Trifosforany nukleozydów - od syntezy do charakterystyki biochemicznej

Ogólnym celem tego filmu jest zademonstrowanie procedury od syntezy zmodyfikowanych fosforanów nukleozydów do ich pełnej charakterystyki biochemicznej. Osiąga się to poprzez uprzednie przekształcenie odpowiednio chronionego prekursora nukleozydów w odpowiadający mu trifosforan poprzez zastosowanie czteroetapowej procedury "jeden garnek". Drugim krokiem jest oczyszczenie otrzymanego trifosforanu najpierw przez wytrącanie, a następnie przez wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami.

Następnie analog trifosforanu charakteryzuje się magnetycznym rezonansem jądrowym i desorpcją laserową wspomaganą matrycą, czasem przelotu desorpcji i jonizacją lub NMR i Maloffem, aby zapewnić wysoką czystość. Ostatnim etapem są reakcje wydłużania startera i końcowej transferazy deoksynukleotydowej lub reakcje polimeryzacji TDT. Ostatecznie produkty reakcji, a tym samym akceptacja substratu przez trifosforan są analizowane za pomocą elektroforezy żelowej.

Zaletą tej metody w porównaniu z innymi strategiami syntetycznymi, takimi jak podejście Borge'a, jest to, że powstaje mniej produktów ubocznych, a tym samym łatwiejsze oczyszczanie. Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w tej technice będą miały trudności, ponieważ jest to dość długa i skomplikowana procedura, która wymaga wiedzy z wielu dziedzin. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł, aby ta metoda została sfilmowana, gdy zsyntetyzowaliśmy zmodyfikowane fosforany i stwierdziliśmy, że znalezienie szczegółowej procedury jest dość trudne.

Kolejną zaletą tej metody jest to, że można ją wykorzystać do rozwiązania innych problemów z zakresu modyfikowanych kwasów nukleinowych. Rzeczywiście, może być używany do selekcji enzymów DNA, które katalizują szeroki zakres reakcji. Ponadto metoda ta może być stosowana do funkcjonalnego znakowania kwasów nukleinowych.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy syntezy i oczyszczania są trudne do nauczenia, ponieważ trifosforany są polarnymi i aktywowanymi pochodnymi, z którymi należy obchodzić się ostrożnie. Aby rozpocząć współodparowanie odpowiednio chronionego hydroksylem nukleozydu o trzech pierwiastkach dwukrotnie z dwoma mililitrami bezwodnej puryny przed wysuszeniem w próżni przez noc. W tym samym czasie suchy pirofosforan amonu w próżni przez noc następnego dnia rozpuścił nukleozyd w minimum 200 mikrolitrach suchej pirydyny.

Następnie dodaj 400 mikrolitrów suchego dioksanu jako rozpuszczalnika COS. Na koniec dodaj cykliczną pochodną fosforu trzy i pozwól mu reagować w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Następnie należy przygotować roztwór suchego pirofosforanu butyloamonu w 170 mikrolitrach suchego dimetyloformamidu i 58 mikrolitrach świeżo destylowanej tributyloaminy.

Dodaj powstały roztwór do mieszaniny reakcyjnej i pozwól mu reagować w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Następnie przygotuj roztwór 160 mikromolowego jodu w 980 mikrolitrach puryny i 20 mikrolitrach wody. Dodać roztwór do mieszaniny reakcyjnej.

W celu utlenienia centrum alfa fosforu. Pozostaw powstały ciemny roztwór do mieszania w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Użyj 10% wodnego roztworu tiosiarczanu sodu, aby ugasić nadmiar jodu.

Usunąć rozpuszczalnik w próżni. Następnie dodaj pięć mililitrów wody i pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby zhydrolizować cykliczny trifosforan moty. Na tym etapie grupy ochronne są zwykle usuwane.

W związku z tym dodać 30% wodorotlenku imodu do próbki surowej. Mieszaj przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej przed usunięciem rozpuszczalnika w próżni. Następnie dodaj dwa mililitry wody i podziel mieszaninę na rurki.

Dodać 12 mililitrów 2% roztworu sodu na chloran w acetonie i wirować przez 30 minut przed powtórzeniem procedury. Jeszcze raz. Odczynniki stosowane w syntezie z trifosforanu wytrącą się, tworząc oleistą pozostałość i umożliwiając oddzielenie rozpuszczalników, a tym samym upraszczając wynikające z tego oczyszczanie HPLC w odwrotnej fazie znacznie po wysuszeniu olejnej pozostałości na powietrzu.

Zapisać widmo P 31 NMR próbki surowej zgodnie ze standardowymi procedurami. Po NMR rozpuszczono oleistą pozostałość w czterech mililitrach wody destylowanej. Oczyszczanie HPLC rozpocząć od przygotowania 50-milimolowego wodorowęglanu trietyloamoniowego w ultraczystej wodzie jako EENT A i w 50% nitrylu acetylowym jako eent B, jak wyszczególniono w protokole tekstowym, odgazowuje oba EENT w próżni i mieszając przez 20 minut.

Przygotować próbkę analityczną, rozpuszczając 10 mikrolitrów surowego trifosforanu w 300 mikrolitrach wody destylowanej. Następnie użyj gradientu w zakresie od 0%B do 100%B w 40 minut. Wstrzyknąć próbkę do systemu HPLC wyposażonego w półpreparatywną odwróconą kolumnę fazy C 18.

Dostosuj program HPLC do czasu retencji trifosforanu i difosforanu. Oczyścić surową mieszaninę w tych warunkach i usuwając wczesne frakcje, które mogą zawierać pewną ilość difosforanu, połączyć wszystkie frakcje zawierające produkt i zamrozić na sucho. Następnie kilkakrotnie odparować z ultraczystą wodą.

Oceń czystość trifosforanu za pomocą NMR i Maloffa, stosując standardowe protokoły. Typowe plony uzyskiwane przy zastosowaniu tego protokołu mieszczą się w zakresie od 30 do 70%, w zależności od podłoża dla pięciu podkładów i oznakowania podkładu. Wymieszać starter i odczynniki zgodnie z protokołem tekstowym i inkubować reakcję znakowania w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Podczas reakcji znakowania należy przygotować kolumnę Cidex G 10, zatykając jednomililitrową końcówkę pipety silosową watą szklaną i napełniając końcówkę roztworem G 10. Odwiruj i umyj trzy razy 500 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody i jedno końcowe pranie 50 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody. Po inkubacji reakcji znakowania, ciepło dezaktywuje kinazę na 10 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza.

Następnie przepuść mieszaninę reakcyjną przez G 10. Aby usunąć wolny żel z etykietą radioaktywną, należy oczyścić znakowany radiowo starter i odzyskać przez zastosowanie metody zgniatania i namaczania, osadu etanolu i G 10 odsolić oligonukleotyd, w którym się wydostał. W przypadku reakcji przedłużania startera połączyć jeden mol PICA startera znakowanego radioaktywnie, P jeden 10 moli PICA startera, P jeden i 10 moli PICA matrycy, T jeden na 10 x bufor reakcyjny i uklęknąć w gorącej wodzie.

Następnie stopniowo schładzaj do temperatury pokojowej przez 45 minut. Umieść probówkę na lodzie i dodaj fosforan nukleozydu lub koktajl DNTP i jedną jednostkę lodu polimerazy DNA. Zakończyć reakcję wodą o całkowitej objętości 20 mikrolitrów, inkubować w optymalnej temperaturze roboczej enzymu.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów roztworu zatrzymującego i podgrzewaj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Ostudzić, próbki w temperaturze zero stopni Celsjusza. Przed rozpuszczeniem przez denaturację elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.

Wizualizuj pasma za pomocą imagera fosfonowego do polimeryzacji TDT, rozcieńczonego jednoniciowego nieznakowanego startera P dwa i znakowanego radiowo startera w jednym mikrolitrze buforu TDT. Umieść probówkę na lodzie i dodaj koktajl DNTP oraz polimerazę TDT, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji dodać 10 mikrolitrów roztworu zatrzymującego, a następnie podgrzać próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie schłodzić w temperaturze zero stopni Celsjusza.

Po rozdzieleniu próbki przez denaturację elektroforezy w żelu poliakryloamidowym, należy zobrazować pasma za pomocą obrazowania fosfonowego. Pokazano tutaj typowe surowe widmo P 31 NMR zmodyfikowanego DNTP, w którym można zaobserwować charakterystyczne sygnały centrów fosforowych. Ponadto sygnały pochodzące ze strony difosforanu i monofosforanu.

Na tym etapie zawsze obserwuje się produkty o wyższej zawartości fosforanów. Analiza HPLC z odwróconymi fazami surowej mieszaniny jest pokazana tutaj. Główny pik odpowiada pięciu pierwszym fosforanom, podczas gdy główny produkt uboczny, pięć pierwszych difosforanów, wykazuje nieco krótszy czas retencji.

Wreszcie, po dokładnej fazie odwrotnej, oczyszczeniu HPLC, zmodyfikowany DNTP charakteryzuje się NMR i maldi, aby pokazać tutaj widmo Maloffa sulfonamidu, zmodyfikowany analog DUTP. Addukt sodu można zaobserwować przy masowym przeładowaniu 712,54 i nie ma śladu difosforanu. Zarówno widma NMR P 31, jak i NMR protonów mają kluczowe znaczenie dla oceny czystości zmodyfikowanego dps.

Ponieważ obecność niepożądanego barwnika i monofosforanów daje zilustrowane charakterystyczne sygnały, oto wynik pierwotnych reakcji przedłużania z DUTP zmodyfikowanym histaminą trans proliną DATP i DCTP zmodyfikowanym kwasem walerianowym, stosowanym jako samotne modyfikacje jako kombinacje dwóch zmodyfikowanych DN dps lub razem, wraz z samotnym naturalnym DGTP. Na koniec przeanalizowano reprezentatywne reakcje polimeryzacji za pośrednictwem TDT z różnymi zmodyfikowanymi analogami DUTP za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z denaturacją. W tym kontekście, DUTP modyfikowany cis proliną i DUTP modyfikowany peptydami są najlepszymi substratami dla TDT.

Ze względu na to, że wydajność ogonowania jest porównywalna lub przewyższa wydajność naturalnego DTTP, DUTP modyfikowany mocznikiem jest w tym kontekście raczej ubogim substratem. Ponieważ polidyspersja jest mało dyspersyjna, można zaobserwować oligonukleotydy o dłuższych rozmiarach Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu około tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że jądrowe fosforany cytrynowe są aktywowanymi przez naturę elementami budulcowymi, dlatego należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z nimi po ich utworzeniu.

Naukowcy zajmujący się kwasami nukleinowymi wykorzystują tę metodę do badania selekcji kombinatorycznej w celu wygenerowania zmodyfikowanych aber i katalitycznych kwasów nukleinowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak syntetyzować i charakteryzować zmodyfikowane fosforany przy użyciu procedury czterech kroków pierwszego popu, po której następuje oczyszczanie HPLC w odwrotnej fazie i reakcje pierwotnego przedłużania. Niektóre szczegóły eksperymentalne, które normalnie nie znajdują się w sekcjach eksperymentalnych, staną się widoczne.

Ta metoda może być stosowana w połączeniu z innymi technikami, takimi jak PCR, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania. Rzeczywiście, może być stosowany do oceny zgodności modyfikowanych trifosforanów z metodami selekcji in VIO.