Interferometria biowarstwowa do pomiaru kinetyki oddziaływań białko-białko i efektów ligandów allosterycznych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar kinetyki białek, oddziaływań białko-białko oraz efektów allosterycznych małych ligandów na te oddziaływania przy użyciu interferometrii warstwy biologicznej (BLI). Osiąga się to poprzez przygotowanie jednego z białek z konkretną biotyną i jego unieruchomienie na powierzchni biosensorów powlekanych streptawidyną w układzie równoległym.

W drugim kroku białko związane z sensorem jest eksponowane na bufor zawierający jego partnera wiążącego, a wiązanie jest mierzone w czasie rzeczywistym poprzez jego wpływ na interferencję optyczną na powierzchni sensora. Następnie każdy sensor przenosi się do buforu bez partnera wiążącego, aby zmierzyć dysocjację białka w czasie rzeczywistym. Kompleksy białkowe.

Uzyskane wyniki pozwalają na wyznaczenie stałych szybkości kinetycznej wiązania i dysocjacji oddziałujących białek, a tym samym ich powinowactwa wiązania. Dalsze wyniki pokazują, że BLI pozwala wykryć wpływ niewielkich ligandów na szybkość dysocjacji kompleksu białko-białko. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak powierzchniowy rezonans plazmonowy, jest fakt, że BLI nie wykazuje nadmiernej wrażliwości na zmiany współczynnika załamania światła.

Zatem etapy wiązania i asocjacji mogą obejmować zmiany w małych ligandach w celu przetestowania ich wpływu na oddziaływania białko-białko w czasie rzeczywistym. Ta metoda może dostarczyć informacji na temat kinetyki oddziaływań białko-białko. Można ją również zastosować do różnych kombinacji, takich jak wiązanie białka do unieruchomionego DNA lub RNA, bądź wiązanie liposomów do unieruchomionego białka. Rozpocznij ten eksperyment od przygotowania urządzenia BLI zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie skonfiguruj schemat doświadczenia w oprogramowaniu do akwizycji danych. W zakładce kreatora eksperymentów wybierz nową próbę kinetyczną. Pojawi się menu z kartami zawierające wszystkie kroki, które należy zdefiniować w pierwszej zakładce.

Zdefiniuj kolumny, które zostaną wykorzystane. Na płytce z 96 dołkami do próbek przypisz kolumny, które będą zawierać bufor, białko do unieruchomienia lub partnera wiążącego.

Dla każdego związku należy wprowadzić stężenie partnera wiążącego, który będzie wykorzystywany. W drugiej zakładce należy zdefiniować wszystkie kroki niezbędne do przeprowadzenia analizy. Obejmują one linię bazową, ładowanie, asocjację oraz dysocjację partnera wiążącego.

Poszczególne etapy analizy są przypisywane do kolumn wgłębników na płytce z próbkami poprzez wybranie etapu analizy, a następnie dwukrotne kliknięcie odpowiedniej kolumny. Pozwala to zaprogramować sensory tak, aby przemieszczały się z jednej kolumny wgłębników do kolejnej. Podczas analizy należy rozpocząć od krótkiego etapu linii bazowej, przypisanego do pierwszej kolumny wgłębników z buforem do analizy, w celu ustalenia początkowych sygnałów BLI w płytce 96-dołkowej.

Następnie powiąż krok ładowania z dołkami, w których znajdzie się biotynilowane białko. Użyj funkcji progu, aby osiągnąć określony poziom wiązania. Ustaw opcję progu tak, aby wszystkie sensory zostały przeniesione do następnej kolumny dołków.

Gdy którykolwiek z czujników osiągnie wartość progową, należy wprowadzić kolejny krok linii bazowej w buforze, aby usunąć niezwiązane biotynilowane białka z czujników i ustalić nowe stabilne sygnały linii bazowej. W przypadku podstawowych analiz służących do wyznaczania globalnych stałych szybkości wiązania i dysocjacji, należy dodać dodatkowy krok linii bazowej z czujnikami w nowej kolumnie studzienek z buforem przed etapem asocjacji. Następnie należy połączyć krok asocjacji z kolumną studzienek zawierających zmienne stężenia partnera wiążącego.

Dostosuj czas trwania etapu tak, aby przynajmniej saturacyjne stężenie partnera wiążącego osiągnęło sygnał równowagi wiązania. Dla etapu dysocjacji ustaw czujniki tak, aby powróciły do kolumny czwartej, do tych samych studni z buforem, które były używane do dodatkowej linii bazowej przed asocjacją. Czas trwania etapów asocjacji i dysocjacji można dostosować w trakcie eksperymentu, jeśli szybkości reakcji okażą się wolniejsze lub szybsze od przewidywanych.

W trzeciej zakładce wskaż miejsca w tacy z czujnikami, w których znajdą się czujniki uprzednio zwilżone dla danego badania. Czwarta zakładka umożliwia graficzny przegląd programu. W piątej zakładce wprowadź niezbędne szczegóły, w tym lokalizację plików danych oraz żądaną temperaturę.

Przed przystąpieniem do eksperymentu należy namoczyć sensory powlekane streptawidyną przez co najmniej 10 minut. Aby usunąć z nich ochronną powłokę sacharozową, wyjmij kasetę z sensorami z tacki, a następnie wstaw do dna tacki płytkę 96-dołkową, wsuwając jeden z jej narożników do nacięcia orientacyjnego w tackce.

Do kolumny używanych czujników dodaj 200 µL buforu do analizy na każdą studzienkę. W tej kolumnie płytki 96-dołkowej umieść statyw z czujnikami w tacy w odpowiedniej orientacji przypisanej podczas programowania; napełnij studzienki płytki z próbkami buforem do analizy lub odpowiednimi rozcieńczeniami białek. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one powodować szumy w sygnale optycznym.

Należy uwzględnić jedną lub więcej studzienek referencyjnych, w których pominięto albo biotynilowane białko, albo partner wiążący. Otwórz drzwiczki urządzenia i odnotuj emisję światła z ramienia sensora. Wsuń tackę z sensorem na platformę, umieszczając wypustki tacki w odpowiednich gniazdach platformy.

Włóż płytkę z próbkami do uchwytu na płytki. Upewnij się, że płytka przylega płasko i jest ustawiona w odpowiedniej orientacji, zgodnie z oznaczeniami na uchwycie. Zamknij drzwiczki i uruchom analizę w programie do akwizycji danych.

Jeśli czujniki nadal wymagają wcześniejszego nawilżenia, należy wybrać opcję opóźnienia rozpoczęcia eksperymentu. Na koniec, gdy cała procedura przygotowania próbek zostanie zakończona, a zarówno płytka z próbkami, jak i tacka z czujnikami zostaną umieszczone w urządzeniu, należy kliknąć przycisk „go”, aby uruchomić analizę. Po przeprowadzeniu analizy otwórz oprogramowanie do analizy danych i załaduj folder zawierający dane.

Kliknij kartę przetwarzania (processing), aby wyświetlić menu przetwarzania krok po kroku oraz surowe dane kinetyczne, w których każdemu czujnikowi przypisany jest inny kolor w sekcji wyboru danych. Kliknij przycisk wyboru czujnika na mapie płytki z próbkami. W menu przetwarzania wyznacz studzienki dla jednego lub dwóch czujników kontrolnych jako studzienki referencyjne.

Zaznacz pole odjemowania i wybierz studzienki referencyjne, aby odjąć sygnał referencyjny od sygnału każdego z pozostałych czujników. Wyrównaj wszystkie przebiegi do wartości Y równej zero, korzystając z kroku wyrównania osi Y (align y axis). Następnie wybierz linię bazową (baseline) jako krok wyrównania dla zakresu czasu.

Wprowadź ostatnie 10 sekund tej linii bazowej. Kliknięcie w kroku linii bazowej wyświetli dopasowanie. Następnie zaznacz pole korekcji między krokami (inter step correction), aby zminimalizować przesunięcia sygnału pomiędzy etapami asocjacji i dysocjacji.

Wybierz linię w celu wyznaczenia poziomu bazowego lub dysocjacji. W większości przypadków wybierz funkcję filtrowania KY gole, a następnie kliknij „process data”, aby przejść do wizualnej inspekcji końcowych przetworzonych danych w panelu w prawym dolnym rogu. Aby przeanalizować dane, kliknij kartę analizy w sekcji analizy danych, wybierz krok do analizy, a następnie wybierz asocjację i dysocjację.

W polu modelu wybierz opcję one to one for fitting, a następnie wybierz global. W polu group by zaznacz color, a dla r max wybierz unlinked by sensor, aby umożliwić niezależne dopasowanie maksymalnej odpowiedzi sygnału przy nasycającym wiązaniu partnera do unieruchomionego białka. Na koniec kliknij fit curves, aby rozpocząć analizę regresji nieliniowej.

Przeanalizuj wyniki dopasowania, które obejmują nałożenie krzywych regresji na przebieg danych z czujników, wykresy rezyduów dopasowania oraz tabelę z wyznaczonymi wartościami parametrów i statystykami. Przedstawione zostały tutaj kinetyki wiązania i dysocjacji BLI w czasie rzeczywistym. Eksperyment rozpoczęto od 10-minutowego etapu linii bazowej, ponieważ czujniki zostały wcześniej jedynie krótko zwilżone, a następnie na czujniki naniesiono biotynilowaną epsilon.

W całym pozostałym przebiegu nie stwierdzono dysocjacji epsilon, co wynika z krzywej referencyjnej, do której nie dodano partnera wiążącego. Drugi sensor referencyjny nie zawierał unieruchomionego białka i wykazał niskie niespecyficzne wiązanie partnera wiążącego. W etapie asocjacji dla sensorów od A do F zastosowano różne stężenia F1 minus epsilon w celu globalnego dopasowania wyników i uzyskania najlepszych wartości dla stałej szybkości asocjacji oraz stałej dysocjacji równowagowej KD; wyniki zostały przetworzone, dając niebieskie przebiegi danych.

W tym przypadku ślad z czujnika referencyjnego odjęto od śladów próbek, aby skorygować nieswoiste wiązanie partnera wiążącego oraz dryft sygnału systemu. Na etapie analizy danych wszystkie krzywe dopasowano globalnie za pomocą modelu jeden do jednego. Globalne dopasowanie zakłada całkowną dysocjację partnera wiążącego.

Tutaj przedstawiono inny eksperyment, w którym enzym został związany z unieruchomionym na czujniku epsilon w obecności 1 mM ATP-ADP. Sprzyja to przyjęciu przez większość kompleksów F1 epsilon konformacji niehamującej, która łatwo ulega dysocjacji. Następnie czujniki przeniesiono do studzienek dysocjacyjnych zawierających bufor do analizy z różnymi ligandami. Wykazuje to wpływ różnych ligandów na konformację epsilon.

Na przykład ekspozycja na magnez A GP i fosforan gwałtownie spowolniła całkowitą dysocjację, co wskazuje, że epsilon zmienił konformację na ściśle związany stan inhibicyjny. Przy pierwszym konfigurowaniu analiz BLI ważne jest uwzględnienie kontroli w celu przetestowania niespecyficznego wiązania białka z sensorami oraz sprawdzenie, czy niespecyficzne wiązanie zmienia się znacząco w zależności od stężeń białek, które będą wykorzystywane. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat projektowania, programowania i analizowania testów BLI służących do pomiaru kinetyki oddziaływań białko-białko oraz zrozumieć znaczenie tych procesów.

BLI umożliwia bezpośrednie badanie wpływu małych ligandów na oddziaływania białko-białko.