Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości
January 2nd, 2014
Dołączanie wirionów do powierzchni jest wymogiem do obrazowania pojedynczego wirionu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości lub mikroskopii sił atomowych (AFM). W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania próbki do kontrolowanej adhezji wirionów do powierzchni szklanych, odpowiednią do stosowania w obrazowaniu AFM i fluorescencji o wysokiej rozdzielczości.
Ta procedura przygotowuje szklane szkiełka nakrywkowe z wirusami do stosowania w mikroskopii sił atomowych i mikroskopii superrozdzielczej, takich jak fluorescencyjna mikroskopia lokalizacyjna aktywowana światłem. Najpierw oczyść szklane podłoże, pokryj szkło cienką warstwą częściowo biotynylowanego glikolu polietylenowego szczepionego poli L lizyną. Następnie potraktuj powierzchnię avadonem, aby zwiększyć powinowactwo wiązania filmu Biotynylowanego.
Teraz potraktuj powierzchnię biotynylowanymi przeciwciałami specyficznymi dla wirusa, który Cię interesuje. Następnie potraktuj przygotowaną powierzchnię przeciwciała interesującym Cię wirusem. W przeciwieństwie do powlekania wirowego, technika ta ma tę zaletę, że warianty są równomiernie rozprowadzane po powierzchni.
W celu optymalizacji mikroskopii należy umieścić szkiełka nakrywkowe pionowo w teflonowym stojaku na szkiełka nakrywkowe o odpowiednim rozmiarze i zanurzyć je w zlewce wypełnionej przefiltrowanym sonikatem alkoholu etylowego na 30 minut. Następnie dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe ultra czystą wodą. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe w oddzielnym, czystym stojaku teflonowym i zlewce wypełnionej jednym molowym sonikatynem wodorotlenku sodu na 30 minut i dokładnie spłucz ultraczystą wodą.
Teraz wysusz wypłukane szkiełka nakrywkowe pod strumieniem azotu i przenieś je na czysty, suchy stojak teflonowy. Sprawdzić, czy każde szkiełko nakrywkowe jest czyste z widocznych filmów lub cząstek. Natychmiast po wysuszeniu w strumieniu azotu w poziomie umieścić jedno szkiełko nakrywkowe na sterylnej szalce Petriego na środku pipety szkiełka nakrywkowego odpowiednią ilość biotynylowanego glikolu polietylenowego szczepionego polilizyną w PBS.
Umieść kolejne czyste szkiełko nakrywkowe na wierzchu płynu metodą kanapkową. Upewnij się, że objętość między aktywnymi powierzchniami dwóch szkiełek nakrywkowych jest całkowicie wypełniona płynem. Przykryj szalkę Petriego i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 45 do 60 minut.
Następnie podnieś kanapkę pęsetą, nie wyciskając nadmiaru płynu. Teraz kciukiem i palcem wskazującym ściśnij kanapkę lekko i poziomo. Przesuń szkiełka okładki w przeciwnych kierunkach i rozdziel je, nie dotykając aktywnych powierzchni.
Spłucz obie aktywne twarze 25 mililitrami ultra czystej wody. Teraz wysuszyć szkiełka nakrywkowe strumieniem azotu i zwrócić uwagę, które powierzchnie szkiełek nakrywkowych są aktywne na sterylnej szalce Petriego. Umieścić szkiełko nakrywkowe poddane działaniu aktywnej strony do góry, pipetą odpowiednią ilość rozmrożonego roztworu dowodowego na środku aktywnej powierzchni
.Umieść kolejne szkiełko nakrywkowe aktywną stroną do dołu, aby ułożyć płyn w warstwie, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 25 do 30 minut. Następnie oddziel dwa szkiełka nakrywkowe, jak pokazano wcześniej. Uważaj, aby nie dotykać aktywnych twarzy.
Teraz spłucz obie aktywne twarze 25 mililitrami ultra czystej wody, a następnie osusz szkiełka nakrywkowe strumieniem azotu. Ważne jest, aby pamiętać, które powierzchnie szkiełek nakrywkowych są aktywne. Na przyszłość należy natychmiast umieścić na sterylnej szalce Petriego aktywną warstwę nakrywkową z aktywną stroną zadrukowaną do góry, a następnie odpipetować odpowiednią ilość rozmrożonego biotynylowanego przeciwciała na środku aktywnej powierzchni
.Umieść kolejne szkiełko nakrywkowe aktywną stroną skierowaną w dół na wierzchu płynu metodą kanapkową. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 do 60 minut Po oddzieleniu dwóch szkiełek nakrywkowych spłucz obie aktywne twarze 25 mililitrami PBS. Następnie umieścić na sterylnej szalce Petriego szkiełko nakrywkowe nasączone przeciwciałami aktywną stroną zadrukowaną do góry i odpipetować odpowiednią ilość wirusa na środek aktywnej powierzchni
.Teraz ułóż kanapkę z drugą aktywną osłoną, wsuń, przykryj i inkubuj. Teraz oddziel dwa szkiełka nakrywkowe. Przepłucz obie aktywne twarze 25 mililitrami PBS i przenieś je do teflonowego stojaka i zlewki wypełnionej PBS.
Przygotowane próbki należy natychmiast zużyć lub przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do trzech dni. Tu. Dziki wariant wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej zakotwiczono na powierzchni szkła i przeanalizowano za pomocą mikroskopii sił atomowych. Szerokość i długość wirionu wynoszą 80 nanometrów na 180 nanometrów, co wykazuje minimalne zniekształcenia w stosunku do oryginalnego rozmiaru wirionu.
W tym eksperymencie pojedynczy wirion został zobrazowany za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii lokalizacji aktywacji fotoaktywnej. Za pomocą przeciwciał VSVG znakowanych Alexis 6 47. Niebieska izopowierzchnia pokazuje odzyskaną powierzchnię wirionu za pomocą mikroskopii FOM.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować szklane szkiełka nakrywkowe z wirusami do użycia z mikroskopią sił atomowych lub mikroskopią super rozdzielczości. Ważne jest, aby przez cały czas pamiętać, na której stronie szkiełka nakrywkowego znajduje się aktywna substancja chemiczna.
Przegląd
W tym artykule przedstawiono metodę przygotowywania szkiełek nakrywkowych z wirusami do stosowania w mikroskopii sił atomowych (AFM) i superrozdzielczej mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta zapewnia kontrolowane przyczepność wirionów, ułatwiając obrazowanie struktur wirusowych o wysokiej rozdzielczości.
Kluczowe Elementy Badania
Dział Nauk Ściagłych
- Neurobiologia
- Biofizyka
- Techniki Mikroskopowe
Wprowadzenie
- Przyczepność wirionów jest niezbędna do technik obrazowania, takich jak AFM i superrozdzielcza mikroskopia.
- Kontrolowana przyczepność poprawia jakość wyników obrazowania.
- Poprzednie metody mogą nie zapewniać jednolitego rozkładu wirionów.
- Niniejsze badanie wprowadza nową metodę przygotowania próbek.
Cel Badania
- Opracowanie niezawodnej metody przyczepiania wirionów do powierzchni szklanych.
- Poprawa jakości obrazowania w AFM i superrozdzielczej mikroskopii.
- Wykażanie skuteczności metody przy użyciu wirusa jodebki ustnej (vesicular stomatitis virus).
Wykorzystane Metody
- Czyszczenie i powlekanie szkiełek nakrywkowych biotryną polietylenglikolu.
- Obróbka powierzchni awidyną i biotypowymi przeciwciałami specyficznymi dla wirusa.
- "Kanapkowe" łączenie szkiełek w celu ułatwienia jednolitego rozkładu cieczy.
- Wykorzystanie technik sonikacji i płukania w celu zapewnienia czystości.
Główne Wyniki
- Wiriony zostały pomyślnie przymocowane do powierzchni szklanych do obrazowania.
- Pojedyncze wiriony zostały zaobserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym z minimalnym zniekształceniem.
- Metoda wykazała skuteczne rozprowadzenie wirionów na powierzchni.
- Wyniki potwierdziły wykonalność metody przygotowania do obrazowania o wysokiej rozdzielczości.
Wnioski
- Opracowana metoda zapewnia niezawodny sposób przyczepiania wirionów.
- Technika ta poprawia jakość obrazowania w zastosowaniach mikroskopowych.
- Przyszłe badania mogą bazować na tej metodzie w różnych zastosowaniach obrazowania wirusów.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
This method enables controlled, homogeneous virion adhesion to glass surfaces, supporting high-resolution imaging for mechanistic studies of viral structure and host interactions. By ensuring reproducible sample preparation, it reduces variability in downstream biophysical assays, improving data reliability for target validation and lead optimization efforts. The technique is applicable to enveloped viruses relevant to antiviral discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of virion morphology and surface protein distribution to inform target accessibility and epitope exposure.
- Operational Value: Provides a standardized platform for comparing wild-type and mutant virions under identical imaging conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates quantitative assessment of antibody or ligand binding to immobilized virions via fluorescence readouts.
- Operational Value: Supports assay uniformity by minimizing virion clustering and orientation bias across the imaging surface.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Allows correlation of structural changes in virions with functional phenotypes such as infectivity or neutralization resistance.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of viral variants in preclinical models using consistent sample preparation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where structural and biophysical characterization informs target selection and lead compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding viral entry mechanisms and antibody-mediated neutralization through direct imaging.
- Screening: Enables reproducible preparation of virion samples for high-content imaging-based screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative morphometric data (e.g., virion dimensions) and fluorescence intensity measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro virion behavior to preclinical efficacy by preserving native structural features during imaging.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable surface chemistry platform applicable to multiple viral targets across discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in structural biology assays by minimizing preparation-induced artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility across laboratories and imaging modalities through standardized surface functionalization.
- Strategic Value: Reduces failed imaging runs due to poor virion adhesion, conserving instrument time and sample resources.
- Portfolio Impact: Enables faster go/no-go decisions in antiviral projects by providing early structural liability assessment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and fluorescence microscopy techniques.
- Depends on access to AFM and super-resolution imaging infrastructure.
- Necessitates strict adherence to active face orientation during multi-step assembly.
- Adaptation to non-enveloped viruses may require modification of anchoring chemistry.
- Storage limitations (up to 3 days at 4°C) necessitate same-week experimental planning.
