Używanie znacznika miejsca wiązania α-bungarotoksyny do badania lokalizacji i transportu błony receptora GABA A

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar lokalizacji powierzchniowej oraz endocytozy receptorów gabaa w neuronach hipokampa. Cel ten osiąga się poprzez uprzednią transfekcję neuronów hipokampa podjednostką receptora gabaa z etykietą, a następnie umożliwienie hodowlanym neuronom rozwoju w inkubatorze. Drugim krokiem jest znakowanie powierzchniowych receptorów gabaa za pomocą toksyny alpha bungalow sprzężonej z fluorescencyjnym barwnikiem Alexa.

Następnie neurony inkubuje się przez różne odstępy czasu, aby umożliwić endocytozę znakowanych receptorów. Ostatnim krokiem jest utrwalenie preparatów w odpowiednich punktach czasowych i przeprowadzenie barwienia immunocytochemicznego z użyciem przeciwciał anty-GFP w celu zaobserwowania całkowitej puli znakowanych receptorów. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię konfokalną do wykazania zmian w lokalizacji powierzchniowej oraz endocytozie znakowanych receptorów gabaa z zastosowaniem metod obrazowania utrwalonych tkanek lub obrazowania na żywo.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu transportu receptorów, takie jak wpływ wiązania ligandu na tempo endocytozy i wbudowywania receptorów oraz to, czy różne ligandy i modulatory mogą wpływać na recykling i degradację receptorów. Chociaż metoda ta była wykorzystywana do badania związanych kanałów jonowych oraz receptorów sprzężonych z białkiem G głównie w kontekście układu nerwowego, można ją również zastosować do badania dynamicznej lokalizacji i transportu innych białek błonowych w hodowlach komórkowych i komórkach pierwotnych z różnych tkanek. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności z dwóch powodów.

Po pierwsze, aby stworzyć funkcjonalne konstrukty, a po drugie, zdobyć praktykę i doświadczenie niezbędne do przetwarzania kilku punktów czasowych jednocześnie. Aby rozpocząć, przygotuj od czterech do pięciu okrągłych szkiełek podstawkowych pokrytych poli-L-lizyną w każdej szalce hodowlanej o średnicy 3,5 centymetra, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie, w dniu hodowli, przeprowadź transfekcję świeżo dysocjowanych neuronów, stosując od jednego do czterech mikrogramów DNA konstrukcji przygotowanego metodą maxi-prep na płytkę.

Transfekowane neurony na szkiełkach podstawkowych powlekanych poli-L-lizyną przy końcowej gęstości wynoszącej około 200 000 neuronów na szalkę o średnicy 3,5 cm. Po upływie od 4 do 24 godzin od przygotowania kultur neuronalnych należy wymienić medium. Następnie należy pozwolić neuronom rozwijać się w inkubatorze przez okres od 14 do 17 dni in vitro lub do osiągnięcia pożądanego stopnia rozwoju w celu przeprowadzenia testu endocytozy.

W pierwszej kolejności ustaw laboratoryjne urządzenie do chłodzenia i ogrzewania na 16 °C. Schłodź sól fizjologiczną z dodatkiem HEPES (HBS) do 16 °C w kąpieli wodnej. Przenieś płytki z neuronami na aluminiową płytę o temperaturze 16 °C i chłodź przez pięć minut.

Usunąć medium i zastąpić je jednym mililitrem HBS o temperaturze 16 °C z dodatkiem 150 µM tuberyny przez dwie minuty. Następnie usunąć medium do oznakowanego pojemnika na odpady i zastąpić je jednym mililitrem HBS o temperaturze 16 °C z dodatkiem tuberyny oraz toksyny alfa-bungarowy Alexa 594, inkubując w temperaturze 16 °C przez 15 minut.

Po inkubacji przenieść medium do oznakowanego pojemnika na odpady i trzykrotnie przemyć szalki dwiema mililitrami HBS o temperaturze 16 °C w przypadku eksperymentów z obrazowaniem na żywo w serii czasowej po endocytozie receptorów, przy użyciu szalki hodowlanej o średnicy 3,5 cm z szklanym dnem. Przenieść szalkę na podgrzewany stół mikroskopu i rozpocząć obrazowanie za pomocą mikroskopu konfokalnego lub Turf. Przygotować zestaw do utrwalonych szkiełek nakrywkowych.

Przenieś szkiełka okrywkowe dla punktu czasowego T=0 do naczynia z 4% paraformaldehydem i 4% sacharozą w temperaturze pokojowej na 20 minut dla pozostałych punktów czasowych. Zastąp HBS warunkowanym, wyrównanym medium o temperaturze 37 °C i zwróć do inkubatora w celu przeprowadzenia endocytozy w temperaturze 37 °C w wymaganych punktach czasowych. Wyjmij naczynia z inkubatora i szybko przemyj dwukrotnie dwoma mililitrami DPBS (buforu fosforanowego z solą) w temperaturze pokojowej.

Następnie utrwal próbkę w 4% paraformaldehydzie i 4% sacharozie przez 20 minut. Po 20-minutowej utrwalaniu przelej 4% paraformaldehyd i 4% sacharozę do pojemnika na odpady, a następnie przemyj naczynia dwukrotnie dwiema mililitrami DPBS w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj szkiełka podstawowe w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Roztwór blokujący do immunofluorescencji zawierający 0,2% Triton X 100 w celu permeabilizacji neuronów i umożliwienia immunobarwienia przeciwciałami przeciwko GFP wewnątrzkomórkowej puli receptorów oraz ewentualnego znakowania innych białek zainteresowania. Następnie należy usunąć permeabilizujący roztwór blokujący i inkubować szkiełka podstawowe w roztworze blokującym do immunofluorescencji bez dodatku Triton X 100 przez 20 do 30 minut. Przeprowadzić inkubację szkiełek podstawowych z przeciwciałem pierwszorzędowym w roztworze blokującym przez kilka godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.

Przemyj szkiełka nakrywkowe, namaczając je w DPBS przez pięć minut, powtarzając ten proces łącznie trzy razy. Następnie inkubuj szkiełka nakrywkowe z przeciwciałami wtórnymi w roztworze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyj szkiełka nakrywkowe trzy razy w DPBS w taki sam sposób jak wcześniej.

Następnie zamocuj każde szkiełko przykrywowe, usuwając nadmiar cieczy z jego tylnej strony za pomocą chusteczki laboratoryjnej, a następnie odwracając szkiełko nad czterema mikrolitrami medium montażowego na szkiełku przedmiotowym. Przeprowadź akwizycję obrazów za pomocą mikroskopii konfokalnej w sposób ślepy względem warunków eksperymentalnych, używając obiektywu imersyjnego olejowego 60 x o aperturze numerycznej 1,49.

Przy zastosowaniu tych samych ustawień akwizycji obrazu, należy wykonać pojedyncze obrazy w przekroju Z, na których w ostrości znajduje się ciało neuronu oraz kilka wypustek dendrytycznych; następnie należy ilościowo określić sygnał fluorescencyjny toksyny alpha bungalow, Alexa oraz barwienie immunologiczne GFP wzdłuż 20 µm trzech do czterech proksymalnych dendrytów na jeden neuron, stosując ten sam próg analizy dla wszystkich danych dotyczących endocytozy. Należy przeanalizować dane z 10 do 12 neuronów dla każdego punktu czasowego, powtarzając eksperyment z wykorzystaniem kilku niezależnych kultur neuronalnych.

Aksony GABAergiczne tworzą kontakty hamujące na dendrytach neuronów piramidalnych. Presynaptyczne terminale hamujące są identyfikowane za pomocą pęcherzykowego transportera inhibicyjnych aminokwasów, który ładuje GABA i glicynę do pęcherzyków synaptycznych. Receptory GABA$_A$ znajdują się w bliskim sąsiedztwie miejsc uwalniania neuroprzekaźnika, zakotwiczonych przez postsynaptyczne białko rusztowania hamującego gein. Przedstawiono tutaj neurony wykazujące ekspresję $\alpha 2$ phg F-P-B-B-S z receptorami GABA$_A$ na powierzchni, znakowanymi toksyną bungalow Alexa 594, a następnie poddane barwieniu immunologicznymi przeciwciałami anty-GFP w celu wykazania całkowitej populacji receptorów (kolor zielony) oraz albo postsynaptycznego białka rusztowania hamującego gein, albo pęcherzykowego transportera inhibicyjnych aminokwasów.

Przedstawiono tutaj endocytozę receptora GABA A zawierającego podjednostkę alfa 2 w neuronach hipokampa w 15. dniu in vitro z użyciem toksyny alfa-bungarozyny. Pomiary fluorescencji poszczególnych wypustek dendrytycznych pokazane na panelach zostały znormalizowane do poziomu ekspresji konstruktu za pomocą przeciwciał przeciwko GFP. Ostateczne porównanie punktów czasowych wykonano poprzez normalizację do pomiaru w czasie T równym zero.

Ilościowe określenie internalizacji receptorów w okresie 60 minut na podstawie zmian sygnału fluorescencyjnego w czasie najlepiej opisano za pomocą pojedynczej funkcji wykładniczej. Alternatywnym podejściem jest śledzenie endocytozy receptorów w pojedynczym neuronie za pomocą konfokalnej mikroskopii czasu rzeczywistego (live imaging time-lapse). Punktowa i nakładająca się fluorescencja receptora GABA A znakowanego P-H-G-F-P oraz receptorów powierzchniowych znakowanych toksyną alfa-bungarową jest widoczna na początku eksperymentu; w trakcie przebiegu badania sygnał receptora GABA A znakowanego toksyną alfa-bungarową maleje w miarę endocytozy receptorów.

Podczas gdy sygnał P-H-G-F-P pozostaje wysoki ze względu na wbudowywanie nowych receptorów, minimalny spadek sygnału P-H-G-F-P po przeprowadzeniu tej procedury wynika ze zmian w dystrybucji receptorów na powierzchni komórki oraz z fotowybielania. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak tempo wbudowywania receptorów przy zastosowaniu różnych preparatów, można przeprowadzić inne metody, np. testy wbudowywania toksyny bungalow. Technika ta pozwala ocenić, w jaki sposób aktywność komórkowa, specyficzne domeny białkowe, agoniści i inne modulatory mogą modyfikować obrót receptorów w żywych neuronach, innych komórkach i tkankach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, w jaki sposób wykorzystać toksynę z alfa-bungarozyny sprzężoną z barwnikami Alexa w połączeniu ze standardowymi technikami immunofluorescencyjnymi do ilościowego oznaczenia lokalizacji receptorów powierzchniowych w neuronach hipokampa.