Wychwytywanie glikopeptydu w proteomice powierzchni komórki

Ogólnym celem tej procedury jest wzbogacenie białek błony powierzchniowej komórek o niskiej liczebności. Osiąga się to poprzez pierwszą denaturację i trawienie białek błonowych. Drugim krokiem jest utlenienie glikanów i wychwycenie glikozylowanych peptydów na powierzchni żywicy.

Nieglikopeptydy są następnie zmywane z żywicy. Ostatnim krokiem jest uwolnienie glikopeptydów sprzężonych z N z żywicy w celu analizy lc MS. Ostatecznie zidentyfikowana sekwencja peptydowa może zostać zmapowana z powrotem do białek w celu identyfikacji i kwantyfikacji.

Dzisiaj pokażę Ci, jak działa ral wychwytujący peptydy Geico. Główną zaletą tej techniki przedawkowania, w przypadku takich jak wychwyt glikoproteiny, jest to, że białko błonowe zostanie najpierw strawione, a wychwyt glikopeptydu może być przeprowadzony w jednym naczyniu. Zastosowanie tej techniki może rozszerzyć się na odkrycie biomarkera choroby.

Ponieważ białko aligatora może być wydalane we krwi i innych płynach ustrojowych, a krążąca glikoproteina we krwi, które są specyficzne dla procesu patologicznego, mogą być wykorzystywane jako biomarkery prognozowania i diagnozy. Najpierw przygotuj cztery mililitry hipotonicznego buforu z jednym do 100 koktajli inhibitorów proteazy. Dodaj jeden mililitr buforu hipotonicznego do osadu komórkowego zawierającego około 10 do ośmiu komórek i inkubuj mieszaninę przez 15 do 30 minut Na lodzie przenieś komórki do dwumililitrowej fiolki i wszawij komórki, przepuszczając próbkę od pięciu do 10 razy przez igłę strzykawki.

Następnie użyj cytometru hemocytometrycznego i barwienia na niebiesko. Aby sprawdzić skuteczność lizy, połącz jeden mililitr lizatu z trzema mililitrami pozostałego buforu hipotonicznego. Wiruj probówkę z prędkością 3000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.

Przenieś super supernatant do probówki ultrawirówkowej i przechowuj granulki w zamrażarce o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza. Wiruj probówkę ultrawirówki z prędkością 100 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez dwie godziny. Następnie rozpuść frakcję mikrosomalną w 200 mikrolitrach buforu denaturacyjnego, a następnie gotuj roztwór w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Po schłodzeniu podgrzanego roztworu do temperatury pokojowej dodać proszek mocznika o ultra wysokiej czystości, aby uzyskać końcowe stężenie ośmiomolowe i inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji dodać 500 milimolowców. I oto roztwór podstawowy acetamidu do próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 15 milimolów.

Następnie inkubować roztwór w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu alkilowania wolnych tioli w próbce. Następnie dodać jeden molowy roztwór podstawowy DTT do próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 10 milimoli i inkubować roztwór przez kolejne 10 minut w temperaturze pokojowej. Aby stłumić nadmierny acetamid I oto, otrzymany roztwór rozcieńczyć 10 razy 40-milimolowym buforem tris o pH ośmiu, a następnie dodać trypsynę do próbki w stosunku jeden do 20 trypsyny do całkowitej ilości białka.

Obliczyć ilość białka całkowitego za pomocą testu Bradforda. Utrzymuj reakcję trawienia w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby upewnić się, że reakcja została zakończona. Po zakończeniu zakończ trawienie, zakwaszając roztwór próbki do pH 1 za pomocą 10-milimolowego kwasu solnego, w stanie, który również ulega najszybszej degradacji.

Detergent rozkłada się najszybciej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę w inkubatorze. Po inkubacji usunąć powstały osad przez odwirowanie po odwirowaniu. Oczyścić natynkę SUP zawierającą peptydy próbki za pomocą wkładu do ekstrakcji do fazy stałej C 18 i wysuszyć otrzymaną próbkę za pomocą próżni szybkoobrotowej.

Wykonaj analizę próbek na stronie SDS przed i po podróżach i mineralizacji, aby potwierdzić skuteczność mineralizacji. W tym momencie rozpuść oczyszczone peptydy w 200 mikrolitrach buforu sprzęgającego. Po dodaniu sodu oczyścić do roztworu peptydu, aby uzyskać końcowe stężenie 10 milimolów.

Inkubować próbkę przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej Po zakończeniu inkubacji stłumić nadmiar pyłu siarczynem sodu, aby uzyskać końcowe stężenie 20 milimolów i pH 5 po inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej, wprowadzić 200 mikrolitrów roztworu żywicy pochodnej hydrocytów, wstępnie zrównoważyć i sprzęgać bufor do roztworu peptydu. Inkubować reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni z rotacją od końca do końca w celu całkowitego sprzężenia. Po zakończeniu usuń niezwiązane peptydy, przemywając żywicę dwukrotnie jednym mililitrem wody dejonizowanej, jednym mililitrem 1,5 molowego chlorku sodu, jednym mililitrem metanolu i jednym mililitrem 80% acetonitrylu.

Następnie zebrać supernatant i popłuczyny do analizy niezwiązanych peptydów. Przechowuj próbki w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy. Następnie umyj żywicę trzykrotnie jednym mililitrem 100-milimolowego wodorowęglanu amonu o pH ośmiu.

Na koniec dodać 300 mikrolitrów wodorowęglanu amonu do fiolki z próbką. Aby uwolnić glikopeptydy N z żywicy. Dodać PNG ACE F i inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z rotacją od końca do końca.

Następnie zbierz uwolnione peptydy przez odwirowanie, a następnie umyj żywicę jednym mililitrem 80% acetyloazotrylu. Połącz pranie z wcześniej zebranym. Na koniec wysuszyć otrzymany roztwór w prędkości VAC do analizy lc MS.

Nietypowe widmo glikopeptydów pobrane po metodzie wzbogacania przedstawiono w otrzymanym glikopeptydzie. Glikan n został usunięty, a glikan przyłączony dyskredytując został przekształcony w kwas spartowy przez P-N-G-A-F. W związku z tym widmo może być łatwo przeszukiwane przez dowolną wyszukiwarkę proteomiczną w porównaniu z popularnymi bazami danych sekwencji białek.

Nietypowy lc MS. Przedstawiono tutaj wynik wychwyconych n glikopeptydów, w którym można zidentyfikować ponad 100 glikoprotein z pojedynczego przebiegu lc MS frakcji mikrosomalnej komórki. Selektywność wzbogacania zarówno glikoprotein, jak i glikopeptydów wynosi na ogół ponad 90%Udana analiza może mieć selektywność wzbogacania na poziomie 95% przy użyciu kolumny SCX i gradientu krokowego w celu dalszej frakcjonowania. Próbki przed analizą LCMS zwykle podwajają liczbę identyfikacji glikoprotein.

Czasami, gdy ilość otrzymanych glikopeptydów jest niska, w próbce końcowej można zaobserwować zanieczyszczenia nagromadzone w fiolkach. Zanieczyszczenia te mogą być usuwane przez kolumnę MCX. Mam nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu dobrze rozumiesz, jak wykorzystać nasze metody wychwytywania glikopeptydu do badania samoobsługowego białka błonowego.

Podczas korzystania z tego protokołu ważne jest również, aby odłożyć próbki dla każdego kroku w celu rozwiązania problemu. Objętość odczynnika może być również zoptymalizowana pod kątem konkretnego badania.