Name: Metody ułatwiania rozwoju mikroorganizmów w strumieniach odpadów z celulozowni i charakterystyka potencjału biodegradacji drobnoustrojów hodowlanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: Poznaj metody hodowli mikroorganizmów na czarnym lugu z celulozowni i analizę ich potencjału biodegradacyjnego przy użyciu chromatografii gazowej. Badanie ocenia zdolność drobnoustrojów do wykorzystania odpadów przemysłowych jako źródła węgla.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Jimowi McMurrayowi za dostarczenie czarnego trunku oraz Dr. Davidowi Tilotcie i Augustowi Mengowi za pomoc w GC-MS. Wsparcie dla Stephanie L. Mathews zostało zapewnione przez USDA National Needs Fellowship (numer nagrody 2010-38420-20399).

1. Zbieranie czarnego ługu i przygotowanie czarnego ługu do hodowli wzrostu
<ol>
	<li>Pobrać próbkę ługu czarnego z zaworu wylotowego podłączonego do komory fermentacyjnej Kraft w sterylnej szklanej butelce i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed przystąpieniem do następujących kroków. 
	zobojętnianie</li>
	<li>Dodać 100 ml próbki ługu czarnego do zlewki o pojemności 500 ml wyposażonej w mieszadło.</li>
	<li>Umieść zlewkę na mieszadle i ustaw prędkość na średnią.</li>
	<li>Powoli dodawaj krople kwasu fosforowego, aż ług stanie się lepki (lepkość podobna do glicerolu).</li>
	<li>Porcjować cały roztwór ługu czarnego, powoli rozlewając do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 9 300 x g przez 30 minut.</li>
	<li>Umieścić supernatant w zlewce i zmierzyć pH za pomocą wstęg do badania pH. Osad wytrąconej ligniny można wyrzucić i potraktować jako inne niż niebezpieczne odpady stałe.</li>
	<li>Kontynuować dodawanie kwasu fosforowego i odwirowywanie roztworu, aż paski pH wskażą neutralne pH supernatantu. 
	sterylizacja</li>
	<li>Przepuść roztwór przez filtr 0,22 μm w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczających bakterii i umieść przefiltrowany roztwór w sterylnym pojemniku do przechowywania. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja lignocelulozy
Separacja węglowodanów
<ol>
	<li>Umieścić 5 g proso rózgowatego, sosny lub trawy bermudzkiej (zmielonej do wielkości cząstek 1 mm lub mniejszej) w kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 ml. Następnie dodać do kolby 200 ml wody destylowanej lub dejonizowanej, 7,5 g NaClO2, 2,5 ml lodowatego kwasu octowego i mieszadło.</li>
	<li>Umieścić kolbę w łaźni olejowej umieszczonej na płytce mieszającej w temperaturze 80 °C na 1 godzinę. Ustawić prędkość mieszadła na średnią.</li>
	<li>Dodać dodatkowe 7,5 g NaClO2 i 2,5 ml lodowatego kwasu octowego do kolby. Kontynuować mieszanie w temperaturze 80 °C w łaźni olejowej przez 30 minut.</li>
	<li>Powtórzyć poprzedni krok 2x (Uwaga: do kolby zawierającej biomasę lignocelulozową dodaje się łącznie 30 g NaClO2 i 10 ml lodowatego kwasu octowego). Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Umieść arkusz bibuły filtracyjnej w lejku Büchnera. Umieść lejek na kolbie bocznej i podłącz ją do odkurzacza.</li>
	<li>Powoli wlej roztwór do lejka.</li>
	<li>Przemyć materiał stały 3x 100 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Wyrzucić filtrat po umyciu materiału stałego.</li>
	<li>Zachowaj 1 g stałego materiału i umieść go na czystym arkuszu bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Wysuszyć ten stały materiał przez noc w piekarniku o temperaturze 50 °C. Po wyjęciu próbki z pieca umieścić ją w fiolce do przechowywania oznaczonej jako "holoceluloza".</li>
	<li>Dodać pozostałą substancję stałą do 250 ml 10% NaOH (v/v) w kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 ml. Zakryć kolbę korkiem.</li>
	<li>Umieścić roztwór w inkubatorze w temperaturze 70 °C na 1 godzinę, wstrząsając z prędkością 250 obr./min.</li>
	<li>Schłodzić roztwór przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć materiał stały za pomocą bibuły filtracyjnej i lejka Büchnera przymocowanego do kolby bocznej.</li>
	<li>Przenieść materiał stały na czystym arkuszu bibuły filtracyjnej do pieca o temperaturze 50 °C i pozostawić do wyschnięcia na noc.</li>
	<li>Po wyschnięciu pozostałości umieścić je w fiolce do przechowywania i oznaczyć jako "celuloza".</li>
	<li>Przenieść filtrat z etapu 2.13 do kolby Erlenmeyera o pojemności 500 ml i dodać 30 ml kwasu octowego i 250 ml alkoholu izopropylowego. Zakryj kolbę i umieść roztwór na blacie stołu na co najmniej 8 godzin w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść cały roztwór do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować roztwór o stężeniu 9 300 x g przez 30 minut. Ostrożnie odpipetować roztwór z probówki stożkowej i wyrzucić.</li>
	<li>Zawiesić osad w 30 ml wody destylowanej lub dejonizowanej przez wirowanie.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.17-2.18 15x, aby dokładnie umyć granulkę.</li>
	<li>Usunąć supernatant i zachować granulat do liofilizacji. Po liofilizacji pobrać próbkę i umieścić ją w fiolce z napisem "hemiceluloza". 
	Separacja ligniny 
	Protokół separacji ligniny oparty na Karaaslan i wsp. 12</li>
	<li>Dodać 5 g proso rózgowatego, sosny lub trawy bermudzkiej (zmielonej na 1 mm lub mniejszy rozmiar cząstek) do 500 ml roztworu 0,25 M NaOH i 30% etanolu. Umieścić gnojowicę w inkubatorze w temperaturze 75 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min przez 2 godziny.</li>
	<li>Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Umieścić arkusz bibuły filtracyjnej w lejku Büchnera na górze kolby bocznej. Podłącz do odkurzacza i powoli wlej roztwór do lejka.</li>
	<li>Wyrzuć materiał stały.</li>
	<li>Dodać mieszadło do kolby zawierającej filtrat i umieścić kolbę na wierzchu płytki mieszającej ustawionej na średnią prędkość. Dodawać stężony kwas solny kroplami do roztworu, aż do uzyskania pH 2,0 (około 20 ml).</li>
	<li>Pozostaw zakwaszony roztwór na noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować roztwór o stężeniu 9 300 x g przez 30 minut w stożkowych probówkach. Ostrożnie odpipetować roztwór ze stożkowej rurki i wyrzucić.</li>
	<li>Zawiesić osad w 30 ml wody destylowanej lub dejonizowanej przez wirowanie.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.27-2.28 15x, aby dokładnie umyć granulkę.</li>
	<li>Po odwirowaniu usunąć supernatant i zachować granulat do liofilizacji. Po liofilizacji umieścić próbkę w fiolce z napisem "lignina".</li>
</ol>
3. Przygotowanie kultur wzrostu mikroorganizmów
Talerze agarowe
<ol>
	<li>Dodaj 0,2% (w/v) sterylnych produktów ekstrakcji lignocelulozy do agaru M9 minimalmedia 13 przed nalaniem płytek.</li>
	<li>Smugi zestalonych płytek z około 200 ul kultury bakteryjnej wyhodowanej w minimalnym podłożu M9 o średnicy zewnętrznej około 2,0.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i monitorować wzrost. 
	Płynne kultury bakterii</li>
	<li>Dodać 50 ml sterylnej pożywki Luria-Bertani (LB)13 lub M9 minimalnej pożywki13 do sterylnej kolby o pojemności 125 ml. Dodać ług w stężeniu 10% (v/v) lub 0,2% (w/v) produktów ekstrakcji lignocelulozy.</li>
	<li>Zaszczepić pożywkę 0,1% (v/v) kultury bakteryjnej przy średnicy zewnętrznej około 2,0.</li>
	<li>Inkubować kultury w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 200 obr./min.</li>
	<li>Oceniać wzrost co 6 godzin w okresie hodowli, mierząc gęstość optyczną (λ = 600 nm). Umieścić 1 ml porcji kultury w kuwecie. Określić gęstość optyczną kultury wyzerowanej na nieinokulowanych pożywkach.</li>
	<li>Przenieś bakterie do butelki z surowicą beztlenową w połowie fazy logarytmicznej.
	<ol>
		<li>Aby przygotować butelkę z surowicą beztlenową: zamknij butelkę z serum korkiem z gumy butylowej i aluminiową nakrętką zaciskaną w warunkach tlenowych i autoklaw. Nie należy modyfikować przestrzeni nad głową w butelce serum po sterylizacji.</li>
		<li>Przenieść całą 50 ml kultury z kolby o pojemności 125 ml do szczelnie zamkniętej sterylnej butelki z surowicą za pomocą strzykawki.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki do GC-MS
Przygotuj próbki według Raja, Reddy'ego i Chandry14. Kontrola ujemna stosowana do porównania składa się z minimalnej pożywki M9 z 10% czarnym ługiem i jest również określana jako próbka nieinokulowana.
<ol>
	<li>Odwirować nieinokulowane i zaszczepione kultury bakterii (50 ml) przy 9 300 x g przez 30 minut po 450 godzinach inkubacji.</li>
	<li>Przenieść 10 ml supernatantu do szklanej probówki. (Uwaga: Plastik jest niekompatybilny z chemikaliami w poniższych krokach.)</li>
	<li>Zakwasić supernatant stężonym HCl do pH 1-2.</li>
	<li>Dodaj 3 objętości octanu etylu (30 ml), zakryj probówkę i wymieszaj, odwracając 4-6 razy.</li>
	<li>Umieść niewielką ilość bezwodnego Na2SO4 (1-2 g) w czystej szklanej probówce.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać warstwę organiczną (górną) z roztworu octanu etylu, pipetując za pomocą jednorazowej, szklanej pipety Pasteura.</li>
	<li>Umieść warstwę organiczną w probówce z bezwodnym Na2SO4.</li>
	<li>Odwodnić warstwę organiczną na bezwodnym Na2SO4, delikatnie stukając w probówkę, aby wymieszać. Stopniowo dodawaj niewielkie ilości bezwodnego Na2SO4i mieszaj, aż nie będzie dużych grudek.</li>
	<li>Umieścić arkusz bibuły filtracyjnej w lejku Büchnera na górze kolby z bocznym ramieniem podłączonej do próżni.</li>
	<li>Wlej roztwór do lejka. Wyrzuć materiał stały.</li>
	<li>Przenieść roztwór do kolby parownika i odparować filtrat za pomocą wyparki obrotowej.</li>
	<li>Umieścić 3 mg pozostałości po ekstrakcji octanu etylu w 2 ml fiolki z chromatografią bursztynową.</li>
	<li>Rozpuścić pozostałość z dodatkiem 100 μl 1,4-dioksanu i 10 μl pirydyny.</li>
	<li>Dodać 50 μl N,O-bis(trimetylosililo) trifluoroacetamidu z trimetylocholorsilanem 99:1% (BSTFA). Następnie umieścić w inkubatorze w temperaturze 60 °C z wytrząsaniem przez 15 minut.</li>
	<li>Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
5. GC-MS
Wyposaż chromatograf gazowy (GC) sprzężony ze spektrometrem masowym (MS) z niepolarną kolumną kapilarną i helem jako gazem nośnym o prędkości przepływu 1 ml/min.
<ol>
	<li>Po ustabilizowaniu się temperatury pieca na poziomie 50 °C, wstrzyknąć 1 μl próbki w stosunku 1/50.</li>
	<li>Utrzymać kolumnę w temperaturze 50 °C przez 5 minut i zwiększyć do 280 °C przy 5 °C/min. Utrzymać temperaturę końcową 280 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Utrzymać linię przesyłową między chromatografem gazowym a spektrometrem masowym w temperaturze 300 °C.</li>
	<li>Wybierz opóźnienie rozpuszczalnika wynoszące 15 minut.</li>
	<li>Zapis widm masowych jonizacji elektronów w zakresie 10-500 (m/z) przy energii elektronów 70 eV.</li>
	<li>Derywatyzacja i wzorzec chromatografu jak wyżej. Zidentyfikuj związki, porównując czasy przechowywania zakupionych wzorców lub danych w bazie danych widma mas National Institute of Standards and Technology (NIST).</li>
</ol>

<ol><li>Tejado, A., Pena, C., Labidi, J., Echeverria, J. M., Mondragon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physico-chemical+characterization+of+lignin+from+different+sources+for+use+in+phenol-formaldehyde+resin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Physico-chemical characterization of lignin from different sources for use in phenol-formaldehyde resin synthesis.</a> Bioresource Technol. 98, 1655-1663 (2007).</li>
<li>Brannvall, E. Overview of pulp and paper processes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrannvall%2C+E+%22Pulp+and+paper+chemistry+and+technology%22">Pulp and paper chemistry and technology</a>. Elk, M., Gellerstedt, G., Henriksson, G. 2, De Gruyter. 1-12 (2009).</li>
<li>Biermann, C. J. Pulping fundamentals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiermann%2C+CJ+%22Handbook+of+pulping+and+papermaking%22">Handbook of pulping and papermaking</a>. , 2nd edition, Academic Press INC. 55-100 (1996).</li>
<li>Sjöström, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSj%C3%B6str%C3%B6m%2C+E+%22Wood+chemistry%3A+fundamentals+and+applications%22">Wood chemistry: fundamentals and applications</a>. , 2nd, San Deigo Academic Press. (1924).</li>
<li>Philbrook, A., Alissandratos, A., Easton, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+processes+for+generating+fuels+and+commodity+chemicals+from+lignocellulosic+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biochemical processes for generating fuels and commodity chemicals from lignocellulosic biomass.</a> Environ. Biotechnol. , 39-63 (2013).</li>
<li>Sanchez, R., Ferrer, A., Serrano, L., Toledano, A., Labidi, J., Rodriguez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hesperaloafunifera+as+a+raw+material+for+integral+utilization+of+its+components%5BTitle%5D)+AND+%22BioResources%22%5BJournal%5D)">Hesperaloafunifera as a raw material for integral utilization of its components.</a> BioResources. 6 (1), 3-21 (2011).</li>
<li>Font, X., Caminal, G., Gabarrel, X., Romero, S., Vicent, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+liquor+detoxification+by+laccase+of+Trametesversicolorpellets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chemical+Tech.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Black liquor detoxification by laccase of Trametesversicolorpellets.</a> J. Chemical Tech. Biotech. 78, 548-554 (2003).</li>
<li>Zimmerman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+lignin+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Degradation of lignin by bacteria.</a> J. Biotechnol. 13, 119-130 (1990).</li>
<li>Ahamad, M., Taylor, C. R., Pink, D., Burton, K., Eastwood, D., Bending, G. R., Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+novel+assay+for+lignin+degradation%3A+comparative+analysis+of+bacterial+and+fungal+lignin+degraders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Development of novel assay for lignin degradation: comparative analysis of bacterial and fungal lignin degraders.</a> Mol. Biosystems. 6, 815-821 (2010).</li>
<li>Ramchandra, M., Crawford, D. L., Hertel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+extracellular+lignin+peroxidase+of+the+lignocellulolyticactinomycete+Streptomyces+viridosporus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Micro%22%5BJournal%5D)">Characterization of an extracellular lignin peroxidase of the lignocellulolyticactinomycete Streptomyces viridosporus.</a> Appl. Environ. Micro. 54, 3057-3063 (1988).</li>
<li>Mishra, M., Thakur, I. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMishra%2C+M+%22Microorganisms+in+environmental+management%3A+microbes+and+the+environment%22">Microorganisms in environmental management: microbes and the environment</a>. Satyanarayana, T., Johri, B. N., Prakash, A. , Springer. (2012).</li>
<li>Karaaslan, A. M., Tshabalala, M. A., Wood Bushcle-Diller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hemicellulose+chitosan-based+semi-interpenetrating+network+hydrogels%3A+mechanical%2C+swelling+and+controlled+drug+release+properties%5BTitle%5D)+AND+%22BioResources%22%5BJournal%5D)">hemicellulose chitosan-based semi-interpenetrating network hydrogels: mechanical, swelling and controlled drug release properties.</a> BioResources. 5 (2), 1036-1054 (2010).</li>
<li>Lech, K., Brent, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLech%2C+K+%22Short+protocols+in+molecular+biology%22">Short protocols in molecular biology</a>. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Kevin, S. , 2nd, John Wiley & Sons. (1992).</li>
<li>Raj, A., Krishna Reddy, M. M., Chandra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+low+molecular+weight+aromatic+compounds+by+gas+chromatography-mass+spectrometry+%28GC-MS%29+from+kraft+lignin+degradation+by+three+Bacillus+sp%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Biodeterior.+Biodegradation%22%5BJournal%5D)">Identification of low molecular weight aromatic compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) from kraft lignin degradation by three Bacillus sp.</a> Int. Biodeterior. Biodegradation. 59, 292-296 (2007).</li>
<li>Chandra, R., Raj, A., Purohit, H. J., Kapley, A. Biodegradation of kraft lignin by three pure and mixed aerobic bacterial cultures isolated from pulp and paper sludge. Proceeding of the 25th international symposium on toxicology environmental and occupational health, , (2005).</li>
<li>Chen, Y., Chai, L., Tang, C., Yang, Z., Zheng, Y., Shi, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kraft+lignin+biodegradation+by+Novosphingobium+sp.+B-7+and+analysis+of+the+degradation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Kraft lignin biodegradation by Novosphingobium sp. B-7 and analysis of the degradation process.</a> Bioresource Technol. 123, 682-685 (2012).</li>
<li>Bandounas, L., Wierckx, N. J., de Winde, J. H., Ruijssenaars, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+novel+bacterial+strains+exhibiting+ligninolytic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of novel bacterial strains exhibiting ligninolytic potential.</a> BMC Biotechnol. 11 (94), (2011).</li>
<li>Chandra, R., Abhishek, A., Sankhwar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+decolorization+and+detoxification+of+black+liquor+from+rayon+grade+pulp+manufacturing+industry+and+detection+of+their+metabolic+products%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Bacterial decolorization and detoxification of black liquor from rayon grade pulp manufacturing industry and detection of their metabolic products.</a> Bioresource Technol. 102, 6429-6436 (2011).</li>
<li>Gellerdtedt, G. Chemistry of Bleaching of Chemical Pulp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGellerdtedt%2C+G+%22Pulp+and+Paper+Chemistry+and+Technology%22">Pulp and Paper Chemistry and Technology</a>. Ek, M., Gellerstedt, G., Henriksson, G. 2, De Gruyter. 201-237 (2009).</li>
<li>Kringstad, K. P., Lindstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spent+liquors+from+pulp+bleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Spent liquors from pulp bleaching.</a> Environ. Sci. Tech. 18, 236-247 (1984).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten opisuje kombinację technik, które mają na celu identyfikację mikroorganizmów, które mogą rozkładać odpady z roztwarzania, źródeł węgla wykorzystywanych podczas wzrostu odpadów z roztwarzania oraz mikrobiologicznych produktów przemiany materii wytwarzanych podczas uprawy na odpadach z roztwarzania. Wykazaliśmy sukces tego protokołu w przypadku mikrobiologicznego izolatu środowiskowego: fakultatywnego beztlenowca, który może rosnąć na 10% ługu czarnym i wykorzystywać składniki ekstrakcji lignocelulozy jako jed...

Roztwarzanie drewna to chemicznie intensywny proces, który był optymalizowany przez wiele lat, aby stworzyć system z minimalną ilością odpadów. Jednak niektóre produkty tego procesu można wykorzystać do wytwarzania produktów o wyższej wartości. Jednym z takich przykładów jest trunek. Jest wytwarzany w procesie kraftowym, który jest dominującą chemiczną metodą roztwarzania, stanowiącą 85% światowej produkcji ligniny1. Proces Krafta (rysunek 1) wykorzystuje temperaturę (160-200 °C), ciśnienie (120 psig) i substancje chemiczne zawarte w ługu białym (wodorotlenek sodu i siarczek sodu) do rozpuszczenia ligniny z włókien drzewnych2,3. Ług zawiera ligninę, kwasy organiczne i produkty uboczne degradacji polisacharydów4. Jest on spalany w celu wytworzenia pary i odzyskania chemikaliów w kotle regeneracyjnym, który dostarcza energię cieplną do dalszych procesów produkcji papieru i roztwarzania. Objętość ługu czarnego wytwarzanego przez roztwarzanie może przekraczać ilość, którą kocioł regeneracyjny może skutecznie przetworzyć. Usuwanie czarnego ługu w postaci ścieków negatywnie wpływa na florę i faunę wodną, a zatem nie jest opcją. Zastosowanie organizmów mikrobiologicznych, które mogłyby wykorzystywać ług do wzrostu, byłoby korzystne z punktu widzenia zwiększenia odzysku chemicznego i wytwarzania produktów o wartości dodanej, które poprawiłyby ogólną analizę cyklu życia systemu roztwarzania. Chemiczna i biologiczna konwersja monomerów pochodzących z ligniny z powodzeniem wyprodukowała wanilinę i kwas cynamonowy do stosowania jako słodziki spożywcze i dodatki zapachowe, fenol stosowany do tworzyw sztucznych i żywic oraz cykloheksan, który może być stosowany jako paliwo5.
Poprzednie prace nad biodegradacją tego odpadu z pulpy koncentrowały się na depolimeryzacji ligniny. Międzynarodowy Instytut Ligniny (ILI) podaje, że każdego roku (http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php) produkuje się od 40 do 50 milionów ton ligniny. Tylko 1,5% tej ligniny jest wykorzystywane w komercyjnych procesach przemysłowych6. Depolimeryzacja ligniny przez lakazę i enzymy peroksydazy wytwarzane przez grzyby białej zgnilizny z rodzajów Phanerochaete i Trametes została szczegółowo zbadana7. Wykazano również, że bakterie glebowe, o których wiadomo, że rozkładają związki aromatyczne, takie jak Nocardia i Rhodococcus8, Pseudomonas putida mt-29 i Streptomyces viridosporus T7A10, są zdolne do degradacji ligniny. Degradacja bakteryjna odpadów z roztwarzania jest obiecująca, ponieważ niektóre bakterie mogą rozwijać się w warunkach zasolenia i zasadowości (pH 10-14), które charakteryzują ścieki z odpadów roztwarzania11. Podczas gdy lignina jest głównym składnikiem ługu czarnego, mikroorganizmy mogą również rozkładać inne składniki składające się na ług. Techniki te nie identyfikują wyłącznie mikroorganizmów rozkładających ligninę, ale służą do identyfikacji mikroorganizmów, które można zastosować bezpośrednio do odpadów roztwarzania ługu czarnego zamiast do jego dalej przetworzonych składników.
ług został zebrany i zmodyfikowany do rozwoju mikroorganizmów poprzez neutralizację i filtr-sterylizację. Wymagania dotyczące wzrostu mikroorganizmów określono dla środowiskowego izolatu mikrobiologicznego poprzez eksperymenty z minimalnym wzrostem pożywek na składnikach lignocelulozowych wytwarzanych za pomocą nowego protokołu ekstrakcji lignocelulozy. Pożywki wzrostowe analizowano za pomocą chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS) w celu określenia produktów przemiany materii środowiskowego izolatu mikrobiologicznego uprawianego na ługu czarnym jako jedynym źródle węgla. Połączenie tych technik stanowi narzędzie oceny pozwalające określić zdolność metaboliczną mikroorganizmu hodowanego na odpadach z celulozowni, takich jak ług. Zastosowanie takich technik daje również wgląd w wartość zastosowania określonych mikroorganizmów do odpadów celulozowni w celu wytworzenia produktów ubocznych.

<table><tbody><tr><td>1,4-dioksan (certyfikowany ACS)</td><td>Fisher</td><td>D111</td><td>Łatwopalny, wstępnie utleniony chemiczny</td></tr><tr><td>ług</td><td>Zakład Biomateriałów Leśnych na Uniwersytecie Stanowym Karoliny Północnej</td><td>Nie</td><td>dotyczy pH 12,72, 13,67% ciał stałych</td></tr><tr><td>Etanol (klasa mikrobiologiczna)</td><td>Fisher</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu (klasa odczynnika ACS)</td><td>EMD</td><td>EX0240-9</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy (certyfikowany ACS)</td><td>EMD</td><td>AX0073</td><td></td></tr><tr><td>Gwajakol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1136</td><td>Szkodliwy po spożyciu,</td></tr><tr><td>Kolumna kapilarna HP-5</td><td>Agilent</td><td>19091J-577</td><td>60 m x 0,18 mm średnica wewnętrzna, 0,18 &mu; m grubości</td></tr><tr><td>Kwas solny (certyfikowany ACS)</td><td>EMD</td><td>HX0603P</td><td></td></tr><tr><td>N,O-bis(trimetylosililo)trifluoroacetamid z trimetylocholorylosilanem 99:1% (BSTFA)</td><td>Fluka</td><td>15238</td><td>Łatwopalny, powoduje oparzenia skóry i uszkodzenia oczu w kontakcie</td></tr><tr><td>Na2SO4 (klasa FCC)</td><td>VWR</td><td>BDH8026</td><td></td></tr><tr><td>NaClO2 (80%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244155</td><td>Łatwopalny, toksyczny&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH (certyfikowany ACS)</td><td>EMD</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>wstążki do badania pH kwasów zasadowych</td><td>Kwas</td> fosforowy Fisher <td>A979</td><td></td></tr><tr><td>(certyfikowany ACS)</td><td>Spektrometr</td> masowy Fisher <td>A242</td><td></td></tr><tr><td>Polaris Q&nbsp;</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pirydyna (99%)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12005</td><td>Łatwopalny, toksyczny w kontakcie ze skórą</td></tr><tr><td>Switchgrass</td><td>Cherry Research Farm Goldsboro, Karolina Północna</td><td>Nie dotyczy</td><td>Zebrane w sierpniu 2011 r</td></tr>. <tr><td>Chromatograf gazowy śladowy Thermo Finnigan</td><td>Bibuła</td><td></td><td></td></tr><tr><td>filtracyjna Whatman nr 1</td><td>Whatman</td><td>1001-150</td><td></td></tr></tbody></table>

metody ułatwiania rozwoju mikroorganizmów w strumieniach odpadów z celulozowni i charakterystyka potencjału biodegradacji drobnoustrojów hodowlanych

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

Proces kraft jest stosowany do wiórów drzewnych w celu oddzielenia ligniny od polisacharydów w lignocelulozie na celulozę, która pozwoli uzyskać wysokiej jakości papier. Ług to odpad roztwarzania powstający w procesie krafta, który ma potencjał do dalszej biokonwersji. Jednak oporny charakter zasobów lignocelulozy, jej pochodnych chemicznych, które stanowią większość dostępnego węgla organicznego w ługu czarnym, oraz jego zasadowego pH stanowią wyzwanie dla mikrobiologicznej biodegradacji tego materiału odpadowego. Metody zbierania i modyfikacji ługu czarnego do wzrostu mikroorganizmów mają na celu wykorzystanie tych odpadów miazgi do przekształcenia ligniny, kwasów organicznych i produktów ubocznych degradacji polisacharydów w cenne chemikalia. Przedstawione techniki ekstrakcji lignocelulozy zapewniają powtarzalną metodę przygotowania substratów wzrostu lignocelulozy w celu zrozumienia zdolności metabolicznych hodowanych mikroorganizmów. Zastosowanie chromatografii gazowej ze spektrometrią mas umożliwia identyfikację i ilościowe określenie produktów fermentacji powstałych w wyniku wzrostu mikroorganizmów na odpadach z roztwarzania. Metody te, gdy są stosowane razem, mogą ułatwić określenie aktywności metabolicznej mikroorganizmów o potencjale wytwarzania produktów fermentacji, które zapewniłyby większą wartość dla systemu roztwarzania i zmniejszyłyby ilość ścieków, zwiększając w ten sposób potencjalne zyski z mielenia papieru i oferując dodatkowe zastosowania ługu czarnego.

Pozyskanie i modyfikacja ługu czarnego powstającego w procesie kraftowego bielenia celulozy (Rysunek 1) umożliwi wykorzystanie tego odpadu z procesu bielenia do określenia zdolności biodegradacyjnej pojedynczego izolatu bakteryjnego lub kultury mieszanej. Rysunek 2 przedstawia wzrost tlenowy mierzony gęstością optyczną izolatu środowiskowego mikroorganizmów hodowanego w samym medium LB oraz w medium LB uzupełnionym o 10% zneutralizowanego ługu czarnego. Wyniki te wskazują, że bakteria ta...

Odpady przemysłowe mogą być zbierane i modyfikowane w celu analizy rozwoju mikroorganizmów. Techniki ekstrakcji lignocelulozy dostarczają składników do analizy określonej zdolności biodegradacji. Chromatografia gazowa ze spektrometrią mas identyfikuje produkty fermentacji mikroorganizmów wyhodowanych na odpadach z roztwarzania. Metody te określają zdolność metaboliczną mikroorganizmów do rozkładu odpadów z roztwarzania.

Metody ułatwiania rozwoju mikroorganizmów w strumieniach odpadów z celulozowni i charakterystyka potencjału biodegradacji drobnoustrojów hodowlanych

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest określenie zdolności mikroorganizmu lub konsorcjum mikroorganizmów do wykorzystania czarnego ługu, będącego odpadem z procesu miazgowania, do wzrostu, a także zidentyfikowanie składników czarnego ługu wykorzystywanych w procesie wzrostu oraz produktów powstających w wyniku mikrobiologicznego metabolizmu tego odpadu. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez pobranie czarnego ługu i przygotowanie go do zastosowania jako składnik pożywki hodowlanej. W drugim etapie ekstrahuje się komponenty lignocelulozowe, które służą do określenia zapotrzebowania mikroorganizmów na źródło węgla.Następnie przygotowuje się kolejne pożywki, szczepi je i analizuje pod kątem wzrostu drobnoustrojów, aby określić zdolność mikroorganizmów do wzrostu na ługu czarnym oraz jego składnikach. Wyniki wykazują wykorzystanie ługu czarnego jako jedynego źródła węgla do wzrostu i syntezy produktów metabolicznych przez środowiskowy izolat drobnoustrojów, co potwierdzono poprzez obserwację wzrostu na płytkach z agarem w pożywce minimalnej oraz za pomocą GCMS. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas dyskusji nad możliwością wzrostu drobnoustrojów na produktach odpadowych z produkc

methods-for-facilitating-microbial-growth-on-pulp-mill-waste-streams

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Metody ułatwiające wzrost mikroorganizmów na strumieniach odpadów z młynów papierniczych oraz charakterystyka potencjału biodegradacji hodowanych drobnoustrojów

Źródło: Villela, H. D. M. i in. Poszukiwanie szczepów mikroorganizmów do bioremediacji oraz rozwój probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje izolację bakterii morskich degradujących zanieczyszczenia poprzez seryjne rozcieńczanie, selekcję kolonii oraz wzrost w medium zawierającym EE2. Wykorzystując EE2 jako jedyne źródło węgla, protokół identyfikuje szczepy bakterii zdolne do metabolizowania tego zanieczyszczenia środowiska.

Przesiewowe bakterie morskie pod kątem izolacji szczepów degradujących zanieczyszczenia

Folie z tworzywa sztucznego oznaczone jako "biodegradowalne" są dostępne na rynku do użytku rolniczego jako ściółki.  Uprawa roli stanowi atrakcyjną metodę utylizacji, ale degradacja w warunkach polowych jest słabo poznana.  Celem pracy było opracowanie metod izolacji rodzimych grzybów glebowych i bakterii, które kolonizują plastikowe folie ściółkowe po zakopaniu w polu.

Izolacja rodzimych mikroorganizmów glebowych z potencjałem do rozkładania biodegradowalnych folii ściółkowych z tworzyw sztucznych stosowanych w rolnictwie

Pokazano chronoamperometryczny wzrost anodowych elektroaktywnych biofilmów mikrobiologicznych w reaktorze z zasilaniem przy użyciu układu trzech elektrod, kontrolowanego przez potencjostat. Zewnątrzkomórkowy transfer elektronów charakteryzuje się za pomocą woltamperometrii cyklicznej w obecności donora elektronów i pod nieobecność donora elektronów. Pokazano analizę danych fundamentalnych.

Elektroaktywne biofilmy mikrobiologiczne pochodzące ze ścieków: wzrost, utrzymanie i podstawowa charakterystyka

Test bioreporterowy całej komórki z Burkholderia sartisoli RP037-mChe został opracowany do wykrywania frakcji zanieczyszczenia organicznego (tj. fluoru) dostępnego do degradacji bakteryjnej po aktywnym transporcie przez grzybnię wypełniającą pory wypełnione powietrzem w systemie modelowym nienasyconym wodą.

Podejście bioreporterowe oparte na całej komórce do oceny transportu i biodostępności zanieczyszczeń organicznych w systemach nienasyconych wodą

Biofilmy mają złożone interakcje z otaczającym je środowiskiem. Aby kompleksowo zbadać interakcje biofilm - środowisko, przedstawiamy tutaj szereg metod tworzenia heterogenicznego środowiska chemicznego do rozwoju biofilmu, ilościowego określania lokalnej prędkości przepływu oraz analizy transportu masowego w koloniach biofilmu i wokół nich.

Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk

Nowatorski projekt reaktora, nazwany bioreaktorem o wysokiej gęstości (HDBR), jest prezentowany do hodowli i badania społeczności drobnoustrojów o dużej gęstości. W tym przypadku HDBR jest z powodzeniem stosowany w konfiguracji fotobioreaktora (PBR) do badania metabolizmu azotu przez mieszaną społeczność glonów o dużej gęstości.

Nowatorski bioreaktor do hodowli o dużej gęstości różnych zbiorowisk mikroorganizmów

Analiza cytometryczna przepływu okazała się przydatna do badania czystych kultur i monitorowania dynamiki społeczności mikroorganizmów. Przedstawiamy trzy kompleksowe przepływy pracy, od próbkowania po analizę danych, dla czystych kultur i złożonych społeczności, odpowiednio w przezroczystym podłożu, jak i w trudnych matrycach.

Charakterystyka dynamiki mikrobiomu – przepływy pracy oparte na cytometrii przepływowej od czystych kultur do naturalnych społeczności

Zanieczyszczenie wpływa na wszystkie biomy. Szczególnie ucierpiały środowiska morskie, zwłaszcza rafy koralowe, jeden z najbardziej wrażliwych ekosystemów na Ziemi. Bioremediacja to zdolność organizmów do rozkładu zanieczyszczeń. W tym miejscu opisujemy metodologie izolowania i testowania drobnoustrojów prezentujących zdolność bioremediacji i potencjalne cechy probiotyczne dla koralowców.

Poszukiwanie szczepów drobnoustrojów do bioremediacji i rozwoju probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów

Ten protokół przedstawia metodologię wykonywania pomiarów wzrostu biofilmu i biomasy przy użyciu samodzielnie zmontowanych urządzeń do płytek PCR z głębokiej studni do wysokoprzepustowego 96-dołkowego statycznego przesiewania biofilmu z pokrywą potwierdzoną.

Wytwarzanie większej biomasy biofilmu bakteryjnego za pomocą urządzeń do mikropłytek głębinowych PCR-Plate

Tutaj prezentujemy protokół badania różnorodności biologicznej gleby w poszukiwaniu szczepów grzybów biorących udział w degradacji opornych materiałów. Najpierw izoluje się szczepy grzybów, które mogą rosnąć na kwasach humusowych lub lignocelulozie. Ich aktywność jest następnie testowana zarówno w testach enzymatycznych, jak i na zanieczyszczeniach, takich jak węglowodory i tworzywa sztuczne.

Izolacja i badania przesiewowe pod kątem różnorodności biologicznej gleby pod kątem grzybów biorących udział w degradacji opornych materiałów

Ten protokół szczegółowo opisuje montaż układów mini-bioreaktorów, które mają być wykorzystane do hodowli złożonego przepływu złożonych zbiorowisk kałowych w warunkach beztlenowych. Omówiono również metody montażu, inokulacji i pobierania próbek z reaktorów do dalszej analizy.

Montaż bioreaktora do ciągłej hodowli złożonych zbiorowisk kałowych

Poznaj metody hodowli mikroorganizmów na czarnym lugu z celulozowni i analizę ich potencjału biodegradacyjnego przy użyciu chromatografii gazowej. Badanie ocenia zdolność drobnoustrojów do wykorzystania odpadów przemysłowych jako źródła węgla.

Metody ułatwiania rozwoju mikroorganizmów w strumieniach odpadów z celulozowni i charakterystyka potencjału biodegradacji drobnoustrojów hodowlanych (Wideo) | JoVE Journal

Metody ułatwiania rozwoju mikroorganizmów w strumieniach odpadów z celulozowni i charakterystyka potencjału biodegradacji drobnoustrojów hodowlanych

Przeglądaj więcej filmów