Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości
2 stycznia 2014
Dołączanie wirionów do powierzchni jest wymogiem do obrazowania pojedynczego wirionu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości lub mikroskopii sił atomowych (AFM). W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania próbki do kontrolowanej adhezji wirionów do powierzchni szklanych, odpowiednią do stosowania w obrazowaniu AFM i fluorescencji o wysokiej rozdzielczości.
Ta procedura przygotowuje szklane szkiełka nakrywkowe z wirusami do stosowania w mikroskopii sił atomowych i mikroskopii superrozdzielczej, takich jak fluorescencyjna mikroskopia lokalizacyjna aktywowana światłem. Najpierw oczyść szklane podłoże, pokryj szkło cienką warstwą częściowo biotynylowanego glikolu polietylenowego szczepionego poli L lizyną. Następnie potraktuj powierzchnię avadonem, aby zwiększyć powinowactwo wiązania filmu Biotynylowanego.
Teraz potraktuj powierzchnię biotynylowanymi przeciwciałami specyficznymi dla wirusa, który Cię interesuje. Następnie potraktuj przygotowaną powierzchnię przeciwciała interesującym Cię wirusem. W przeciwieństwie do powlekania wirowego, technika ta ma tę zaletę, że warianty są równomiernie rozprowadzane po powierzchni.
W celu optymalizacji mikroskopii należy umieścić szkiełka nakrywkowe pionowo w teflonowym stojaku na szkiełka nakrywkowe o odpowiednim rozmiarze i zanurzyć je w zlewce wypełnionej przefiltrowanym sonikatem alkoholu etylowego na 30 minut. Następnie dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe ultra czystą wodą. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe w oddzielnym, czystym stojaku teflonowym i zlewce wypełnionej jednym molowym sonikatynem wodorotlenku sodu na 30 minut i dokładnie spłucz ultraczystą wodą.
Teraz wysusz wypłukane szkiełka nakrywkowe pod strumieniem azotu i przenieś je na czysty, suchy stojak teflonowy. Sprawdzić, czy każde szkiełko nakrywkowe jest czyste z widocznych filmów lub cząstek. Natychmiast po wysuszeniu w strumieniu azotu w poziomie umieścić jedno szkiełko nakrywkowe na sterylnej szalce Petriego na środku pipety szkiełka nakrywkowego odpowiednią ilość biotynylowanego glikolu polietylenowego szczepionego polilizyną w PBS.
Umieść kolejne czyste szkiełko nakrywkowe na wierzchu płynu metodą kanapkową. Upewnij się, że objętość między aktywnymi powierzchniami dwóch szkiełek nakrywkowych jest całkowicie wypełniona płynem. Przykryj szalkę Petriego i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 45 do 60 minut.
Następnie podnieś kanapkę pęsetą, nie wyciskając nadmiaru płynu. Teraz kciukiem i palcem wskazującym ściśnij kanapkę lekko i poziomo. Przesuń szkiełka okładki w przeciwnych kierunkach i rozdziel je, nie dotykając aktywnych powierzchni.
Spłucz obie aktywne twarze 25 mililitrami ultra czystej wody. Teraz wysuszyć szkiełka nakrywkowe strumieniem azotu i zwrócić uwagę, które powierzchnie szkiełek nakrywkowych są aktywne na sterylnej szalce Petriego. Umieścić szkiełko nakrywkowe poddane działaniu aktywnej strony do góry, pipetą odpowiednią ilość rozmrożonego roztworu dowodowego na środku aktywnej powierzchni
.Umieść kolejne szkiełko nakrywkowe aktywną stroną do dołu, aby ułożyć płyn w warstwie, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 25 do 30 minut. Następnie oddziel dwa szkiełka nakrywkowe, jak pokazano wcześniej. Uważaj, aby nie dotykać aktywnych twarzy.
Teraz spłucz obie aktywne twarze 25 mililitrami ultra czystej wody, a następnie osusz szkiełka nakrywkowe strumieniem azotu. Ważne jest, aby pamiętać, które powierzchnie szkiełek nakrywkowych są aktywne. Na przyszłość należy natychmiast umieścić na sterylnej szalce Petriego aktywną warstwę nakrywkową z aktywną stroną zadrukowaną do góry, a następnie odpipetować odpowiednią ilość rozmrożonego biotynylowanego przeciwciała na środku aktywnej powierzchni
.Umieść kolejne szkiełko nakrywkowe aktywną stroną skierowaną w dół na wierzchu płynu metodą kanapkową. Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 do 60 minut Po oddzieleniu dwóch szkiełek nakrywkowych spłucz obie aktywne twarze 25 mililitrami PBS. Następnie umieścić na sterylnej szalce Petriego szkiełko nakrywkowe nasączone przeciwciałami aktywną stroną zadrukowaną do góry i odpipetować odpowiednią ilość wirusa na środek aktywnej powierzchni
.Teraz ułóż kanapkę z drugą aktywną osłoną, wsuń, przykryj i inkubuj. Teraz oddziel dwa szkiełka nakrywkowe. Przepłucz obie aktywne twarze 25 mililitrami PBS i przenieś je do teflonowego stojaka i zlewki wypełnionej PBS.
Przygotowane próbki należy natychmiast zużyć lub przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do trzech dni. Tu. Dziki wariant wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej zakotwiczono na powierzchni szkła i przeanalizowano za pomocą mikroskopii sił atomowych. Szerokość i długość wirionu wynoszą 80 nanometrów na 180 nanometrów, co wykazuje minimalne zniekształcenia w stosunku do oryginalnego rozmiaru wirionu.
W tym eksperymencie pojedynczy wirion został zobrazowany za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii lokalizacji aktywacji fotoaktywnej. Za pomocą przeciwciał VSVG znakowanych Alexis 6 47. Niebieska izopowierzchnia pokazuje odzyskaną powierzchnię wirionu za pomocą mikroskopii FOM.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować szklane szkiełka nakrywkowe z wirusami do użycia z mikroskopią sił atomowych lub mikroskopią super rozdzielczości. Ważne jest, aby przez cały czas pamiętać, na której stronie szkiełka nakrywkowego znajduje się aktywna substancja chemiczna.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę przygotowania szkiełek podstawowych z wirusami do zastosowania w mikroskopii sił atomowych (AFM) oraz superrozdzielczym obrazowaniu fluorescencyjnym. Technika ta zapewnia kontrolowaną adhezję wirionów, co umożliwia obrazowanie struktur wirusowych z wysoką rozdzielczością.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biofizyka
- techniki mikroskopowe
Wprowadzenie
- Przytwierdzenie wirionów jest kluczowe dla technik obrazowania, takich jak AFM i mikroskopia superrozdzielcza.
- Kontrolowana adhezja poprawia jakość wyników obrazowania.
- Poprzednie metody mogły nie zapewniać jednorodnego rozkładu wirionów.
- Niniejsza praca przedstawia nową metodę przygotowania próbek.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody adhezji wirionów do powierzchni szklanych.
- Poprawa jakości obrazowania w AFM oraz w mikroskopii nadrozdzielczej.
- Wykazanie skuteczności metody z wykorzystaniem wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej.
Zastosowane metody
- Czyszczenie i powlekanie szklanych szkiełek podstawkowych biotynylowanym glikolem polietylenowym.
- Traktowanie powierzchni awidyną i biotynylowanymi przeciwciałami specyficznymi dla wirusa.
- Tworzenie kanapki ze szkiełek podstawkowych w celu ułatwienia równomiernego rozprowadzenia cieczy.
- Stosowanie sonikacji i technik płukania w celu zapewnienia czystości.
Główne wyniki
- Wiriony zostały pomyślnie zakotwiczone na powierzchniach szklanych w celu obrazowania.
- Pojedyncze wiriony zostały zobrazowane przy minimalnych zniekształceniach z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.
- Metoda wykazała efektywny rozkład wirionów na powierzchni.
- Wyniki potwierdziły przydatność metody przygotowania próbek do obrazowania o wysokiej rozdzielczości.
Wnioski
- Opracowana metoda zapewnia niezawodne podejście do adhezji wirionów.
- Technika ta poprawia jakość obrazowania w zastosowaniach mikroskopowych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w różnych zastosowaniach obrazowania wirusów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia kontrolowaną, homogeniczną adhezję wirionów do powierzchni szklanych, co wspiera obrazowanie o wysokiej rozdzielczości w badaniach mechanistycznych nad strukturą wirusów oraz interakcjami z gospodarzem. Dzięki zapewnieniu powtarzalnego przygotowania próbek, technika ta zmniejsza zmienność w późniejszych analizach biofizycznych, poprawiając wiarygodność danych dla walidacji celów oraz działań w zakresie optymalizacji wiodących związków. Technika ta ma zastosowanie w przypadku wirusów otoczkowych istotnych dla programów poszukiwania leków przeciwwirusowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia bezpośrednią wizualizację morfologii wirionów oraz rozkładu białek powierzchniowych, co pozwala ocenić dostępność celu i ekspozycję epitopów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowaną platformę do porównywania wirionów typu dzikiego i mutantów w identycznych warunkach obrazowania.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia ilościową ocenę wiązania przeciwciał lub ligandów do unieruchomionych wirionów za pomocą odczytów fluorescencyjnych.
- Wartość operacyjna: Wspiera jednolitość analizy poprzez minimalizację agregacji wirionów i błędu orientacji na powierzchni obrazowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala na korelację zmian strukturalnych w wirionach z fenotypami funkcjonalnymi, takimi jak zakaźność lub odporność na neutralizację.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne śledzenie wariantów wirusowych w modelach przedklinicznych przy zastosowaniu spójnego przygotowania próbek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów odkrywania leków, w których charakterystyka strukturalna i biofizyczna służy do wyboru celu molekularnego oraz przesiewania związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących mechanizmów wnikania wirusów oraz neutralizacji zapśredniczonej przez przeciwciała poprzez bezpośrednie obrazowanie.
- Przesiewanie: Umożliwia powtarzalne przygotowanie próbek wirionów do kampanii przesiewowych opartych na obrazowaniu wysokotreściowym.
- Analityka: Generuje ilościowe dane morfometryczne (np. wymiary wirionów) oraz pomiary intensywności fluorescencji do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy zachowanie wirionów in vitro z efektywnością przedkliniczną poprzez zachowanie natywnych cech strukturalnych podczas obrazowania.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi adaptowalną platformę chemii powierzchni, którą można zastosować do wielu celów wirusowych w ramach programów odkrywczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w testach biologii strukturalnej poprzez minimalizację artefaktów powstających podczas przygotowania próbek.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność wyników między laboratoriami i różnymi metodami obrazowania dzięki standaryzacji funkcjonalizacji powierzchni.
- Wartość strategiczna: Redukuje liczbę nieudanych sesji obrazowania wynikających ze słabej adhezji wirionów, co pozwala oszczędzać czas pracy aparatury oraz zasoby próbek.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektów przeciwwirusowych poprzez wczesną ocenę podatności strukturalnej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie chemii powierzchni oraz technik mikroskopii fluorescencyjnej.
- Zależne od dostępu do infrastruktury AFM oraz obrazowania o superrozdzielczości.
- Wymaga ścisłego przestrzegania orientacji aktywnej powierzchni podczas wieloetapowego montażu.
- Adaptacja do wirusów nieotoczkowych może wymagać modyfikacji chemii kotwiczenia.
- Ograniczenia w przechowywaniu (do 3 dni w 4°C) wymagają planowania eksperymentów w ramach jednego tygodnia.
