Obrazowanie oczyściło nienaruszone systemy biologiczne na poziomie komórkowym za pomocą 3DISCO

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie, nienaruszonych próbek biologicznych bez konieczności wykonywania przekrojów histologicznych. Osiąga się to poprzez sekwencyjną inkubację utrwalonych tkanek w rozpuszczalnikach organicznych, aż do uzyskania pełnej przejrzystości. Jako drugi krok.

Przezroczyste tkanki są obrazowane w 3D przy użyciu mikroskopu skaningowego laserowego. Następnie analizowane są wyniki obrazowania, a struktury neuronalne w nieprzeciętym rdzeniu kręgowym i mózgu mogą zostać zrekonstruowane w 3D na podstawie zebranych obrazów disco. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki dotyczące mapowania połączeń neuronalnych i GAL w całym mózgu i rdzeniu kręgowym.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię neurodegeneracji, ponieważ możemy teraz wizualizować integralność neuronalną w całym układzie nerwowym. Chociaż metoda ta pozwala uzyskać wgląd w organizację układu nerwowego, może być ona stosowana również w odniesieniu do innych narządów, takich jak płuca czy tkanka nowotworowa. Po opanowaniu techniki, proces ten zajmuje zaledwie kilka godzin w przypadku małych organów, takich jak rdzeń kręgowy lub płuca, oraz około jednego lub dwóch dni w przypadku mózgu. Procedurę należy rozpocząć od dodania od dwóch do trzech mililitrów świeżo przygotowanego 50% THF do jednej fiolki szklanej na każdą pobraną tkankę.

Następnie przenieś utrwalone organy do roztworu przejaśniającego i szczelnie zamknij probówki. Umieść probówki na rotatorze i owiń je folią aluminiową, mieszając próbki przez odpowiedni czas przy stałej prędkości 30 RPM. Następnie usuń roztwór przejaśniający i za pomocą nowej pipety lub PE zawieś tkankę w kolejnym roztworze.

Zgodnie z informacjami w tabeli dotyczącymi końcowego etapu klarowania, należy utrzymywać próbki w roztworze do momentu uzyskania pełnej przezroczystości, niezbędnej do mikroskopii wielofotonowej lub konfokalnej. Po osiągnięciu pełnego klarowania należy zamontować próbkę na odpowiednim szkiełku do obrazowania. Do stworzenia obramowania wokół tkanki należy użyć cementu dentystycznego.

Wypełnij zbiorniczek końcowym roztworem klarowania tuż przed całkowitym stwardnieniem cementu dentystycznego, a następnie niezwłocznie umieść sklarowaną próbkę na środku zbiorniczka i przykryj ją szkiełkiem nakrywką. Dociskaj szkiełko nakrywkę, aż zostanie całkowicie uszczelnione cementem dentystycznym i dotknie powierzchni sklarowanego organu; po uzyskaniu pełnego sklarowania i zamocowaniu próbki do mikroskopii arkusza światła, ręcznie przekręć śrubę uchwytu próbki, aby ją unieruchomić. Następnie zanurz próbkę w komorze obrazowania mikroskopu arkusza światła wypełnionej końcowym roztworem klarowania odpowiednim dla obrazowanej tkanki.

Następnie wykonaj skany w osi Z obejmujące całą utkaną tkankę z najwyższą rozdzielczością, jaką oferuje mikroskop, powiększając obszary zainteresowania w celu uzyskania obrazów o wyższej rozdzielczości. Po zebraniu obrazów załaduj serię zdjęć do oprogramowania Amira z modułem resolve RT. Po załadowaniu serii wprowadź odpowiednie rozmiary wokseli w oknie parametrów odczytu obrazu i kliknij OK.

Następnie wybierz podaplikację widoku wielopłaszczyznowego. Użyj suwaków primary i thickness, aby dobrać optymalną grubość projekcji oraz próg dla wartości szarości. Na koniec skorzystaj z modułu crop corner, aby przeglądać przekroje w różnych orientacjach 3D.

Aby zwizualizować próbki, mapowanie organizacji strukturalnej neuronów jest niezwykle ważne dla zrozumienia, jak funkcjonują one w zdrowiu i chorobie. Choć tę metodę można zastosować w przypadku różnych narządów, jest ona szczególnie użyteczna przy śledzeniu długich połączeń neuronalnych w rdzeniu kręgowym i mózgu. Na przykład, wykorzystując skany ultramikroskopowe dużych, przejrzystych segmentów rdzenia kręgowego, można śledzić połączenia aksonalne na odcinku wielu centymetrów w rdzeniu kręgowym gryzoni, co zilustrowano na tych obrazach.

W podobny sposób można obrazować cały oczyszczony mózg i hipokamp myszy, aby śledzić połączenia neuronalne w mózgu. Przy zastosowaniu mikroskopii konfokalnej lub wielofotonowej rozdzielczość obrazowania może zostać znacznie poprawiona, zwłaszcza w wymiarze Z. Na przykład obrazowanie wielofotonowe oczyszczonych rdzeni kręgowych myszy z linii GFPM pozwala uzyskać jednolity obraz w całej głębokości rdzenia kręgowego, od 1,5 do dwóch milimetrów.

Mikroskopia konfokalna obrazowania sklarowanego rdzenia kręgowego zapewnia w podobny sposób lepszą rozdzielczość. Obrazowanie sklarowanych mózgów za pomocą mikroskopii wielofotonowej dostarcza obrazów o bardzo wysokiej rozdzielczości, co pozwala na wizualizację drobnych szczegółów struktur neuronalnych, w tym kolców dendrytycznych. Próbki do metody three disco mogą być znakowane na różne sposoby.

Na przykład możliwe jest znakowanie całego układu naczyniowego mózgu i rdzenia kręgowego przy użyciu znaczników fluorescencyjnych sprzężonych z lektyną, co może służyć do badania bariery krew-mózg w stanie zdrowym i chorobowym. Dzięki zastosowaniu trzech technik disco można obrazować również mniejsze komórki w dużych tkankach. Przykładowo, zarówno mikroglej, jak i astrocyty są w znacznym stopniu zaangażowane w patologię neurodegeneracji, w tym w chorobę Alzheimera oraz urazy traumatyczne.

Dzięki zastosowaniu trzech dysków można badać gęstość i rozmieszczenie struktur w rdzeniu kręgowym. Możliwe jest również obrazowanie tkanek nieneuronalnych. Przykładowo, komórki Clary w całych płucach gryzonia mogą zostać znakowane immunologicznie przeciwciałami i obrazowane bez konieczności wykonywania przekrojów na poziomie pojedynczych komórek.

Podobnie, możliwe jest utrwalenie i obrazowanie komórek w niezmodyfikowanej tkance trzustki. Na przykład, na tych obrazach trzustki przedstawiono obrazowanie fluorescencyjnie znakowanych komórek alfa po procesie utrwalenia. Wizualna demonstracja tej metody jest istotna, ponieważ choć etapy utrwalania i obrazowania są proste, analiza danych może być skomplikowana.

Podczas stosowania tej procedury ważne jest, aby wykonać obrazowanie utklarowanych tkanek niezwłocznie po osiągnięciu pełnej przezroczystości, ponieważ sygnał fluorescencyjny w roztworze utklarzającym ulega z czasem degradacji. Opracowanie tej techniki otworzyło badaczom drogę do eksploracji szczegółów oraz nienaruszonych organów, na przykład poprzez mapowanie sieci neuronalnych w mózgu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak utklarzać i obrazować struktury komórkowe oraz podkomórkowe w całych organach, a następnie je wizualizować i analizować.