Name: Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Poznaj metodę przygotowania szkiełek do mikroskopii sił atomowych i fluorescencyjnej w superrozdzielczości. Technika zapewnia kontrolowane przyleganie wirionów, umożliwiając wysokiej jakości obrazowanie struktur wirusowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy doktorowi Tillowi Böckingowi za oryginalny protokół przygotowania pojedynczej cząsteczki. 
Prace te były wspierane przez grant NSF 1121972(SS).

<ol><li>Pang, H. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virion+stiffness+regulates+immature+HIV-1+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry.</a> Retrovirology. 10, 4(2013).</li>
<li>Kol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Stiffness+Switch+in+Human+Immunodeficiency+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus.</a> Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).</li>
<li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+tip%E2%80%93sample+forces+in+jumping+mode+atomic+force+microscopy+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Minimizing tip–sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid.</a> Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).</li>
<li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamics+of+human+adenovirus+disassembly+induced+by+mechanical+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li>
<li>Hernando-Pérez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+Virology%3A+Direct+Measurement+of+Phage%5BTitle%5D)+AND+%22phi29+Stiffness+Provides+Evidence+of+Internal+Pressure+%28Small+15%2F2012%29.+Small%22%5BJournal%5D)">Physical Virology: Direct Measurement of Phage.</a> phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).</li>
<li>Carrasco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-mediated+anisotropic+mechanical+reinforcement+of+a+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+Grafted+to+Silicon+Surfaces%3A+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Visnapuu, M. -L., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+surfaces+in+single-molecule+bioscience%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">The importance of surfaces in single-molecule bioscience.</a> Mol. Biosyst. 4, 394-403 (2008).</li>
<li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+binding+experiments+on+long+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Single-molecule binding experiments on long time scales.</a> Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).</li>
<li>van Oijen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Kinetics+of+%CE%BB+Exonuclease+Reveal+Base+Dependence+and+Dynamic+Disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Kinetics of λ Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li>
<li>Böcking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+a+molecular+disassemblase+reveals+the+mechanism+of+Hsc70-driven+clathrin+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).</li>
<li>Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+First+Five+Seconds+in+the+Life+of+a+Clathrin-Coated+Pit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit.</a> Cell. 150, 495-507 (2012).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%2C+Spectrin%2C+and+Associated+Proteins+Form+a+Periodic+Cytoskeletal+Structure+in+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons.</a> Science. 339, 452-456 (2013).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hodges, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+packaging+of+polymerases+within+vesicular+stomatitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).</li>
<li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych w niniejszej pracy.

Obrazowanie pojedynczego wirionu za pomocą AFM i obrazowanie fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości mogą być stosowane jako alternatywna metodologia dla tomografii krioEM. Każda z tych metodologii ma swoje mocne strony. Na przykład AFM można wykonać na wirionach WT bez konieczności znakowania próbki lub wewnętrznych białek wirusowych. Lokalizacja struktur wirusowych jest zdekonwoluowana na podstawie ich wkładu w elastyczne właściwości wirionu.
Obrazowanie w superrozdzielczości pojedynczego wirionu w połączeniu z nowo opracowanymi metodami genetyki odwrotnej wirusa staje się potężną techniką lokalizacji białek wirusowych o niskiej liczbie kopii20. Rekombinowane wirusy z zastąpieniem ich białek białkami połączonymi z białkami fluorescencyjnymi mogą być wytwarzane i oczyszczane przy użyciu tych odwrotnych metod genetycznych. Chociaż obrazowanie w super rozdzielczości ma specyficzność częściowo ze względu na znakowanie genetyczne, wymaga użycia zmutowanych wirusów.
AFM i obrazowanie superrozdzielcze to uzupełniające się metody, które wykorzystują bardzo podobne preparaty próbek. Metody opisane w tym artykule, które zostały przyjęte z wcześniejszych testów obrazowania pojedynczych cząsteczek, pozwalają na zakotwiczenie pojedynczych wirionów przy niewielkim wpływie na topologię wirionów.

Niespecyficzne interakcje oparte na ładunku są rutynowo używane do adhezji wirionów w mikroskopii sił atomowych1,2. Techniki te szczególnie dobrze sprawdzają się, gdy są stosowane na wirionach bezotoczkowych z bardzo sztywnymi kapsydami3-6. Chociaż techniki te są bardzo skuteczne w unieruchamianiu próbki, nie zapobiegają niespecyficznemu wiązaniu białek z powierzchnią. Niespecyficzne wiązanie może stwarzać problem podczas próby obrazowania wirionów za pomocą AFM i technik fluorescencji o wysokiej rozdzielczości, które wymagają inkubacji próbki z różnymi przeciwciałami. W tym miejscu przedstawiamy metodę przygotowania próbki do specyficznego unieruchomienia wirionów.
Poli(glikol etylenowy) (PEG) szczepiony do poli(L-lizyny) (PLL) i adsorbowany na powierzchni szkła stanowi znaczącą blokadę dla oddziaływań elektrostatycznych białek ze szkłem7. Testy pojedynczych cząsteczek, które wymagają immobilizacji pojedynczych cząsteczek na powierzchniach szklanych, wykorzystały tę właściwość i wykorzystały ją do stworzenia specyficznej techniki immobilizacji pojedynczych cząsteczek opartej na PEG8-10. Preparat ten stosowano również do unieruchamiania klatek klatryny na powierzchni szkła11, a także do tworzenia jednorodnej powłoki fibronektyny w celu kontroli adhezji komórek 12.
Przyjęliśmy metodę przygotowania próbki opartą na adsorpcji PLL-g-PEG do powierzchni szklanych z metodologii obrazowania pojedynczych cząsteczek i zastosowaliśmy ją do obrazowania pojedynczych wirionów wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV). Te pojedyncze wiriony zobrazowano za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM). Podobne eksperymenty przeprowadzono również na funkcjonalizowanych koralikach jako kontroli. Wiriony zostały również zobrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości, w której przeciwciało VSV-G znakowane Alexa 647 zostało użyte do stworzenia obrazu otoczki pojedynczych wirionów. Obrazowanie fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości wykorzystuje lokalizację pojedynczych cząsteczek w celu uzyskania obrazu13-15. Obrazowanie dwupłaszczyznowe fPALM umożliwia lokalizację pojedynczych cząsteczek o długości fali 20 nm w płaszczyźnie i rozdzielczości 50 nm wzdłuż osi optycznej15,16. Ta dwupłaszczyznowa technika została wykorzystana do zobrazowania obrazów fluorescencyjnych o wysokiej rozdzielczości obecnych w tym badaniu. Alternatywną techniką, która daje podobne wyniki, jest STORM13,17,18.
Zarówno AFM, jak i superrozdzielcze obrazy fluorescencyjne VSV zakotwiczone w szkle za pomocą procedur opisanych w tym artykule, wykazały specyficzne wiązanie wirionów ze szkłem przy minimalnych oddziaływaniach niespecyficznych19. W tym miejscu przedstawiamy protokoły przygotowania próbek do eksperymentów AFM i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości. W skrócie: Szkiełka nakrywkowe z czystego szkła są funkcjonalizowane przez adsorpcję mieszaniny PLL-g-PEG i PLL-g-PEG-biotyny. Typowe jest, że ta cienka warstwa jest zaprojektowana tak, aby zapewnić od 15 do 25% funkcjonalizowanej biotyny na powlekanej powierzchni. Szkiełka nakrywkowe są następnie inkubowane z tetrameryczną awidyną. Biotynylowane przeciwciało wirusowe jest następnie wykorzystywane do stworzenia unikalnego miejsca wiązania wirionów. Wiązanie przeciwciała może odbywać się na dwa sposoby.
Pierwsza metoda jest zoptymalizowana pod kątem AFM, jednak nadal nadaje się do obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości. W tej metodzie powierzchnia pokryta awidyną jest traktowana biotynylowanym przeciwciałem przed adhezją wirusa. Unieruchomione wiriony są traktowane przeciwciałem znakowanym Alexa 647, aby pokryć otoczkę i umożliwić obrazowanie fluorescencyjne wirionów w superrozdzielczości.
Drugą metodą jest zaatakowanie wirusa w roztworze za pomocą przeciwciała znakowanego biotynylem i przeciwciałem znakowanym Alexa 647 przed przyklejeniem wirusów do powierzchni leczonej awidyną; ta metoda jest zoptymalizowana pod kątem eksperymentów z obrazowaniem fluorescencyjnym w superrozdzielczości, w których ważne jest odzyskanie otoczki wirusa. Zaletą tej metody jest to, że umożliwia równomierne pokrycie przeciwciał na powierzchni wirusa. Biotynylowane przeciwciało można mieszać z przeciwciałami wirusowymi znakowanymi Alexa 647 w proporcjach, które pozwalają na wystarczającą adsorpcję wirusa na powierzchni poddanej działaniu awidyny, przy jednoczesnym utrzymaniu wysokiego stężenia znacznika fluorescencyjnego na zewnątrz otoczki wirusa. Te przeciwciała wirusowe znakowane Alexa 647 nie są biotynylowane, a ich nadmiar można wypłukać w celu zmniejszenia hałasu tła.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane (fPALM)</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>72225-01</td><td>Szkiełka nakrywkowe 25 mm</td></tr><tr><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotyna (20%)&nbsp;</td><td>SuSoS-Stock</td><td></td><td>: 0,5 mg/ml w</td></tr><tr><td>białku wiążącym biotynę PBS NeutrAvidin</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td>Zapas: 0,25 mg/ml w PBS</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 kozia anty-królicza IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>1:200 w 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10% glikol, bufor pH 7,2</td></tr><tr><td>&alfa;-VSV-G&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>ab34774</td><td>1:200 in 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10% glikol, bufor pH 7,2</td></tr><tr><td>Gluox</td><td>Sigma</td><td>G2133-250KU</td><td>Oksydaza glukozowa typu siedem od Aspergillius&nbsp;</td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma</td><td>C40-100mg</td><td>Katalaza z wątroby bydlęcej&nbsp;</td></tr><tr><td>MEA</td><td>Sigma</td><td>30070-10G</td><td>Cysteamina (</td></tr><tr><td>bufor</td><td></td><td></td> magazynowy MEA <td>50 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 10 mM NaCl + 10% glukozy</td></tr><tr><td>NTE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer, mini jednostka dializy</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>10 000 MW</td></tr><tr><td>Szkło pokrywowe mikroskopu: 35 KOŁO #1</td><td>Fisherbrand</td><td>35 KOŁO #1</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Unieruchomienie wirionów na powierzchniach szklanych jest krytycznym krokiem w obrazowaniu pojedynczego wirionu. W tym miejscu przedstawiamy technikę zaczerpniętą z testów obrazowania pojedynczych cząsteczek, która pozwala na swoistą adhezję pojedynczych wirionów do powierzchni szklanych. Preparat ten polega na zaszczepieniu powierzchni szkła mieszaniną PLL-g-PEG i PLL-g-PEG-Biotyny, dodaniu warstwy awidyny, a na końcu wytworzeniu kotwic wirionowych poprzez przyłączenie biotynylowanych przeciwciał specyficznych dla wirusa. Zastosowaliśmy tę technikę w wielu eksperymentach, w tym w mikroskopii sił atomowych (AFM) i obrazowaniu fluorescencyjnym w superrozdzielczości. Ta metoda przygotowania próbki powoduje kontrolne przyleganie wirionów do powierzchni.

Obrazowanie pojedynczych wirionów za pomocą AFM:
Opisany powyżej protokół przygotowania próbek został wykorzystany do zakotwiczenia wirionów typu dzikiego na powierzchni szkła. Wiriony VSV mają kształt pocisku, 180 nm długości i 80 nm średnicy. Ponieważ technikę tę można zastosować do wielu rodzajów wirionów, koncepcja ta została tutaj zademonstrowana również na biotynilowanych kuleczkach o średnicy 36 nm. Wyniki eksperymentów AFM przedstawiono na Rysunku 1. Należy zauważyć, że wiriony VSV mają niższy moduł Younga (100 MPa) w porównaniu do wirusów bezotoczkowych (GPa). Szczegółowe obrazy pojedynczego wirionu VSV uzyskano w trybie stukowym (tapping mode) w warunkach otoczenia przy użyciu sztywnej dźwigni. Celem było odkształcenie wirusa do momentu, w którym dodatkowa gęstość białek wewnątrz wirusa stanie się widoczna jako wybrzuszenie na obrazie AFM. Metoda ta jest stosowana do wykrywania dodatkowej gęstości białek wewnątrz jamie wirusa19.
Obrazowanie pojedynczych wirionów w superrozdzielczości:
Przeciwciała VSV-G znakowane Alexa 647 zostały użyte do pokrycia otoczki poszczególnych wirionów VSV w eksperymentach superrozdzielczych z zastosowaniem metody 5A. Aby zademonstrować gęstość wiązania oraz niskie wiązanie niespecyficzne, w rysunku 2A przedstawiono szeroki skan próbki. Rekonstrukcję otoczki wirusowej reprezentatywnego wirionu pokazano na rysunku 2B (niebieska izopowierzchnia).
<img alt="Wykresy 3D nanostruktury analizujące zmienność wysokości; oznaczone A, B, C; dane topograficzne." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1">
Rycina 1. Obrazowanie AFM kulek i VSV na funkcjonalizowanej powierzchni PEGG.Skan AFM kulek biotynilowanych o rozmiarze 36 nm (A, B) oraz wirionu VSV (C) zakotwiczonego do powierzchni za pomocą biotynilowanego przeciwciała VSVG. AFM wykonano w trybie skanowania topografii w powietrzu AC. Promień końcówki wynosi &lt;25 nm, a pomiary przeprowadzono przy modulacji siły i lekkim stukaniu (light tapping). Końcówka miała stałą siły 3 N/m i częstotliwość rezonansową 75 kHz z niepewnością 15 kHz. Podczas gdy kulki zachowały swoją wysokość podczas skanowania AFM, wirion VSV ma znacznie mniejszy moduł Younga i jest znacznie zdeformowany pod względem wysokości. Na tym obrazie wirion został zobrazowany specjalnie za pomocą sztywnego wspornika w trybie stukowym, co spowodowało niewielką sploty xy (wykorzystany do odróżnienia wierzchołka od tępego końca wirusa), a różnica wysokości między wierzchołkiem a tępym końcem wirusa służy do wykrycia dodatkowej gęstości białek na tępym końcu wirusa19.
<img alt="Analiza ultrastrukturalna: schemat cząsteczki wirusa, modele cząsteczek, skale mikroskopowe 5 μm, 100 nm." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Obrazowanie fluorescencyjne wirionów VSV na powierzchni funkcjonalizowanej PEGG. A) rekombinowane wiriony VSV unieruchomione na powierzchni PEGG przy użyciu biotynilowanego przeciwciała anty-VSVG, obrazowane w szerokim polu fluorescencji. B) Wysokorozdzielcza rekonstrukcja fluorescencyjna otoczki VSV przytwierdzonej do powierzchni PEGG poprzez biotynilowane przeciwciało anty-VSVG i znakowanej przeciwciałami anty-VSVG z użyciem Alexa 647 (do stworzenia tych obrazów zastosowano Metodę 5A). Niebieska powierzchnia stanowi projekcję izopowierzchni 2D. Po lewej stronie przedstawiono model wirusa w kształcie pocisku.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212">
	<colgroup>
		<col>
		<col>
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:119px;">Rozmiar szkiełka nakrywnego</td>
			<td style="width:93px;">ciecz</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40 mm</td>
			<td>65 µl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm</td>
			<td>50 µl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 mm</td>
			<td>36 µl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25 mm</td>
			<td>25 µl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 mm</td>
			<td>16 µl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Alikwoty cieczy w zależności od rozmiaru szkiełka nakrywki.

Dołączanie wirionów do powierzchni jest wymogiem do obrazowania pojedynczego wirionu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości lub mikroskopii sił atomowych (AFM). W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania próbki do kontrolowanej adhezji wirionów do powierzchni szklanych, odpowiednią do stosowania w obrazowaniu AFM i fluorescencji o wysokiej rozdzielczości.

Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Niniejsza procedura opisuje przygotowanie szkiełek podstawkowych z wirusami do zastosowania w mikroskopii sił atomowych oraz mikroskopii superrozdzielczej, takiej jak fluorescencyjna mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanej. W pierwszej kolejności należy oczyścić podłoże szklane, a następnie pokryć szkło cienką warstwą częściowo biotynilowanego glikolu polietylenowego szczepionego do poli-L-lizyny. Następnie powierzchnię należy potraktować awidyną w celu zwiększenia powinowactwa wiązania warstwy biotynilowanej.Następnie powierzchnię należy potraktować przeciwciałami biotynolowanymi, specyficznymi dla badanego wirusa. Potem przygotowaną powierzchnię z przeciwciałami należy poddać działaniu badanego wirusa. W przeciwieństwie do powlekania wirowego, technika ta daje zaletę jednorodnego rozmieszczenia wariantów na całej powierzchni.W celu optymalizacji mikroskopii, umieść szkiełka podstawowe pionowo w odpowiedniej rozmiarowo teflonowej kasecie do szkiełek, a następnie zanurz je w zlewce wypełnionej filtrowanym etanolem i poddaj sonikacji przez 30 minut. Następnie dokładnie wypłucz szkiełka wodą ultrapure. Kolejno umieść szkiełka w osobnej, czystej kasecie teflonowej i zlewce wypełnionej 1 M wodorotlenkiem sodu, sonikuj przez 30 minut i dokładnie wypłucz wodą ultrapure.Następnie osuszyć wypłukane szkiełka nakrywkowe strumieniem azotu i przenieść je na czystą, suchą statywę teflonową. Sprawdzić, czy każde szkiełko nakrywkowe jest wolne od widocznego filmu lub cząsteczek. Natychmiast po poziomym osuszeniu strumieniem azotu, umieścić jedno szkiełko nakrywkowe w sterylnym naczyniu Petriego, a na środek szkiełka nakrywkowego nanieść pipetą odpowiednią ilość biotynilowanej poli-L-lizyny szczepionej glikolem polietylenowym w PBS.Umieść drugie czyste szkiełko nakrywkowe na cieczy, stosując metodę kanapkową. Upewnij się, że przestrzeń między aktywnymi powierzchniami obu szkiełek nakrywkowych jest całkowicie wypełniona cieczą. Przykryj szalkę Petriego i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 45 do 60 minut.Następnie, za pomocą pęsety podnieś preparat typu sandwich, nie wyciskając nadmiaru cieczy. Teraz, używając kciuka i palca wskazującego, delikatnie ściśnij preparat w płaszczyźnie poziomej. Przesuń szkiełka podstawowe w przeciwnych kierunkach i rozdziel je, nie dotykając aktywnych powierzchni.Przepłucz obie aktywne powierzchnie 25 mililitrami ultraczystej wody. Następnie osusz szkiełka nakrywkowe strumieniem azotu i zanotuj, które powierzchnie szkiełek są aktywne, umieszczając je w sterylnym szalce Petriego. Połóż potraktowane szkiełko nakrywkowe aktywną powierzchnią do góry i nanieś pipetą odpowiednią ilość rozmrożonego roztworu dowodowego na środek aktywnej powierzchni.Umieść drugie szkiełko nakrywką stroną aktywną do dołu, aby zamknąć ciecz, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 25 do 30 minut. Następnie rozdziel dwa szkiełka nakrywki w sposób opisany wcześniej, dbając o to, aby nie dotykać stron aktywnych.Następnie opłucz obie aktywne strony 25 mililitrami ultraczystej wody, a potem osusz szkiełka podstawowe strumieniem azotu. Ważne jest, aby zapamiętać, które strony szkiełek są aktywne. W celu dalszego wykorzystania, natychmiast umieść aktywne szkiełko podstawowe stroną aktywną do góry w sterylnym naczyniu Petriego, a następnie pipetą nanieś odpowiednią ilość rozmrożonego biotynylowanego przeciwciała na środek aktywnej strony.Umieść drugie szkiełko nakrywkę aktywną stroną do dołu na cieczy, stosując metodę kanapkową. Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej od 45 do 60 minut. Po rozdzieleniu obu szkiełek nakrywczych wypłucz obie powierzchnie aktywne 25 mililitrami PBS. Następnie umieść szkiełko nakrywcze potraktowane przeciwciałami stroną aktywną do góry w sterylnym naczyniu Petriego i nanieś pipetą odpowiednią ilość wirusa na środek powierzchni aktywnej.Następnie przykryj całość drugą aktywną szkiełkiem nakrywką, dociśnij, przykryj i inkubuj. Teraz rozdziel oba szkiełka nakrywkowe. Przepłucz obie aktywne powierzchnie 25 mililitrami PBS i przenieś je na teflonowy statyw oraz do zlewki wypełnionej PBS.Przygotowane próbki należy wykorzystać niezwłocznie lub przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza przez maksymalnie trzy dni. Tutaj. Wiriony wirusa zapalenia pęcherzykowego jamy ustnej typu dzikiego zostały przytwierdzone do szklanej powierzchni i przeanalizowane za pomocą mikroskopii sił atomowych. Szerokość i długość wirionu wynoszą 80 nanometrów na 180 nanometrów, co wskazuje na minimalne odkształcenia w stosunku do pierwotnego rozmiaru wirionu.W tym doświadczeniu pojedynczy wirion obrazowano za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii lokalizacji z fotoaktywacją. Wykorzystano przeciwciała anty-VSVG znakowane barwnikiem Alexa Fluor 470. Niebieska izopowierzchnia przedstawia odtworzoną powierzchnię wirionu z obrazowania mikroskopowego FOM.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania szkiełek nakrywkowych z wirusami do zastosowania w mikroskopii sił atomowych lub mikroskopii superrozdzielczej. Należy przez cały czas pamiętać, która strona szkiełka nakrywkowego posiada aktywną warstwę chemiczną.

sample-preparation-for-single-virion-atomic-force-microscopy-super

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczych wirionów i fluorescencji nadrozdzielczej

Genomika pojedynczych wirusów (SVG) to metoda izolacji i amplifikacji genomów pojedynczych wirionów. Zawiesiny wirusowe mieszaniny różnych szczepów są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej na preparat mikroskopowy z osobnymi studzienkami zawierającymi agarozę, co pozwala na przechwycenie wirionu i ograniczenie fragmentacji genomu podczas dalszej obróbki. Amplifikacja całego genomu jest przeprowadzana za pomocą wielokrotnej amplifikacji z wypieraniem (MDA), w wyniku czego otrzymuje się...

Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem metody „Single Virus Genomics”

Źródło: Zeigler Allen, L., et al. Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'. J. Vis. Exp. (2013).Niniejszy film demonstruje, w jaki sposób cytometria przepływowa umożliwia izolację pojedynczych wirusów zawierających genom z populacji mieszanych dzięki detekcji opartej na fluorescencji i precyzyjnemu sortowaniu cząstek, a następnie ich zatopienie w agarozie w celu późniejszej charakterystyki genomowej.

Sortowanie pojedynczych cząstek wirusowych metodą fluorescencyjną do analizy genomowej

Ten manuskrypt wykorzystuje oparty na Fidżi pakiet oprogramowania open-source VirusMapper do zastosowania analizy pojedynczej cząstki do obrazów mikroskopowych o wysokiej rozdzielczości w celu wygenerowania precyzyjnych modeli struktury w nanoskali.

Analiza pojedynczych cząstek typu open source do mikroskopii superrozdzielczej za pomocą VirusMapper

Ten protokół opisuje niezbędne kroki do uzyskania wyników lokalizacji białek subkomórkowych na siatkówce danio pręgowanego poprzez korelację obrazów z superrozdzielczej mikroskopii świetlnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna superrozdzielczość i mikroskopia elektronowa w celu ustalenia lokalizacji białek w siatkówce danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół łączenia dwóch technik przetwarzania próbek, zamrażania wysokociśnieniowego i przetwarzania próbek wspomaganego mikrofalami, a następnie minimalnego zatapiania żywicy w celu pozyskiwania danych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z skupioną wiązką jonów (FIB-SEM). Wykazano to przy użyciu próbki nerwu piszczelowego myszy i Caenorhabditis elegans.

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

Tutaj opisujemy metodę mikroaspiracji pojedynczych komórek do separacji zainfekowanych ameb. W celu oddzielenia subpopulacji wirusów w Vermamoeba vermiformis zakażonych faustowirusami i nieznanymi gigantycznymi wirusami, opracowaliśmy protokół opisany poniżej i wykazaliśmy jego zdolność do oddzielania dwóch nowych wirusów gigantycznych o niskiej liczebności.

Mikroaspiracja pojedynczych komórek jako alternatywna strategia dla sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu separacji gigantycznych mieszanin wirusów

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Tutaj opisane są protokoły przygotowania zestawów wirusów odpowiednich do analizy ciekłego EM i krio-EM w nanoskali przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Postęp w obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości zespołów wirusów w cieczach i lodzie

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Poznaj metodę przygotowania szkiełek do mikroskopii sił atomowych i fluorescencyjnej w superrozdzielczości. Technika zapewnia kontrolowane przyleganie wirionów, umożliwiając wysokiej jakości obrazowanie struktur wirusowych.

Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów