Spektroskopia rozpadu indukowanego laserem: nowe podejście do mapowania i kwantyfikacji nanocząstek w tkance narządowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie prostej i niezawodnej metody mapowania i ilościowego oznaczania pierwiastków organicznych i nieorganicznych w tkance biologicznej przy użyciu aparatury stołowej w pełni kompatybilnej z konwencjonalną mikroskopią optyczną. Osiąga się to poprzez ogniskowanie impulsu lasera na badanej próbce w celu zainicjowania rozpadu i powstania iskry materiału. Plazma emituje promieniowanie, które jest następnie analizowane za pomocą spektrometru.

Drugim krokiem jest wybór i identyfikacja linii widmowych odpowiadających badanym pierwiastkom oraz skanowanie powierzchni próbki. Następnie należy przeprowadzić pomiary kalibracyjne, aby umożliwić oznaczenie stężeń pierwiastków. Ostatnim etapem jest sporządzenie mapowania pierwiastkowego tkanki próbki na podstawie wszystkich zarejestrowanych widm, przy użyciu skali intensywności względnej lub skali stężeń.

W konsekwencji spektroskopia przełomu wywołanego laserem jest wykorzystywana do wykazania rozkładu tkankowego różnych pierwiastków bez konieczności stosowania znakowania. W porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak mikrofluorescencja rentgenowska czy techniki oparte na spektrometrii mas, spektroskopia przełomu wywołanego laserem (LIBS) jest prosta w implementacji, działa pod ciśnieniem atmosferycznym i jest kompatybilna z większością systemów mikroskopów optycznych.

Ponadto pozwala ona na osiągnięcie czułości na poziomie PPM przy rozdzielczości rzędu mikrona. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w nanotechnologii stosowanej w badaniach biologicznych, takich jak rozkład nanocząsteczek zawierających pierwiastki metaliczne w próbce tkanki, bez konieczności znakowania nanocząsteczek. Technika ta może znaleźć zastosowanie w patologii ze względu na niską granicę wykrywalności nieprawidłowych stężeń pierwiastków metalicznych, takich jak miedź, żelazo i aluminium, które mogą występować w różnych narządach ciała, zwłaszcza w mózgu. Dzięki temu metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat detekcji i identyfikacji nanocząsteczek.

Metodę tę można zastosować również w innych układach, takich jak detekcja pierwiastków nieorganicznych w TCU lub analiza niejednorodnego rozkładu pierwiastków. Naukowcy przeprowadzający tego rodzaju eksperymenty muszą zoptymalizować ustawienia akwizycji, aby uzyskać jak najsilniejszy sygnał, unikając przy tym nadmiernego uszkodzenia próbek. Eksperyment należy rozpocząć od przygotowania preparatów do badania zgodnie z niniejszym protokołem.

Pobrać organy od myszy z nowotworami, którym wstrzyknięto roztwór nanocząsteczek gadolinu, w celu przygotowania preparatów. Umieścić skrawki organów o grubości 100 µm na szkiełku kwarcowym lub w szalce Petriego. Preparaty zawsze przechowywać w temperaturze -80 °C.

Następnie należy przygotować próbki do kalibracji. Oznakuj kilka fiolek, podając na nich stężenia, zaczynając od 0 nM i kończąc na 5 mM. Do każdej fiolki przygotuj 100 µL mieszaniny gadolinu w wodzie o odpowiednim stężeniu.

Po wykonaniu tych czynności przygotuj szkiełko. Odmierz 5 µL z pierwszej fiolki i nanieś kroplę na szkiełko kwarcowe lub szalkę Petriego. Pamiętaj o odpowiednim oznakowaniu kropli do późniejszego użycia.

Przesuń się o trzy milimetry wzdłuż obwodu i nanieś pięć µL kolejnego stężenia na szkiełko. Powtórz tę czynność dla każdego z pozostałych roztworów. Pozostaw zawartość szkiełka do wyschnięcia na 20 minut w temperaturze pokojowej.

W tym układzie wykorzystano nanosekundowy laser neodymowo-gadolinowy z domieszką aluminium, generujący wiązkę o długości fali 1064 nanometrów. Część wiązki służy do synchronizacji systemu spektrometru. Pozostała część jest kierowana przez sterowany komputerowo tłumik, który służy do regulacji i stabilizacji energii impulsu laserowego podczas całego eksperymentu.

Następnie skieruj wiązkę na obszar próbki. Skup wiązkę na sterowanym programowo stole translacyjnym. Będzie on podtrzymywał uchwyt próbki, a jedna kamera CCD będzie monitorować powierzchnię uchwytu próbki.

Kolejny służy do monitorowania pióropusza plazmy. Analizuj światło pochodzące z rozpadu próbki w spektrometrze obrotowym z kamerą ICCD chłodzoną do -26 °C. Przed pomiarem rozpocznij stabilizację lasera oraz chłodzenie kamery do -26 °C.

10 minut przed eksperymentem. Po przygotowaniu należy użyć tłumika, aby zablokować energię impulsu na poziomie 5 mJ. Następnie należy pobrać preparat do badania i przygotować go do zamocowania na stole obiektowym.

Zamocuj próbkę w zmotoryzowanym uchwycie na próbki. Po wykonaniu tej czynności wróć do komputera. Aby ustawić próbkę, przesuń stolik tak, aby część próbki znalazła się w wiązce lasera.

Ustaw ostrość lasera około 100 µm poniżej powierzchni próbki. Po wykonaniu tej czynności laser tworzy kratery o średnicy 50 µm lub mniejszej. Za pomocą komputera ustaw wartość szczeliny wejściowej spektrometru na 40 µm oraz parametry ICCD dla pomiaru mapowania.

Dostosuj pozycję uchwytu, aby nakierować go na wybrany obszar próbki. Wykonaj panoramiczne zdjęcie próbki w wysokiej rozdzielczości, korzystając z szerokopasmowego źródła światła. Następnie wykorzystaj oprogramowanie i wykonane zdjęcie do zdefiniowania obszaru skanowania oraz rozdzielczości LIBS.

W tym przypadku siatka ma rozmiar 100 na 100 z odstępem 100 µm między punktami. Należy uruchomić zautomatyzowany pomiar danych w każdym punkcie siatki. Widmo jest mierzone i zapisywane do pliku.

Po zakończeniu pomiarów, co zajmuje około 30 minut, wykonaj drugie zdjęcie przekroju próbki, a następnie połącz wszystkie widma w jednym pliku danych do późniejszego wykorzystania. Następnie wyjmij preparat z próbką i przygotuj się do zamontowania próbek kalibracyjnych. Zamocuj płytkę kwarcową z próbkami kalibracyjnymi na stole translacyjnym, wracając do komputera.

Umieść środek pierwszej próbki kalibracyjnej na drodze wiązki lasera. Zachowaj dotychczasowe parametry eksperymentu i zarejestruj widmo. Postąp w ten sam sposób z każdą z pozostałych próbek o różnych stężeniach gadolinu.

Są to przykłady widm pojedynczego pomiaru zarejestrowanych z różnych obszarów tkanki nerek. Widmo niebieskie zarejestrowano w obszarze centralnym nerki. Widmo czerwone odpowiada błonie nerkowej, a widmo zielone obszarowi obwodowemu.

Wstrzyknięte nanocząsteczki na bazie gadolinu składają się z matrycy polislanu z jonami gadolinu chelatowanymi przez ligand DOCA na ich powierzchniach. W wykorzystanym zakresie spektralnym od 286 nanometrów do 320 nanometrów można wykryć gadolin, wapń, żelazo, krzem i glin. Zwróć uwagę, jak intensywność zmienia się w różnych obszarach próbki, co sugeruje dużą heterogenność stężeń tych pierwiastków; mapowanie tkankowe gadolinu, krzemu i żelaza w przekroju nerki myszy wykonano przy użyciu danych z LIBS z rozdzielczością około 100 mikrometrów.

Intensywność skali jest wyrażona w jednostkach umownych. Jest to obraz w świetle widzialnym. Dla porównania uzyskano podobne wyniki w przypadku próbek guza.

Podobnie jak na tej mapie tkanki guza SQ 20 B z gadolinem, na obrazie w świetle widzialnym naniesiono skalę fałszywych kolorów. W tym doświadczeniu nanocząstki podano bezpośrednio do guza. Po godzinie guz usunięto i przygotowano do analizy.

Należy zauważyć, że około połowa objętości guza zawiera niektóre cząstki na matrycach. Technikę tę można przeprowadzić w czasie krótszym niż jedna godzina dla próbek o powierzchni jednego centymetra kwadratowego przy rozdzielczości 100 µm, jeśli jest ona wykonana prawidłowo. Podczas przeprowadzania LIBS należy pamiętać, że pomiary są wykonywane z plazmy indukowanej laserem i kluczowe jest kontrolowanie wszystkich parametrów podczas całego eksperymentu zgodnie z procedurą.

W celu udzielenia odpowiedzi na dalsze pytania, np. dotyczące rodzaju komórek zaangażowanych w analizowany proces, można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia na sąsiednich skrawkach po zakończeniu etapu opracowania. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie nanotechnologii stosowanej w biologii i medycynie do badania rozkładu związków zawierających pierwiastki metaliczne w tkankach biologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wykorzystać techniki LA-ICP-MS w celu mapowania wielu pierwiastków w tkankach biologicznych.