Sieciowanie in vivo w celu wyizolowania kompleksów białkowych z zarodków Drosophila

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest uzyskanie kompleksów białkowych z żywych embrionów muszki owocówki przy użyciu metody sieciowania in vivo. Osiąga się to poprzez umieszczenie tysięcy much w klatce populacyjnej i zebranie wczesnych embrionów. Następnie białka są sieciowane in vivo za pomocą formaldehydu, co stabilizuje ich wewnętrzne kompleksy białkowe.

Następnie z embryos poddanych sieciowaniu przygotowuje się ekstrakty białkowe w celu immunoprecypitacji kompleksów białkowych. Wyniki pozwalają zidentyfikować wyizolowane kompleksy białkowe za pomocą analizy Western blot. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak tradycyjna izolacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem podejść in vitro, jest fakt, że to podejście in vivo pozwala na uchwycenie przejściowych, lecz funkcjonalnie istotnych oddziaływań białko-białko, których nie udałoby się wykryć za pomocą tradycyjnych metod in vitro.

Technikę zaprezentuje dr Min Gao, stażysta podoktorski z mojego laboratorium. Najpierw wymieszaj wodę z agarem muchowym za pomocą mieszadła magnetycznego. Poddaj tę mieszaninę autoklawowaniu podczas cyklu pracy autoklawu.

Wymieszaj sacharozę z sokiem jabłkowym i podgrzej roztwór do 70 °C na płycie grzejnej. Następnie połącz mieszaniny i pozostaw je do ostygnięcia na 15 minut, aż agar stężeje. Przygotuj świeży roztwór czterohydroksybenzoesanu metylu w etanolu.

Jest to konserwant. Należy dodać go do mieszaniny utwardzającej i mieszać przez pięć minut. Następnie wlać mieszaninę do plastikowych lub styropianowych płytek o powierzchni 300 cm², unikając powstawania pęcherzyków powietrza.

Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu tygodnia. Przygotować klatkę populacyjną zawierającą od 40 do 50 000 much, z której będą zbierane embriony. Do klatki populacyjnej dołączyć dwie świeże płytki z pożywką z mąki kukurydzianej i melasy, posypując ich powierzchnię około 4 g drożdży piekarskich.

Pozostaw muchy na tych płytkach na 48 godzin w temperaturze 25 °C. Po dwóch dniach posyp około jednego grama drożdży na dwie płytki z agarem z sokiem jabłkowym, a następnie zastąp płytki w klatce z populacją tymi nowymi płytkami. Po godzinie zastąp płytki w klatce kolejnymi dwiema płytkami tego samego rodzaju.

Dwie płytki zbiorcze, z których muchy korzystały przez godzinę, będą zawierać zarodki. Zawiesić zarodki wraz z wodą na płytce i za pomocą pędzla pomóc w ich usunięciu. Następnie przelać je przez dwuwarstwowe sito.

Warstwa wierzchnia to stalowe sito o oczkach 850 µm, a warstwa dolna to stalowe sito o oczkach 75 µm. Zarodki zbiorą się na gęstszym sicie, skąd należy je oddzielić od grubych zanieczyszczeń za pomocą pędzla. Przenieś zarodki do koszyczka z gęstej nylonowej siatki wykonanego z górnej części probówki stożkowej o pojemności 50 ml.

Opłukać zarodki w wodzie i osuszyć je w siatce, dociskając do ręcznika papierowego. Następnie zanurzyć zarodki w 50% roztworze wybielacza na trzy minuty. Zamieszać zarodki w wybielaczu, a następnie dokładnie opłukać je wodą i osuszyć przez dociskanie.

Następnie zarodki zanurza się w izopropanolu na około 15 sekund. Delikatne mieszanie w sposób wirowy pozwala rozbić skupiska zarodków; proces ten nie powinien trwać dłużej niż 30 sekund. Zarodki należy osuszyć za pomocą papierowego ręcznika, a następnie przenieść do roztworu heptanu na pięć minut.

Często pipetować heptan nad zarodkami, aby zapobiec ich zlepianiu się, osuszyć zarodki za pomocą papierowego ręcznika i przepłukać je w PBST. Po trzech minutach płukania zarodków przenieść je wraz z siatką do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBST. Usunąć siatkę, pozostawiając zarodki w roztworze, i odmierzyć od 100 do 300 µl zawiesiny zarodków.

Odstaw próbki do osadzenia na dnie, odessaj PBST i niezwłocznie przystąp do sieciowania zarodków. Najpierw dodaj do zarodków 10 milliliters świeżo przygotowanego 0.2% formaldehydu w PBST. Inkubuj je przy łagodnym mieszaniu w temperaturze 25 degrees Celsius przez 10 minut.

Po 10 minutach reakcji należy pozwolić zarodkom opaść na dno i usunąć roztwór. Następnie należy szybko zastąpić go 10 mililitrami 0,25 M glicyny w PBST, aby przerwać reakcję. Probowkę należy inkubować wstrząsając przez kolejne pięć minut. Po przerwaniu reakcji należy usunąć roztwór i wypłukać zarodki trzykrotnie, używając za każdym razem 10 mililitrów PBST.

Usunąć pozostały PBST za pomocą aspiracji pipetą i przechowywać zarodki w temperaturze -80°C do momentu ich użycia. Używając homogenizatora typu dounce i 2 mL buforu lizującego, zhomogenizować 500 µL sieciowanych zarodków. Wymaga to około 15 ruchów dopasowanym tłuczkiem.

Przenieś lizat do probówki do mikrocentryfugi i ustaw urządzenie na łagodne kołysanie przez 15 minut. Następnie odwiruj lizat przy 16 000 GS przez pięć minut. Przenieś nadsącz do probówki o pojemności 15 ml.

Osad można zutylizować. Do nadpływu należy teraz dodać 40 µL zawiesiny kulek przeciw-HA. Pozostawić na wytrząsarce na około 2,5 godziny, aż koniugacja z kuleczkami zostanie zakończona.

Odwirować kuleczki z prędkością 2 500 G przez pięć minut. Pozostawić w probówce około 250 µL supernatantu i w nim resuspender kuleczki. Przenieść zawiesinę kuleczek na filtr o wielkości porów 10 µm w kolumnie wirówkowej.

Usuń roztwór, wirując próbkę przez 10 s przy 12 000 Gs. Przemyj kuleczki na kolumnie 200 µL buforu do płukania i ponownie odwiruj. Powtórz tę czynność łącznie trzy razy. Następnie dodaj do kuleczek 40 µL buforu do elucji i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez 15 minut.

W tym czasie delikatnie wstrząsaj probówką co pięć minut, aby zebrać osad. Ponownie odwiruj kolumnę z prędkością 12 000 GS przez 10 sekund. Skuteczność sieciowania oraz oczyszczania sieciowanych kompleksów dwóch białek przeanalizowano za pomocą elektroforezy SDS-PAGE na żelu gradientowym od 3 do 7%, a następnie przeprowadzono western blot. Do monitorowania zakresu sieciowania i testowania różnych stężeń formaldehydu w protokole wykorzystano embriony wykazujące ekspresję tagu HA oraz białka GFP.

Większość GFP w potraktowanych embrionach nie uległa sieciowaniu, zatem proces ten nie zachodzi. Losowo sieciowany kompleks dwóch białek porównano z kontrolą nie sieciowaną. Dwa białka, które nie uległy sieciowaniu, widoczne są jako pasmo 285 kilodalton, które migruje swobodnie.

Produkt sieciowania dwóch białek jest cięższy i migruje wolniej w surowym lizacie białkowym. Około połowy z tych dwóch białek uległo sieciowaniu in vivo. Elucja partnerów oddziałujących za pomocą peptydu HA wykazała w frakcji elucyjnej obecność zarówno kompleksu, jak i wolnego białka, po uprzednim przemyciu kulek.

Po usunięciu SDS otrzymuje się w większości wolne białka w probówce przy minimalnej ilości kompleksów. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak spektrometria mas, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące metod, na przykład w celu identyfikacji komponentów białkowych w wyizolowanych kompleksach.