Strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie profilowania metabolicznego w hodowanych komórkach. Osiąga się to poprzez ekstrakcję metabolitów polarnych z komórek. Drugim krokiem jest rozpuszczenie ekstraktów komórkowych w wodzie i przeniesienie próbek do fiolek LC.

Następnie próbki są wstrzykiwane do przyrządu LC QE MS, który został skalibrowany, a w ostatnim kroku surowe dane są rejestrowane w komputerze. Piki metabolitów są ekstrahowane z surowych danych za pomocą komercyjnego oprogramowania, a nieznane piki są przeszukiwane w bazie danych mas o wysokiej rozdzielczości. Chociaż ten mistrz może zapewnić wgląd w względne poziomy metabolitów w sars, może być również stosowany do innych systemów, takich jak surowica lub tkanki.

Najpierw przygotuj 500 mililitrów ruchomej fazy A, która jest 20-milimolowym octanem amonu i 15-milimolowym wodorotlenkiem amonu w 3% acetonie, nitrylu i wodzie. Po luźnym zamknięciu butelki, sonikować roztwór w łaźni wodnej sonikować przez 10 minut bez podgrzewania. Następnie rozpuść pięć miligramów zarówno octanu fluoru sodu, jak i kwasu w pięciu mililitrach wody, aby uzyskać końcowe stężenie jednego miligrama na mililitr.

Następnie rozpuść diazynon w metanolu, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikrogramów na mililitr. Aby przygotować jeden mililitr ujemnego roztworu kalibracyjnego o niskiej masie, zmieszaj 960 mikrolitrów termoujemnego roztworu kalibracyjnego z 20 mikrolitrami roztworu fluorooctanu sodu i kwasu homowanilinowego. Aby przygotować jeden mililitr dodatniego roztworu kalibracyjnego o niskiej masie, zmieszaj 990 mikrolitrów termododatniego roztworu kalibracyjnego i 10 mikrolitrów roztworu diazynonu.

Po przeprowadzeniu wzorcowej kalibracji masy w trybie dodatnim, wyreguluj zakres skanowania na stosunek masy do ładunku od 60 do 900 w tablicy rozdzielczej przyrządów i zastosuj dysocjację wywołaną zderzeniem źródła o wartości 25 elektronowoltów. Wprowadź niestandardowe jony kalibracyjne, a gdy źródło jonów się ustabilizuje, rozpocznij niestandardową kalibrację na stronie strojenia. Przełącz polaryzację na tryb ujemny po przeprowadzeniu standardowej kalibracji masy w trybie ujemnym, dostosuj zakres skanowania do stosunku masy do ładunku od 60 do 900 w tablicy rozdzielczej przyrządów i zastosuj dysocjację wywołaną zderzeniem źródła o wartości 35 elektronowoltów.

Wprowadź niestandardowe jony kalibracyjne, a gdy źródło jonów się ustabilizuje, rozpocznij niestandardową kalibrację. Na stronie strojenia wyposaż instrument QE MS w podgrzewaną sondę jonizacji elektrorozpylanej lub HESI, ustalając ją na poziomie C, a następnie podłączając do wlotów azotu gazowego, parownika i napięciowych. Na stronie dostrajania komputera ustaw odpowiednie parametry dostrajania dla sondy.

Ustaw temperaturę kapilary na 320 stopni Celsjusza, a soczewkę S na 55. Następnie w programie metody zbuduj metodę pełnego skanowania, używając następujących wartości. Ustal metodę chromatograficzną, wprowadzając informacje o gradiencie liniowym.

Zastosuj kolumnę amid do separacji związków w temperaturze pokojowej. W tym momencie przygotuj rozpuszczalnik ekstrakcyjny, ręcznie mieszając 40 mililitrów metanolu i 10 mililitrów wody w 50 mililitrach. Dwa. Gdy wcześniej hodowano raka jelita grubego, H, CT osiem komórek osiąga 80% zbiegu.

Szybko zassaj pożywkę i umieść płytkę z sześcioma dołkami na wierzchu suchego lodu. Następnie natychmiast dodaj jeden mililitr rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do każdej studzienki i przenieś płytkę do zamrażarki o ujemnych 80 stopniach Celsjusza. Po wyjęciu płytki z zamrażarki, 15 minut później, umieść ją na suchym lodzie i zeskrob komórki do rozpuszczalnika.

Przenieś roztwór z każdej studzienki do trzech 1,7 mililitrowych probówek einor i odwiruj próbki z prędkością 20 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Po odwirowaniu przenieść supernatant do dwóch nowych probówek einor. Następnie wysuszyć próbki w próżni o dużej prędkości.

Po wyschnięciu próbek przechowuj je w zamrażarce o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza. Po wyjęciu próbek z zamrażarki do analizy, pozwól im osiągnąć temperaturę lodu. Następnie dodaj 20 mikrolitrów lodowatej wody i zwiruj próbki, aby rozpuścić metabolity.

Następnie odwiruj próbki w temperaturze 20 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza. Przez dwie minuty przenieść SUPERNAT do fiolek lc i wstrzyknąć pięć mikrolitrów próbek do przyrządu LC QES w celu analizy. Po prawidłowym przeprowadzeniu kalibracji na przyrządzie QE MS, należy zrównoważyć kolumnę lc przez pięć minut z 85% ruchomej fazy B przy natężeniu przepływu 0,15 mililitra na minutę.

Następnie ustaw sekwencję próbek w kolejności losowej, aby rozłożyć fluktuacje wprowadzone przez LCMS na każdą próbkę i zapewnić dokładniejsze porównanie między różnymi próbkami. Po każdych sześciu próbkach dodać przebieg mycia, a następnie próbkę zerową, aby ocenić tło systemu i poziomy przeniesienia. Zapisz sekwencję i rozpocznij przebieg sekwencji.

Gdy kolumna lc wykaże stabilne ciśnienie bliskie 400 PSI, po uruchomieniu pierwszych dwóch próbek sekwencji, sprawdź piki na tych chromatogramach pod kątem nieznanych metabolitów, aby upewnić się, że sekwencja próbki przebiega płynnie. Po zakończeniu wszystkich próbek w sekwencji przeprowadź analizę danych na osobnym komputerze. Wybierz metodę wyrównania pików i ekstrakcji ramek dla małych cząsteczek na dostępnym na rynku oprogramowaniu.

Następnie załaduj surowe dane lc ms i pogrupuj je na podstawie typów próbek. Pobrać próbki w środku sekwencji serii jako chromatograficzną próbkę referencyjną do wyrównania pików i wybrać grupę jako grupę proporcji lub pełne obliczenie zmiany. Następnie prześlij ziarno ramki, w tym znane metabolity do ukierunkowanej analizy metabolitów wraz z zebranymi danymi i odpowiadającym im ziarnem ramki.

Następnie wybierz pełne skanowanie widm w trybie dodatnim lub ujemnym i zapisz ten plik przetwarzania danych w tym samym folderze, co surowe dane. Wyłącz funkcję przeszukiwania bazy danych i uruchom przepływ pracy. Następnie wyeksportuj dane procesowe jako arkusz Excela zawierający obszar piku każdej klatki.

W przypadku nieukierunkowanej analizy metabolitów należy wybrać metodę ekstrakcji składników. Załaduj próbki nieprzetworzonych danych i trzy puste próbki w celu odjęcia tła. Po tej grupie należy pobrać dane surowe i ustawić próbki referencyjne zgodnie z wcześniejszym opisem.

Ustaw próg komponentu na 10 do piątego. Użyj bazy danych ludzkiego metabolomu do identyfikacji nieznanych związków. Po zapisaniu tego pliku przetwarzania wyłącz funkcję przeszukiwania bazy danych i uruchom przepływ pracy.

Po zakończeniu przetwarzania danych należy użyć współczynników zmienności lub filtrów CV, aby usunąć składniki o dużym CV w próbkach replik i filtrach intensywności. Aby ręcznie usunąć komponenty wykryte na poziomie szumu, przejdź przez każdy komponent i wybierz te z dobrze zdefiniowanym szczytem lub stosunkowo dużą różnicą w różnych typach próbek do przeszukiwania bazy danych. Na koniec wyeksportuj dane z trafieniami w bazie danych.

Dokładność danych metabolomicznych w dużym stopniu zależy od wydajności urządzenia LC QEMS w celu oceny, czy urządzenie działa w dobrym stanie i czy zastosowana metoda jest właściwa. Kilka znanych pików lc metabolitów ekstrahuje się z chromatografii jonów całkowitych, jak pokazano tutaj. Metabolity polarne, w tym aminokwasy, glikoliza, produkty pośrednie, TCA, pośrednie nukleotydy, witaminy A, TP i NADP, mają dobrą retencję na kolumnie i dobre kształty pików w obecnych warunkach lc.

Tymczasem test błędu masy jest wykonywany w ciągu 24 godzin po kalibracji niskiej masy, jak pokazano na ilustracji. W tym przypadku błąd masy ocenia się, porównując wykryty stosunek masy do ładunku z teoretycznym stosunkiem masy do ładunku docelowych metabolitów. W tym przypadku docelowe metabolity mają stosunek masy do ładunku w zakresie od 74 do 744.

Oś Y reprezentuje tutaj skumulowany procent metabolitów w pewnym zakresie błędu masy. Niebieska krzywa pokazuje wynik od zera do 12 godzin, podczas gdy czerwona krzywa pokazuje dane zebrane od 12 do 24 godzin po kalibracji. Ponad 90% metabolitów mieści się w granicach błędu masy pięciu części na milion, co oznacza, że opracowana tutaj metoda kalibracji niskiego zakresu masy jest wystarczająca do utrzymania błędu masy na poziomie pięciu części na milion w celu wykrycia niskiego zakresu masy.

Kolejną kwestią, którą należy się zająć, jest czułość instrumentu przy obecnej metodzie i konfiguracji instrumentu. Seryjne rozcieńczanie potrójnych próbek z 10-centymetrowej szalki Petriego przeprowadzono pięciokrotnie ze współczynnikiem rozcieńczenia wynoszącym sześć, co dało sześć różnych stężeń próbek. Ukierunkowany wykaz służy do oceny liczby metabolitów wykrytych przy różnych stężeniach próbki.

Przedstawione tutaj wyniki wskazują, że optymalna liczba wykrywanych docelowych metabolitów wynosi od 2,78 razy 10 do piątej i 1,67 razy 10 do sześciu komórek, podczas gdy jedna razy 10 do siedmiu komórek daje mniejszą liczbę wykrytych metabolitów, co jest spowodowane efektami tłumienia jonów. Wynik ten wskazuje, że optymalna ilość komórek do ekstrakcji do tej analizy jest mniej więcej taka, jak w studzience na płytce sześciodołkowej. W przypadku nieukierunkowanej analizy metabolitów do filtrowania tabeli składników stosuje się wartość odcięcia CV wynoszącą 20% i średnią wartość intensywności od 10 do siódmej.

Wartości odcięcia CV można zwiększyć, podczas gdy średnie wartości intensywności muszą zostać zmniejszone, aby uwzględnić więcej pików: Po ręcznym sprawdzeniu pików wybierane są komponenty o dobrych kształtach i wyszukiwane w bazie danych ludzkiego metabolomu. Wyniki z danych zebranych w trybie dodatnim są wymienione tutaj, a wyniki z trybu ujemnego są wymienione tutaj. Niektóre z zidentyfikowanych tutaj metabolitów pokrywają się z metabolitami z listy docelowej, takimi jak glutation i prolina.

Badane są również dodatkowe metabolity nieobecne w wykazie docelowym, takie jak glioksal metylowy, który może pochodzić z glikolizy oraz jeden glicerol WOM, dwa ELE SN glicerol, trzy fosfocholiny, który jest wykrywany w trybie dodatnim z czasem retencji wynoszącym 3,2 minuty. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ekstrahować polimetabolity z hodowanych sars, a następnie używać RC QES do pomiaru względnych poziomów metabolizowanych w różnych próbkach. Dziękuję za oglądanie.