Używanie znacznika miejsca wiązania α-bungarotoksyny do badania lokalizacji i transportu błony receptora GABA A

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar lokalizacji powierzchni receptora gabaa i endocytozy w neuronach hipokampa. Osiąga się to poprzez pierwszą transekcję neuronów hipokampa ze znakowaną podjednostką receptora gabaa i umożliwienie rozwoju hodowanych neuronów w inkubatorze. Drugim krokiem jest oznaczenie powierzchniowych receptorów gabaa za pomocą fluorescencyjnej matrycy Alexa sprzężonej z alfa bungalow.

Następnie neurony są inkubowane w różnych punktach czasowych, aby umożliwić znakowane receptory bycia endocytozą. Ostatnim krokiem jest utrwalenie próbek w odpowiednich punktach czasowych i wykonanie barwienia immunologicznego za pomocą anty GFP w celu obserwacji całkowitej puli oznakowanych receptorów. Ostatecznie mikroskopia konfokalna służy do pokazania zmian w lokalizacji powierzchniowej i endocytozie znakowanych receptorów gabaa przy użyciu metod obrazowania stałego lub na żywo.

Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transportu receptorów, takie jak wpływ wiązania ligandów na endocytozę receptora i szybkość insercji oraz czy różne ligandy i modulatory mogą wpływać na recykling i degradację receptorów. Chociaż metoda ta została wykorzystana do badania ligowanych kanałów jonowych i receptorów sprzężonych z białkiem G głównie w kontekście układu nerwowego, może być również stosowana do badania dynamicznej lokalizacji i transportu innych białek błonowych w hodowli komórkowej i komórkach pierwotnych różnych tkanek. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy z dwóch powodów.

Po pierwsze, aby stworzyć funkcjonalne konstrukty, a po drugie, praktyka i doświadczenia potrzebne do przetwarzania kilku punktów czasowych jednocześnie. Na początek przygotuj cztery do pięciu okrągłych szkiełek pokrywowych ze szkła pokrytego poli lizyną w każdym 3,5-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przetransfekuj świeżo zdysocjowane neurony w dniu hodowli za pomocą jednego do czterech mikrogramów maxi przygotowanej płytki DNA.

Transfekowane neurony na pokrytej poli lycyną pokrywie ślizgają się w końcowej gęstości około 200 000 neuronów na 3,5-centymetrową płytkę. Wymień pożywkę na cztery do 24 godzin po przygotowaniu kultur neuronalnych. Następnie pozwól neuronom rozwijać się w inkubatorze do 14 do 17 dni in vitro lub pożądanego etapu, aby wykonać test endocytozy.

Najpierw ustaw stołowe urządzenie grzewcze chłodzące na 16 stopni Celsjusza. Schłodzić zewnątrzkomórkowe hałdy, buforowaną sól fizjologiczną lub HBS do 16 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Przenieś szalki neuronów na aluminiową płytkę w temperaturze 16 stopni Celsjusza i ostudź przez pięć minut.

Usuń pożywkę i zastąp jednym mililitrem HBS o temperaturze 16 stopni Celsjusza plus 150 mikromolowców dwa Bo Rine na dwie minuty. Następnie usuń pożywkę do oznakowanego pojemnika na odpady i zastąp ją jednym mililitrem HBS o temperaturze 16 stopni Celsjusza plus dwa bo kerine plus toksyna alfa bungalow. Alexa 5 9 4 inkubacja w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Po inkubacji przenieś pożywkę do oznakowanego pojemnika na odpady i umyj naczynia trzykrotnie dwoma mililitrami HBS o temperaturze 16 stopni Celsjusza do eksperymentów z szeregami czasowymi na żywo po endocytozie receptora przy użyciu naczynia hodowlanego o szklanym dnie o grubości 3,5 centymetra. Przenieś naczynie do podgrzanego stolika pod mikroskopem i rozpocznij obrazowanie za pomocą mikroskopu konfokalnego lub darniowego. Konfiguracja dla stałych szkiełek nakrywkowych.

Transfer T równa się zerowemu punktowi czasowemu, pokrywa wsuwa się do naczynia o temperaturze pokojowej 4% para formaldehydu, 4% sacharozy na 20 minut dla innych punktów czasowych. Zastąp HBS kondycjonowaną pożywką o temperaturze 37 stopni Celsjusza i wróć do inkubatora w celu endocytozy w temperaturze 37 stopni Celsjusza w potrzebnych punktach czasowych. Wyjmij naczynia z inkubatora i szybko umyj dwukrotnie dwoma mililitrami temperatury pokojowej, fosforanem delcos, buforowaną solą fizjologiczną lub DPBS.

Następnie utrwal próbkę w 4% aldehydzie paraformowym, 4% sacharozie przez 20 minut. Po 20-minutowym utrwaleniu usuń 4% aldehydu paraformowego, 4% sacharozy do pojemnika na odpady i umyj naczynia dwukrotnie dwoma mililitrami DPBS o temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Roztwór bloku immunofluorescencyjnego zawierający 0,2% Triton X 100 do przenikania neuronów i umożliwienia barwienia immunologicznego anty GFP puli receptorów wewnątrzkomórkowych i/lub znakowania innych białek będących przedmiotem zainteresowania. Następnie usunąć przepuszczalny roztwór blokowy i inkubować szkiełka nakrywkowe w roztworze blokowym immunofluorescencji bez Triton X 100 przez 20 do 30 minut. Przeprowadzić inkubację przeciwciał pierwotnych szkiełek nakrywkowych w bloku przez kilka godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza po inkubacji.

Umyj szkiełka nakrywkowe, mocząc je w DPBS przez pięć minut, co daje w sumie trzy prania. Następnie inkubować szkiełka nakrywkowe z przeciwciałami drugorzędowymi w roztworze blokowym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej po jednej godzinie. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy za pomocą DPBS, tak jak poprzednio.

Następnie zamontuj każde szkiełko nakrywkowe, usuwając nadmiar płynu z tyłu szkiełka nakrywkowego za pomocą chusteczki laboratoryjnej, a następnie odwracając szkiełko nakrywkowe na cztery mikrolitry podłoża montażowego na szkiełku podstawowym. Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą mikroskopii konfokalnej ślepej na warunki eksperymentalne przy użyciu 60-krotnej apertury numerycznej oleju. 1.49 Cel zanurzenia.

Korzystając z tych samych ustawień akwizycji obrazu, uzyskaj obrazy pojedynczego przekroju Z z ciałem komórki neuronalnej i kilkoma procesami dendrytycznymi w centrum uwagi, określ ilościowo toksynę alfa bungalow, sygnał fluorescencyjny Alexa i barwienie immunologiczne GFP wzdłuż 20 mikronów od trzech do czterech dendrytów proksymalnych na neuron, używając tego samego progu do analizy wszystkich danych dotyczących endocytozy. Analizuj dane z 10 do 12 neuronów dla każdego punktu czasowego. Powtórzenie eksperymentu z kilkoma niezależnymi kulturami neuronalnymi.

Aksony GABA-ergiczne nawiązują hamujące kontakty z dendrytami neuronów piramidowych. Presynaptyczne zakończenia hamujące są identyfikowane przez pęcherzykowy transporter aminokwasów hamujących, który ładuje GABA i glicynę do pęcherzyków synaptycznych. Receptory GABA a są ściśle przeciwstawne do miejsc uwalniania neuroprzekaźników związanych z postsynaptycznym rusztowaniem hamującym Pokazane tutaj białko gein to neurony alfa dwa phg F-P-B-B-S eksprymujące się z powierzchniowymi receptorami gabaa znakowanymi toksyną Alexa 5 9 4 bungalow, a następnie barwienie immunologiczne dla całej populacji receptorów z przeciwciałem anty GFP pokazanym na zielono i albo postsynaptyczne białko rusztowania hamującego gein, albo pęcherzykowy transporter aminokwasów hamujących.

Tutaj endocytoza alfa dwa zawierająca receptor GABA A i neurony hipokampa po 15 dniach in vitro jest pokazana toksyna alfa bungalow. Fluorescencja Pomiary poszczególnych procesów dendrytycznych, jak pokazano w panelach, są znormalizowane do poziomu ekspresji konstruktu za pomocą przeciwciał GFP. Barwienie końcowe porównanie punktów czasowych odbywa się poprzez normalizację do pomiaru T równa się zero.

Kwantyfikacja internalizacji receptorów w okresie 60 minut na podstawie zmian sygnału fluorescencyjnego w czasie została najlepiej opisana przez pojedynczy wykładnik. Alternatywnym podejściem jest śledzenie endocytozy receptora w pojedynczym neuronie za pomocą obrazowania na żywo w poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Punktowa i nakładająca się fluorescencja receptora GABA A znakowanego P-H-G-F-P i powierzchniowych receptorów znakowanych toksyną alfa bungalow jest widoczna na początku eksperymentu w czasie, w którym sygnał receptora GABA A znakowany toksyną alfa bungalow zmniejsza się wraz z receptorami endocytozy.

Podczas gdy sygnał P-H-G-F-P pozostaje wysoki z powodu insercji nowego receptora, minimalny spadek sygnału P-H-G-F-P jest spowodowany zmianami dystrybucji receptorów na powierzchni komórki i fotowybielaniem Po tej procedurze. Inne metody, takie jak testy wprowadzania toksyn bungalow, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wskaźniki wstawiania receptorów przy różnych zabiegach. Technika ta pozwala ocenić, w jaki sposób aktywność komórkowa, określone domeny białkowe, agoniści i inne modulatory mogą modyfikować obrót receptorów w żywych neuronach, innych komórkach i tkankach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać barwników Alexa sprzężonych z toksyną alfa bungalow w połączeniu ze standardowymi technikami immunofluorescencyjnymi do ilościowego określenia lokalizacji receptorów powierzchniowych w neuronach hipokampa.