Obrazowanie oczyściło nienaruszone systemy biologiczne na poziomie komórkowym za pomocą 3DISCO

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zobrazowanie fluorescencyjnie znakowanych nienaruszonych próbek biologicznych bez sekcji histologicznej. Osiąga się to poprzez sekwencyjną inkubację utrwalonych tkanek w rozpuszczalnikach organicznych, aż do uzyskania pełnej przezroczystości. Jako drugi krok.

Przezroczyste tkanki są obrazowane w 3D za pomocą laserowego mikroskopu skaningowego. Następnie wyniki obrazowania są analizowane, a struktury neuronalne w nieprzeciętym rdzeniu kręgowym i mózgu mogą być zrekonstruowane w 3D na podstawie zebranych trzech obrazów dyskotekowych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii dotyczące mapowania połączeń neuronalnych i GAL w całym mózgu i rdzeniu kręgowym.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii neurodegeneracji, ponieważ możemy teraz wizualizować integralność neuronalną w całym układzie nerwowym. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w organizację układu nerwowego, może być również stosowana do innych narządów, takich jak płuca lub tkanka nowotworowa. Po opanowaniu technika ta zajmuje tylko kilka godzin w przypadku małych narządów, takich jak rdzeń kręgowy lub płuca, i około jednego lub dwóch dni w przypadku mózgu Rozpocznij procedurę od dodania dwóch do trzech mililitrów świeżo przygotowanego 50% THF do jednej szklanej fiolki na pobraną tkankę.

Następnie przenieść utrwalone narządy do roztworu oczyszczającego i dokładnie zamknąć fiolki. Umieścić fiolki na rotatorze i przykryć je folią aluminiową, mieszając próbki przez odpowiedni czas ze stałą prędkością 30 obr./min. Następnie usuń roztwór czyszczący i użyj nowego PE lub pipety, aby zawiesić tkankę w następnym roztworze.

Jak wskazano w tabeli, podczas ostatniego etapu oczyszczania, próbki należy przechowywać w roztworze, aż staną się całkowicie przezroczyste do mikroskopii wielofotonowej lub konfokalnej. Jak tylko zostanie osiągnięte całkowite oczyszczenie, w tym celu zamontuj próbkę na szkiełku obrazowym. Użyj cementu dentystycznego, aby zrobić granicę wokół tkanki.

Napełnij basen końcowym roztworem czyszczącym tuż przed tym, jak cement dentystyczny stanie się całkowicie sztywny, a następnie natychmiast umieść oczyszczoną próbkę na środku basenu i przykryj ją szkłem nakrywkowym. Dociśnij szkło nakrywkowe, aż zostanie całkowicie uszczelnione przez cement dentystyczny i dotknie powierzchni oczyszczonego narządu do mikroskopii z użyciem lekkiego arkusza, gdy tylko zostanie osiągnięte całkowite oczyszczenie, zamontuj, a następnie ręcznie przekręć uchwytu próbki, aby zamocować próbkę. Następnie zanurz próbkę w komorze obrazowania mikroskopu z arkuszem świetlnym wypełnionej końcowym roztworem czyszczącym odpowiednim dla obrazowanej tkanki.

Następnie zbierz skany Z obejmujące całe oczyszczone tkanki w najlepszej rozdzielczości, jaką może zapewnić mikroskop, przybliżając obszary zainteresowania, aby uzyskać obrazy o wyższej rozdzielczości. Po zebraniu obrazów załaduj serię obrazów do oprogramowania Amira za pomocą modułu resolve RT. Po załadowaniu serii wprowadź poprawne rozmiary wokseli w oknie parametrów odczytu obrazu i kliknij przycisk OK.

Następnie wybierz aplikację podrzędną widoku wielopłaszczyznowego. Następnie użyj suwaków Podstawowe i Grubość, aby wybrać optymalną grubość projekcji i próg dla wartości szarości. Na koniec użyj modułu kadrowania narożnika, aby przeglądać plasterki w różnych orientacjach 3D.

Aby zobrazować próbki, mapowanie organizacji strukturalnej neuronów jest niezwykle ważne dla zrozumienia, w jaki sposób funkcjonują one w zdrowiu i chorobie. Podczas gdy trzy dyskoteki mogą być stosowane na różnych narządach, są one szczególnie przydatne do śledzenia długich połączeń neuronalnych w rdzeniu kręgowym i mózgu. Na przykład, korzystając z ultramikroskopowych skanów dużych, oczyszczonych segmentów rdzenia kręgowego, połączenia aksonalne można śledzić na przestrzeni kilku centymetrów w rdzeniu kręgowym gryzoni, jak pokazano na tych obrazach.

W podobny sposób cały oczyszczony mózg myszy i hipokamp można zobrazować tak, aby śledził połączenia neuronalne w mózgu. W przypadku zastosowania mikroskopii konfokalnej lub wielofotonowej rozdzielczość obrazowania może ulec znacznej poprawie, zwłaszcza w wymiarze Z. Na przykład obrazowanie wielofotonowe oczyszczonych rdzeni kręgowych od myszy z linii GFPM pozwala uzyskać bezproblemowy obraz na całej głębokości rdzenia kręgowego od 1,5 do 2 milimetrów.

Mikroskopia konfokalna na oczyszczonym rdzeniu kręgowym zapewnia lepszą rozdzielczość w podobny sposób. Obrazowanie oczyszczonych mózgów za pomocą mikroskopii wielofotonowej dostarcza obrazów o bardzo wysokiej rozdzielczości, aby uwidocznić drobne szczegóły struktur neuronalnych, w tym kolców dendrytycznych. Próbki dla trzech dyskotek mogą być oznaczone na różne sposoby.

Na przykład możliwe jest oznaczenie całego układu naczyniowego mózgu i rdzenia kręgowego za pomocą sprzężonych ze wskaźnikami fluorescencyjnymi z lektyną, które można wykorzystać do badania bariery krew-mózg w zdrowiu i chorobie. Korzystając z trzech dyskotek, można również obrazować mniejsze komórki w dużych tkankach. Na przykład zarówno mikroglej, jak i astrocyty są silnie zaangażowane w patologię neurodegeneracji, w tym chorobę Alzheimera i urazy pourazowe.

Za pomocą trzech dyskotek można badać ich gęstość i rozmieszczenie w rdzeniu kręgowym. Można również obrazować tkanki nieneuronalne. Na przykład komórki Clara w całych płucach gryzoni mogą być znakowane immunologicznie przeciwciałami i obrazowane bez sekcji na poziomie pojedynczej komórki.

Podobnie możliwe jest oczyszczenie i zobrazowanie komórek w niesankcjonowanej tkance trzustki. Na przykład fluorescencyjnie znakowane komórki alfa są obrazowane po oczyszczeniu w tych obrazach trzustki. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ chociaż etapy oczyszczania i obrazowania są proste, analiza danych może być skomplikowana.

Podczas stosowania tej procedury ważne jest, aby zobrazować czyste tkanki, gdy tylko zostanie osiągnięta pełna przezroczystość, ponieważ sygnał fluorescencyjny będzie z czasem ulegał degradacji w roztworze oczyszczającym. Opracowanie tej techniki utorowało naukowcom drogę do badania szczegółów i nienaruszonych narządów, takich jak mapowanie sieci neuronalnych w mózgu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyścić i zobrazować struktury komórkowe i subkomórkowe w całych narządach, a następnie je wizualizować i analizować.