Name: Strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-27T13:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji i analizy polarnych metabolitów z komórek hodowlanych za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z wysokorozdzielczą spektrometrią mas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Detlefowi Schumannowi, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) i Nathanielowi Snyderowi (University of Pennsylvania) za cenne dyskusje na temat kalibracji masy i przetwarzania danych. Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer R00CA168997. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

1. Przygotowanie odczynników LC-MS, opracowanie metody chromatograficznej i opracowanie procedur obsługi przyrządów
<ol>
	<li>Przygotowanie rozpuszczalników LC
	<ol>
		<li>Przygotuj 500 ml faz ruchomych. A to 20 mM octanu amonu i 15 mM wodorotlenku amonu w 3% acetonitrylu/wody, końcowe pH 9,0; a B to 100% acetonitryl.</li>
		<li>Luźno zakręć butelkę, umieść ją w sonikatorze łaźni wodnej i sonikuj przez 10 minut bez dodatkowego podgrzewania. (Ten krok ma na celu upewnienie się, że wszystkie sole amonowe całkowicie się rozpuszczają i że nie ma resztkowych pęcherzyków powietrza.)</li>
		<li>Przenieść 250 ml rozpuszczalnika do szklanej butelki o pojemności 250 ml do stosowania LC-MS, a pozostałą część przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór kalibracyjny o niskim zakresie masy. Ważne jest, aby używać dostosowanej mieszaniny kalibracyjnej o niskim zakresie mas do zastosowań metabolomicznych, aby zapewnić wykrywanie dokładnych mas przy niskich masach cząsteczkowych.
	<ol>
		<li>Odważyć 5 mg zarówno fluorooctanu sodu, jak i kwasu homowanilinowego i rozpuścić je w 5 ml wody, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mg/ml. Rozpuścić diazynon w metanolu, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mg/ml.</li>
		<li>Aby przygotować 1 ml ujemnego roztworu kalibracyjnego o niskiej masie, należy zmieszać 960 ml roztworu kalibracyjnego termoujemnego z 20 ml roztworu fluorooctanu sodu i kwasu homowanilinowego. Aby przygotować 1 ml dodatniego roztworu kalibracyjnego o niskiej masie, należy zmieszać 990 ml termododatniego roztworu kalibracyjnego i 10 ml roztworu diazynonu. (Roztwór do kalibracji o niskiej masie powinien być przechowywany w temperaturze 4 °C i przygotowywany w stanie świeżym co 2 miesiące).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kalibracja QE-MS w małym zakresie masowym
	<ol>
		<li>Przed wykonaniem wzorcowania w małym zakresie mas należy przeprowadzić wzorcową kalibrację masy (m/z, 150-2 000) zarówno w trybie dodatnim, jak i ujemnym zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Po pomyślnym przejściu normalnej kalibracji wzorcowania masy należy dostosować zakres skanowania do 60–900 m/z w panelu sterowania przyrządu i zastosować źródłowy CID 25 eV dla trybu dodatniego i 35 eV dla trybu ujemnego. (Da to silne sygnały jonu fragmentu kofeiny i jonu siarczanowego. Zakres skanowania jest tutaj stały, ponieważ ostatni m/z nie powinien być większy niż 15x początkowy m/z)</li>
		<li>Gdy źródło jonów ustabilizuje się, wykonaj niestandardową kalibrację. Uwaga: Stabilne źródło definiuje się jako mniej niż 10% całkowitej zmiany prądu jonowego w trybie dodatnim i mniej niż 15% w trybie ujemnym. Dostosowane jony kalibracyjne i odpowiadające im m/z są wymienione w tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustanowić oprzyrządowanie LC-MS do analizy metabolitów polarnych. LC jest sprzężony z QE-MS w celu separacji i wykrywania metabolitów.
	<ol>
		<li>Wyposaż QE-MS w podgrzewaną sondę jonizacyjną z elektrorozpylaniem (H-ESI). Ustaw odpowiednie parametry strojenia sondy zgodnie z podaną listą: temperatura grzałki, 120 °C; gaz osłonowy, 30; gaz pomocniczy, 10; gaz do wymiatania, 3; napięcie natrysku, 3,6 kV dla trybu dodatniego i 2,5 kV dla trybu ujemnego. Ustaw temperaturę kapilary na 320 °C, a soczewkę S na 55.</li>
		<li>Zbuduj metodę pełnego skanowania w następujący sposób: Pełny zakres skanowania: od 60 do 900 (m/z); rozdzielczość: 70 000; maksymalny czas wtrysku: 200 ms przy typowych czasach wtrysku około 50 ms; automatyczna kontrola wzmocnienia (AGC): 3 000 000 jonów. Te ustawienia skutkują cyklem pracy wynoszącym około 550 ms, aby przeprowadzić skanowanie zarówno w trybie pozytywnym, jak i negatywnym.</li>
		<li>Ustalić metodę chromatograficzną. Zastosować kolumnę amidową (100 x 2,1 mm średnica wewn., 3,5 mm) do separacji związków w temperaturze pokojowej13,15. Faza ruchoma A jest opisana powyżej, a faza ruchoma B to acetonitryl. Użyj gradientu liniowego w następujący sposób: 0 min, 85% B; 1,5 min, 85% B, 5,5 min, 35% B; 10 min, 35% B, 10,5 min, 35% B, 14,5 min, 35% B, 15 min, 85% B i 20 min, 85% B. Natężenie przepływu wynosi 0,15 ml/min od 0 do 10 min i od 15 do 20 min oraz 0,3 ml/min od 10,5 do 14,5 min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek metabolitów
<ol>
	<li>Przygotować rozpuszczalnik ekstrakcyjny. Wymieszaj 40 ml metanolu (klasa LC-MS) i 10 ml wody (klasa LC-MS) w probówce o pojemności 50 ml i przechowuj w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 godzinę przed użyciem. Uwaga: Ta procedura i poniższe kroki mogą być modyfikowane w celu ekstrakcji próbek tkanek biologicznych i płynów.
	<ol>
		<li>Hodowla komórek raka jelita grubego HCT 8 w trzech 10-centymetrowych szalkach lub 6-dołkowych płytkach z pełną pożywką wzrostową, RPMI 1640 uzupełnioną 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i 100 000 jednostek/l penicyliny i 100 mg/l streptomycyny.</li>
		<li>Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, szybko usuń podłoże i umieść naczynie lub talerz na suchym lodzie13,15. Natychmiast dodać 1 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (80% metanolu/wody) i przenieść płytkę do zamrażarki o temperaturze -80 °C. Na naczynie o średnicy 10 cm dodaj 3 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do każdej studzienki. (Staraj się usunąć pożywkę tak bardzo, jak to możliwe, aby uniknąć efektu tłumienia jonów z powodu resztkowych soli z pożywki.)</li>
		<li>Pozostaw talerz na 15 minut. Wyjmij go z zamrażarki i zeskrob komórki do rozpuszczalnika na suchym lodzie. Przenieść roztwór do probówek Eppendorfa o pojemności 1,7 ml i odwirować z prędkością 20 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. (Przygotować metabolity komórkowe z trzech oddzielnych szalek w celu uzyskania trzech powtórzonych próbek. Celem przechowywania dwóch probówek jest posiadanie jednej jako kopii zapasowej.)</li>
		<li>Przenieś supernatant do dwóch nowych probówek Eppendorfa i wysusz je w próżni o dużej prędkości. Zajmuje to około 3-6 godzin, w zależności od używanej próżni. (Próbki można również suszyć przez noc w atmosferze azotu).</li>
		<li>Po wysuszeniu probówki z każdą próbką należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Gdy wszystko będzie gotowe, rozpuść jedną próbkę w 20 ml wody (klasa LC-MS) i wstrzyknij 5 ml do LC-QE-MS w celu analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ustawienie sekwencji próbek
<ol>
	<li>Po prawidłowym przeprowadzeniu kalibracji na QE-MS, zrównoważyć kolumnę LC przez 5 minut z 85% A przy natężeniu przepływu 0,15 ml/min, co jest warunkiem początkowym gradientu LC.</li>
	<li>Ustaw sekwencję próbek w kolejności losowej. Uwaga: W ten sposób rozkłada fluktuacje wprowadzone przez LC-MS do każdej próbki i zapewnia dokładniejsze porównanie między różnymi próbkami. Co 6 próbek dodać przebieg mycia, który ma tę samą metodę MS, z wyjątkiem gradientu LC wynosi 95% A przez 10 minut, a następnie następuje 5-minutowa równowaga kolumny przy 85% A przy natężeniu przepływu 0,15 ml/min. Dodaj ślepe próbki (100% wody) po każdym uruchomieniu mycia, aby ocenić tło systemu i przenieść poziomy.</li>
	<li>Zapisz sekwencję, a gdy kolumna LC pokaże stabilne ciśnienie, około 400 psi, rozpocznij przebieg sekwencji. Jeżeli po tej sekwencji nie ma innej próbki, należy dodać przebieg zatrzymania na końcu sekwencji, który ma natężenie przepływu 0 ml/min na końcu gradientu i wybrać opcję "czuwania" po zakończeniu sekwencji.</li>
	<li>Uruchom ponownie ten sam zestaw próbek 12 godzin po kalibracji. (Ma to na celu ocenę fluktuacji błędu masy po kalibracji).</li>
</ol>
4. Czyszczenie i konserwacja przyrządów do analizy końcowej
<ol>
	<li>Pod koniec sekwencji przepłukać kolumnę 95% A przy natężeniu przepływu 0,2 ml/min przez 2 godziny i jeśli to konieczne, odwrócić kolumnę przed myciem.</li>
	<li>Wyjmij kolumnę LC i bezpośrednio podłącz LC do źródła jonów za pomocą złączki. Przygotuj rozpuszczalnik czyszczący, wodę/metanol/kwas mrówkowy (v:v:v, 90:10:0,2), ustaw MS w trybie czuwania i umyj system LC-MS z natężeniem przepływu 0,1 ml/min przez 1 godzinę, aby usunąć resztki wytrąconych soli lub innych zanieczyszczeń. Zmniejsz natężenie przepływu, jeśli ciśnienie w układzie jest zbyt duże.</li>
	<li>Ustawić temperaturę kapilary na 50 °C i wyjąć klatkę jonową. Ostrożnie wyjmij stożek jonowy i rurkę do wymiany jonów, gdy temperatura kapilary spadnie do 50 °C. Użyj szorstkiej siatki, takiej jak papier ścierny, aby usunąć zanieczyszczenia pozostawione na powierzchni stożka jonowego.</li>
	<li>Umieścić probówkę do przenoszenia jonów w 15 ml probówce Falcon zawierającej 10 ml 90% wody/metanolu z 0,1% kwasem mrówkowym. Po sonikacji probówki w łaźni wodnej przez 20 minut, zdekantować rozpuszczalnik do środka, zastąpić go 10 ml czystego metanolu i sonikować przez kolejne 20 minut. (Jeśli to konieczne, sonikację można przeprowadzić w temperaturze 40 °C lub nawet wyższej, aby osiągnąć lepsze wyniki czyszczenia).</li>
</ol>
5. Analiza danych LC-MS
<ol>
	<li>Aby upewnić się, że sekwencja próbki przebiega płynnie, po zakończeniu pierwszych dwóch próbek w sekwencji należy sprawdzić piki pod kątem nieznanych metabolitów. Użyj pliku csv zawierającego nazwy metabolitów, neutralny wzór chemiczny i tryb wykrywania (dodatni lub ujemny) jako plik wejściowy, a plik wyjściowy zawiera wyodrębnione piki i błąd masy w ppm. Jeśli kształt piku jest nieprawidłowy lub błąd masy jest opóźniony o więcej niż 5 ppm, należy zatrzymać resztę sekwencji i rozwiązać problem.</li>
	<li>Wybierz metodę "wyrównania pików i ekstrakcji ramy" w dostępnym na rynku oprogramowaniu. Wybierz surowe dane z LC-MS i pogrupuj je. Pobrać próbki w środku sekwencji serii jako chromatograficzną próbkę referencyjną w celu wyrównania pików. Prześlij ziarno ramkowe zawierające znane metabolity do analizy metabolitów docelowych wraz z zebranymi danymi i odpowiadającym im zasiewem ramkowym.</li>
	<li>Analizę danych w trybie dodatnim i ujemnym należy wykonywać oddzielnie. Użyj ustawienia domyślnego dla innych parametrów. Wyłącz funkcję przeszukiwania bazy danych i uruchom przepływ pracy. Eksportuj przetworzone dane jako arkusz Excela zawierający obszar piku każdej klatki. Pierwsze zestawy ramek odpowiadają metabolitom znajdującym się na liście docelowej. Uwaga: W przypadku celowanej analizy metabolitów informacje o metabolitach uzyskuje się na podstawie poprzednich badań13,15.</li>
	<li>W przypadku nieukierunkowanej analizy metabolitów należy wybrać metodę "ekstrakcji składników". Załaduj puste próbki do odejmowania tła. Ustaw próg natężenia szczytowego na 105, szerokość m/z 10 ppm i stosunek sygnału do szumu 3.</li>
	<li>Użyj bazy danych ludzkiego metabolomu do identyfikacji nieznanych związków. Użyj filtru CV, aby usunąć składniki z dużymi CV w powtórzonych próbkach. Ręcznie przejrzyj każdy komponent i wybierz te z dobrze zdefiniowanym szczytem lub stosunkowo dużą różnicą w różnych typach próbek do przeszukiwania bazy danych. Eksport danych z trafieniami w bazie danych. (Wyrównanie wartości szczytowej można pominąć, jeśli wynik wyrównania wartości szczytowej jest zbyt niski).</li>
</ol>

<ol><li>Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+genomics%2C+metabolome+analysis%2C+and+biochemical+modelling+to+understand+metabolic+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+and+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks.</a> Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).</li>
<li>Mulleder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prototrophic+deletion+mutant+collection+for+yeast+metabolomics+and+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology.</a> Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).</li>
<li>Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CircadiOmics%3A+Integrating+circadian+genomics%2C+transcriptomics%2C+proteomics+and+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics.</a> Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).</li>
<li>Ideker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomic+and+proteomic+analyses+of+a+systematically+perturbed+metabolic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network.</a> Science. 292 (5518), 929-934 (2001).</li>
<li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+identifying+differences+in+large+series+of+metabolomic+samples+analyzed+by+GC%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS.</a> Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).</li>
<li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+data+analysis+for+detecting+and+identifying+differences+between+samples+in+GC%2FMS-based+metabolomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).</li>
<li>Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+profiling%3A+Quantitative+analysis+of+1H+NMR+metabolomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data.</a> Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).</li>
<li>Wiklund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+GC%2FTOF-MS-based+metabolomics+data+for+identification+of+biochemically+interesting+compounds+using+OPLS+class+models%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models.</a> Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).</li>
<li>Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetaboMiner--semi-automated+identification+of+metabolites+from+2D+NMR+spectra+of+complex+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids.</a> BMC Bioinformatics. 9, 507(2008).</li>
<li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C+NMR+isotopomer+analysis+reveals+a+connection+between+pyruvate+cycling+and+glucose-stimulated+insulin+secretion+%28GSIS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+rate+of+the+glutamate%2Fglutamine+cycle+in+the+human+brain+b.+in+vivo+13C+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).</li>
<li>Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+reaction+monitoring+for+quantitative+biomarker+analysis+in+proteomics+and+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+B%2C+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).</li>
<li>Locasale, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+human+cerebrospinal+fluid+identifies+signatures+of+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics+%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma.</a> Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).</li>
<li>Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+reaction+monitoring+for+robust+quantitative+proteomic+analysis+of+cellular+signaling+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).</li>
<li>Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+positive%2Fnegative+ion-switching%2C+targeted+mass+spectrometry-based+metabolomics+platform+for+bodily+fluids%2C+cells%2C+and+fresh+and+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue.</a> Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).</li>
<li>Ramanathan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It+is+time+for+a+paradigm+shift+in+drug+discovery+bioanalysis%3A+From+SRM+to+HRMS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry+%3A+JM%22%5BJournal%5D)">It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS.</a> Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).</li>
<li>Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+analysis+via+reversed-phase+ion-pairing+liquid+chromatography+coupled+to+a+stand+alone+orbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer.</a> Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).</li>
<li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+high+resolution+linear+ion+trap+orbitrap+mass+spectrometer+%28orbitrap+elite%29+facilitates+top+down+LC+MS%2FMS+and+versatile+peptide+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics+%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes.</a> Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).</li>
<li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+using+Q+exactive%2C+a+high-performance+benchtop+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics+%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).</li>
<li>Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untargeted+Metabolomics+from+Biological+Sources+Using+Ultraperformance+Liquid+Chromatography-High+Resolution+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22UPLC-HRMS%29.+J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry.</a> UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).</li>
<li>Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Within-day+reproducibility+of+an+HPLC-MS-based+method+for+metabonomic+analysis%3A+Application+to+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine.</a> Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).</li>
<li>Want, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Najważniejszymi etapami skutecznego profilowania metabolitów w komórkach przy użyciu tego protokołu są: 1) kontrolowanie pożywki wzrostowej i ostrożna ekstrakcja komórek; 2) dostosowanie metody LC w oparciu o konfigurację metody MS w celu zapewnienia, że w całym piku jest wystarczająca liczba (zwykle co najmniej 10) punktów danych do oceny ilościowej; 3) wykonanie kalibracji o niskiej masie przed uruchomieniem próbek; 4) wstrzykiwanie nie więcej niż 5 ml w celu uniknięcia przesunięcia czasu retencji i poszerzenia piku sp...

Metabolomika, definiowana jako eksperyment, który mierzy wiele metabolitów jednocześnie, była obszarem intensywnego zainteresowania. Metabolomika dostarcza bezpośredniego odczytu fizjologii molekularnej i dostarcza wglądu w rozwój i choroby, takie jak rak1-4. Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) i chromatografia gazowo-spektrometria mas (GC-MS) należą do najczęściej używanych instrumentów5-9. NMR, szczególnie używany do eksperymentów z topnikiem, ponieważ związki znakowane ciężkimi izotopami, takie jak metabolity znakowane 13C, są aktywne w NMR10,11. Strategia ta wymaga jednak stosunkowo wysokiej czystości próbki i dużej ilości próbek, co ogranicza jej zastosowania w metabolomice. Tymczasem dane zebrane z NMR wymagają intensywnej analizy, a przypisanie złożonych widm NMR do złożonych związków jest trudne. GC-MS jest szeroko stosowany do badań metabolitów polarnych i lipidów, ale wymaga związków lotnych, a zatem często derywatyzacji metabolitów, co czasami wiąże się ze złożoną chemią, która może być czasochłonna i wprowadza szum eksperymentalny.
Chromatografia cieczowa (LC) sprzężona z potrójną kwadrupolową spektrometrią mas wykorzystuje pierwszy kwadrupol do wyboru nienaruszonych jonów rodzicielskich, które są następnie fragmentowane w drugim kwadrupolu, podczas gdy trzeci kwadrupol służy do wyboru charakterystycznych fragmentów lub jonów potomnych. Ta metoda, która rejestruje przejście od jonów macierzystych do określonych jonów potomnych, jest określana jako monitorowanie reakcji wielokrotnych (MRM). MRM jest bardzo czułym, specyficzna i solidna metoda oznaczania ilościowego zarówno małych cząsteczek, jak i białek12-15,21. MRM ma jednak swoje ograniczenia. Aby osiągnąć wysoką swoistość, należy opracować metodę MRM dla każdego metabolitu. Metoda ta polega na identyfikacji określonego fragmentu i odpowiadającej mu zoptymalizowanej energii zderzenia, co wymaga wstępnej wiedzy na temat właściwości metabolitów będących przedmiotem zainteresowania, takich jak informacje o strukturze chemicznej. W związku z tym, z pewnymi wyjątkami związanymi z neutralną utratą wspólnych fragmentów, nie jest możliwa identyfikacja nieznanych metabolitów za pomocą tej metody. 

W ostatnich latach pojawiły się instrumenty do spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (HRMS), takie jak LTQ-orbitrap i Exactive series, QuanTof i TripleTOF 560016-18,22. HRMS może zapewnić stosunek masy do ładunku (m/z) nienaruszonych jonów z błędem kilku ppm. W związku z tym przyrząd HRMS działający na zasadzie wykrywania wszystkich jonów prekursorowych (tj. w trybie pełnego skanowania) może uzyskać bezpośrednie informacje strukturalne z dokładnej masy i wynikowego składu pierwiastkowego analitu, a informacje te można wykorzystać do identyfikacji potencjalnych metabolitów. Rzeczywiście, wszystkie informacje o związku można uzyskać z dokładną masą, aż do poziomu izomerów strukturalnych. Ponadto metoda pełnego skanowania nie wymaga wcześniejszej wiedzy na temat metabolitów i nie wymaga optymalizacji metody. Ponadto, ponieważ można analizować wszystkie jony, których m/z mieszczą się w zakresie skanowania, HRMS ma prawie nieograniczoną zdolność pod względem liczby metabolitów, które można określić ilościowo w jednym przebiegu, w porównaniu z metodą MRM. HRMS jest również porównywalny z potrójnym kwadrupolem MRM pod względem pojemności ilościowej ze względu na krótki cykl pracy, co skutkuje porównywalną liczbą punktów danych, które można uzyskać w pełnym skanowaniu MS. W związku z tym HRMS stanowi alternatywne podejście do metabolomiki ilościowej. Ostatnio ulepszona wersja HRMS zwana spektrometrią mas Q-Exactive (QE-MS) może być obsługiwana przy przełączaniu między trybami dodatnim i ujemnym z wystarczająco krótkimi czasami cyklu w jednej metodzie, co rozszerza zakres wykrywania19. Tutaj opisujemy naszą strategię metabolomiki z wykorzystaniem QE-MS.

<table><tbody><tr><td>Pozytywna mieszanka kalibracyjna</td><td>Thermo Scientific</td><td>#88323</td><td>Jest wrażliwy na światło. Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Ujemna mieszanka kalibracyjna</td><td>Thermo Scientific</td><td>#88324</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Diazinon</td><td>Sant Cruz Biotechnology</td><td>#C0413</td><td>Powoduje podrażnienie oczu, więc pracuj w kapturze. Przechowywać w temperaturze 4 & deg; </td></tr><tr><td>Wkładka igły C H-ESI</td><td>Fisher Scientific</td><td>#1303200</td><td>Można ją wymienić lub wyczyścić 5% kwasem mrówkowym/wodą (usunąć gumowy pierścień), jeśli jest zatkana.</td></tr><tr><td>Kolumna amidowa</td><td>Xbridge Waters</td><td>#186004860</td><td>Kolumna ochronna jest zalecana w celu wydłużenia żywotności kolumny.</td></tr></tbody></table>

strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Profilowanie metabolitów było cennym atutem w badaniach nad metabolizmem w zdrowiu i chorobie. Jednak obecne platformy mają różne czynniki ograniczające, takie jak pracochłonne przygotowanie próbek, niskie limity wykrywalności, niskie prędkości skanowania, intensywna optymalizacja metod dla każdego metabolitu oraz niemożność pomiaru zarówno dodatnio, jak i ujemnie naładowanych jonów w pojedynczych eksperymentach. W związku z tym nowy protokół metabolomiczny może przyczynić się do postępu w badaniach metabolomicznych. Chromatografia hydrofilowa na bazie amidu umożliwia analizę metabolitów polarnych bez derywatyzacji chemicznej. MS o wysokiej rozdzielczości wykorzystujący Q-Exactive (QE-MS) ma ulepszoną optykę jonową, zwiększoną prędkość skanowania (256 ms przy rozdzielczości 70 000) i ma możliwość przeprowadzania przełączania dodatniego/ujemnego. Zastosowanie strategii ekstrakcji metanolem na zimno i sprzężenie kolumny amidowej z QE-MS umożliwia niezawodne wykrywanie 168 docelowych metabolitów polarnych i tysięcy dodatkowych cech jednocześnie. Przetwarzanie danych odbywa się za pomocą komercyjnie dostępnego oprogramowania w bardzo wydajny sposób, a nieznane cechy wyodrębnione z widm masowych mogą być wyszukiwane w bazach danych.

Dokładność danych metabolomicznych w dużym stopniu zależy od wydajności urządzenia LC-QE-MS. Aby ocenić, czy przyrząd działa w dobrym stanie i czy zastosowana metoda jest właściwa, z chromatografii jonów całkowitych (TIC) ekstrahuje się kilka znanych pików LC metabolitów, jak pokazano na rysunku 1. Metabolity polarne, w tym aminokwasy, produkty pośrednie glikolizy, produkty pośrednie TCA, nukleotydy, witaminy, ATP, NADP+ i tak dalej, mają dobrą retencję na kolumnie i dobre kształty pików w kol...

Profilowanie metabolitów było cennym atutem w badaniach nad metabolizmem w zdrowiu i chorobie. Wykorzystując chromatografię cieczową z fazami normalnymi sprzężoną ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości ze zmianą polaryzacji i szybkim cyklem pracy, opisujemy protokół analizy polarnego składu metabolicznego materiału biologicznego z wysoką czułością, dokładnością i rozdzielczością.

Strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie profilowania metabolicznego w hodowanych komórkach. Osiąga się to poprzez ekstrakcję metabolitów polarnych z komórek. Drugim krokiem jest rozpuszczenie ekstraktów komórkowych w wodzie i przeniesienie próbek do fiolek LC.Następnie próbki są wstrzykiwane do przyrządu LC QE MS, który został skalibrowany, a w ostatnim kroku surowe dane są rejestrowane w komputerze. Piki metabolitów są ekstrahowane z surowych danych za pomocą komercyjnego oprogramowania, a nieznane piki są przeszukiwane w bazie danych mas o wysokiej rozdzielczości. Chociaż ten mistrz może zapewnić wgląd w względne poziomy metabolitów w sars, może być również stosowany do innych systemów, takich jak surowica lub tkanki.Najpierw przygotuj 500 mililitrów ruchomej fazy A, która jest 20-milimolowym octanem amonu i 15-milimolowym wodorotlenkiem amonu w 3% acetonie, nitrylu i wodzie. Po luźnym zamknięciu butelki, sonikować roztwór w łaźni wodnej sonikować przez 10 minut bez podgrzewania. Następnie rozpuść pięć miligramów zarówno octanu fluoru sodu, jak i kwasu w pięciu mililitrach wody, aby uzyskać końcowe stężenie jednego miligrama na mililitr.Następnie rozpuść diazynon w metanolu, ab

a-strategy-for-sensitive-large-scale-quantitative-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Strategia dotycząca wrażliwej, dużej skali ilościowej metabolomiki

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Wiarygodność wyników eksperymentów metabolomicznych zależy od skuteczności i powtarzalności przygotowania próbki. Opisana jest rygorystyczna i dogłębna metoda, która umożliwia ekstrakcję metabolitów z płynów biologicznych z możliwością późniejszej analizy do tysięcy związków lub tylko klas związków będących przedmiotem zainteresowania.

Wieloetapowa technika przygotowania do odzyskiwania wielu klas związków metabolitów w celu dogłębnej i pouczającej analizy metabolomicznej

Neurochemia mózgu ssaków ulega zmianie w wielu chorobach neurologicznych i ogólnoustrojowych. Profile charakterystyczne metabolitów mózgowych można skutecznie uzyskać na podstawie surowych ekstraktów tkanki mózgowej. W tym celu stosuje się wysokorozdzielczą spektroskopię NMR, umożliwiającą szczegółową analizę ilościową stężeń metabolitów (metabolomika).

Analiza metabolomiczna mózgu szczura za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego o wysokiej rozdzielczości ekstraktów tkankowych

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

W tym protokole prezentujemy zoptymalizowany przepływ pracy, który łączy w sobie efektywne i szybkie przygotowanie wielu próbek. Ponadto udostępniamy przewodnik krok po kroku, jak zmniejszyć odchylenia analityczne w celu wysokoprzepustowej oceny metabolicznych badań GWAS.

Large-Scale Multi-Omimic Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Wytyczne dotyczące przygotowania i normalizacji próbek

Skonstruowaliśmy nieukierunkowany przepływ metabolomiczny, który zintegrował XY-Meta i metaX razem. W tym protokole pokazaliśmy, jak używać XY-Meta do generowania wabikowej biblioteki spektralnej na podstawie odniesienia do widm w otwartym dostępie, a następnie przeprowadziliśmy kontrolę FDR i użyliśmy metaX do ilościowego określenia metabolitów po zidentyfikowaniu widm metabolomicznych.

Zintegrowany proces identyfikacji i kwantyfikacji nieukierunkowanego metabolomu opartego na kontroli FDR

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) służy do wykrywania dysregulacji metabolitów u pacjentów z różnymi chorobami. Technika ta pozwala na ilościowe określenie zaburzonych metabolitów, odkrywając patofizjologiczne wglądy. W tym miejscu opisujemy krok po kroku procedurę podejścia opartego na NMR w celu charakterystyki metabolicznej pacjentów.

Identyfikacja i kwantyfikacja metabolitów zaburzonych u pacjentów w stanie krytycznym przy użyciu metabolomiki opartej na NMR

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Poznaj metodę ekstrakcji i analizy polarnych metabolitów z komórek hodowlanych za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z wysokorozdzielczą spektrometrią mas.

Strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej

Przeglądaj więcej filmów