Interferometria biowarstwowa do pomiaru kinetyki oddziaływań białko-białko i efektów ligandów allosterycznych
18 lutego 2014
Protokoły tutaj opisują kinetyczne testy interakcji białko-białko za pomocą interferometrii warstwy biologicznej. Syntaza ATP typu F, która bierze udział w metabolizmie energii komórkowej, może być hamowana przez swoją ε podjednostka u bakterii. Dostosowaliśmy interferometrię biowarstw do badania oddziaływań kompleksu katalitycznego z hamującą domeną C-końcową ε.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zmierzenie kinetyki białek, interakcji białkowych oraz allosterycznego wpływu małych ligandów na te oddziaływania za pomocą interferometrii biowarstwowej, BLI. Osiąga się to poprzez przygotowanie jednego z białek ze specyficzną biotyną i unieruchomienie go na powierzchni paciorkowca. Biosensory z powłoką Aden równolegle.
W drugim etapie białko związane z czujnikiem jest wystawiane na działanie buforu zawierającego jego składnik wiążący, a wiązanie jest mierzone w czasie rzeczywistym na podstawie jego wpływu na zakłócenia optyczne na powierzchni czujnika. Następnie każdy czujnik jest przenoszony do bufora bez partnera wiążącego w celu pomiaru dysocjacji białka w czasie rzeczywistym. Kompleksy białkowe.
Uzyskane wyniki pozwalają na wyznaczenie kinetycznych stałych szybkości wiązania i dysocjacji oddziałujących białek, a tym samym ich powinowactwa do wiązania. Dalsze wyniki pokazują, że BLI może wykrywać wpływ małych ligandów na szybkość dysocjacji kompleksu białkowego. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak powierzchniowy rezonans plazmowy, jest to, że BLI nie jest nadmiernie wrażliwy na zmiany współczynnika załamania światła.
Tak więc etapy wiązania i asocjacji mogą obejmować zmiany w małych ligandach, aby przetestować ich wpływ na interakcje białko-białko w czasie rzeczywistym, Chociaż ta metoda może dostarczyć wglądu w kinetykę interakcji białko-białko. Może być również stosowany do różnych kombinacji, takich jak wiązanie białka z unieruchomionym DNA lub RNA lub wiązanie liposomów z unieruchomionym białkiem. Rozpocznij ten eksperyment od ustawienia instrumentu BLI zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Następnie skonfiguruj projekt eksperymentalny w oprogramowaniu do akwizycji danych. Wybierz nowy eksperyment kinetyczny na karcie kreatora eksperymentu. Spowoduje to wyświetlenie menu z zakładkami ze wszystkimi krokami, które należy zdefiniować na karcie pierwszej.
Zdefiniuj kolumny, które mają być używane. Na 96-dołkowej płytce z próbką. Przypisz kolumny do zawierania buforu, białka, które ma zostać unieruchomione, lub partnera wiążącego.
Dla każdego skojarzenia dobrze wprowadź stężenie partnera wiążącego, który ma być użyty. Na karcie drugiej zdefiniuj wszystkie kroki potrzebne do przeprowadzenia testu. Obejmują one asocjację obciążenia linii bazowej i dysocjację partnera wiążącego.
Poszczególne etapy oznaczania są łączone z kolumnami studzienek na płytce z próbką poprzez wybranie kroku testu, a następnie dwukrotne kliknięcie na odpowiednią kolumnę. To programuje czujniki, które mają być przenoszone z jednej kolumny studni do drugiej. Podczas testu należy rozpocząć od krótkiego kroku podstawowego połączonego z pierwszą kolumną studzienek z buforem testowym w celu ustalenia początkowych sygnałów BLI w płytce 96-dołkowej.
Następnie połącz etap ładowania z dołkami, które będą zawierały biotynylowane białko. Użyj funkcji progu, aby osiągnąć wstępnie określony poziom powiązania. Ustaw opcję progu tak, aby wszystkie czujniki zostały przeniesione do następnej kolumny studni.
Gdy którykolwiek z czujników osiągnie próg, należy dołączyć kolejny krok linii bazowej do bufora, aby zmyć nieunieruchomione białka biotynylowane z czujników i ustanowić nowe stabilne sygnały wyjściowe dla podstawowych testów w celu określenia globalnych stałych szybkości wiązania i dysocjacji, w tym dodatkowego kroku linii podstawowej z czujnikami w nowej kolumnie studzienek buforowych przed asocjacją. Krok dalej, połącz skojarzenie. Przejdź do kolumny studzienek, które zawierają różne stężenia składnika wiążącego.
Dostosuj czas kroku tak, aby co najmniej nasycone stężenie środka wiążącego osiągnęło sygnał wiązania równowagi. Na etapie dysocjacji należy wyznaczyć czujniki tak, aby powróciły do kolumny czwartej, tych samych studzienek buforowych, które są używane do dodatkowej linii podstawowej przed asocjacją. Czasy etapów asocjacji i dysocjacji można dostosować podczas eksperymentu, jeśli tempo jest wolniejsze lub szybsze niż przewidywano.
Na karcie trzeciej wskaż miejsca w tacce czujnika, które będą zawierały wstępnie zwilżone czujniki do testu. Zakładka czwarta umożliwia graficzny przegląd programu. Na karcie piątej wprowadź niezbędne szczegóły, w tym lokalizację plików danych i żądaną temperaturę.
Do eksperymentu. Wstępnie zwilżyć czujniki pokryte streptawidyną przez co najmniej 10 minut. Aby usunąć ochronną powłokę sacharozy, wyjmij stojak zawierający czujnik z tacki na czujnik i włóż 96-dołkową płytkę w dno tacy, wsuwając jeden róg płytki w wycięcie orientacyjne na tacy.
W przypadku kolumny czujników, które mają być użyte, dodać 200 mikrolitrów buforu testowego na studzienkę. W tej kolumnie płytki 96-dołkowej należy umieścić stojak z czujnikami na tacy we właściwej orientacji, zgodnie z przypisaniem Podczas programowania należy wypełnić studzienki płytki próbki buforem do oznaczania lub odpowiednimi rozcieńczeniami białka. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one powodować zakłócenia w sygnale optycznym.
Dołączyć jeden lub więcej studzienek referencyjnych, które pomijają biotynylowane białko lub partnera wiążącego. Otwórz drzwiczki przyrządu i zwróć uwagę na strumień świetlny z ramienia czujnika. Włóż tacę czujnika na stolik tak, aby zaczepy tac były włożone w szczeliny stolika.
Włóż płytkę do próbki do uchwytu płytki. Upewnij się, że talerz jest osadzony płasko i we właściwej orientacji, jak wskazano na uchwycie talerza. Zamknij drzwi i rozpocznij test z programu do akwizycji danych.
Jeśli czujniki nadal wymagają wstępnego zwilżenia, wybierz opcję opóźnienia rozpoczęcia eksperymentu. Na koniec, po zakończeniu przygotowywania całej próbki i załadowaniu zarówno płytki na próbkę, jak i tacki czujnika do urządzenia, kliknij przycisk Go, aby uruchomić test. Po uruchomieniu testu otwórz oprogramowanie do analizy danych i załaduj folder zawierający dane.
Kliknij kartę przetwarzania, aby wyświetlić menu przetwarzania krokowego i surowe dane kinetyczne z każdym czujnikiem przypisanym do innego koloru w obszarze wyboru danych. Kliknij przycisk wyboru czujnika na mapie płytki próbki. Oznacz dołki dla jednego lub dwóch czujników sterujących jako dołki referencyjne w menu przetwarzania.
Zaznacz pole odejmowania i wybierz studnie referencyjne, aby odjąć sygnał referencyjny od każdego innego sygnału czujnika. Wyrównaj wszystkie ślady do wartości Y równa się zero przy użyciu kroku Wyrównaj oś y. Następnie wybierz linię bazową jako krok wyrównania dla zakresu czasu.
Wprowadź ostatnie 10 sekund tego punktu odniesienia. Kliknięcie w obrębie tego kroku linii bazowej spowoduje wyświetlenie wyrównania. Następnie zaznacz pole korekcji międzyetapowej, aby zminimalizować przesunięcia sygnału między krokami asocjacji i dysocjacji.
Wybierz linię do linii bazowej lub dysocjacji. W większości przypadków wybierz funkcję filtrowania KY gole i kliknij dane procesowe, aby przejść do wizualnej kontroli końcowych danych procesu w prawym dolnym panelu. Aby przeanalizować dane, kliknij kartę analizy w obszarze Analiza danych w obszarze Krok do analizy wybierz asocjację i dysocjację.
W przypadku modelu wybierz jeden do jednego do dopasowania Wybierz globalnie. Dla grupowania według wybranego koloru wybierz r max odłączony przez czujnik, aby umożliwić niezależne dopasowanie maksymalnej odpowiedzi sygnału po nasyceniu wiązania partnera z unieruchomionym białkiem. Na koniec kliknij opcję Dopasuj krzywe, aby rozpocząć analizę regresji nieliniowej.
Zbadaj wyniki dopasowania, które obejmują nałożenie krzywych regresji ze śladami danych z czujnika, wykresy reszt dopasowania oraz tabelę z określonymi wartościami parametrów i statystykami. Kinetyka BLI wiązania i dysocjacji w czasie rzeczywistym jest pokazana tutaj. Eksperyment ten rozpoczął się od 10-minutowego kroku podstawowego, ponieważ czujniki zostały wstępnie zmoczone, a następnie na krótko załadowano biotynylowany epsilon na czujniki.
Nie wystąpiła wykrywalna dysocjacja epsilonu we wszystkich pozostałych etapach, co widać na podstawie krzywej odniesienia, do której nie dodano partnera wiążącego. Drugi czujnik referencyjny był pozbawiony zmobilizowanego białka i wykazywał niskie niespecyficzne wiązanie partnera wiążącego. Na etapie asocjacji dla czujników od A do F zastosowano różne stężenia F1 minus epsilon, aby dopasować wyniki globalnie i uzyskać najlepsze wartości stałej szybkości asocjacji do stałej szybkości asocjacji i stałej dysocjacji równowagi KD, uzyskując niebieskie ślady danych.
W tym przypadku ślad czujnika referencyjnego został odjęty od śladów próbki w celu skorygowania niespecyficznego wiązania partnera wiążącego i dryfu sygnału systemu. Na etapie analizy danych wszystkie krzywe zostały globalnie dopasowane do modelu jeden do jednego, jeden do jednego. Dopasowanie globalne zakłada całkowite odłączenie partnera wiążącego.
Pokazano tutaj inny eksperyment, w którym enzym został związany z czujnikiem unieruchomionym epsilonem w obecności jednego milimola, A-T-P-A-D-T-A. To predysponuje większość kompleksów epsilonów F1 do przyjęcia potwierdzenia niehamującego, które łatwo dysocjuje, czujniki zostały następnie przeniesione do studzienek dysocjacyjnych zawierających bufor testowy z różnymi ligandami. Pokazuje to wpływ różnych ligandów na potwierdzenie epsilonu.
Na przykład, ekspozycja na magnez A GP i fosforan dramatycznie spowolniła dysocjację netto, co wskazuje, że epsilon przesunął potwierdzenie do ściśle związanego stanu hamującego. Podczas pierwszego konfigurowania testów BLI ważne jest, aby uwzględnić kontrole w celu sprawdzenia nieswoistego wiązania białka z czujnikami oraz tego, czy niespecyficzne wiązanie różni się znacząco w zależności od stężenia białka, które ma być użyte. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak projektować, programować i analizować testy BLI do pomiaru kinetyki interakcji białek białkowych i docenić to.
BLI pozwala na bezpośrednie badanie wpływu małych ligandów na interakcje białek białkowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokoły pomiaru interakcji białko-białko za pomocą interferometrii warstwy białkowej (BLI). Koncentracja jest na interakcji między syntazą ATP typu F a jej podjednostką ε, która odgrywa rolę w metabolizmie energetycznym bakterii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Interakcje białkowe
Tło
- Syntaza ATP typu F jest kluczowa dla produkcji energii komórkowej.
- Podjednostka ε może hamować aktywność syntaz ATP.
- Rozumienie tych interakcji jest ważne dla wniknięcia w regulację metabolizmu.
- Interferometria warstwy białkowej pozwala na pomiar tych interakcji w czasie rzeczywistym.
Cel badania
- Pomiar kinetyki interakcji białko-białko.
- Zbadanie efektów allosterycznych małych ligandów na te interakcje.
- Adaptacja BLI do badania kompleksu katalizycznego syntaz ATP.
Stosowane metody
- Przygotowanie białek z biotyną do unieruchomienia.
- Użycie biosensorów pokrytych streptawidyną do badań wiązania.
- Pomiar w czasie rzeczywistym wiązania i dysocjacji za pomocą interferencji optycznej.
- Analiza kompleksów białkowych tworzonych podczas interakcji.
Główne wyniki
- Skuteczna pomiar kinetyki wiązania między syntazą ATP a jej podjednostką ε.
- Dane w czasie rzeczywistym dotyczące dysocjacji kompleksów białkowych.
- Wgląd w allosteryczną regulację aktywności syntaz ATP.
- Demonstracja BLI jako cennego narzędzia do badania interakcji białkowych.
Wnioski
- BLI jest skuteczna w badaniu interakcji białko-białko.
- Interakcja między syntazą ATP a jej podjednostką ε jest kluczowa dla zrozumienia kontroli metabolizmu.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych metodach do zbadania innych interakcji białkowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Bio-layer Interferometry (BLI) enables real-time kinetic analysis of protein-protein interactions and allosteric ligand effects, supporting target validation in antibacterial drug discovery. By measuring binding and dissociation rates of the ε subunit with ATP synthase catalytic complexes, BLI provides quantitative data to de-risk mechanistic hypotheses and prioritize lead compounds. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking ligand-induced conformational changes to functional inhibition of a clinically relevant target.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how ligands shift ε subunit conformation between active and inhibitory states.
- Operational Value: Enables real-time monitoring of binding kinetics without label interference, reducing assay variability.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating ligand binding with functional outcomes in bacterial energy metabolism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Measures association and dissociation rate constants to characterize binding affinity under physiologically relevant conditions.
- Operational Value: Tolerates varying buffer compositions, allowing screening of diverse ligand libraries without signal artifacts.
- Scalability: Compatible with 96-well formats for parallel evaluation of multiple ligand concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links in vitro binding data to bacterial-specific auto-inhibition mechanisms relevant to antibiotic development.
- Mechanistic De-risking: Clarifies allosteric regulation of ATP synthase, reducing ambiguity in target engagement strategies.
- Preclinical Alignment: Supports disease-relevant modeling by focusing on a validated antibacterial target (FDA-approved for tuberculosis).
Pipeline & Workflow Integration
BLI fits within the discovery continuum from target engagement assessment to lead optimization, particularly for antibacterial programs targeting energy metabolism.
- Discovery Biology: Tests target validity by measuring real-time kinetics of protein-protein interactions and ligand-induced conformational shifts.
- Screening: Delivers quantitative KD, kon, and koff values to support hit-to-lead progression and structure-activity relationship analysis.
- Analytics: Provides sensor-based optical interference readouts that enable global fitting and residual analysis for robust kinetic modeling.
- Translational Research: Connects biochemical mechanism to antibacterial phenotype through inhibition of a clinically validated target.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying protein-protein interactions across multiple targets and ligand classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target modulation by detecting allosteric effects of small ligands on protein complex stability.
- Operational Value: Ensures reproducibility through reference subtraction, baseline alignment, and inter-step correction during data processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing kinetic thresholds for target engagement and ligand efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on binding kinetics and conformational selectivity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein biotinylation, streptavidin biosensor handling, and BLI instrument setup.
- Depends on access to multi-well plate readers with temperature control and real-time optical monitoring capabilities.
- Necessitates standardized workflows for sensor regeneration, reference well inclusion, and data subtraction to minimize noise.
- Involves optimization of association and dissociation timing based on ligand binding kinetics and complex stability.
- Limited by the need for immobilized binding partners, which may affect native protein conformation or accessibility.
