Name: Używanie znacznika miejsca wiązania α-bungarotoksyny do badania lokalizacji i transportu błony receptora GABA A (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-28T15:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Poznaj metodę oznaczania receptorów GABA A na powierzchni neuronów hipokampalnych za pomocą α-bungarotoksyny sprzężonej z barwnikiem Alexa. Technika ta umożliwia analizę endocytozy i dynamiki receptorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wsparcie zostało zapewnione przez fundusze startowe z Wydziału Farmakologii i Biologii Chemicznej Szkoły Medycznej Uniwersytetu w Pittsburghu. Podziękowania dla członków laboratorium Jacoba, którzy przyczynili się do przesłania filmu: Nicholas Graff.

Wszystkie opisane poniżej protokoły są zgodne z instytucjonalnymi komisjami rewizyjnymi IACUC i IRB University of Pittsburgh School of Medicine.
1. Przygotowanie kultur neuronalnych hipokampa w kapturze do hodowli tkankowych
Uwaga: Używaj sterylnych technik i odczynników w całym Protokole 1.
<ol>
	<li>Przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną (0,1 mg/ml wH2O) jako substrat dla hodowli neuronalnej.
	<ol>
		<li>Umieść 4-5 okrągłych szklanych szkiełek nakrywkowych w każdym naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 3,5 cm.</li>
		<li>Umieścić 70 μl poli-D-lizyny na każdym szkiełku nakrywkowym o średnicy 12 mm. Uwaga: do obrazowania na żywo można użyć 3,5-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej ze szklanym dnem (namaskowo 200 μl poli-D-lizyny na osadzonym szkiełku nakrywkowym o średnicy 14 mm).</li>
		<li>Przygotowane potrawy pozostaw w okapie do hodowli tkankowych O/N. Aby zminimalizować parowanie poli-D-lizyny i utrzymać sterylność powierzchni w okapie do hodowli tkankowych, zamknij skrzydło okienne i wyłącz dmuchawę O/N. Uwaga: Lampy UV nie są używane podczas inkubacji O/N.</li>
		<li>Następnego ranka umyj naczynia 3x 2 mlH2O.</li>
		<li>Po wyjęciu ostatniego płukaniaH2O, dodaj 2 ml pożywki do każdego naczynia o średnicy 3,5 cm i pozostaw naczynia w inkubatorze, aż będą gotowe do płytki neuronów w kroku 1.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Neurony hipokampa są przygotowywane od 18-19 dnia embrionalnego (E18-19) szczurów (zmodyfikowanych z Goslin22).</li>
	<li>Transfekcja świeżo zdysocjowanych neuronów w dniu hodowli za pomocą 1-4 μg maxipreparowanego konstruktu DNA. 
	Uwaga: zazwyczaj 3 μg DNA jest transfekowane do 1-2 milionów neuronów, z żywotnością 50% i skutecznością transfekcji 60% (np. zaczynając od 2 milionów neuronów: ((2 x 106 neuronów x 0,5)0,6) zapewnia ok. 1 milion neuronów, z których 600 000 jest transfekowanych1. Różne ilości konstruktu DNA mogą być transfekowane podczas rozwiązywania potencjalnych problemów związanych z nadmierną ekspresją, a następnie odpowiedniej charakterystyki lokalizacji i funkcji konstruktu.</li>
	<li>Ułóż transfekowane neurony na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną w końcowej gęstości około 200 000 neuronów na 3,5 cm szalkę. Uwaga: w przypadku naczynia ze szklanym dnem umieść 40 000-50 000 neuronów na szklanej powierzchni 14 mm.</li>
	<li>Wymień pożywkę 4-24 godziny po przygotowaniu kultur neuronalnych, a następnie pozwól neuronom rozwijać się w inkubatorze do 14-17 dni in vitro (DIV) lub do pożądanego etapu.</li>
</ol>
2. Test endocytozy
UWAGA: Uwaga na temat odpadów α-bungarotoksyny i tubokuraryny oraz obchodzenia się z nimi:
<ol>
	<li>Postępowanie ze wszystkimi neurotoksynami peptydowymi jest zalecane zgodnie z wytycznymi protokołów badawczych poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BL-2). Należy nosić wszystkie odpowiednie środki ochrony osobistej. Liofilizowane proszki toksyn należy rozpuścić zgodnie z instrukcjami producenta. Odpady toksyn należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucji zarządzającej dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego.</li>
	<li>W celu usunięcia potencjalnych agregatów peptydowych, które mogły powstać podczas przechowywania, podwielokrotności α-bungarotoksyny należy odwirować na krótko przed użyciem, a do doświadczenia należy użyć supernatantu.</li>
	<li>Zapasy α-bungarotoksyny (Bgt) zawiesza się w stężeniu 1 mg/ml w sterylnymH2Oi przechowuje w podwielokrotnościach 10 μl w temperaturze -20 °C. Stosuje się fluorescencyjnie sprzężone zapasy Bgt w stężeniu 3 μg/ml. Tubukurarynę stosuje się w końcowym stężeniu 150 μM.</li>
</ol>
<ol>
	<li>Ustaw blok grzejny stołowy na 16 °C w chłodni z cienką płytą aluminiową lub ze stali nierdzewnej na górze. Alternatywnie, jeśli jest to możliwe, można zastosować laboratoryjne urządzenie chłodząco-grzewcze dla każdego etapu wymagającego 16 °C.</li>
	<li>Schłodzić zewnątrzkomórkową sól fizjologiczną buforowaną przez Hepesa (HBS zawierającą w mM: 135 NaCl, 4,7 KCl, 10 HEPES, 11 glukozy, 1,2 MgCl2 i 2,5 CaCl2, pH 7,4) do 16 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Przenieść szalki neuronowe na aluminiową płytkę w temperaturze 16 °C i schłodzić przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć pożywkę (przechowywać kondycjonowaną pożywkę i odłożyć w inkubatorze na krok 2.8, punkty czasowe oznaczania endocytozy) i zastąpić 1 ml HBS + tubokuraryna o temperaturze 16 °C (150 μM) na 2 min.</li>
	<li>Wyjąć HBS + tubocurarynę do oznakowanego pojemnika na odpady i zastąpić 1 ml HBS + tubokuraryna o temperaturze 16 °C (150 μM) + α-bungarotoksyna Alexa 594 [3 μg/ml], inkubując w temperaturze 16 °C przez 15 min.</li>
	<li>Wyjąć HBS + tubocurarine + α-bungarotoxin Alexa 594 do oznakowanego pojemnika na odpady i umyć naczynia 3x 2 ml HBS o temperaturze 16 °C (popłuczyny można zebrać przez aspirację w kolbie próżniowej zawierającej 50 ml 50 % wybielacza).</li>
	<li>W przypadku eksperymentów z szeregami czasowymi na żywo po endocytozie receptora przy użyciu naczynia hodowlanego o średnicy 3,5 cm ze szklanym dnem, wykonaj kroki 2.1-2.6, a następnie przenieś naczynie do podgrzewanego stolika (urządzenie Peltiera) pod mikroskopem i rozpocznij obrazowanie za pomocą mikroskopu konfokalnego lub TIRF.</li>
	<li>Przenieś szkiełka nakrywkowe T = 0 punktów czasowych do naczynia z RT 4% paraformaldehydu / 4% sacharozy na 20 minut, kontynuując z innymi szkiełkami nakrywkowymi do kroku 2.9.</li>
	<li>W przypadku innych punktów czasowych należy zastąpić HBS kondycjonowaną pożywką o temperaturze 37 °C (zarezerwowaną w kroku 2.4) i wrócić do inkubatora w celu endocytozy w temperaturze 37 °C. Uwaga: sugerowane dodatkowe punkty czasowe T = 15, 30 i 60.</li>
	<li>W odpowiednim czasie wyjmij naczynia z inkubatora, umyj je szybko dwukrotnie 2 ml RT DPBS (DPBS bez wapnia, magnezu), a następnie dodaj 4% paraformaldehydu/4% sacharozy na 20 minut.</li>
	<li>Po 20 minutach utrwalenia usunąć 4% paraformaldehydu / 4% sacharozy do pojemnika na odpady i umyć naczynia dwukrotnie 2 ml RT DPBS.</li>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez 10 minut w roztworze blokowym immunofluorescencji (roztwór blokowy = 5% surowicy końskiej, 0,5% BSA w DPBS) zawierającym 0,2% Triton X-100 w celu przenikania neuronów i umożliwienia barwienia immunologicznego anty-GFP wewnątrzkomórkowej puli receptorów i / lub znakowania innych białek będących przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Usunąć blok + 0,2% Triton X-100 i inkubować szkiełka nakrywkowe w roztworze bloku immunofluorescencyjnego bez Triton X-100 przez 20-30 minut.</li>
	<li>Przeprowadzić inkubację preparatów nakrywkowych z przeciwciałami pierwotnymi w bloku przez kilka godzin w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C. Uwaga: inkubacja szkiełek nakrywkowych z pierwotnymi w temperaturze 4 °C O/N rutynowo daje lepsze wyniki immunofluorescencji.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe myć 3x za pomocą DPBS (5 minut na każdy etap mycia).</li>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe z przeciwciałami drugorzędowymi w roztworze blokowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe myć 3x za pomocą DPBS (5 minut na każdy etap mycia).</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe, traktując je indywidualnie: usuń nadmiar płynu z tyłu szkiełka nakrywkowego za pomocą chusteczki laboratoryjnej, a następnie odwróć szkiełko nakrywkowe na 4 μl podłoża mocującego na szkiełku podstawowym.</li>
	<li>Pozostawić szkiełka do wyschnięcia pod przykryciem RT przez 30 minut, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do wykonania mikroskopii.</li>
	<li>Akwizycja obrazu i analiza eksperymentu za pomocą mikroskopii konfokalnej (ślepa na warunki eksperymentalne). Obiektyw zanurzeniowy 60X oil NA 1.49 z następującymi laserami: argon gazowy 488 nm, dioda 561, dioda 640.
	<ol>
		<li>Korzystając z tych samych ustawień akwizycji obrazu, uzyskaj obrazy pojedynczego przekroju Z z ciałem komórki neuronalnej i kilkoma procesami dendrytycznymi w ostrości.</li>
		<li>Określ ilościowo sygnał fluorescencyjny Alexa α-bungarotoksyny i barwienie immunologiczne GFP wzdłuż 20 μm 3-4 dendrytów proksymalnych na neuron, używając tego samego progu do analizy wszystkich danych dotyczących endocytozy.</li>
		<li>Analizuj dane z 10-12 neuronów dla każdego punktu czasowego, powtarzając eksperyment z kilkoma niezależnymi kulturami neuronalnymi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gephyrin+regulates+the+cell+surface+dynamics+of+synaptic+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).</li>
<li>Bogdanov, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+GABAA+receptors+are+directly+recruited+from+their+extrasynaptic+counterparts%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts.</a> EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).</li>
<li>Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mobility+of+functional+GABA%28A%29+receptors+at+inhibitory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses.</a> Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).</li>
<li>Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Cell+Surface+GABAB+Receptors+Using+an+%CE%B1-Bungarotoxin+Tag%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag.</a> J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).</li>
<li>Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-like+protein+Plic-1+enhances+the+membrane+insertion+of+GABAA+receptors+by+increasing+their+stability+within+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum.</a> J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).</li>
<li>Bannai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Tuning+of+Inhibitory+Neurotransmission+Based+on+GABAAR+Diffusion+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics.</a> Neuron. 62, 670-682 (2009).</li>
<li>Muir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+regulate+GABAA+receptor+lateral+mobility+and+clustering+at+inhibitory+synapses+through+serine+327+on+the+gamma2+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).</li>
<li>Katchalski-Katzir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+synthesis+of+peptides+that+bind+alpha-bungarotoxin+with+high+affinity+and+mimic+the+three-dimensional+structure+of+the+binding-site+of+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor.</a> Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).</li>
<li>Scherf, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beta+-hairpin+structure+in+a+13-mer+peptide+that+binds+alpha+-bungarotoxin+with+high+affinity+and+neutralizes+its+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).</li>
<li>Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+cell+surface+GABAB+receptors+using+an+alpha-bungarotoxin+tag%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag.</a> J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzodiazepine+treatment+induces+subtype-specific+changes+in+GABAA+receptor+trafficking+and+decreases+synaptic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).</li>
<li>Anderson, M. J., Cohen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+staining+of+acetylcholine+receptors+in+vertebrate+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle.</a> J. Physiol. 237, 385-400 (1974).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinkage+and+visualization+of+acetylcholine+receptors+on+myotubes+with+biotinylated+alpha-bungarotoxin+and+fluorescent+avidin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).</li>
<li>Axelrod, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+motion+of+fluorescently+labeled+acetylcholine+receptors+in+membranes+of+developing+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).</li>
<li>Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+receptor+trafficking+by+using+alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).</li>
<li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA+receptor+membrane+trafficking+regulates+spine+maturity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).</li>
<li>Hannan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAB+receptor+internalisation+is+regulated+by+the+R2+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit.</a> J. Biol. Chem. , (2011).</li>
<li>Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+phosphorylation+of+GABAA+receptors+regulates+receptor+insertion+and+tonic+current%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current.</a> EMBO. 31, 2937-2951 (2012).</li>
<li>Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+G-Protein+Coupling+in+an+mGluR6+Point+Mutant+Associated+with+Congenital+Stationary+Night+Blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness.</a> Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).</li>
<li>Terunuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+activation+of+NMDA+receptors+promotes+dephosphorylation+and+alters+postendocytic+sorting+of+GABAB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).</li>
<li>Goslin, K. G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+Nerve+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Culturing Nerve Cells.</a> , 2nd ed, MIT Press. (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane tutaj techniki stałe i żywe oparte na BBS mogą być używane do śledzenia transportu receptorów lub innych białek błony komórkowej w liniach komórkowych, neuronach i innych komórkach pierwotnych. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do badania insercji i usuwania błony kanałowej bramkowanych ligandem kanałów jonowych i GPCR oraz oceny zmian w transporcie spowodowanych obecnością agonistów receptorów i modulatorów. Kluczowe aspekty obejmują odpowiednią lokalizację znacznika w lokalizacji pozakomórkowej i prze...

Użycie fluorescencyjnie sprzężonej α-bungarotoksyny do badania lokalizacji i dynamiki receptora zostało zapoczątkowane w badaniach nikotynowego receptora acetylocholiny13-15, endogennego celu toksyny. Następnie, włączenie minimalnego peptydu wiążącego Bgt (BBS) wykorzystano do zbadania transportu zarówno pobudzających, jak i hamujących kanałów jonowych bramkowanych ligandem oraz receptorów sprzężonych z białkiem G2,10,16-21. Ta technika oparta na BBS zapewnia korzyści w porównaniu z innymi podejściami stosowanymi w badaniach nad transportem, takimi jak metody biotynylacji powierzchniowej, znakowanie przeciwciałami żywych komórek przeciwciałami przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym oraz odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP). Podczas biotynylacji powierzchni komórki wolne aminy są kowalencyjnie modyfikowane, co może wpływać na aktywność komórkową. Badania oparte na przeciwciałach były często utrudnione przez grupowanie lub ograniczanie antygenów powierzchniowych, co może zmienić zdarzenia związane z transportem. Ze względu na etap wybielania w badaniach FRAP, poważnym problemem jest uszkodzenie podstawowej struktury komórkowej. Dodatkową zaletą jest to, że konstrukty znakowane BBS mogą być również wykorzystywane do metodologii biochemicznych z bungarotoksyną sprzężoną z biotyną do oceny transportu receptorów. Technika ta jest łatwo stosowana do linii komórkowych i komórek pierwotnych. Do stosowania w komórkach, które wyrażają nikotynowe receptory acetylocholiny (nAChR), antagonista nAChR, tubokuraryna, musi być stosowany przez cały czas trwania protokołu, jak wskazano. Wykonanie prostego powierzchniowego znakowania Bgt (odpowiednik punktu czasowego T = 0 dla protokołu endocytozy) na nietransfekowanych komórkach przy braku tubokuraryny dostarczy dowodów na endogenny nAChR.
Ważnym czynnikiem przy użyciu tej techniki jest odpowiednie wprowadzenie BBS, tak aby był on obecny w miejscu pozakomórkowym, gdy interesujące białko jest dostarczane do błony plazmatycznej. Na przykład N-końcowe domeny podjednostek GABAAR znajdują się w świetle pęcherzyka podczas transportu i stają się zewnątrzkomórkowe po wprowadzeniu receptora do błony plazmatycznej, umożliwiając specyficzne znakowanie receptorów na powierzchni komórki i ocenę ich usunięcia z powierzchni komórki przez zdarzenia endocytarne. Wcześniej wykazaliśmy, że dodanie epitopów GFP, myc lub BBS do tej domeny podjednostek GABAAR jest funkcjonalnie ciche. Należy przeprowadzić standardowe kontrole, aby upewnić się, że znakowane białko ulega ekspresji na podobnych poziomach do nieznakowanego konstruktu, że jest odpowiednio zlokalizowane i że nie wpływa na funkcję receptora. Ta charakterystyka transfekowanych konstruktów pomoże również w rozwiązywaniu problemów związanych z nadekspresją.

<table><tbody><tr><td>Zestaw P3 Primary Cell 4D&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 sprzężone</td><td>sondy molekularne</td><td>B35450</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 sprzężone</td><td>sondy molekularne</td><td>B13422</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 sprzężone</td><td>sondy molekularne</td><td>B13423</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Chlorek tubokuraryny</td><td>Tocris</td><td>2820</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe&nbsp;</td><td>DAKO</td><td>cS703</td><td></td></tr><tr><td>DPBS bez wapnia, magnezu</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało gefiryny</td><td>Systemy synaptyczne</td><td>147 011</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Przeciwciało VIAAT/VGAT</td><td>Systemy synaptyczne</td><td>131 002</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>anty GFP</td><td>Life Technologies</td><td>A6455</td><td>1:2,000</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych ze szklanym dnem</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C - Mattek Naczynia</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe (okrągłe szkło nakrywkowe), Grubość #1, 12 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>640-0702</td><td></td></tr></tbody></table>

używanie znacznika miejsca wiązania α-bungarotoksyny do badania lokalizacji i transportu błony receptora gaba a

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Coraz bardziej oczywiste jest, że receptory neuroprzekaźników, w tym jonotropowe receptory GABA A (GABAAR), wykazują wysoce dynamiczny transport i mobilność powierzchni komórki1-7. Aby zbadać lokalizację powierzchni komórek receptorowych i endocytozę, opisana tutaj technika łączy zastosowanie fluorescencyjnej α-bungarotoksyny z komórkami eksprymującymi konstrukty zawierające miejsce wiązania α-bungarotoksyny (Bgt) (BBS). BBS (WRYYESSLEPYPD) opiera się na α podjednostce mięśniowego nikotynowego receptora acetylocholiny, która wiąże Bgt z wysokim powinowactwem8,9. Włączenie miejsca BBS umożliwia lokalizację powierzchniową i pomiary insercji lub usuwania receptora za pomocą egzogennego fluorescencyjnego Bgt, jak opisano wcześniej w śledzeniu receptorów GABAA i metabotropowych GABAB2,10. Oprócz miejsca BBS umieściliśmy wrażliwy na pH GFP (pHGFP11) między aminokwasami 4 i 5 dojrzałej podjednostki GABAAR za pomocą standardowej biologii molekularnej i strategii klonowania PCR (patrz rysunek 1)12. BBS to 3' czułego na pH reportera GFP, oddzielonego 13-aminokwasowym łącznikiem alanina/prolina. W przypadku badań dotyczących transportu opisanych w tej publikacji, które opierają się na ustalonych próbkach, pHGFP służy jako reporter całkowitych poziomów znakowanych podjednostek białka GABAAR, umożliwiając normalizację populacji receptorów znakowanych Bgt do całkowitej populacji receptorów. Minimalizuje to zmienność sygnału barwienia Bgt między komórkami, wynikającą z wyższej lub niższej wyjściowej ekspresji znakowanych podjednostek GABAAR. Co więcej, znacznik pHGFP umożliwia łatwą identyfikację komórek wykazujących ekspresję konstruktu do eksperymentów obrazowania na żywo lub w utrwalonym obrazowaniu.

Charakterystyka konstruktu z tagiem BBS obejmuje istotne kontrole, takie jak ustalenie, czy ekspresowane białko prawidłowo się składa (szczególnie w przypadku receptorów składających się z wielu podjednostek), czy jest transportowane na powierzchnię komórki i czy lokalizuje się w odpowiednim miejscu. Synapsy hamujące składają się z powierzchniowych skupisk receptora GABA A, które kolokalizują z hamującym białkiem rusztowaniowym gefyryną i są przylegałe do presynaptycznych zakończeń hamujących, identyfikowanych za pomocą ...

Tutaj demonstrujemy użycie fluorescencyjnego barwnika Alexa sprzężonego z α-bungarotoksyną do pomiaru lokalizacji powierzchni receptora GABA A i endocytozy w neuronach hipokampa. Dzięki zastosowaniu konstruktów z krótkim znacznikiem zewnątrzkomórkowym, który wiąże α-bungarotoksynę, można uzyskać analizę transportu endocytarnego białek błony komórkowej.

Używanie znacznika miejsca wiązania α-bungarotoksyny do badania lokalizacji i transportu błony receptora GABA A

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar lokalizacji powierzchniowej oraz endocytozy receptorów gabaa w neuronach hipokampa. Cel ten osiąga się poprzez uprzednią transfekcję neuronów hipokampa podjednostką receptora gabaa z etykietą, a następnie umożliwienie hodowlanym neuronom rozwoju w inkubatorze. Drugim krokiem jest znakowanie powierzchniowych receptorów gabaa za pomocą toksyny alpha bungalow sprzężonej z fluorescencyjnym barwnikiem Alexa.Następnie neurony inkubuje się przez różne odstępy czasu, aby umożliwić endocytozę znakowanych receptorów. Ostatnim krokiem jest utrwalenie preparatów w odpowiednich punktach czasowych i przeprowadzenie barwienia immunocytochemicznego z użyciem przeciwciał anty-GFP w celu zaobserwowania całkowitej puli znakowanych receptorów. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię konfokalną do wykazania zmian w lokalizacji powierzchniowej oraz endocytozie znakowanych receptorów gabaa z zastosowaniem metod obrazowania utrwalonych tkanek lub obrazowania na żywo.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu transportu receptorów, takie jak wpływ wiązania ligandu na tempo endocytozy i wbudowywania receptorów oraz to, czy różne ligandy i

using-an-bungarotoxin-binding-site-tag-to-study-gaba-receptor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Stosowanie znacznika miejsca wiązania α-bungarotoksyny do badania lokalizacji i transportu receptorów GABA A w błonie

Poprzez znakowanie domen pozakomórkowych receptorów błonowych za pomocą superecliptic pHluorin oraz obrazowanie tych receptorów fuzyjnych w hodowlanych neuronach mysich, możemy bezpośrednio wizualizować pojedyncze zdarzenia wbudowywania pęcherzyków z receptorami w błonę plazmatyczną. Technika ta będzie miała kluczowe znaczenie w wyjaśnianiu molekularnych mechanizmów sterujących wbudowywaniem receptorów w błonę plazmatyczną.

Obrazowanie wbudowywania receptorów znakowanych pHluoriną w błonę plazmatyczną w pierwotnych kulturach neuronów mysich

Ten film demonstruje podejście oparte na podawaniu przeciwciał do badania transportu receptorów glutaminianu w pierwotnych kulturach neuronów hipokampa. Takie podejście pozwala na obserwację populacji receptorów zarówno w plazmie, jak i błonach wewnętrznych. Dyskryminację między tymi podzbiorami uzyskuje się poprzez znakowanie receptorów przed i po przepuszczalności błony, przy użyciu tego samego przeciwciała pierwszorzędowego, ale przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z różnymi fluoroforami.

Technika in vitro do badania transportu receptorów glutaminianu w neuronach hipokampa

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Metoda postembed immunogold jest jednym z najskuteczniejszych sposobów dostarczania wysokorozdzielczych analiz subkomórkowej lokalizacji określonych molekuł. Tutaj opisujemy protokół ilościowej analizy receptorów glutaminianu w synapsach wstęgowych siatkówki.

Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki

Konstrukt kodujący TMEM184A ze znacznikiem GFP na końcu karboksylowym, przeznaczony do ekspresji eukariotycznej, został wykorzystany w testach mających na celu potwierdzenie identyfikacji TMEM184A jako receptora heparyny w komórkach naczyniowych.

Wykorzystanie konstruktu TMEM184A znakowanego GFP w celu potwierdzenia tożsamości receptora heparyny

Tutaj prezentujemy protokoły odkrywania związków aktywnych w receptorach GABAA, od wiązania po fizjologię i farmakologię.

Metody odkrywania nowych związków modulujących neuroprzekaźnictwo receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu A

Celem tego protokołu jest ułatwienie badania receptorów NMDA (NMDAR) na większą skalę i umożliwienie badania modulacyjnych efektów małych cząsteczek i ich zastosowań terapeutycznych.

Wysokoprzepustowy test strumienia wapnia do badania receptorów NMDA z wrażliwością na glicynę/D-serynę i glutaminian

Pobudliwość neuronów może być modulowana poprzez dynamiczny proces endo- i egzocytozy pobudzających jonotropowych receptorów glutaminianu. Opisany tutaj jest dostępny test o wysokiej zawartości do ilościowego określania puli populacji receptorów powierzchniowych i wewnętrznych.

Test o wysokiej zawartości do monitorowania transportu receptora AMPA

Ten artykuł przedstawia metodę badania transportu receptora glutaminianu (GluR) w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa. Wykorzystując podejście oparte na podawaniu przeciwciał do znakowania endogennych lub nadmiernie eksprymowanych receptorów w połączeniu z podejściami farmakologicznymi, metoda ta pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych regulujących ekspresję powierzchniową GluR poprzez modulację procesów internalizacji lub recyklingu.

Podejście do karmienia przeciwciałami w celu zbadania transportu receptora glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa

Interakcje GPCR-β-aresztin to nowa dziedzina w odkrywaniu leków GPCR. Dokładne, precyzyjne i łatwe do skonfigurowania metody są niezbędne do monitorowania takich interakcji w żywych systemach. Pokazujemy test komplementacji strukturalnej do monitorowania interakcji GPCR-β-arrestin w żywych komórkach w czasie rzeczywistym i można go rozszerzyć na dowolny GPCR.

Monitorowanie interakcji GPCR-β-arrestin1/2 w żywych systemach w czasie rzeczywistym w celu przyspieszenia odkrywania leków

Protokół ten opisuje ekspresję i ilościową liczbę podjednostek receptorów acetylocholinowych neuronów za pomocą linii komórkowej Neuro-2a ssaków. Znaczniki fluorescencyjne wrażliwe na pH oraz mikroskopia konfokalna umożliwiają precyzyjną ocenę lokalizacji receptorów w błonie plazmatycznej w porównaniu do tych wyrażanych w neutralnych pH-przedziałach wewnątrzkomórkowych, ułatwiając badania transportu nAChR i modulacji farmakologicznej.

Lokalizacja błony plazmatycznej i wewnątrzkomórkowych receptorów nikotynowej acetylocholiny za pomocą obrazowania ilościowego w komórkach ssaków

Poznaj metodę oznaczania receptorów GABA A na powierzchni neuronów hipokampalnych za pomocą α-bungarotoksyny sprzężonej z barwnikiem Alexa. Technika ta umożliwia analizę endocytozy i dynamiki receptorów.

Używanie znacznika miejsca wiązania α-bungarotoksyny do badania lokalizacji i transportu błony receptora GABA A

Przeglądaj więcej filmów