Name: Trifosforany nukleozydów - od syntezy do charakterystyki biochemicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 22 s
Description: Poznaj syntezę i charakteryzację modyfikowanych trifosforanów nukleozydów metodą czteroetapową. Protokół obejmuje oczyszczanie chromatografią HPLC oraz analizę NMR i MALDI-TOF w celu zapewnienia wysokiej czystości związków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (granty nr PZ00P2_126430/1 i PZ00P2_144595). Prof. C. Leumann jest wdzięczny za udostępnienie przestrzeni laboratoryjnej i sprzętu, a także za jego ciągłe wsparcie. Pani Sue Knecht jest wdzięczna za owocne dyskusje.

1. Synteza modyfikowanych trifosforanów nukleozydów
Wybrane podejście syntetyczne jest zgodne z procedurą opracowaną przez Ludwiga i Ecksteina, ponieważ ta metoda jest ogólnie niezawodna i prowadzi do bardzo niewielu produktów ubocznych (Rysunek 1A)39.
<ol>
	<li>Odpowiednio odparowany nukleozyd chroniony przed 3'-OAc (zwykle 0,1 mmol) należy dwukrotnie odparować bezwodną pirydyną (2 ml), a następnie wysuszyć w próżni przez noc. W tym samym czasie wysuszyć pirofosforan tributyloamonu (0,13 mmol) w próżni przez noc.</li>
	<li>Rozpuścić nukleozyd w minimalnej ilości suchej pirydyny (0,2 ml) i dodać suchy dioksan (0,4 ml) jako współrozpuszczalnik. Na koniec dodać 2-chloro-1,3,2-benzodioksafosforin-4-on (0,11 mmol) i pozostawić do reakcji w temperaturze pokojowej przez 45 min. 
	Uwaga: Warto zauważyć, że szczególną ostrożność należy zachować w przypadku odczynnika 2-chloro-1,3,2-benzodioksafosforyno-4-onu. Rzeczywiście, nawet przechowywanie tego odczynnika w atmosferze gazu obojętnego nie wystarczy, aby zapobiec jego rozkładowi. Tak więc białe ciało stałe, które powstaje w tym rozkładzie może i powinno zostać zeskrobane przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować roztwór pirofosforanu tributyloamonu w suchym DMF (0,17 ml) i świeżo destylowanej tributyloaminy (58 μl; nigdy nie dodawać sit molekularnych). Powstały roztwór dodać do mieszaniny reakcyjnej (pojawia się biały osad, ale szybko znika) i pozostawić do reakcji w temperaturze pokojowej na 45 minut.</li>
	<li>Przygotować roztwór jodu (0,16 mmol) w pirydynie (0,98 ml) iH2O(20 μl) i dodać do mieszaniny reakcyjnej w celu utlenienia centrum Pα(III). Pozostaw powstały ciemny roztwór do mieszania w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Użyj 10% wodnego roztworu NaS2O3 do ugaszenia nadmiaru I2. Usunąć rozpuszczalnik w próżni (temperatura łaźni wodnej wyparki obrotowej musi być utrzymywana poniżej 30 °C). DodaćH2O(5 ml) i pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 30 minut w celu hydrolizy cyklicznego ugrupowania trifosforanowego.</li>
	<li>Na tym etapie zwykle usuwane są grupy ochronne (tj. 3'-OAc i grupy na łańcuchach bocznych zasady nukleotydowej). W związku z tym dodać NH4OH (30% w H2O, 10 ml) do ropy naftowej i mieszać przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej i usunąć rozpuszczalnik w próżni.</li>
	<li>Dodać 2 mlH2Oi podzielić na 2 probówki. Dodać 12 ml 2% roztworu NaClO4 w acetonie i wirować (1 000 x g) przez 30 minut. Ta procedura jest powtarzana po raz kolejny. Wytrącanie to pozwala na oddzielenie rozpuszczalników i odczynników użytych do syntezy od trifosforanu (który spowoduje wytrącenie), upraszczając w ten sposób następujące po tym oczyszczanie RP-HPLC.</li>
	<li>Po wysuszeniu na powietrzu oleistej pozostałości należy zanotować widmo 31P-NMR surowca (zgodnie ze standardowymi procedurami, patrz również wykaz materiałów i rysunek 3) i rozpuścić w 4 ml H2O. 
	Uwaga: Ta procedura syntezy koncentruje się głównie na wytwarzaniu zmodyfikowanych trifosforanów deoksynukleozydów, ale bardzo podobną procedurę można zastosować do ich odpowiedników RNA (po prostu przy użyciu prekursorów 2',3'-bis-O-acetylowanych).</li>
</ol>
2. Oczyszczanie HPLC zmodyfikowanych trifosforanów nukleozydów
<ol>
	<li>Przygotowanie 1 M roztworu podstawowego wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB):40
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór 1 mola trietyloaminy (139 ml) w ≈ 600 ml destylowanego i przefiltrowanegoH2O.</li>
		<li>Wprowadzić CO2 (za pomocą suchego lodu i bełkotki gazowej) do roztworu przy energicznym mieszaniu, aż do osiągnięcia pH 7,6 (zajmie to co najmniej 10 godzin). Ten roztwór podstawowy można przechowywać w lodówce przez okres do jednego miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>oczyszczanie:
	<ol>
		<li>Przygotować dwa roztwory buforowe z 1 M zapasu: 2 l 50 mM TEAB w wodzie ultraczystej (eluent A) i 1 l 50 mM TEAB w 50% MeCN (eluent B). Odgazowuje oba eluenty w próżni i mieszając przez 20 minut (należy zachować szczególną ostrożność, aby nie zmienić pH poprzez usunięcie CO2 podczas odgazowywania).</li>
		<li>Przygotować próbkę analityczną, rozpuszczając 10 μl surowego trifosforanu w 300 μl destylowanegoH2Oi wstrzyknąć do systemu HPLC wyposażonego w półpreparatywną kolumnę RP (C18) i stosując gradient w zakresie od 0 do 100% B w ciągu 40 minut (rysunek 4). Dostosować program HPLC zgodnie z Rt trifosforanu (który jest zwykle głównym pikiem na chromatogramie) i difosforanu (który ma nieco niższą Rt). Oczyścić surową mieszaninę w tych warunkach i usuwając wczesne frakcje, które mogą zawierać pewną ilość difosforanu.</li>
		<li>Połączyć wszystkie frakcje zawierające produkt i liofilizować (co jest preferowane niż parowanie na wyparce obrotowej w celu zminimalizowania hydrolizy do niepożądanego difosforanu). Kilkakrotnie odparować ultraczystą wodą (w celu usunięcia pozostałości trietyloaminy z eluentów). Ocenić czystość trifosforanu za pomocą NMR (zarówno 1H, jak i 31P NMR) i MALDI-TOF, stosując standardowe protokoły (patrz rysunek 5). Typowe plony uzyskiwane przy zastosowaniu tego protokołu mieszczą się zazwyczaj w przedziale 30-70%, w zależności od podłoża.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Reakcje przedłużania startera i polimeryzacja TdT
<ol>
	<li>Etykietowanie 5' końca podkładu
	<ol>
		<li>Zmieszać 30 pmol odpowiedniego startera (np. P1, Wykaz materiałów) z 4 μl 10x buforu kinazy polinukleotydowej (PNK), 3 μl γ-[32P]-ATP, 1 μl PNK i ddH2O (dla całkowitej objętości reakcji 40 μl). Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie dezaktywować kinazę termicznie (10 minut w temperaturze 70 °C).</li>
		<li>Podczas reakcji etykietowania należy przygotować kolumnę G10 Sephadex, zatykając końcówkę pipety o pojemności 1 ml silanizowaną watą szklaną i napełniając końcówkę roztworem G10 (10% w ddH2O, w autoklawie). Odwirować i przemyć trzykrotnie 500 μl ddH2O i jedno ostatnie płukanie 50 μl ddH2O. Przepuścić mieszaninę reakcyjną przez G10 (w celu usunięcia wolnej etykiety radioaktywnej).</li>
		<li>Żel oczyścić (STRONA 20%) znakowany radioizotopem starter i odzyskać przez zastosowanie metody zgniatania i namaczania (tj. elucja za pomocą 500 μl roztworu wodnego zawierającego 1% LiClO4 i 1 mMNEt 3 (pH 8) w temperaturze 72 °C przez 15 min). Osad etanolu i G10 odsalają eluowany oligonukleotyd.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja przedłużania podkładu
	<ol>
		<li>Wyżarzać 1 pmol znakowanego radioaktywnie startera P1, 10 pmol startera P1 i 10 pmol matrycy T1 (wykaz materiałów) w 10-krotnym buforze reakcyjnym (dostarczonym przez dostawcę polimerazy, która ma być użyta) poprzez umieszczenie probówki w gorącej (90-95 °C) wodzie i pozostawienie do stopniowego schładzania do temperatury pokojowej (przez 45 min).</li>
		<li>Umieścić probówkę na lodzie i dodać (kolejno) koktajl dNTP (zawierający zarówno zmodyfikowane, jak i naturalne trifosforany, końcowe stężenie 100 μM) oraz 1 U polimerazy DNA (Vent (egzo-), Klenow, Pwo lub 9°Nm) i uzupełnić wodą (dla całkowitej objętości reakcji 20 μl). Inkubować w optymalnej temperaturze roboczej enzymu (np. 60 °C przez 30 minut, gdy używany jest Vent (egzo-)).</li>
		<li>Dodać 20 μl roztworu zatrzymującego (formamid (70%), kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA; 50 mM), błękit bromofenolowy (0,1%), cyjanol ksylenowy (0,1 %)), podgrzać próbki (95 °C, 5 min), schłodzić (0 °C) i rozpuścić przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym. Wizualizacja za pomocą phosphorimager.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Polimeryzacja TdT
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 7 pmol jednoniciowego, nieznakowanego startera P2 (wykaz materiałów), 1 pmol startera znakowanego radioaktywnie w 1 μl buforu TdT 10x.</li>
		<li>Umieścić probówkę na lodzie i dodać (kolejno) koktajl dNTP (o odpowiednim stężeniu między 10 a 200 μM) oraz polimerazę TdT (4 j.). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Dodać 10 μl roztworu zatrzymującego, podgrzać próbki (95 °C, 5 min), schłodzić (0 °C) i rozpuścić przez denaturację w żelu poliakryloamidowym metodą elektroforezy (STRONA 15%). Wizualizacja za pomocą phosphorimager.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. PCR ze zmodyfikowanymi trifosforanami nukleozydów
<ol>
	<li>Zmieszać 8 pmol zarówno starterów do przodu, jak i do tyłu z 0,5 pmol matrycy, która ma być amplifikowana. Dodać 10x bufor reakcyjny i koktajl dNTP (dla końcowego stężenia 200 μM) i umieścić probówkę na lodzie. Dodać 1 j. polimerazy DNA i uzupełnićH2O, aby osiągnąć końcową objętość 20 μl. Przenieść mieszaninę do fiolki PCR i przeprowadzić 30 cykli PCR.</li>
	<li>Rozcieńczyć 6 μl 6 μl 2x buforu ładującego sacharozę i rozpuścić w elektroforezie agarozy 2% (barwionej bromkiem etydyny). Wizualizacja za pomocą phosphorimager.</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Włączenie modyfikacji do kwasów nukleinowych jest interesujące dla wielu zastosowań praktycznych, w tym rozwoju agentów antysensownych i antygenowych42,43, znakowania i funkcjonalnego znakowania oligonukleotydów41 oraz w wysiłkach na rzecz rozszerzenia alfabetu genetycznego44-46. Zmiany chemiczne i grupy funkcyjne są zwykle wprowadzane do kwasów nukleinowych poprzez zastosowanie standardowych i zautomatyzowanych protokołów syntezy w fazie stałej. Jednak bloki budulcowe fosforoamidytu musz...

5'-trifosforany nukleozydów ((d)NTP) reprezentują klasę ważnych biomolekuł, które biorą udział w niezliczonych procesach i funkcjach, począwszy od bycia uniwersalną walutą energii, a skończywszy na regulatorach metabolizmu komórkowego. Oprócz ich roli w tych fundamentalnych przemianach biologicznych, ich zmodyfikowane odpowiedniki rozwinęły się jako wszechstronna i łagodna platforma do wprowadzania grup funkcyjnych do oligonukleotydów, metodologia, która dobrze uzupełnia zautomatyzowaną syntezę w fazie stałej, która jest zwykle stosowana1,2. Rzeczywiście, pod warunkiem, że (d)NTP mogą działać jako substraty dla polimeraz RNA i DNA3, bogactwo grup funkcyjnych, w tym aminokwasy4-13, kwasy borowe14,15, nornbornen16, reszty diamentoidopodobne17, łańcuchy boczne do organokatalizy18, kwasy żółciowe19, a nawet oligonukleotydy20 mogą zostać wprowadzone do oligonukleotydów.
Poza tym, że stanowią wygodny wektor do funkcjonalizacji kwasów nukleinowych, zmodyfikowane dNTP mogą być wykorzystywane w SELEX i innych pokrewnych metodach kombinatorycznej selekcji in vitro do generowania zmodyfikowanych katalitycznych kwasów nukleinowych21-30 i aptamerów do różnych praktycznych zastosowań10,31-36. Uważa się, że dodatkowe łańcuchy boczne, które są wprowadzane przez polimeryzację zmodyfikowanych dNTP, zwiększają przestrzeń chemiczną, którą można zbadać podczas eksperymentu selekcyjnego i uzupełniają raczej ubogi funkcjonalny arsenał kwasów nukleinowych37. Jednak pomimo tych atrakcyjnych cech i niedawnego postępu poczynionego w rozwoju zarówno metod syntetycznych, jak i analitycznych, nie istnieje żadna uniwersalna i wysokowydajna procedura wytwarzania zmodyfikowanych trifosforanów nukleozydów2,38.
Celem tego obecnego protokołu jest rzucenie światła na (czasami) skomplikowane procedury prowadzące do syntezy i biochemicznej charakterystyki tych aktywowanych elementów budulcowych (Rysunek 1B). Szczególny nacisk zostanie położony na wszystkie syntetyczne szczegóły, które często są trudne do znalezienia lub są nieobecne w sekcjach eksperymentalnych, ale są kluczowe dla pomyślnego zakończenia ścieżki syntezy prowadzącej do izolacji czystych (d)NTP (Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>pirofosforan tributyloamonu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8533</td><td>Higroskopijne ciało stałe, przechowywać w Ar</td></tr><tr><td>2-Chloro-1,3,2-benzodioksafosforyno-4-onu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>324124</td><td>Wrażliwy</td></tr><tr><td>na wilgoć Pirydyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82704</td><td>Pod sitami molekularnymi</td></tr><tr><td>Dioksan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296309</td><td>Pod sitami molekularnymi</td></tr><tr><td>Dimetyloformamid (DMF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40248</td><td>Pod sitami molekularnymi</td></tr><tr><td>Acetonitryl&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>HPLC klasa</td></tr><tr><td>Trietyloamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90342</td><td></td></tr><tr><td>Tributyloamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90781</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>Milli-Q</td><td></td><td>dejonizowana i oczyszczona woda, autoklawizowana w obecności dietylopirowęglanu (DEPC)</td></tr><tr><td>Dwupirowęglan dietylu (DEPC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>159220</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-4-25</td><td></td></tr><tr><td>&#947;-[32P]-ATP</td><td>Hartmann Analytics</td><td>FP-301</td><td></td></tr><tr><td>Natural dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1420</td><td></td></tr><tr><td>Vent (exo-) Polimeraza DNA</td><td>NEB</td><td>M0257S</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA I, duży (Klenow) fragment</td><td>NEB</td><td>MO210S</td><td></td></tr><tr><td>9&deg; Nm Polimeraza DNA</td><td>NEB</td><td>MO260S</td><td></td></tr><tr><td>Końcowa deoksynukleotydylotransferaza (TdT)</td><td>Promega</td><td>M828A</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Pwo</td><td>Peqlab</td><td>01 01 5010</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>Thermo Scientific</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid/bisakryloamid (19:1, 40%)</td><td>Serva</td><td>10679.01</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Apollo Scientific</td><td>BIA1177</td><td></td></tr><tr><td>G10 Sephadex</td><td>Sigma</td><td>G10120</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Apollo Scientific</td><td>BIU4110</td><td></td></tr><tr><td>Półpreparatywna kolumna Jupiter RP-HPLC (5&#956; C18 300 & Aring ;)</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Q Thermal Cycler</td><td>Bioconcept</td><td>BYQ6042E</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki do PCR</td><td>Bioconcept</td><td>3220-00</td><td></td></tr><tr><td>System HPLC</td><td>Amersham Pharmacia Biotech</td><td></td><td>&Auml; kta basic 10/100</td></tr><tr><td>Wszystkie oligonukleotydy zostały zakupione od Microsynth i oczyszczone przez PAGE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&#039;-CAAGGACAAAATAC 
CTGTATTCCTT P1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&#039;-GACATCATGAGAGA 
CATCGCCTCTGGGCTA 
ATAGGACTTCTAAT 
CTGTAAGAGCAGATCC 
CTGGACAGGCAAGGAA 
TACAGGTATTTGTCCTTG T1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&#039;-GAATTCGATATCAAG P2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Więcej informacji na temat procedur i sprzętu eksperymentalnego można znaleźć w następujących artykułach: 
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F</td></tr></tbody></table>

trifosforany nukleozydów - od syntezy do charakterystyki biochemicznej

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Tradycyjna strategia wprowadzania funkcji chemicznych polega na wykorzystaniu syntezy w fazie stałej poprzez dołączanie odpowiednio zmodyfikowanych prekursorów fosforamidytu do powstającego łańcucha. Jednak warunki zastosowane podczas syntezy i ograniczenie do raczej krótkich sekwencji utrudniają zastosowanie tej metodologii. Z drugiej strony, zmodyfikowane trifosforany nukleozydów są aktywowanymi elementami budulcowymi, które zostały wykorzystane do łagodnego wprowadzenia wielu grup funkcyjnych do kwasów nukleinowych, strategii, która toruje drogę do wykorzystania zmodyfikowanych kwasów nukleinowych w szerokiej palecie praktycznych zastosowań, takich jak znakowanie funkcjonalne i generowanie rybozymów i DNAzymów. Jednym z głównych wyzwań jest zawiłość metodologii prowadzącej do izolacji i charakterystyki tych analogów nukleozydów.
	
W tym artykule wideo przedstawiamy szczegółowy protokół syntezy tych zmodyfikowanych analogów przy użyciu odczynników na bazie fosforu(III). Ponadto przedstawiono procedurę ich charakterystyki biochemicznej, ze szczególnym naciskiem na reakcje wydłużania starterów i polimeryzację ogonową TdT. Ten szczegółowy protokół będzie przydatny do tworzenia zmodyfikowanych dNTP i ich dalszego wykorzystania w biologii chemicznej.

Zmodyfikowane nukleozydotrifosforany są atrakcyjnymi celami syntetycznymi, ponieważ umożliwiają łatwe wprowadzanie szerokiego wachlarza grup funkcyjnych do kwasów nukleinowych41. Jednakże izolacja i charakterystyka tych aktywowanych bloków budulcowych często okazuje się być żmudna. W związku z tym uważa się, że przedstawione tutaj wyniki pomogą w śledzeniu poszczególnych etapów w ramach wyżej wspomnianych procedur syntetycznych i biochemicznych (Rysunek 1B).
W szcze...

Protokół opisany tutaj ma na celu wyjaśnienie i skrócenie licznych przeszkód na drodze skomplikowanej drogi prowadzącej do zmodyfikowanych trifosforanów nukleozydów. W związku z tym protokół ten ułatwia zarówno syntezę tych aktywowanych elementów budulcowych, jak i ich dostępność do praktycznych zastosowań.

Trifosforany nukleozydów - od syntezy do charakterystyki biochemicznej

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Ogólnym celem tego filmu jest zademonstrowanie procedury od syntezy zmodyfikowanych fosforanów nukleozydów do ich pełnej charakterystyki biochemicznej. Osiąga się to poprzez uprzednie przekształcenie odpowiednio chronionego prekursora nukleozydów w odpowiadający mu trifosforan poprzez zastosowanie czteroetapowej procedury "jeden garnek". Drugim krokiem jest oczyszczenie otrzymanego trifosforanu najpierw przez wytrącanie, a następnie przez wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami.Następnie analog trifosforanu charakteryzuje się magnetycznym rezonansem jądrowym i desorpcją laserową wspomaganą matrycą, czasem przelotu desorpcji i jonizacją lub NMR i Maloffem, aby zapewnić wysoką czystość. Ostatnim etapem są reakcje wydłużania startera i końcowej transferazy deoksynukleotydowej lub reakcje polimeryzacji TDT. Ostatecznie produkty reakcji, a tym samym akceptacja substratu przez trifosforan są analizowane za pomocą elektroforezy żelowej.Zaletą tej metody w porównaniu z innymi strategiami syntetycznymi, takimi jak podejście Borge'a, jest to, że powstaje mniej produktów ubocznych, a tym samym łatwiejsze oczyszczanie. Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w tej technice będą miały trudności, ponieważ jest to dość długa i skomplikowana procedura, która wymaga wiedzy z wielu dziedzin. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł, aby ta metoda została sfilmowana, gdy zsyntetyzowaliśmy zmodyfikowane fosforany i stwierdziliśmy, że znalezienie szczegółowej procedury jest dość trudne.Kolejną zaletą tej metody jest to, że można ją wykorzystać do rozwiązania innych problemów z zakresu modyfikowanych kwasów nukleinowych. Rzeczywiście, może być używany do selekcji enzymów DNA, które katalizują szeroki zakres reakcji. Ponadto metoda ta może być stosowana do funkcjonalnego znakowania kwasów nukleinowych.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy syntezy i oczyszczania są trudne do nauczenia, ponieważ trifosforany są polarnymi i aktywowanymi pochodnymi, z którymi należy obchodzić się ostrożnie. Aby rozpocząć współodparowanie odpowiednio chronionego hydroksylem nukleozydu o trzech pierwiastkach dwukrotnie z dwoma mililitrami bezwodnej puryny przed wysuszeniem w próżni przez noc. W tym samym czasie suchy pirofosforan amonu w próżni przez noc następnego dnia rozpuścił nukleozyd w minimum 200 mikrolitrach suchej pirydyny.Następnie dodaj 400 mikrolitrów suchego dioksanu jako rozpuszczalnika COS. Na koniec dodaj cykliczną pochodną fosforu trzy i pozwól mu reagować w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Następnie należy przygotować roztwór suchego pirofosforanu butyloamonu w 170 mikrolitrach suchego dimetyloformamidu i 58 mikrolitrach świeżo destylowanej tributyloaminy.Dodaj powstały roztwór do mieszaniny reakcyjnej i pozwól mu reagować w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Następnie przygotuj roztwór 160 mikromolowego jodu w 980 mikrolitrach puryny i 20 mikrolitrach wody. Dodać roztwór do mieszaniny reakcyjnej.W celu utlenienia centrum alfa fosforu. Pozostaw powstały ciemny roztwór do mieszania w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Użyj 10% wodnego roztworu tiosiarczanu sodu, aby ugasić nadmiar jodu.Usunąć rozpuszczalnik w próżni. Następnie dodaj pięć mililitrów wody i pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby zhydrolizować cykliczny trifosforan moty. Na tym etapie grupy ochronne są zwykle usuwane.W związku z tym dodać 30% wodorotlenku imodu do próbki surowej. Mieszaj przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej przed usunięciem rozpuszczalnika w próżni. Następnie dodaj dwa mililitry wody i podziel mieszaninę na rurki.Dodać 12 mililitrów 2% roztworu sodu na chloran w acetonie i wirować przez 30 minut przed powtórzeniem procedury. Jeszcze raz. Odczynniki stosowane w syntezie z trifosforanu wytrącą się, tworząc oleistą pozostałość i umożliwiając oddzielenie rozpuszczalników, a tym samym upraszczając wynikające z tego oczyszczanie HPLC w odwrotnej fazie znacznie po wysuszeniu olejnej pozostałości na powietrzu.Zapisać widmo P 31 NMR próbki surowej zgodnie ze standardowymi procedurami. Po NMR rozpuszczono oleistą pozostałość w czterech mililitrach wody destylowanej. Oczyszczanie HPLC rozpocząć od przygotowania 50-milimolowego wodorowęglanu trietyloamoniowego w ultraczystej wodzie jako EENT A i w 50% nitrylu acetylowym jako eent B, jak wyszczególniono w protokole tekstowym, odgazowuje oba EENT w próżni i mieszając przez 20 minut.Przygotować próbkę analityczną, rozpuszczając 10 mikrolitrów surowego trifosforanu w 300 mikrolitrach wody destylowanej. Następnie użyj gradientu w zakresie od 0%B do 100%B w 40 minut. Wstrzyknąć próbkę do systemu HPLC wyposażonego w półpreparatywną odwróconą kolumnę fazy C 18.Dostosuj program HPLC do czasu retencji trifosforanu i difosforanu. Oczyścić surową mieszaninę w tych warunkach i usuwając wczesne frakcje, które mogą zawierać pewną ilość difosforanu, połączyć wszystkie frakcje zawierające produkt i zamrozić na sucho. Następnie kilkakrotnie odparować z ultraczystą wodą.Oceń czystość trifosforanu za pomocą NMR i Maloffa, stosując standardowe protokoły. Typowe plony uzyskiwane przy zastosowaniu tego protokołu mieszczą się w zakresie od 30 do 70%, w zależności od podłoża dla pięciu podkładów i oznakowania podkładu. Wymieszać starter i odczynniki zgodnie z protokołem tekstowym i inkubować reakcję znakowania w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Podczas reakcji znakowania należy przygotować kolumnę Cidex G 10, zatykając jednomililitrową końcówkę pipety silosową watą szklaną i napełniając końcówkę roztworem G 10. Odwiruj i umyj trzy razy 500 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody i jedno końcowe pranie 50 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody. Po inkubacji reakcji znakowania, ciepło dezaktywuje kinazę na 10 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza.Następnie przepuść mieszaninę reakcyjną przez G 10. Aby usunąć wolny żel z etykietą radioaktywną, należy oczyścić znakowany radiowo starter i odzyskać przez zastosowanie metody zgniatania i namaczania, osadu etanolu i G 10 odsolić oligonukleotyd, w którym się wydostał. W przypadku reakcji przedłużania startera połączyć jeden mol PICA startera znakowanego radioaktywnie, P jeden 10 moli PICA startera, P jeden i 10 moli PICA matrycy, T jeden na 10 x bufor reakcyjny i uklęknąć w gorącej wodzie.Następnie stopniowo schładzaj do temperatury pokojowej przez 45 minut. Umieść probówkę na lodzie i dodaj fosforan nukleozydu lub koktajl DNTP i jedną jednostkę lodu polimerazy DNA. Zakończyć reakcję wodą o całkowitej objętości 20 mikrolitrów, inkubować w optymalnej temperaturze roboczej enzymu.Następnie dodaj 20 mikrolitrów roztworu zatrzymującego i podgrzewaj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Ostudzić, próbki w temperaturze zero stopni Celsjusza. Przed rozpuszczeniem przez denaturację elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.Wizualizuj pasma za pomocą imagera fosfonowego do polimeryzacji TDT, rozcieńczonego jednoniciowego nieznakowanego startera P dwa i znakowanego radiowo startera w jednym mikrolitrze buforu TDT. Umieść probówkę na lodzie i dodaj koktajl DNTP oraz polimerazę TDT, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji dodać 10 mikrolitrów roztworu zatrzymującego, a następnie podgrzać próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie schłodzić w temperaturze zero stopni Celsjusza.Po rozdzieleniu próbki przez denaturację elektroforezy w żelu poliakryloamidowym, należy zobrazować pasma za pomocą obrazowania fosfonowego. Pokazano tutaj typowe surowe widmo P 31 NMR zmodyfikowanego DNTP, w którym można zaobserwować charakterystyczne sygnały centrów fosforowych. Ponadto sygnały pochodzące ze strony difosforanu i monofosforanu.Na tym etapie zawsze obserwuje się produkty o wyższej zawartości fosforanów. Analiza HPLC z odwróconymi fazami surowej mieszaniny jest pokazana tutaj. Główny pik odpowiada pięciu pierwszym fosforanom, podczas gdy główny produkt uboczny, pięć pierwszych difosforanów, wykazuje nieco krótszy czas retencji.Wreszcie, po dokładnej fazie odwrotnej, oczyszczeniu HPLC, zmodyfikowany DNTP charakteryzuje się NMR i maldi, aby pokazać tutaj widmo Maloffa sulfonamidu, zmodyfikowany analog DUTP. Addukt sodu można zaobserwować przy masowym przeładowaniu 712,54 i nie ma śladu difosforanu. Zarówno widma NMR P 31, jak i NMR protonów mają kluczowe znaczenie dla oceny czystości zmodyfikowanego dps.Ponieważ obecność niepożądanego barwnika i monofosforanów daje zilustrowane charakterystyczne sygnały, oto wynik pierwotnych reakcji przedłużania z DUTP zmodyfikowanym histaminą trans proliną DATP i DCTP zmodyfikowanym kwasem walerianowym, stosowanym jako samotne modyfikacje jako kombinacje dwóch zmodyfikowanych DN dps lub razem, wraz z samotnym naturalnym DGTP. Na koniec przeanalizowano reprezentatywne reakcje polimeryzacji za pośrednictwem TDT z różnymi zmodyfikowanymi analogami DUTP za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z denaturacją. W tym kontekście, DUTP modyfikowany cis proliną i DUTP modyfikowany peptydami są najlepszymi substratami dla TDT.Ze względu na to, że wydajność ogonowania jest porównywalna lub przewyższa wydajność naturalnego DTTP, DUTP modyfikowany mocznikiem jest w tym kontekście raczej ubogim substratem. Ponieważ polidyspersja jest mało dyspersyjna, można zaobserwować oligonukleotydy o dłuższych rozmiarach Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu około tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że jądrowe fosforany cytrynowe są aktywowanymi przez naturę elementami budulcowymi, dlatego należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z nimi po ich utworzeniu.Naukowcy zajmujący się kwasami nukleinowymi wykorzystują tę metodę do badania selekcji kombinatorycznej w celu wygenerowania zmodyfikowanych aber i katalitycznych kwasów nukleinowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak syntetyzować i charakteryzować zmodyfikowane fosforany przy użyciu procedury czterech kroków pierwszego popu, po której następuje oczyszczanie HPLC w odwrotnej fazie i reakcje pierwotnego przedłużania. Niektóre szczegóły eksperymentalne, które normalnie nie znajdują się w sekcjach eksperymentalnych, staną się widoczne.Ta metoda może być stosowana w połączeniu z innymi technikami, takimi jak PCR, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania. Rzeczywiście, może być stosowany do oceny zgodności modyfikowanych trifosforanów z metodami selekcji in VIO.

nucleoside-triphosphates-from-synthesis-to-biochemical

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Nukleozydowe Trifosforany - Od Syntezy do Charakteryzacji Biochemicznej

Ten artykuł zawiera szczegółową procedurę syntezy, oczyszczania i charakterystyki dodekamerów RNA modyfikowanych w pozycji C2'-O. Analizy fotometryczne UV-vis i dichroizmu kołowego służą do ilościowego określania i charakteryzowania aspektów strukturalnych, tj. jednoniciowych lub dwuniciowych.

Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2'-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego

Tutaj prezentujemy protokoły syntezy nukleozydów disacharydowych metodą regioselektywnej O-glikozylacji rybonukleozydów poprzez tymczasową ochronę ich ugrupowań 2',3'-diolu za pomocą cyklicznego estru boronowego. Metoda ta ma zastosowanie do kilku niezabezpieczonych nukleozydów, takich jak adenozyna, guanozyna, cytydyna, urydyna, 5-metylurydyna i 5-fluorourydyna, aby uzyskać odpowiednie nukleozydy disacharydowe.

Regioselektywna O-glikozylacja nukleozydów poprzez tymczasową ochronę 2',3'-diolem przez ester boronowy do syntezy nukleozydów disacharydowych

Testy aktywności oparte na NMR zostały opracowane w celu identyfikacji i scharakteryzowania inhibitorów dwóch nukleozydowych enzymów rybohydrolazy. Przedstawiono protokoły dla początkowych testów związków chemicznych przy 500 μM i 250 μM, testów dawka-odpowiedź do oznaczania wartości IC50, testów przesiewowych licznika detergentów, testów przesiewowych licznika rozcieńczeń skokowych oraz testów w całych komórkach E. coli.

Testy aktywności oparte na NMR do określania inhibicji związku, wartości IC50, aktywności artefaktów i aktywności całych komórek rybohydrolaz nukleozydowych

Tu opisano jest precyzyjna i możliwa do powtórzenia metoda ilościowego oceny nukleozydów/nukleotydów in vivo w roślinach. Ta metoda wykorzystuje HPLC-MS/MS.

Przygotowanie próbki roślinnej do pomiaru zawartości nukleozydów/nukleotydów za pomocą HPLC-MS/MS

Oligonukleotydowe 5′-trifosforany są wszechobecnymi składnikami w podstawowych szlakach biologicznych i są coraz częściej wykorzystywane w zastosowaniach biotechnologicznych. W tym miejscu opisano techniki rutynowej syntezy i oczyszczania oligonukleotydowych 5′-trifosforanów, zaczynając od oligonukleotydów przygotowanych standardowymi technikami syntezy automatycznej.

Chemiczna trifosforylacja oligonukleotydów

Izolacja i charakterystyka domeny lipidów A lipopolisacharydu (LPS) od bakterii Gram-ujemnych dostarcza wglądu w oparte na powierzchni komórek mechanizmy oporności na antybiotyki, przeżywalność i sprawność bakterii, oraz jak chemicznie zróżnicowane gatunki molekularne lipidów A różnie modulują wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Izolacja i charakterystyka chemiczna lipidu A z bakterii Gram-ujemnych

Synteza i charakterystyka trzeciorzędowej biblioteki amidów peptydów

Synteza, aktywacja i charakterystyka celowo zaprojektowanych metaloorganicznych materiałów szkieletowych jest wyzwaniem, zwłaszcza gdy bloki budulcowe są niekompatybilne lub niechciane polimorfy są termodynamicznie faworyzowane nad pożądanymi formami. Opisujemy, w jaki sposób zastosowania wspomaganej rozpuszczalnikiem wymiany łączników, dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego proszku w kapilarnach i aktywacji poprzez suszenie nadkrytycznym CO2 mogą rozwiązać niektóre z tych wyzwań.

Synteza i charakterystyka funkcjonalizowanych struktur metaloorganicznych

Celem tego manuskryptu jest zademonstrowanie prostej metody przygotowania ynonów z materiałów wyjściowych chlorku acylu i soli alkinylotrifluoroboranu potasu. Reakcja jednogarnkowa przebiega szybko w obecności trójchlorku boru bez wykluczenia powietrza i wilgoci.

Bezmetalowa synteza ynonów z chlorków acylu i soli alkinylotrifluoroboranu potasu

Kompleksy fosforowo-wodorowe rutenu są powszechnie stosowane w jednorodnych reakcjach katalitycznych, takich jak uwodornienie. Przedstawiono syntezę szeregu nowych kompleksów rutenu trójzębnego zawierających ligand N-trifosu N(CH2PPh2)3. Dodatkowo opisano reakcję stechiometryczną kompleksu dwuwodorkowego Ru–N-trifosu z kwasem lewulinowym.

Synteza, charakterystyka i reaktywność szeregu kompleksówPh N-trifosu rutenu

Poznaj syntezę i charakteryzację modyfikowanych trifosforanów nukleozydów metodą czteroetapową. Protokół obejmuje oczyszczanie chromatografią HPLC oraz analizę NMR i MALDI-TOF w celu zapewnienia wysokiej czystości związków.

Trifosforany nukleozydów - od syntezy do charakterystyki biochemicznej

Przeglądaj więcej filmów