Metody ułatwiania rozwoju mikroorganizmów w strumieniach odpadów z celulozowni i charakterystyka potencjału biodegradacji drobnoustrojów hodowlanych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie zdolności mikroorganizmu lub konsorcjów mikroorganizmów do wykorzystania odpadów roztwarzania ługu czarnego do wzrostu, składników ługu czarnego, które są używane do wzrostu, oraz produktów wytwarzanych w wyniku metabolizmu mikrobiologicznego tych odpadów roztwarzania. Osiąga się to poprzez zebranie odpadów z roztwarzania ługu czarnego i przygotowanie go do wykorzystania jako składnik pożywki hodowlanej. W drugim etapie ekstrahuje się składniki lignocelulozy, które służą do określenia wymagań mikroorganizmów dotyczących źródła węgla.

Następnie pożywki są przygotowywane, inokulowane i analizowane pod kątem wzrostu drobnoustrojów w celu określenia zdolności mikroorganizmów do wzrostu na ługu czarnym i jego składnikach. Wyniki wskazują na wykorzystanie ługu czarnego jako jedynego źródła węgla do wzrostu i syntezy produktów przemiany materii przez mikrobiologiczny izolat środowiskowy w oparciu o jego wzrost uwidoczniony na płytkach agarowych z minimalną ilością pożywki oraz przez GCMS. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy dyskutowaliśmy o możliwości rozwoju mikroorganizmów na produktach odpadowych z masy celulozowej i że możemy być w stanie wyizolować te mikroorganizmy bezpośrednio z celulozowni.

Główną przewagą techniki ekstrakcji celozy zignal w porównaniu z istniejącymi obecnie metodami, takimi jak wybielanie wodorotlenkiem sodu, jest to, że wybielanie chlorkiem sodu zapewnia wysoką i zwiększoną czystość. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Ponieważ etapy przygotowania próbki Theo celulozy i GCMS są trudne do nauczenia, a wynika to z liczby wymaganych kroków oraz z wizualnej determinacji potrzebnej do weryfikacji zakończenia procesu.

Metoda ta może nie tylko zapewnić wgląd w mikrobiologiczną degradację ługu czarnego, ale może być również stosowana do strumieni odpadów przemysłowych zawierających materiały z celulozy Magno, takie jak resztki pożniwne, resztki leśne i stałe odpady komunalne. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pobrać próbkę ługu czarnego z zaworu wylotowego podłączonego do komory fermentacyjnej i sterylnej szklanej butelki i pozostawić ją do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed przejściem do następnego kroku. Następnie dodać 100 mililitrów próbki ługu czarnego do 500-mililitrowej zlewki wyposażonej w mieszadło i mieszać próbkę ze średnią prędkością.

Zneutralizuj ług, dodając kroplami kwas fosforowy, aż stanie się lepki. Następnie podwielokrotność roztworu ługu czarnego rozlać do 50-mililitrowych stożkowych probówek i odwirować próbki o sile 9,300 g przez 30 minut. Aby oddzielić węglowodany, umieść pięć gramów zmielonej trawy rózgowej o grubości jednego milimetra lub mniejszej i mieszadło w kolbie o pojemności 500 mililitrów.

Następnie dodaj 200 mililitrów wody destylowanej, 7,5 grama chlorynu sodu i 2,5 mililitra lodowatego kwasu octowego. Umieścić kolbę w łaźni olejowej umieszczonej na talerzu mieszającym w temperaturze 80 stopni Celsjusza na jedną godzinę. Następnie dodaj do kolby dodatkowe 7,5 grama chlorku sodu i 2,5 mililitra lodowatego kwasu octowego.

Kontynuuj mieszanie w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 30 minut po dwukrotnym powtórzeniu poprzedniego kroku. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Następnie przefiltruj go przez lejek Buchnera w próżni, aby wyizolować materiał stały.

Umyj materiał stały trzykrotnie 100 mililitrami wody destylowanej. Następnie zbierz jeden gram materiału stałego i umieść go na czystym arkuszu bibuły filtracyjnej. Umieść ciało stałe w temperaturze 50 stopni Celsjusza do wyschnięcia przez noc.

Po wyjęciu próbki z pieca następnego dnia, przenieś ją do fiolki do przechowywania oznaczonej jako pusta komórka. Dodać pozostały materiał stały do kolby o pojemności 500 ml zawierającej 250 mililitrów 10% wodorotlenku sodu i zakryć kolbę korkiem. Umieść roztwór w inkubatorze w temperaturze 70 stopni Celsjusza na godzinę z wytrząsaniem przy 250 obr./min.

Następnie pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej Po 30 minutach odizolować materiał stały poprzez filtrację próżniową za pomocą lejka Buchnera. Po wysuszeniu stałej pozostałości przez noc w piekarniku o temperaturze 50 stopni Celsjusza umieść ją w fiolce do przechowywania oznaczonej celulozą. Przenieść filtrat do kolby o pojemności 500 mililitrów i dodać 30 mililitrów kwasu octowego i 250 mililitrów nasadki z alkoholu izopropylowego i umieścić powstały roztwór na blacie na co najmniej osiem godzin w temperaturze pokojowej.

Po zakończeniu przenieść cały roztwór do 50-mililitrowych stożkowych probówek i odwirować próbkę przy 9,300 G przez 30 minut. Po odwirowaniu ostrożnie odpipetować roztwór ze stożkowych probówek i wyrzucić. Następnie umyj granulki 30 mililitrami wody destylowanej przez wirowanie i odwiruj przy 9, 300 Gs przez 30 minut.

Powtórz ten krok 15 razy, aby dokładnie umyć granulkę. Po odwirowaniu usunąć supernatant w celu wyizolowania osadu do liofilizacji. Po liofilizacji próbki umieść ją w fiolce z oznaczeniem hemi celuloza.

W celu oddzielenia ligniny dodaj pięć gramów zmielonej trawy rózgowej o długości jednego milimetra lub mniejszej do 500 mililitrów roztworu 25-molowego wodorotlenku sodu i 30% etanolu. Umieścić gnojowicę w inkubatorze w temperaturze 75 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 250 obr./min przez dwie godziny. Po przefiltrowaniu chłodnego roztworu dodać mieszadło do kolby i umieścić je na płytce mieszającej ustawionej na średnią prędkość.

Dodawać stężony kwas solny kroplami do filtratu, aż do uzyskania pH równego dwie. Pozostaw roztwór na noc w temperaturze pokojowej. Po przeniesieniu roztworu do 50-mililitrowych stożkowych probówek, odwirować próbki w temperaturze 9 300 GS przez 30 minut.

Po zakończeniu ostrożnie odpipetować roztwór ze stożkowej rurki i wyrzucić. Przemyć osad 30 mililitrami wody destylowanej przez wirowanie i odwirować w temperaturze 9 300 g przez 30 minut. Powtórz ten krok 15 razy, aby dokładnie umyć granulkę.

Po odwirowaniu usunąć natant leżący na wznak, aby wyizolować osad do liofilizacji. Po wysuszeniu liofilizowanym umieść próbkę w fiolce z ligniną oznaczoną etykietą. Dodać 50 mililitrów sterylnej pożywki minimalnej M nine do sterylnej kolby o pojemności 125 mililitrów.

Następnie dodać 10% objętości czarnego ługu do podłoża. W celu inokulacji dodać 0,1% objętości nocnej kultury bakteryjnej do mieszaniny, inkubować kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem przy 200 obr./min. W połowie fazy logarytmicznej przenieść bakterie do szczelnie zamkniętej sterylnej butelki z surowicą beztlenową za pomocą strzykawki po odwirowaniu kultur bakterii zaszczepionych i zaszczepionych przez ONZ.

Po 450 godzinach wzrostu dodaj 10 mililitrów każdego supernatantu do oddzielnych szklanych probówek. Zakwasić każdy supernatant stężonym kwasem solnym dodawanym kroplami do pH od jednego do dwóch. Do każdej próbki dodać 30 mililitrów octanu etylu do supra natantu.

Po zamknięciu probówki wymieszaj roztwór, odwracając probówkę cztery do sześciu razy. Następnie umieść jeden do dwóch gramów bezwodnego siarczanu sodu w czystej szklanej probówce. Ostrożnie zebrać górną warstwę organiczną, pipetując za pomocą jednorazowej szklanej pipety pastewnej.

Umieść warstwę organiczną w probówce zawierającej bezwodny siarczan sodu. Odwodnić warstwę organiczną na bezwodnym siarczanie sodu, delikatnie stukając w probówkę, aby stopniowo mieszać. Dodaj niewielkie ilości bezwodnego siarczanu sodu i mieszaj, aż nie będzie dużych grudek.

Następnie przefiltrować roztwór przez lejek Buchnera w próżni, a następnie przenieść roztwór do kolby parownika i odparować filtrat za pomocą wyparki obrotowej. Po zakończeniu umieścić trzy miligramy pozostałości po ekstrakcji octanu etylu w dwumililitrowej fiolce do chromatografii bursztynowej. Rozpuścić pozostałość w 100 mikrolitrach jednego czterodioksanu i 10 mikrolitrach pirydyny.

Następnie dodać do fiolki 50 mikrolitrów roztworu B-S-T-F-A z 1% chlorem trimetylu. Umieść roztwór w inkubatorze w temperaturze 60 stopni Celsjusza, wstrząsając przez 15 minut. Przeanalizuj próbkę za pomocą usługi GCMS.

Zbieranie i modyfikowanie ługu czarnego powstającego w procesie roztwarzania rzemieślniczego pozwoli na wykorzystanie tych odpadów roztwarzania do określenia zdolności biodegradacji pojedynczego izolatu bakteryjnego lub mieszanej kultury. Pokazano tutaj wzrost tlenowy mierzony gęstością optyczną szczepu środowiskowego hodowanego w pożywkach LB i pożywkach LB uzupełnionych 10% zneutralizowanym ługiem czarnym. Wyniki te wskazują, że bakteria ta rozwija się w obecności ługu czarnego.

Wzrost izolatu środowiskowego w pożywce LB jest szybszy niż w przypadku uprawy w obecności ługu czarnego, ale gęstość optyczna zaczyna spadać po 62 godzinach. Natomiast wzrost mikrobiologicznego izolatu środowiskowego w obecności czarnego ługu nadal zwiększa gęstość optyczną aż do 230 godzin wzrostu. Krzywa wzrostu mikrobiologicznego izolatu środowiskowego w obecności czarnego ługu przedstawia również wzrost dwufazowy, co sugeruje, że ług zawiera więcej niż jedno źródło węgla, które może być wykorzystane przez mikrobiologiczny izolat środowiskowy, oraz że bakteria preferuje wykorzystanie składników odżywczych

Konieczne są dalsze eksperymenty, aby określić jego zdolność do wykorzystania ługu czarnego do wymagań wzrostu. Można również określić wzrost bakterii na niezneutralizowanym ługu czarnym lub określić wpływ zwiększonych stężeń ługu czarnego na wzrost. Po wykazaniu wzrostu na ługu czarnym można określić wykorzystanie źródła węgla za pomocą eksperymentów z minimalnym wzrostem pożywki.

Komercyjne podłoża, które składają się na składniki lignocelulozy, mogą być stosowane jako źródła węgla w minimalnych mediach. Przedstawiony tutaj protokół ekstrakcji LIGNOCELULOZĄ stanowi model do określania wymagań dotyczących wzrostu bakterii przedstawionej na zdjęciu Oto wzrost środowiskowego izolatu drobnoustrojów na M dziewięć. Minimalna ilość agaru z podłożem uzupełniona każdym składnikiem ekstrakcji lignocelulozowym.

Obecność kolonii na minimalnych płytkach agarowych podłoża wskazuje na zdolność izolatu środowiskowego do degradacji kolonii holocelulozy, celulozy, hemi celulozy i ligniny obecnych na M nine. Minimalna ilość pożywek może sugerować zdolność izolatu środowiskowego do degradacji agaru zamiast płytek. Minimalne krzywe wzrostu pożywek dla kultur płynnych mogą być również wykorzystane do określenia konkretnego tempa wzrostu każdej frakcji lignocelulozy, tak aby nie trzeba było dodawać agaru, który może być potencjalnym źródłem węgla.

Analiza wyekstrahowanych i pochodnych hodowli bakterii oczu i bakterii za pomocą GCMS ujawnia wytwarzane produkty przemiany materii. Pokazano tutaj widmo GCMS pochodnych TMS obecnych w niezaszczepionej próbce, widmo pochodnych TMS wytwarzanych przez środowiskowy izolat mikrobiologiczny podczas uprawy beztlenowej i M dziewięć, minimalne pożywki z 10% niezneutralizowanym czarnym ługiem jest pokazane tutaj. Porównanie tych dwóch widm ujawnia różnice w składnikach obecnych w pożywkach, co sugeruje obecność produktów fermentacji i degradacji składników ługu czarnego.

W zaszczepionej próbce pojawił się pik z czasem retencji wynoszącym 39,34 minuty. Pik z czasem retencji wynoszącym 21 punktów 84 minuty zwiększył się w zaszczepionej próbce. Pik z czasem retencji wynoszącym 25,79 zmniejszył się w zaszczepionej próbce.

Pokazane tutaj widmo jest wzorcem guac, który został użyty do identyfikacji piku z czasem retencji wynoszącym 25,79 minut. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić, czy mikroorganizm lub konsorcjum mikroorganizmów może rozkładać ług. Ponadto, postępując zgodnie z tym protokołem, można użyć innych metod, takich jak krzywe wzrostu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące szybkości wzrostu mikroorganizmu lub mikroorganizmów w różnych stężeniach składników ługu czarnego lub ekstraktu z ligoncelulozy.