

<ol><li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biophysics+and+biomolecular+structure%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).</li>
<li>Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein-coupled+receptor+signalling+in+the+cardiac+nuclear+membrane%3A+evidence+and+possible+roles+in+physiological+and+pathophysiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function.</a> The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).</li>
<li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+dissection+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biophysical dissection of membrane proteins.</a> Nature. 459, 344-346 (2009).</li>
<li>Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+topology.+%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein topology. </a> Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-resolution+proteomics+for+data-driven+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology.</a> Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).</li>
<li>Lamond, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+cell+biology+through+proteomics+in+space+and+time+%28PROSPECTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS).</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
<li>Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+accelerates+membrane+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biochemical+sciences%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis.</a> Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+glycopeptide+capture+approach+coupled+with+mass+spectrometry+for+comprehensive+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).</li>
<li>Lowe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation%2C+immunity%2C+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation, immunity, and autoimmunity.</a> Cell. 104, 809-812 (2001).</li>
<li>Dodds, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+dissociation+of+glycosylated+peptide+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+spectrometry+reviews%22%5BJournal%5D)">Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions.</a> Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).</li>
<li>Kaji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin+affinity+capture%2C+isotope-coded+tagging+and+mass+spectrometry+to+identify+N-linked+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).</li>
<li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry%2C+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).</li>
<li>Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+identification+of+N-glycosylated+proteins+and+unambiguous+assignment+of+their+glycosylation+sites+using+HILIC+enrichment+and+partial+deglycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation.</a> J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).</li>
<li>Bond, M. R., Kohler, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+for+glycoprotein+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical methods for glycoprotein discovery.</a> Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).</li>
<li>Pasini, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+analysis+of+the+membrane+and+cytosolic+proteome+of+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells.</a> Blood. 108, 791-801 (2006).</li>
<li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycoproteome+of+E14.Tg2a+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycocapture-assisted+global+quantitative+proteomics+%28gagQP%29+reveals+multiorgan+responses+in+serum+toxicoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome.</a> J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu przedstawiamy strategię wychwytywania glikopeptydu do profilowania białek na powierzchni komórki. Metoda może być stosowana do badania wydzielanych białek, takich jak te znajdujące się we krwi, a także w innych płynach ustrojowych lub w pożywkach do hodowli komórkowych.
Powodzenie metody zależy od całkowitego roztrawienia próbek; w związku z tym konieczna jest charakterystyka wydajności mineralizacji za pomocą SDS-PAGE, szczególnie w przypadku pierwszej analizy próbki. Całkowite ...

Białka powierzchniowe komórki oddziałują ze środowiskiem zewnątrzkomórkowym i przekazują sygnały z zewnątrz do wnętrza komórki. Tak więc białka te, w tym białka macierzy zewnątrzkomórkowej, odgrywają kluczową rolę we wszystkich aspektach biologii i fizjologii komórkowej, począwszy od proliferacji, wzrostu, migracji, różnicowania po starzenie się i tak dalej. Białka powierzchniowe funkcjonują poprzez interakcję z innymi komórkami, białkami i małymi cząsteczkami1-3. Charakterystyka molekularna białek na powierzchni komórki jest bardzo interesująca nie tylko dla biologów, ale także dla firm farmaceutycznych, ponieważ ponad 60% leków jest ukierunkowanych na białka na powierzchni komórki4.
Tandemowa spektrometria mas (MS), ze swoją doskonałą czułością, dokładnością i przepustowością do identyfikacji białek i peptydów, stała się potężnym narzędziem do globalnych badań proteomicznych5,6. Jednak białka powierzchniowe stanowią poważne wyzwanie dla proteomiki opartej na stwardnieniu rozsianym, ponieważ większość białek powierzchniowych występuje w małych ilościach i z silnymi modyfikacjami. Regiony obejmujące błonę białek powierzchniowych sprawiają, że są one hydrofobowe; Dotyczy to zwłaszcza wieloprzebiegowych białek transbłonowych. W związku z tym trudno jest rozpuścić białka błonowe w roztworach wodnych bez pomocy detergentu; jednakże stosowanie detergentów na ogół hamuje działanie HPLC i MS1,7,8 w identyfikacji białek. W związku z tym białka błonowe zostały słabo scharakteryzowane w bezpośredniej proteomice opartej na LC-MS.
Glikozylacja jest jedną z najważniejszych i najliczniejszych modyfikacji potranslacyjnych zachodzących w białkach powierzchniowych komórek9. Ogromna złożoność i niejednorodność glikanów utrudnia peptydom sygnał MS10. Niemniej jednak kilka metod proteomicznych wykorzystało tę unikalną modyfikację do wzbogacenia białek powierzchniowych i usunięcia ugrupowań cukrowych z białek przed analizą LC-MS. Metody te obejmują wychwyt powinowactwa na podstawie lektyny11 oraz wychwyt chemiczny na bazie hydrazydów lub kwasu borowego12, a także rozdzielanie metodą chromatografii hydrofilowej8,13. Usunięcie glikanów przekształca białka błonowe w zwykłe białka i drastycznie upraszcza charakterystykę MS. Ponieważ glikozylacja zachodzi również w wydzielanych białkach, które mają wysoką rozpuszczalność w przeciwieństwie do białek błonowych, wiele metod glikoproteomicznych jest zoptymalizowanych pod kątem białek rozpuszczalnych i ma tendencję do niższej selektywności i wrażliwości glikopeptydów, gdy są stosowane do białek błonowych8,14. Istnieją również inne metody wzbogacania, w szczególności, białek powierzchniowych komórek, takie jak metody wykorzystujące ultrawirowanie15 i strategie znakowania16. Szczegółowe porównanie naszej metody z innymi istniejącymi metodami charakteryzowania białek błonowych zostało przeprowadzone niedawno17, a wyniki wskazały, że nasza metoda może działać równie dobrze, jeśli nie lepiej, niż wszystkie porównywane metody proteomiki błonowej, ale z większą prostotą.
Aby pomóc badaczom w korzystaniu z tej metody, szczegółowo opisujemy tutaj ogólny protokół. Metoda ta łączy w sobie kilka zalet istniejących strategii glikoproteomicznych i została opracowana specjalnie dla glikoprotein błonowych, ale metoda działa równie dobrze w przypadku wydzielanych białek. Cechy charakterystyczne tej metody obejmują: 1) całkowitą rozpuszczalność białek błonowych, 2) wzbogacenie glikopeptydów zamiast glikoprotein w celu wyeliminowania potencjalnej przeszkody sterycznej przy użyciu stałego substratu wychwytującego, 3) zastosowanie chemii hydrazydów do tworzenia wiązań kowalencyjnych między glikopeptydami a substratem wychwytującym, tak aby związane glikopeptydy mogły tolerować rygorystyczne płukanie w celu uzyskania wysokiej glikoselektywności, oraz 4) możliwość przeprowadzenia całej procedury wychwytywania w jednej probówce w celu zmniejszenia utraty próbki i skrócenia czasu trwania procedury. Po zastosowaniu tej metody do badania różnych próbek biologicznych, w tym komórek i tkanek, zaobserwowaliśmy wysoką selektywność (> 90%) w stosunku do glikoprotein8,17,18.

<table><tbody><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma 646547</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF</td><td>Waters</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Periodate sodu</td><td>Sigma</td><td>311448</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0704S</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Żel hydrazydowy Hz</td><td>Bio-Rad</td><td>153-6047</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Worthington Biomedical</td><td>LS02115</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C-18 wkład</td><td>Waters</td><td>WAT054955</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX</td><td>Woda</td><td>186000252</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitora proteazy</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Amersco</td><td>568</td><td></td></tr><tr><td>Siarczyn sodu</td><td>Caledon</td><td>8360-1</td><td></td></tr><tr><td>Invertaza</td><td>Sigma</td><td>I0408</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-1 trypsyna</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Rybonaza B</td><td>Sigma</td><td>R7884</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Albumina jaja kurzego</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Conalbumina</td><td>Sigma</td><td>C0755</td><td></td></tr></tbody></table>

wychwytywanie glikopeptydu w proteomice powierzchni komórki

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Białka powierzchniowe komórek, w tym białka macierzy zewnątrzkomórkowej, uczestniczą we wszystkich głównych procesach i funkcjach komórkowych, takich jak wzrost, różnicowanie i proliferacja. Kompleksowa charakterystyka tych białek dostarcza bogatych informacji do odkrywania biomarkerów, identyfikacji typu komórki i wyboru celu leku, a także pomaga pogłębić naszą wiedzę na temat biologii i fizjologii komórek. Białka powierzchniowe stanowią jednak poważne wyzwanie analityczne ze względu na ich z natury niską liczebność, wysoką hydrofobowość i silne modyfikacje potranslacyjne. Wykorzystując dominującą glikozylację białek powierzchniowych, wprowadzamy tutaj wysokoprzepustowe podejście do wychwytywania glikopeptydów, które integruje zalety kilku istniejących środków N-glikoproteomicznych. Nasza metoda może wzbogacić glikopeptydy pochodzące z białek powierzchniowych i usunąć ich glikany w celu ułatwienia proteomiki za pomocą LC-MS. Rozwiązany N-glikoproteom zawiera informacje o tożsamości i ilości białek, a także o miejscach ich glikozylacji. Metoda ta została zastosowana w serii badań w obszarach takich jak rak, komórki macierzyste i toksyczność leków. Ograniczenie metody polega na niskiej obfitości białek błony powierzchniowej, tak że do tej analizy wymagana jest stosunkowo duża ilość próbek w porównaniu z badaniami skoncentrowanymi na białkach cytozolowych.

Reprezentatywny schemat procedury eksperymentalnej przedstawiono na Rysunku 1. Etapy znakowania i dalszego frakcjonowania są opcjonalne, a ich szczegóły opisano w niedawnej publikacji18. Inną opcją jest analiza peptydów niemodyfikowanych, które nie reagują z żywicą. Zalety analizy peptydów niemodyfikowanych obejmują możliwość identyfikacji peptydów i białek nieglikozylowanych, takich jak klaudyny w połączeniach ścisłych; dodatkową zaletą jest bardziej dokładne oznaczanie ilościowe. W oparciu o...

Białka powierzchniowe komórek są biologicznie ważne i szeroko glikozylowane. Przedstawiamy tutaj podejście do wychwytywania glikopeptydów w celu rozpuszczania, wzbogacania i deglikozylowania tych białek w celu łatwego analizowania proteomicznego opartego na LC-MS.

Wychwytywanie glikopeptydu w proteomice powierzchni komórki

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wzbogacenie białek błony komórkowej o niskiej zawartości. Osiąga się to poprzez wstępną denaturację i trawienie białek błonowych. Drugim krokiem jest utlenienie glikanów i wychwycenie glikozylowanych peptydów na powierzchni żywicy.Następnie nieglikopeptydy są wypłukiwane z żywicy. Ostatnim krokiem jest uwolnienie glikopeptydów z wiązaniem N-glikozydowym z żywicy w celu przeprowadzenia analizy lc MS. Ostatecznie zidentyfikowana sekwencja peptydowa może zostać przypisana do białek w celu ich identyfikacji i kwantyfikacji.Dzisiaj zaprezentuję Państwu zasadę działania metody wychwytywania peptydów Geico. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wychwytywanie glikoprotein, jest to, że białko błonowe jest najpierw trawione, a następnie wychwytywanie glikopeptydów może zostać przeprowadzone w jednym naczyniu. Zastosowanie tej techniki może przyczynić się do odkrycia biomarkerów chorób.Ponieważ białko gator może być uwalniane do krwi i innych płynów ustrojowych, a krążące w krwi glikoproteiny specyficzne dla procesu patologicznego mogą służyć jako biomarkery prognostyczne i diagnostyczne, należy w pierwszej kolejności przygotować cztery mililitry buforu hipotonicznego z dodatkiem koktajlu inhibitorów proteaz w stosunku 1:100. Do pelletu komórkowego zawierającego około 10⁸ komórek dodać jeden mililitr buforu hipotonicznego i inkubować mieszaninę w temperaturze 0-4°C (na lodzie) przez 15 do 30 minut. Następnie przenieść komórki do probówki o pojemności dwóch mililitrów i poddać je lizie, przepuszczając próbkę od 5 do 10 razy przez igłę strzykawki.Następnie należy użyć hematocytometru i barwienia błękitem trypanowym. Aby sprawdzić wydajność lizy, połączyć 1 ml lizatu z 3 ml pozostałego buforu hipotonicznego. Wirować próbkę z prędkością 3000 ×g w temperaturze 4 °C przez 15 minut.Przenieś nadsącz do probówki do ultrawirowania, a pellet przechowuj w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Wirowaj probówkę w ultrawirowarce przy 100 000 ×g w temperaturze 4 °C przez dwie godziny. Następnie rozpuść frakcję mikrosomalną w 200 µL buforu denaturującego, a następnie gotuj roztwór w temperaturze 100 °C przez 10 minut.Po ochłodzeniu podgrzanego roztworu do temperatury pokojowej, należy dodać proszek mocznika o wysokiej czystości, aby uzyskać końcowe stężenie 8 M, a następnie inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji do próbki należy dodać roztwór zapasowy acetamidu o stężeniu 500 mM, aby uzyskać końcowe stężenie 15 mM.Następnie inkubować roztwór w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej, abyy zaalkilować wolne grupy tiolowe w próbce. Po tym czasie dodać do próbki roztwór stokowy DTT o stężeniu 1 M, tak aby uzyskać stężenie końcowe 10 mM, i inkubować roztwór przez kolejne 10 minut w temperaturze pokojowej. Aby zneutralizować nadmiar jodacetamidu, rozcieńczyć otrzymany roztwór 10-krotnie buforem Tris o stężeniu 40 mM i pH 8, a następnie dodać do próbki trypsynę w stosunku 1:20 trypsyny do całkowitej ilości białka.Oznacz ilość całkowitego białka za pomocą metody Bradforda. Przechowuj reakcję trawienia w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc, aby zapewnić całkowity przebieg reakcji. Po zakończeniu przerwij proces trawienia poprzez zakwaszenie roztworu próbki do pH 1 za pomocą 10 mM kwasu solnego, co jednocześnie doprowadzi do degradacji rapydestu.Następnie detergent ulega najszybszej degradacji w temperaturze 37°C przez jedną godzinę w inkubatorze. Po inkubacji usuń powstały osad poprzez wirowanie. Oczyść nadsącz zawierający peptydy z próbki za pomocą kartridża do ekstrakcji do fazy stałej C 18, a otrzymaną próbkę wysusz w wirówce odparowującej.Przeprowadź analizę SDS-PAGE próbek przed i po trawieniu, aby potwierdzić wydajność procesu. Na tym etapie rozpuść oczyszczone peptydy w 200 µL buforu sprzęgającego. Następnie dodaj puriuan sodu do roztworu peptydów, aby uzyskać stężenie końcowe 10 mM.Próbkę inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji nadmiar prate neutralizować siarczynem sodu, aby uzyskać stężenie końcowe 20 millimolar i pH 5. Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej do roztworu peptydów dodać 200 mikrolitrów roztworu żywicy z pochodną hydrocytą, uprzednio równowagią w buforze sprzęgającym. Reakcję inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni przy stałym obracaniu w celu całkowitego sprzężenia. Po zakończeniu usunąć niezwiązane peptydy, przemywając żywicę dwukrotnie jednym mililitrem wody dejonizowanej, jednym mililitrem 1,5 molarnego chlorku sodu, jednym mililitrem metanolu oraz jednym mililitrem 80% acetonitrylu.Następnie należy zebrać supernatant oraz kolejne porcje z płukania w celu analizy niezwiązanych peptydów. Próbki należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia analizy. Następnie żywicę należy przemyć trzykrotnie 1 mL 100 mM wodorowęglanu amonu o pH 8.Na koniec należy dodać 300 µL wodorowęglanu amonu do fiolki z próbką. Aby uwolnić glikopeptydy N z żywicy, dodaj PNG ACE F i inkubuj próbkę w temperaturze 37 °C w rotacji end-to-end.Następnie należy zebrać uwolnione peptydy poprzez wirowanie, a następnie przemyć żywicę jednym mililitrem 80% acetonitrylu. Przemywiny należy połączyć z wcześniej zebranymi frakcjami. Na koniec otrzymany roztwór należy wysuszyć w koncentratorze SpeedVac przed analizą lc MS.Tutaj przedstawiono nietypowe widmo glikopeptydu uzyskane po zastosowaniu metody wzbogacania w otrzymanym glikopeptydzie. Glikan n został usunięty, a miejsce przyczepienia glikanu przekształcono w kwas asparaginowy za pomocą P-N-G-A-F. Dzięki temu widmo może być łatwo przeszukiwane przez dowolny silnik wyszukiwania proteomicznego w odniesieniu do powszechnych baz danych sekwencji białkowych.Atypowe LC-MS. Przedstawiono tutaj wynik analizy wychwyconych n-glikopeptydów, w której z jednego przebiegu LC-MS frakcji mikrosomalnej komórek zidentyfikowano ponad 100 glikoprotein. Selektywność wzbogacania zarówno w odniesieniu do glikoprotein, jak i glikopeptydów, wynosi zazwyczaj ponad 90%. W przypadku pomyślnej analizy selektywność wzbogacania może osiągnąć 95% dzięki zastosowaniu kolumny SCX i gradientu schodkowego w celu dalszego frakcjonowania. Próbki przed analizą LC-MS zazwyczaj pozwalają na dwukrotne zwiększenie liczby zidentyfikowanych glikoprotein.W przypadkach, gdy ilość otrzymanych glikopeptydów jest niewielka, w końcowej próbce mogą być widoczne zanieczyszczenia pochodzące z fiolek. Zanieczyszczenia te można usunąć za pomocą kolumny MCX. Mam nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu mają Państwo jasne wyobrażenie o tym, jak wykorzystać nasze metody wychwytywania glikopeptydów do badania białek błonowych.Podczas wykonywania tego protokołu ważne jest również odłożenie próbek z każdego etapu w celu późniejszego rozwiązywania problemów. Objętość odczynnika może zostać zoptymalizowana pod kątem konkretnego badania.

glycopeptide-capture-for-cell-surface-proteomics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przechwytywanie glikopeptydów dla proteomiki powierzchni komórkowej

Do analizy HPLC wykorzystano kulki POROS sprzężone z lektynami. Standardy glikopeptydów posłużyły jako kontrole pozytywne i negatywne. Osocze ludzkie po usunięciu białek MARS-14 i trawieniu trypsyną poddano chromatografii, a następnie zebrano frakcje przepływowe (FT) oraz związane do analiz ESI-LC-MS/MS. W frakcji związanej odnotowano wzbogacenie glikopeptydów w porównaniu z frakcją FT.

Metoda HPLC z wykorzystaniem lektyn do selektywnego wzbogacania glikopeptydów z złożonych próbek biologicznych

Wszechobecny drugi przekaźnik c-di-GMP kontroluje wzrost i zachowanie wielu bakterii. Opracowaliśmy nowatorską technologię opartą na spektrometrii mas wychwytywania związków do biochemicznej identyfikacji i charakterystyki białek wiążących c-di-GMP u praktycznie każdego gatunku bakterii.

Spektrometria mas związków chemicznych - potężne narzędzie do identyfikacji nowych białek efektorowych c-di-GMP

Protokół o wysokiej przepustowości został opracowany dla połączonego oczyszczania proteomiki i glikomiki oraz kwantyfikacji LC-MS/MS w osoczu. Analiza deamidacji motywów glikozylacji sprzężonych z N była specyficzna dla miejsc deglikozylowanych. Dokładne oznaczanie ilościowe N-glikanów osiągnięto poprzez sprzężenie separacji N-glikanów wspomaganej filtrem z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanów.

Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Ten artykuł opisuje metodologię przygotowania próbek tkanek sercowo-naczyniowych do analizy MS, która pozwala na (1) analizę składu białka ECM, (2) identyfikację miejsc glikozylacji oraz (3) charakterystykę składu form glikanów. Metodologia ta może być zastosowana, z niewielkimi modyfikacjami, do badania ECM w innych tkankach.

Glikoproteomika macierzy zewnątrzkomórkowej: metoda analizy nienaruszonego glikopeptydu przy użyciu spektrometrii mas

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Otwarte wyszukiwanie umożliwia identyfikację glikopeptydów ozdobionych nieznanymi wcześniej kompozycjami glikanów. W tym artykule przedstawiono uproszczone podejście do podejmowania otwartych poszukiwań i późniejszych poszukiwań glikopeptydów skoncentrowanych na glikanie dla próbek bakteryjnych na przykładzie Acinetobacter baumannii.

Zastosowanie otwartych podejść opartych na poszukiwaniach do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii sprzężonych z O

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) zmieniają struktury i funkcje białek. Metody jednoczesnego wzbogacania wielu typów PTM mogą maksymalizować pokrycie w analizach. Przedstawiamy protokół wykorzystujący dwufunkcyjną chromatografię powinowactwa do metali immobilizowaną Ti(IV), a następnie spektrometrię mas do jednoczesnego wzbogacania i analizy N-glikozylacji i fosforylacji białek w tkankach trzustki.

Strategia wzbogacania spin-tip do jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z ludzkich tkanek trzustki

Przedstawiono protokół do oznaczania biomarkerów o niskiej obfitości z wysuszonych próbek surowicy, czego przykładem jest biomarker peptydu uwalniającego progastrynę (ProGRP). Kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami są używane do selektywnego oczyszczania i wzbogacania proteotypowego peptydu ProGRP. Wychwycony peptyd jest następnie analizowany za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas.

Mikropróbkowanie w ukierunkowanej analizie białek o niskiej liczebności opartej na spektrometrii mas

Tutaj opisujemy proces proteomiki do charakterystyki proteomu powierzchni komórki różnych typów komórek. Ten przepływ pracy obejmuje wzbogacanie białek na powierzchni komórki, późniejsze przygotowanie próbki, analizę przy użyciu platformy LC-MS/MS oraz przetwarzanie danych za pomocą specjalistycznego oprogramowania.

Przepływ pracy "Cell Surface Capture" do ilościowego oznaczania proteomu powierzchni komórki bez znaczników

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną przez glikomikę, zintegrowaną technologię omiczną, która oferuje wszechstronny wgląd w heterogeniczny glikoproteom w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych, niezbędny do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

Poznaj metodę wychwytywania glikopeptydów do wzbogacania białek błonowych powierzchni komórki. Technika ta umożliwia identyfikację i ilościowe oznaczanie niskostężonych glikoprotein w analizie proteomicznej.

Wychwytywanie glikopeptydu w proteomice powierzchni komórki

Przeglądaj więcej filmów