Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila labellar Taste Sensilla
26 lutego 2014
Ten protokół opisuje zewnątrzkomórkowy zapis odpowiedzi potencjału czynnościowego wyzwalanych przez neurony smaku etykietowego u Drosophila.
Ogólnym celem tej procedury jest zmierzenie reakcji poszczególnych zmysłów smakowych na labum drosophila. Osiąga się to poprzez zbudowanie najpierw stanowiska do elektrofizjologii i ustawienie całego niezbędnego sprzętu. Drugim krokiem jest przygotowanie muchy do nagrywania.
Następnie pojedynczy lum jest stymulowany związkiem smakowym, podczas gdy odpowiedź neuronalna jest jednocześnie rejestrowana. Ostatecznie, elektrofizjologiczne nagranie końcówki z poszczególnych etykiet silla służy do pokazania reakcji smaku illa na różne związki smakowe. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania muchy mogą być technicznie trudne i trudne do nauczenia.
W tej procedurze należy zebrać nowo przygotowane muchy ELO z dobrze utrzymanych kultur much. Następnie leżakuj je przez pięć do 10 dni w świeżych fiolkach z kulturami przed nagraniem, przed przygotowaniem muchy, schłodzić płytkę mikroskopu na lodzie przez 15 do 30 minut. Następnie wypełnij szklaną elektrodę odniesienia roztworem B i e.
I delikatnie wystukaj wszelkie bąbelki pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj kleszczy, aby odłamać niewielką część końcówki. Następnie użyj działania kapilarnego, aby wyciągnąć wszelkie pozostałe pęcherzyki z tkanką.
Następnie nasuń elektrodę referencyjną wypełnioną B i E na drut uchwytu elektrody i aby uważać, aby nie wprowadzić po tym żadnych pęcherzykach powietrza, zassaj muchę do końcówki pipety P 200. Umieść go w wiaderku z lodem i schładzaj przez 30 sekund do jednej minuty. Następnie wyjmij płytkę mikroskopu z lodu i umieść ją pod mikroskopem po wytarciu wilgoci.
Następnie delikatnie postukaj rozporkiem końcówki pipety na płytkę mikroskopu w małym powiększeniu. Usuń cztery nogi za pomocą jednej pary kleszczy, jednocześnie utrzymując Forex stabilnie za pomocą drugiej pary kleszczy. Ustaw muchę na jej brzusznej stronie grzbietowej skierowaną do góry.
Zawsze należy uważać, aby nie dotykać etykiety beum kleszczami podczas procesu przygotowania, aby zminimalizować uszkodzenia mechaniczne podczas przytrzymywania muchy na miejscu za pomocą jednej pary kleszczy, włóż elektrodę odniesienia na linii środkowej tylnej tylnej klatki piersiowej grzbietowej pod kątem około 45 stopni w kierunku głowy. Następnie zabezpiecz uchwyt elektrody referencyjnej plasteliną tak, aby mucha była widoczna pod mikroskopem w dużym powiększeniu. Manewruj i ustaw szklaną elektrodę pod kątem na jej szyi i głowie, a następnie przesuń rozporek w kierunku uchwytu elektrody referencyjnej za pomocą dwóch par kleszczy.
Teraz delikatnie rozciągnij trąby za pomocą jednej pary kleszczyków i przesuń muchę dalej w dół szklanej elektrody referencyjnej, aż końcówka elektrody znajdzie się wewnątrz etykiety beum, a trąbki zostaną całkowicie wysunięte. Na tym etapie przymocuj uchwyt elektrody referencyjnej do mikromanipulatora zamontowanego na stole powietrznym. Umieść jeden płatek labum etykiety w polu widzenia mikroskopu pod dużym powiększeniem i w jednej linii ze strumieniem nawilżonego powietrza.
Następnie włącz cyfrowy system akwizycji nawilżonego strumienia powietrza lub DAS i amplifier. Następnie użyj strzykawki i plastikowej rurki, aby przeciągnąć niewielką ilość ultraczystej wody przez rurkę co najmniej 10 razy. Aby przepłukać szklaną elektrodę nagrywającą, należy następnie przepłukać elektrodę rejestrującą za pomocą TAST co najmniej pięć razy.
Następnie napełnij elektrodę nagrywającą w około jednej trzeciej do połowy smakiem i wyjmij ją z rurki. Jeśli są pęcherzyki powietrza, dotknij, aby je uwolnić lub po prostu napełnij elektrodę. Teraz szybko i płynnie wsuń elektrodę na srebrny drut stopnia głównego.
Aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza w celu stymulacji pojedynczego wysyłania, najpierw użyj mikromanipulatora, aby ustawić elektrodę rejestrującą w jednej linii z interesującym Cię zmysłem. Następnie naciśnij pedał nożny, aby uruchomić tryb akwizycji amplifier. Następnie ostrożnie przesuwaj elektrodę nagrywającą za pomocą precyzyjnego pokrętła mikromanipulatora, aż dotknie końcówki czujnika i rozpocznij nagrywanie.
Wyjmij elektrodę po jednej do dwóch sekund. Powtórz procedurę ponownie z innymi illo i odczekaj co najmniej minutę między prezentacjami do tego samego lumu. W przypadku nagrywania z jednym smakiem i przez dłuższy czas, smak i roztwór mogą wyschnąć, a roztwór w końcówce może stać się bardziej skoncentrowany.
Można temu zaradzić, delikatnie dotykając końcówki szklanej elektrody gładkim papierem, aby usunąć niewielką ilość płynu poprzez działanie kapilarne, aby zarejestrować reakcje na inny smak, a następnie spłukać i naładować elektrodę rejestrującą nowym smakiem i powtórzyć procedurę. Okresowo zapisuj pliki danych z informacjami identyfikującymi, takimi jak data, genotyp i smak. Rysunek ten pokazuje reakcję centum na sacharozę cukrową.
Ten sam centum nie reaguje na gorzki związek berberynę, a ten rysunek pokazuje, że czujnik typu oka, który zawiera neuron reagujący na gorzko, wykazuje większe skoki amplitudy w odpowiedzi na berberynę i mniejsze skoki amplitudy w odpowiedzi na sacharozę. Pokazane tutaj reprezentatywne nieoptymalne wyniki elektrofizjologiczne. Ten ślad reprezentuje całkowity brak sygnału.
Jest to szum o częstotliwości 50 lub 60 Hz z zewnętrznych źródeł elektrycznych, a to jest szum stochastyczny. Ten ślad oznacza, że neuron czuciowy Meno strzelał sam, podczas gdy zarówno neuron receptora gorzkiego smaku, jak i neuron czuciowy Meno strzelały. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rejestrować odpowiedzi neuronalne z Oph Atory Silla na labum.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje pomiar potencjałów czynnościowych odpowiedzi neuronów smakowych na labellach u Drosophila. Procedura polega na skonstruowaniu urządzenia elektrofizjologicznego i przygotowaniu muchy do rejestracji podczas stymulacji poszczególnych labelli związkami smakowymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Biologia zachowania
Tło
- Zrozumienie percepcji smaku u Drosophila jest kluczowe dla wniknięcia w przetwarzanie sensoryczne.
- Techniki elektrofizjologiczne pozwalają na bezpośrednie pomiar odpowiedzi neuronowych.
- Neurony smakowe labelli odgrywają znaczącą rolę w zachowaniu żywieniowym muchy.
- Istnieją wyzwania techniczne w przygotowaniu muchy do dokładnych rejestracji.
Cel badania
- Pomiar odpowiedzi pojedynczych ciałek smakowych na wargi górnej Drosophila.
- Przedstawienie technik rejestracji elektrofizjologicznych odpowiedzi neuronów smakowych.
- Dostarczenie przewodnika wizualnego dla badaczy, którzy napotykają trudności w przygotowaniu muchy.
Stosowane metody
- Budowa urządzenia elektrofizjologicznego.
- Przygotowanie muchy do rejestracji neuronalnej.
- Stymulowanie pojedynczych labelli związkami smakowymi.
- Przeprowadzanie jednoczesnego rejestrowania odpowiedzi neuronalnych podczas stymulacji.
Główne wyniki
- Sukcesywne rejestrowanie potencjałów czynnościowych z neuronów smakowych labelli.
- Wykazana zmienność odpowiedzi neuronalnych na różne związki smakowe.
- Dostarczenie wglądu w przetwarzanie sensoryczne smaku u Drosophila.
- Podkreślenie znaczenia technicznej precyzji w rejestrach elektrofizjologicznych.
Wnioski
- Protokół skutecznie mierzy odpowiedzi neuronów smakowych u Drosophila.
- Demonstracje wizualne są niezbędne do pokonywania wyzwań technicznych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów percepcji smaku.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla enables direct measurement of neuronal responses to defined taste compounds, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides high-resolution, stimulus-specific data critical for validating sensory targets and clarifying pathway function. The method's reproducibility and quantitative outputs position it as a foundational tool for target validation and assay development in sensory biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gustatory neuron function in response to specific compounds.
- Supports biological de-risking by distinguishing stimulus-specific neuronal activation.
- Provides quantitative data for functional target validation and mechanistic confidence.
- Facilitates portfolio triage by clarifying sensory pathway engagement.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream compound screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative electrophysiological outputs for assay standardization.
- Enables reliable evaluation of compound effects on sensory neuron activity.
- Supports scalability and platform reuse for diverse tastant panels.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant sensory models for translational biomarker exploration when applicable.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of sensory targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on functional neuronal readouts.
- Offers predictive de-risking for sensory-driven therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This electrophysiological method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational data for both target validation and assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring direct neuronal responses to defined stimuli.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-resolution spike data enabling statistical comparison of sensory responses across conditions.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to preclinical sensory models when aligned with disease relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for ongoing sensory target and compound evaluation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in sensory target validation.
- Operational Value: Standardizes and streamlines electrophysiological recording for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of sensory targets and compounds.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in electrophysiological rig assembly and fly preparation.
- Demands precise instrumentation and controlled recording environments to minimize noise.
- Necessitates cross-team standardization for data comparability and reproducibility.
- May require adaptation for different model systems or compound solubility constraints.
- Limitations include challenges with temporally complex stimuli and water-insoluble tastants.
