Name: Spektroskopia rozpadu indukowanego laserem: nowe podejście do mapowania i kwantyfikacji nanocząstek w tkance narządowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Poznaj spektroskopię rozpadu indukowanego laserem do mapowania i kwantyfikacji nanocząstek w tkankach narządowych. Ta metoda umożliwia wykrywanie pierwiastków z rozdzielczością 100 μm i czułością sub-mM.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Labex-Imust.

1. Przygotowanie próbki biologicznej
Wszystkie eksperymenty opisane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania CECCAPP (Lyon, Francja) (autoryzacja #LYONSUD_2012_004), a eksperymenty były przeprowadzane pod nadzorem upoważnionych osób (L. Sancey, autoryzacja DDPP #38 05 32).
<ol>
	<li>Dodać 1 mlH2Odo 100 μmol nanocząstek na bazie gadolinu (Gd), odczekać 15 minut i dodać 20 μl HEPES 50 mM, NaCl 1,325 M, CaCl2 20 mM do 100 μlH2Oi 80 μl pierwotnego roztworu nanocząstek na bazie Gd, aby otrzymać 200 μl roztworu o stężeniu 40 mM gotowego do wstrzyknięcia (Miasto: Villeurbanne, w laboratorium).</li>
	<li>Wstrzyknąć dożylnie roztwór nanocząstek na bazie 200 μl Gd znieczulonym gryzoniom z nowotworem (Miasto: Lyon Sud (Oullins), 15 km od laboratorium).</li>
	<li>1-24 godziny po wstrzyknięciu poświęć myszy i umieść próbki biologiczne w izopentanie chłodzonym ciekłym azotem. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C (Miasto: Lyon Sud (Oullins), 15 km od laboratorium).</li>
	<li>Pokrój próbkę na plasterki (Miasto: zwykle Grenoble, 100 km od laboratorium; Postaram się mieć dostęp w Lyonie Sud) w szkiełkach o grubości 100 μm i umieszczę szkiełka biologiczne na specjalnych plastikowych szalkach (szalka Petriego). Przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	Uwaga: Plastikowe naczynia są w zasadzie bardzo czystą próbką polimeru. Stosuje się je w celu uniknięcia ingerencji w elementy zawarte w tkance.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki do kalibracji
<ol>
	<li>Przygotować fiolki ze zwiększającymi się dawkami nanocząstek na bazie Gd do wody (0 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM, 1 mM i 5 mM).</li>
	<li>Umieścić 5 μl kropli każdego roztworu w regularnych odstępach co 3 mm na szalce Petriego.</li>
	<li>Suszyć w temperaturze pokojowej przez 20 min.</li>
</ol>
3. Eksperyment LIBS
<ol>
	<li>Inicjowanie konfiguracji biblioteki LIBS
	<ol>
		<li>Ustawienia lasera. Po włączeniu przyrządów należy odczekać 10-20 minut na ustabilizowanie się energii impulsu laserowego i schłodzenie kamery ICCD do -20 °C. Dostosuj energię impulsu za pomocą tłumika. 
		Uwaga: Optymalne parametry lasera do mapowania tkanek to czas trwania impulsu 5 ns, długość fali 1 064 nm i energia impulsu około 4 mJ. Laser wykorzystuje typowy laser nanosekundowy Nd:YAG.</li>
		<li>Ustawienia bibliotek LIBS. Ustaw pozycję ogniskowania lasera (w stosunku do powierzchni próbki), aby uzyskać mniejszą średnicę krateru (około 50 μm lub mniej). 
		Uwaga: Odpowiada to ogniskowaniu impulsu laserowego 100 μm poniżej powierzchni próbki.</li>
		<li>Ustawienia spektrometru. Użyj spektrometru Czerny-Turnera w połączeniu z siatką 1,200 linii/mm i kamerą ICCD o wysokiej rozdzielczości czasowej. Steruj wszystkimi tymi urządzeniami za pomocą komputera. Ustaw wartość szczeliny wejściowej na 40 μm. Ustaw zakres widmowy dotyczący pierwiastka, który ma być analizowany. Użyj zakresu spektralnego obejmującego od 325 do 355 nm, aby wykryć Gd z wysoką czułością, a także Na, Cu i Ca. Ustaw parametry ICCD z opóźnieniem 300 nsec, bramką 2 μs i wzmocnieniem 200.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mapowanie pomiaru
	<ol>
		<li>Umieść próbkę biologiczną na zmotoryzowanym uchwycie na próbkę LIBS.</li>
		<li>Dostosuj wysokość próbki zgodnie z pozycją ostrości lasera.</li>
		<li>Zrób zdjęcie próbki w wysokiej rozdzielczości.</li>
		<li>Ustaw moduł mapowania oprogramowania do akwizycji LIBS tak, aby wykonywał mapę z typowymi punktami pomiarowymi 100 x 100 rozmieszczonymi w rozdzielczości około 100 μm.</li>
		<li>Rozpocznij nabywanie. Od tego momentu zautomatyzuj wszystko; ruchoma sekwencja, a także nagrywanie i zapisywanie widma. Do odwzorowania 10 000 punktów potrzeba 40 minut (co odpowiada 1cm2 dla rozdzielczości 100 μm). Przegrupuj wszystkie zarejestrowane widma w ten sam plik.</li>
		<li>Po zakończeniu zrób drugie zdjęcie wycinka próbki</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar kalibracyjny</li>
</ol>
Z tymi samymi parametrami eksperymentalnymi, zmierz próbki kalibracyjne (szczegóły dotyczące przygotowania, patrz sekcja 2). Wykonaj mapę lub zapisz 25 widm (uzyskanych z miejsc pomiarowych w środkowej części kropli) w każdej z kropli kalibracyjnych.
4. Analiza widma LIBS: Konstruowanie obrazów chemicznych
<ol>
	<li>Zapisz wszystkie widma LIBS z mapowania tkanek i załaduj je do analizy oprogramowania LIBS. Odejmij linię bazową dla każdego widma i skonstruuj obrazy chemiczne ze skalą intensywności względnej, używając fałszywego koloru. 
	Uwaga: Algorytm pobiera określone intensywności linii, takie jak Gd, Cu, Na lub Ca.</li>
	<li>Wykonaj tę samą operację na widmach zmierzonych ze skalibrowanej próbki, aby umożliwić obliczenie krzywych kalibracyjnych (zależność między intensywnością a stężeniem) i zbuduj mapę ilościową lub obraz dla Gd (lub innego elementu będącego przedmiotem zainteresowania).</li>
	<li>Zastosuj odpowiednie zabiegi do obrazów chemicznych, takie jak interpolacja lub wygładzenie. Zapisz mapy intensywności lub koncentracji w formacie obrazu (bitmapa).</li>
</ol>

<ol><li>Smith, M. A., Harris, P. L., Sayre, L. M., Perry, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+accumulation+in+Alzheimer+disease+is+a+source+of+redox-generated+free+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 9866-9868 (1997).</li>
<li>Wang, Y., Zhu, S., Weisman, G. A., Gitlin, J. D., Petris, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+knockout+of+the+Menkes+disease+copper+transporter+demonstrates+its+critical+role+in+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Conditional knockout of the Menkes disease copper transporter demonstrates its critical role in embryogenesis.</a> PloS one. 7, (2012).</li>
<li>Reske-Nielson, E., Lou, H. O., Andersen, P., Vagn-Hansen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-copper+concentration+in+Menkes%27+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Brain-copper concentration in Menkes' disease.</a> Lancet. 1, 613 (1973).</li>
<li>Hayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Various+copper+and+iron+overload+patterns+in+the+livers+of+patients+with+Wilson+disease+and+idiopathic+copper+toxicosis%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+molecular+morphology%22%5BJournal%5D)">Various copper and iron overload patterns in the livers of patients with Wilson disease and idiopathic copper toxicosis.</a> Medical molecular morphology. 46, (2013).</li>
<li>Lobinski, R., Moulin, C., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+speciation+of+trace+elements+in+biological+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Imaging and speciation of trace elements in biological environment.</a> Biochimie. 88, 1591-1604 (2006).</li>
<li>Devès, G., Bouhacina, T., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM+mass+measurements+for+quantitative+trace+element+analysis+within+biological+samples+and+validation+using+AFM+thickness+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochimica+Acta+B%22%5BJournal%5D)">STIM mass measurements for quantitative trace element analysis within biological samples and validation using AFM thickness measurements.</a> Spectrochimica Acta B. 59, 1733-1738 (2004).</li>
<li>Twining, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+trace+elements+in+individual+aquatic+protist+cells+with+a+synchrotron+X-ray+fluorescence+microprobe%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe.</a> Analytical chemistry. 75, 3806-3816 (2003).</li>
<li>Guerquin-Kern, J. L., Wu, T. D., Quintana, C., Croisy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+analytical+imaging+of+the+cell+by+dynamic+secondary+ion+mass+spectrometry+%28SIMS+microscopy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy).</a> Biochimica et biophysica acta. 1724, 228-238 (2005).</li>
<li>Binet, M. R., Ma, R., McLeod, C. W., Poole, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+zinc-+and+cadmium-binding+proteins+in+Escherichia+coli+by+gel+electrophoresis+and+laser+ablation-inductively+coupled+plasma-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of zinc- and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry.</a> Analytical biochemistry. 318, 30-38 (2003).</li>
<li>Becker, J., Gorbunoff, A., Zoriy, M., Izmer, A., Kayser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+near-field+laser+ablation+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry+%28NF-LA-ICP-MS%29+at+nanometre+scale+for+elemental+and+isotopic+analysis+on+gels+and+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anal.+Atom.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometre scale for elemental and isotopic analysis on gels and biological samples.</a> J. Anal. Atom. Spectrom. 21, 19-25 (2006).</li>
<li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+by+mass+spectrometry%3A+a+new+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">3D imaging by mass spectrometry: a new frontier.</a> Analytical chemistry. 84, 2105-2110 (2012).</li>
<li>Pornwilard, M. -M., Weiskirchen, R., Gassler, N., Bosserhoff, A. K., Becker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+bioimaging+techniques+of+metals+by+laser+ablation+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry+for+diagnosis+of+fibrotic+and+cirrhotic+liver+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Novel bioimaging techniques of metals by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry for diagnosis of fibrotic and cirrhotic liver disorders.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Cremers, D. A., Radziemski, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCremers%2C+DA+%22Handbook+of+laser-induced+breakdown+spectroscopy%22">Handbook of laser-induced breakdown spectroscopy</a>. , Wiley. (2006).</li>
<li>Miziolek, A. W., Palleschi, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiziolek%2C+AW+%22Laser-Induced+Breakdown+Spectroscopy%3A+Fundamentals+and+Applications%22">Laser-Induced Breakdown Spectroscopy: Fundamentals and Applications</a>. , (2006).</li>
<li>Motto-Ros, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nanoparticles+injected+into+a+biological+tissue+using+laser-induced+breakdown+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochimica+Acta+Part+B%22%5BJournal%5D)">Mapping nanoparticles injected into a biological tissue using laser-induced breakdown spectroscopy.</a> Spectrochimica Acta Part B. , (2013).</li>
<li>Motto-Ros, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+native+inorganic+elements+and+injected+nanoparticles+in+a+biological+organ+with+laser-induced+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Mapping of native inorganic elements and injected nanoparticles in a biological organ with laser-induced plasma.</a> Applied Physics Letters. 101, (2012).</li>
<li>Mignot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+top-down+synthesis+route+to+ultrasmall+multifunctional+Gd-based+silica+nanoparticles+for+theranostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications.</a> Chemistry. 19, 6122-6136 (2013).</li>
<li>Lux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasmall+rigid+particles+as+multimodal+probes+for+medical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Ultrasmall rigid particles as multimodal probes for medical applications.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 12299-12303 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Technika ta, zastosowana do próbki biologicznej, umożliwia obrazowanie chemiczne, tj. mapowanie i kwantyfikację Gd i Si z wstrzykniętych nanocząstek na bazie Gd do różnych narządów. Z głównych ustawień krytycznych, kontrola właściwości lasera (długość fali, energia impulsu, ogniskowanie i stabilność) ma kluczowe znaczenie dla precyzyjnej i precyzyjnej ablacji tkanek (tj. rozdzielczości mapowania), a także dla czułości. Praca przy dużej energii zapewnia lepszą czułość, ale niestety generuje pogorszoną ro...

Szeroki rozwój nanocząsteczek do zastosowań biologicznych skłonił do równoległego doskonalenia technik analitycznych do ich kwantyfikacji i obrazowania w próbkach biologicznych. Zwykle wykrywanie i mapowanie nanocząstek w narządach odbywa się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. Niestety, metody te wymagają znakowania nanocząstek barwnikiem bliskiej podczerwieni, który może modyfikować biodystrybucję nanocząstek, szczególnie w przypadku bardzo małych nanocząstek ze względu na ich właściwości hydrofobowe. Wykrywanie znakowanych nanocząstek, a zwłaszcza bardzo małych nanocząstek (wielkość < 10 nm), może zatem zakłócać ich biodystrybucję w skali całego ciała, ale także na poziomie tkanek i komórek. Opracowanie nowych urządzeń zdolnych do wykrywania nanocząstek bez konieczności znakowania stwarza nowe możliwości badania ich zachowania i kinetyki. Co więcej, rola pierwiastków śladowych, takich jak żelazo i miedź, w chorobach mózgu i chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak Alzheimer1, Menkes2,3 lub Wilson4, sugeruje zainteresowanie badaniem i lokalizacją tych pierwiastków w tkankach.
Różne techniki zostały użyte do mapowania pierwiastków lub mikroanalizy różnych materiałów. W pracy przeglądowej opublikowanej w 2006 r. R. Łobinski i wsp. przedstawili przegląd dostępnych standardowych technik mikroanalizy pierwiastkowej w środowisku biologicznym, jednym z najtrudniejszych środowisk dla nauk analitycznych5. Mikrosonda elektronowa, która składa się z mikroanalizy rentgenowskiej z dyspersją energii w transmisyjnym mikroskopie elektronowym, może być stosowana w wielu badaniach, jeśli stężenie pierwiastka jest wystarczające (>100–1000 μg/g). Aby osiągnąć dolne granice wykrywalności, zastosowano następujące techniki:
<ul>
	<li>mikrosonda wiązki jonów wykorzystująca emisję promieniowania rentgenowskiego indukowaną cząstkami μ-PIXE (1–10 μg/g)6</li>
	<li>mikroanaliza promieniowania synchrotronowego μ-SXRF (0,1–1 μg/g)7</li>
	<li>spektrometria mas jonów wtórnych SIMS (0,1 μg/g)8</li>
	<li>ablacja laserowa spektrometria mas sprzężona indukcyjnie LA-ICP-MS (do 0,01 μg/g)9,10</li>
</ul>
Wyżej wymienione techniki zapewniają rozdzielczość mikrometryczną, jak pokazano w Tabeli 1 zaczerpniętej od Lobinski et al.
3D rekonstrukcja seryjnych badań 2D może być również zaproponowana do rekonstrukcji głębszych tkanek11. Jednak wszystkie urządzenia i systemy wymagają zarówno wykwalifikowanych specjalistów, umiarkowanego i bardzo drogiego sprzętu, jak i długotrwałych eksperymentów (zwykle ponad 4 godziny w przypadku 100 μm x 100 μm w przypadku μ-SXRF i 10 mm x 10 mm w przypadku LA-ICP-MS)12. Łącznie wymagania te sprawiają, że mikroanaliza elementarna jest bardzo restrykcyjna i niekompatybilna z konwencjonalnymi systemami obrazowania optycznego, mikroskopią fluorescencyjną lub mikroskopią nieliniową. Kolejną kwestią, o której możemy tutaj wspomnieć, jest to, że możliwości pomiaru ilościowego są nadal dość ograniczone i zależą od dostępności wzorców laboratoryjnych dopasowanych do matrycy. Dalsze uogólnienie zastosowania mikroanalizy elementarnej w procesach przemysłowych, geologii, biologii i innych dziedzinach zastosowań zaowocuje znaczącymi przełomami koncepcyjnymi i technologicznymi.
Celem niniejszego manuskryptu jest zaproponowanie rozwiązań dla ilościowego mapowania pierwiastków (lub mikroanalizy pierwiastków) w tkankach biologicznych za pomocą oprzyrządowania w pełni kompatybilnego z konwencjonalną mikroskopią optyczną. Nasze podejście opiera się na spektroskopii rozpadu indukowanego laserem (technologia LIBS). W LIBS impuls laserowy jest skupiany na próbce będącej przedmiotem zainteresowania, aby wytworzyć rozpad i iskrę materiału. Promieniowanie atomowe emitowane w plazmie jest następnie analizowane przez spektrometr, a stężenia pierwiastków można uzyskać za pomocą pomiarów kalibracyjnych wykonanych wcześniej13,14. Do zalet LIBS należą: czułość (μg/g dla prawie wszystkich pierwiastków), kompaktowość, bardzo podstawowe przygotowanie próbki, brak kontaktu z próbką, natychmiastowa reakcja i precyzyjnie zlokalizowana (mikro) analiza powierzchni. Zastosowanie obrazowania chemicznego tkanek pozostaje jednak wyzwaniem, ponieważ ablacja laserowa tkanek musi być precyzyjnie kontrolowana, aby można było wykonywać mapy o wysokiej rozdzielczości przestrzennej wraz z czułością w zakresie μg/g15,16.
Przy takim rozwiązaniu, nie jest potrzebne stosowanie znaczników lub środków etykietujących, co pozwala na wykrywanie pierwiastków nieorganicznych bezpośrednio w ich naturalnym środowisku w tkankach biologicznych. Opracowany w naszym laboratorium instrument LIBS oferuje rozdzielczość prądu niższą niż 100 μm przy szacowanej czułości dla Gd poniżej 35 μg/g, co odpowiada 0,1 mM 16, co pozwala na mapowanie dużych próbek (>1 cm2) w ciągu 30 minut. Ponadto domowe oprogramowanie ułatwia pozyskiwanie i wykorzystywanie danych. Przyrząd ten służy do wykrywania, mapowania i ilościowego określania rozkładu tkanek nanocząstek na bazie gadolinu (Gd)17-18 w nerkach i próbkach guza od małych zwierząt, od 1 do 24 godzin po dożylnym wstrzyknięciu cząstek (wielkość <5 nm). Pierwiastki nieorganiczne, które są nieodłącznie zawarte w tkance biologicznej, takie jak Fe, Ca, Na i P, również zostały wykryte i zobrazowane.

<table><tbody><tr><td>Laser nanosekundowy Nd:YAG</td><td>Quantel</td><td>Brillant</td><td>5 nsec szerokość impulsu, długość fali 1,064 nm</td></tr><tr><td>Spektrometr</td><td>Andor Technology</td><td>Shamrock 303</td><td>z 1,200 liniami / mm palony na siatce 300 nm</td></tr><tr><td>Detektor ICCD</td><td>Andor Technology</td><td>Istar</td><td>2 nsec rozdzielczość czasowa</td></tr><tr><td>LIBS Jednostka</td><td>ILM</td><td></td><td>Domowe oprzyrządowanie</td></tr><tr><td>oparte na Gd nanocząstki</td><td>Nano-H</td><td></td><td>cząstki</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>do rozcieńczania cząstek</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td>do rozcieńczania cząstek</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>do rozcieńczania cząstek</td></tr><tr><td>Myszy</td><td>Charles River</td><td>w zależności od hodowli</td><td></td> zwierząt</tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Coveto / Virbac</td><td></td><td>do znieczulenia - Isofluranum</td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59060</td><td>do zamrażania próbki&nbsp; powoli</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Air Liquide</td><td></td><td>do schładzania izopentanu</td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>CM-3050S</td><td>do przesuwania</td></tr><tr><td>próbek Szalki Petriego</td><td>Dutscher</td><td>353004</td><td>do przyklejenia próbka</td></tr></tbody></table>

spektroskopia rozpadu indukowanego laserem: nowe podejście do mapowania i kwantyfikacji nanocząstek w tkance narządowej

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: A New Approach for Nanoparticle's Mapping and Quantification in Organ Tissue

Spektroskopia emisyjna plazmy indukowanej laserem została zastosowana do analizy pierwiastkowej próbek biologicznych. Spektroskopia rozpadu indukowanego laserem (LIBS) wykonywana na cienkich skrawkach tkanek gryzoni: nerek i guza, pozwala na wykrycie pierwiastków nieorganicznych, takich jak (i) Na, Ca, Cu, Mg, P i Fe, naturalnie występujących w organizmie oraz (ii) Si i Gd, wykrywanych po wstrzyknięciu nanocząstek na bazie gadolinu. Zwierzęta zostały poddane eutanazji od 1 do 24 godzin po dożylnym wstrzyknięciu cząstek. Dwuwymiarowy skan próbki, wykonany przy użyciu zmotoryzowanego mikrometrycznego stolika 3D, pozwolił wiązce lasera na podczerwień badać powierzchnię z rozdzielczością boczną mniejszą niż 100 μm. Ilościowe obrazy chemiczne pierwiastka Gd wewnątrz narządu uzyskano z czułością sub-mM. LIBS oferuje prostą i solidną metodę badania rozkładu materiałów nieorganicznych bez specjalnego etykietowania. Co więcej, kompatybilność zestawu ze standardową mikroskopią optyczną podkreśla jego potencjał do dostarczania wielu obrazów tej samej tkanki biologicznej z różnymi typami odpowiedzi: elementarną, molekularną lub komórkową.

Jak pokazano na Rysunku 1, wiązka lasera Nd:YAG o podstawowej długości fali 1 064 nm była ogniskowana pionowo w dół na plaster tkanki za pomocą soczewki kwarcowej o ogniskowej 50 mm. Energia impulsu wynosiła 4 mJ, a częstotliwość repetycji 10 Hz. Aby uniknąć generowania plazmy w powietrzu, wiązkę laserową ogniskowano około 100 µm poniżej powierzchni próbki. W tych warunkach nie zaobserwowano plazmy powietrznej. Podczas eksperymentów próbka była przesuwana za pomocą silnika krokowego, aby wygenerować jedn...

Laserowa spektroskopia rozpadu przeprowadzona na cienkich narządach i tkankach nowotworowych skutecznie wykryła naturalne pierwiastki i sztucznie wstrzyknięty gadolin (Gd), emitowany z nanocząstek opartych na Gd. Obrazy pierwiastków chemicznych osiągnęły rozdzielczość 100 μm i czułość ilościową poniżej mM. Kompatybilność zestawu ze standardową mikroskopią optyczną podkreśla jego potencjał do dostarczania wielu obrazów tej samej tkanki biologicznej.

Spektroskopia rozpadu indukowanego laserem: nowe podejście do mapowania i kwantyfikacji nanocząstek w tkance narządowej

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie prostej i niezawodnej metody mapowania i ilościowego oznaczania pierwiastków organicznych i nieorganicznych w tkance biologicznej przy użyciu aparatury stołowej w pełni kompatybilnej z konwencjonalną mikroskopią optyczną. Osiąga się to poprzez ogniskowanie impulsu lasera na badanej próbce w celu zainicjowania rozpadu i powstania iskry materiału. Plazma emituje promieniowanie, które jest następnie analizowane za pomocą spektrometru.Drugim krokiem jest wybór i identyfikacja linii widmowych odpowiadających badanym pierwiastkom oraz skanowanie powierzchni próbki. Następnie należy przeprowadzić pomiary kalibracyjne, aby umożliwić oznaczenie stężeń pierwiastków. Ostatnim etapem jest sporządzenie mapowania pierwiastkowego tkanki próbki na podstawie wszystkich zarejestrowanych widm, przy użyciu skali intensywności względnej lub skali stężeń.W konsekwencji spektroskopia przełomu wywołanego laserem jest wykorzystywana do wykazania rozkładu tkankowego różnych pierwiastków bez konieczności stosowania znakowania. W porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak mikrofluorescencja rentgenowska czy techniki oparte na spektrometrii mas, spektroskopia przełomu wywołanego laserem (LIBS) jest prosta w implementacji, działa pod ciśnieniem atmosferycznym i jest kompatybilna z większością systemów mikroskopów optycznych.Ponadto pozwala ona na osiągnięcie czułości na poziomie PPM przy rozdzielczości rzędu mikrona. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w nanotechnologii stosowanej w badaniach biologicznych, takich jak rozkład nanocząsteczek zawierających pierwiastki metaliczne w próbce tkanki, bez konieczności znakowania nanocząsteczek. Technika ta może znaleźć zastosowanie w patologii ze względu na niską granicę wykrywalności nieprawidłowych stężeń pierwiastków metalicznych, takich jak miedź, żelazo i aluminium, które mogą występować w różnych narządach ciała, zwłaszcza w mózgu. Dzięki temu metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat detekcji i identyfikacji nanocząsteczek.Metodę tę można zastosować również w innych układach, takich jak detekcja pierwiastków nieorganicznych w TCU lub analiza niejednorodnego rozkładu pierwiastków. Naukowcy przeprowadzający tego rodzaju eksperymenty muszą zoptymalizować ustawienia akwizycji, aby uzyskać jak najsilniejszy sygnał, unikając przy tym nadmiernego uszkodzenia próbek. Eksperyment należy rozpocząć od przygotowania preparatów do badania zgodnie z niniejszym protokołem.Pobrać organy od myszy z nowotworami, którym wstrzyknięto roztwór nanocząsteczek gadolinu, w celu przygotowania preparatów. Umieścić skrawki organów o grubości 100 µm na szkiełku kwarcowym lub w szalce Petriego. Preparaty zawsze przechowywać w temperaturze -80 °C.Następnie należy przygotować próbki do kalibracji. Oznakuj kilka fiolek, podając na nich stężenia, zaczynając od 0 nM i kończąc na 5 mM. Do każdej fiolki przygotuj 100 µL mieszaniny gadolinu w wodzie o odpowiednim stężeniu.Po wykonaniu tych czynności przygotuj szkiełko. Odmierz 5 µL z pierwszej fiolki i nanieś kroplę na szkiełko kwarcowe lub szalkę Petriego. Pamiętaj o odpowiednim oznakowaniu kropli do późniejszego użycia.Przesuń się o trzy milimetry wzdłuż obwodu i nanieś pięć µL kolejnego stężenia na szkiełko. Powtórz tę czynność dla każdego z pozostałych roztworów. Pozostaw zawartość szkiełka do wyschnięcia na 20 minut w temperaturze pokojowej.W tym układzie wykorzystano nanosekundowy laser neodymowo-gadolinowy z domieszką aluminium, generujący wiązkę o długości fali 1064 nanometrów. Część wiązki służy do synchronizacji systemu spektrometru. Pozostała część jest kierowana przez sterowany komputerowo tłumik, który służy do regulacji i stabilizacji energii impulsu laserowego podczas całego eksperymentu.Następnie skieruj wiązkę na obszar próbki. Skup wiązkę na sterowanym programowo stole translacyjnym. Będzie on podtrzymywał uchwyt próbki, a jedna kamera CCD będzie monitorować powierzchnię uchwytu próbki.Kolejny służy do monitorowania pióropusza plazmy. Analizuj światło pochodzące z rozpadu próbki w spektrometrze obrotowym z kamerą ICCD chłodzoną do -26 °C. Przed pomiarem rozpocznij stabilizację lasera oraz chłodzenie kamery do -26 °C.10 minut przed eksperymentem. Po przygotowaniu należy użyć tłumika, aby zablokować energię impulsu na poziomie 5 mJ. Następnie należy pobrać preparat do badania i przygotować go do zamocowania na stole obiektowym.Zamocuj próbkę w zmotoryzowanym uchwycie na próbki. Po wykonaniu tej czynności wróć do komputera. Aby ustawić próbkę, przesuń stolik tak, aby część próbki znalazła się w wiązce lasera.Ustaw ostrość lasera około 100 µm poniżej powierzchni próbki. Po wykonaniu tej czynności laser tworzy kratery o średnicy 50 µm lub mniejszej. Za pomocą komputera ustaw wartość szczeliny wejściowej spektrometru na 40 µm oraz parametry ICCD dla pomiaru mapowania.Dostosuj pozycję uchwytu, aby nakierować go na wybrany obszar próbki. Wykonaj panoramiczne zdjęcie próbki w wysokiej rozdzielczości, korzystając z szerokopasmowego źródła światła. Następnie wykorzystaj oprogramowanie i wykonane zdjęcie do zdefiniowania obszaru skanowania oraz rozdzielczości LIBS.W tym przypadku siatka ma rozmiar 100 na 100 z odstępem 100 µm między punktami. Należy uruchomić zautomatyzowany pomiar danych w każdym punkcie siatki. Widmo jest mierzone i zapisywane do pliku.Po zakończeniu pomiarów, co zajmuje około 30 minut, wykonaj drugie zdjęcie przekroju próbki, a następnie połącz wszystkie widma w jednym pliku danych do późniejszego wykorzystania. Następnie wyjmij preparat z próbką i przygotuj się do zamontowania próbek kalibracyjnych. Zamocuj płytkę kwarcową z próbkami kalibracyjnymi na stole translacyjnym, wracając do komputera.Umieść środek pierwszej próbki kalibracyjnej na drodze wiązki lasera. Zachowaj dotychczasowe parametry eksperymentu i zarejestruj widmo. Postąp w ten sam sposób z każdą z pozostałych próbek o różnych stężeniach gadolinu.Są to przykłady widm pojedynczego pomiaru zarejestrowanych z różnych obszarów tkanki nerek. Widmo niebieskie zarejestrowano w obszarze centralnym nerki. Widmo czerwone odpowiada błonie nerkowej, a widmo zielone obszarowi obwodowemu.Wstrzyknięte nanocząsteczki na bazie gadolinu składają się z matrycy polislanu z jonami gadolinu chelatowanymi przez ligand DOCA na ich powierzchniach. W wykorzystanym zakresie spektralnym od 286 nanometrów do 320 nanometrów można wykryć gadolin, wapń, żelazo, krzem i glin. Zwróć uwagę, jak intensywność zmienia się w różnych obszarach próbki, co sugeruje dużą heterogenność stężeń tych pierwiastków; mapowanie tkankowe gadolinu, krzemu i żelaza w przekroju nerki myszy wykonano przy użyciu danych z LIBS z rozdzielczością około 100 mikrometrów.Intensywność skali jest wyrażona w jednostkach umownych. Jest to obraz w świetle widzialnym. Dla porównania uzyskano podobne wyniki w przypadku próbek guza.Podobnie jak na tej mapie tkanki guza SQ 20 B z gadolinem, na obrazie w świetle widzialnym naniesiono skalę fałszywych kolorów. W tym doświadczeniu nanocząstki podano bezpośrednio do guza. Po godzinie guz usunięto i przygotowano do analizy.Należy zauważyć, że około połowa objętości guza zawiera niektóre cząstki na matrycach. Technikę tę można przeprowadzić w czasie krótszym niż jedna godzina dla próbek o powierzchni jednego centymetra kwadratowego przy rozdzielczości 100 µm, jeśli jest ona wykonana prawidłowo. Podczas przeprowadzania LIBS należy pamiętać, że pomiary są wykonywane z plazmy indukowanej laserem i kluczowe jest kontrolowanie wszystkich parametrów podczas całego eksperymentu zgodnie z procedurą.W celu udzielenia odpowiedzi na dalsze pytania, np. dotyczące rodzaju komórek zaangażowanych w analizowany proces, można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia na sąsiednich skrawkach po zakończeniu etapu opracowania. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie nanotechnologii stosowanej w biologii i medycynie do badania rozkładu związków zawierających pierwiastki metaliczne w tkankach biologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wykorzystać techniki LA-ICP-MS w celu mapowania wielu pierwiastków w tkankach biologicznych.

laser-induced-breakdown-spectroscopy-new-approach-for-nanoparticle-s

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Spektroskopia rozładowania indukowanego laserem: nowe podejście do mapowania i ilościowego określania nanocząstek w tkankach narządów

Laserowa ablacja z jonizacją elektrosprayową (LAESI) jest źródłem jonów dla spektrometrii mas pracującym pod ciśnieniem atmosferycznym. W trybie obrazowania laser średniofalowy w podczerwieni bada rozkład cząsteczek w przekroju tkanki lub biofilmie. Technika ta stanowi nowe podejście do różnorodnych badań bioanalitycznych prowadzonych w natywnych warunkach doświadczalnych.

Obrazowanie molekularne tkanek biologicznych i biofilmów w ciśnieniu atmosferycznym przy użyciu spektrometrii mas LAESI

Źródło: Hare, D. J., et.al.  Obrazowanie metali w tkance mózgowej metodą ablacji laserowej - plazma sprzężona indukcyjnie - spektrometria mas (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje zastosowanie spektrometrii mas plazmy sprzężonej indukcyjnie z ablacją laserową (LA-ICP-MS) do wizualizacji i ilościowego określenia rozkładu metali w tkance mózgowej myszy. Protokół obejmuje ablację laserową w celu wytworzenia aerozolu cząstek próbki, jonizację cząstek w plazmie wysokotemperaturowej...

Spektrometria mas plazmy sprzężonej z ablacją laserową do wizualizacji metali w tkance mózgowej myszy

Możliwości wykrywania LIBS na symulantach glebowych zostały przetestowane przy użyciu różnych energii impulsów i parametrów czasowych.  Krzywe kalibracyjne wykorzystano do wyznaczenia granic wykrywalności i czułości dla różnych parametrów.  Ogólnie rzecz biorąc, wyniki pokazały, że nie nastąpiło znaczące zmniejszenie możliwości wykrywania przy użyciu niższych energii impulsów i detekcji bez bramki.

Zależność wyników spektroskopii rozpadów indukowanych laserem od energii impulsów i parametrów czasowych z wykorzystaniem płynów modelowych gleby

Atomowe i dwuatomowe gatunki molekularne z rozdzielczością czasową są mierzone za pomocą LIBS. Widma są zbierane z różnymi opóźnieniami czasowymi po wytworzeniu plazmy rozpadu optycznego z promieniowaniem laserowym Nd:YAG i są analizowane w celu wywnioskowania gęstości elektronów i temperatury.

Pomiar i analiza widm wodoru atomowego i dwuatomowego molekularnego AlO,C2, CN i TiO po rozpadzie optycznym wywołanym laserem

Opisano zastosowanie tomografii rentgenowskiej z dyspersją energii w skaningowym transmisyjnym mikroskopie elektronowym do scharakteryzowania rozkładów pierwiastków w pojedynczych nanocząstkach w trzech wymiarach.

Tomografia rentgenowska z dyspersją energii do mapowania pierwiastkowego 3D pojedynczych nanocząstek

Mikroskopia koherentnego rozpraszania Ramanowskiego (CARS) oparta na naturalnej wibracji wiązań molekułowych pozwala na chemicznie selektywne obrazowanie żywych komórek bez znaczników. W pracy przedstawiono implementację komplementarnej techniki mikroskopowej na standardowym wielofotonowym laserowym mikroskopie skaningowym opartym na laserze femtosekundowym Ti:sapphire i laserze OPO.

Implementacja koherentnego systemu rozpraszania Ramana (CARS) na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym Ti:Sapphire i OPO

Lasery są często używane w badaniach nad odpowiedzią komórkową na uszkodzenie DNA. Generują jednak zmiany, których odstępy, częstotliwość i kolizje z widełkami replikacyjnymi są rzadko charakteryzowane. W tym miejscu opisujemy podejście, które umożliwia określenie tych parametrów za pomocą laserowo zlokalizowanych wiązań międzypasmowych.

Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

Podczas topienia indukcyjnego próżniowego, spektroskopia rozpadu indukowana laserem jest używana do przeprowadzania w czasie rzeczywistym analizy ilościowej głównych składników stopionego stopu.

Analiza ilościowa topnienia indukcyjnego w próżni za pomocą spektroskopii rozpadu indukowanego laserem

Strumienie węgla w kriosferze są jeszcze prawie nie oszacowane, ale są kluczowe dla zmian klimatycznych. Prezentujemy nowatorskie prototypowe urządzenie, które rejestruje potencjał fototroficzny w środowiskach nadraglacyjnych w oparciu o technologię emisji fluorescencji indukowanej laserem (L.I.F.E.), oferując dane o wysokiej rozdzielczości spektralnej i przestrzennej w warunkach in situ.

Emisja fluorescencji indukowanej laserem (L.I.F.E.) jako nowatorskie nieinwazyjne narzędzie do pomiarów in situ biomarkerów w siedliskach kriosfery

Ten artykuł przedstawia integrację modułu spektralnego ogniskowania i lasera impulsowego o podwójnym wyjściu, umożliwiającego szybkie obrazowanie hiperspektralne nanocząsteczek złota i komórek rakowych. Praca ta ma na celu zademonstrowanie szczegółów multimodalnych nieliniowych technik optycznych na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym.

Obrazowanie biomolekularne wychwytu komórkowego nanocząstek przy użyciu multimodalnej nieliniowej mikroskopii optycznej

Ultraszybka ablacja laserowa w cieczy to precyzyjna i wszechstronna technika syntezy nanomateriałów (nanocząstek [NPs] i nanostruktur [NSs]) w środowisku ciecz/powietrze. Nanomateriały ablowane laserowo mogą być funkcjonalizowane cząsteczkami aktywnymi Ramanem w celu wzmocnienia sygnału Ramana analitów umieszczonych na lub w pobliżu NS/NP.

Ultraszybkie nanocząstki i nanostruktury z ablacją laserową do zastosowań w wykrywaniu opartym na rozpraszaniu Ramana ze wzmocnieniem powierzchniowym

Poznaj spektroskopię rozpadu indukowanego laserem do mapowania i kwantyfikacji nanocząstek w tkankach narządowych. Ta metoda umożliwia wykrywanie pierwiastków z rozdzielczością 100 μm i czułością sub-mM.

Spektroskopia rozpadu indukowanego laserem: nowe podejście do mapowania i kwantyfikacji nanocząstek w tkance narządowej

Przeglądaj więcej filmów