Name: Sieciowanie in vivo w celu wyizolowania kompleksów białkowych z zarodków Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj metodę sieciowania in vivo do izolacji kompleksów białkowych z zarodków Drosophila. Technika umożliwia uchwycenie przejściowych interakcji białkowych kluczowych dla funkcji komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jordanowi Davisowi, Yanyanowi Linowi, Ericowi Schadlerowi i Jimiao Zhengowi za ich pomoc techniczną w tym badaniu. Praca ta była wspierana przez grant NSF CAREER MCB-1054962 dla A.L.A.

1. Przygotowanie dużych talerzy z sokiem jabłkowym
<ol>
	<li>Aby przygotować 4 płytki, dodać 375 ml H2O, 11,25 g agaru muchowego i mieszadło do kolby o pojemności 1 000 ml. To jest Mix A. Autoklaw Mix A z luźno zakręconą pokrywą kolby w jednym 30-minutowym cyklu sterylizacji dla produktów płynnych.</li>
	<li>Do zlewki o pojemności 500 ml dodaj 125 ml soku jabłkowego, 12,5 g cukru stołowego i tabliczkę mieszanki. To jest Mix B. Podgrzej Mix B na podgrzewanej platformie, mieszając i utrzymuj temperaturę na poziomie około 70 °C, aż do zakończenia autoklawowania Mix A.</li>
	<li>Po zakończeniu autoklawowania Mix A przenieś Mix B do Mix A. Delikatnie mieszaj połączoną mieszaninę i pozwól jej ostygnąć przez 15 minut. Unikaj nadmiernego chłodzenia i wynikającego z tego zestalenia agaru przed dodaniem środka konserwującego.</li>
	<li>Przygotować 10% (wagowo/objętościowo) roztwór 4-hydroksybenzoesanu metylu w etanolu. To będzie działać jako środek konserwujący. Dodać 3,75 ml roztworu do powyższej mieszanki soku jabłkowego i agaru. Mieszaj przez kolejne 5 minut.</li>
	<li>Wlej 125 ml mieszanki soku jabłkowego i agaru ze środkiem konserwującym do każdej 300 cm2 plastikowej lub styropianowej płyty. Pozwól mu ostygnąć do RT i zestalić się. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas nalewania. 
	nuta: Talerze z agarem z sokiem jabłkowym są natychmiast gotowe do użycia. Niewykorzystane talerze przykryć przezroczystymi foliami i przechowywać w temperaturze 4°C przez okres do tygodnia.</li>
</ol>
2. Pobieranie zarodków Drosophila i leczenie przed sieciowaniem
<ol>
	<li>Załaduj klatkę populacyjną około 40 000 do 50 000 much, z których zostaną pobrane zarodki.</li>
	<li>Przygotuj dwie płytki, z których każda zawiera 125 ml standardowej mąki kukurydzianej i melasy12 i posyp każdy talerz około 4 g suszonych drożdży piekarskich. Umieścić te płytki w klatce populacyjnej w inkubatorze o temperaturze 25 °C na 48 godzin w celu tuczenia muszek.</li>
	<li>Podgrzej 2 talerze z sokiem jabłkowym i agarem do temperatury 25 °C. Posyp każdy talerz około 1 g suszonych drożdży piekarskich. Umieść 2 płytki w klatce populacyjnej, aby rozpocząć zbieranie zarodków w wieku 0-1 godziny.</li>
	<li>Wyjmij talerze pod koniec 1-godzinnej zbiórki. Wymień na 2 nowe talerze, jeśli potrzebna jest kolejna runda zbierania.</li>
	<li>Dodaj tyle wody, aby przykryć płytki i delikatnie zawieś zarodki za pomocą cienkiego pędzla. Przelej zawieszone zarodki przez dwuwarstwowe sito wykonane z siatki drucianej ze stali nierdzewnej. 
	nuta: Wierzchnia warstwa wykonana jest z siatki o średniej wielkości porów (850 μm), która zbiera duże części muchy, przepuszczając zarodki. Dolna warstwa wykonana jest z drobnej siatki (75 μm), która zbiera zarodki, przepuszczając drożdże i wodę.</li>
	<li>Za pomocą cienkiego pędzla przenieś zebrane zarodki do kosza do pobierania wykonanego z probówki o pojemności 50 ml i drobnej nylonowej siatki. Krótko opłucz zarodki wodą, a następnie osusz siatkę na ręcznikach papierowych do wyschnięcia.</li>
	<li>Zanurz zarodki w 50% wybielaczu, delikatnie mieszając na 3 minuty. Dokładnie spłucz wodą, aby usunąć resztki wybielacza. Osusz siatkę na ręcznikach papierowych do wyschnięcia.</li>
	<li>Zanurz zdekorionowane zarodki w izopropanolu z delikatnym mieszaniem na 15 sekund lub do momentu rozpadu grudek wielozarodkowych (nie powinno to trwać dłużej niż 30 sekund). Osusz siatkę na ręcznikach papierowych, aby dokładnie wyschły.</li>
	<li>Zanurz zarodki w heptanie na 5 minut, używając pipety, aby rozprowadzić heptan po zarodkach, aby utrzymać je w zawieszeniu. Osusz siatkę na ręcznikach papierowych do wyschnięcia.</li>
	<li>Płukać zarodki strumieniami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, pH 7,4 (PBS) zawierającej 0,1% Triton X-100 (PBST) przez 3 min.</li>
	<li>Zdemontować kosz do pobierania i przenieść zarodki wraz z siatką do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBST. Delikatnie odwróć rurkę, aby zmyć zarodki z siatki.</li>
	<li>Usuń siatkę z tuby. Ustaw probówkę w pozycji pionowej i pozwól zarodkom opaść na dno rurki grawitacyjnie. 
	nuta: Oczekuje się, że około 100 - 300 μl zarodków zostanie pobranych w ciągu 1 godziny z jednej klatki.</li>
	<li>Usuń PBST i natychmiast kontynuuj sieciowanie.</li>
</ol>
3. Sieciowanie in vivo pobranych zarodków
<ol>
	<li>Przygotować 0,2% formaldehydu w PBST bezpośrednio przed użyciem. Dodać 10 ml utrwalacza formaldehydu do zarodków i inkubować w temperaturze 25 °C, delikatnie mieszając na wytrząsarce obrotowej przez 10 minut. Wyrzuć niewykorzystany utrwalacz do końca dnia.</li>
	<li>Ugasić reakcję sieciowania
	<ol>
		<li>Pod koniec sieciowania pozwól zarodkom opaść na dno probówki.</li>
		<li>Usuń roztwór formaldehydu. Natychmiast dodać 10 ml 0,25 M glicyny do PBST, aby wygasić reakcję sieciowania. Inkubować w temperaturze 25 °C z delikatnym mieszaniem na wytrząsarce obrotowej przez 5 minut.</li>
		<li>Pozwól zarodkom opaść na dno probówki. Usunąć roztwór hartowniczy. Umyj zarodki trzykrotnie 10 ml PBST.</li>
		<li>Całkowicie usunąć roztwór płuczący PBST za pomocą pipety. Przechowywać zarodki w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki białka i immunoprecypitacja
<ol>
	<li>Homogenizować 500 μl usieciowanych zarodków za pomocą homogenizatora Dounce w 2 ml buforu do lizy (0,5 M mocznika, 0,01% SDS, 2% Triton-X 100, 2 mM fluorku fenylometanosulfonylu [PMSF] i koktajl inhibitorów proteazy w PBS). 
	nuta: Wykonaj te i następne kroki w RT, chyba że określono inaczej.</li>
	<li>Przenieś lizat do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i delikatnie kołysz się na obrotowej platformie przez 15 minut, aby zapewnić dokładną lizę. Odwirować lizat przy 16 000 x g przez 5 minut, aby osadzać resztki komórkowe. Przechowywać supernatant w czystej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać 40 μl zawiesiny z kulek agarozy anty-HA do supernatantu i inkubować na platformie obrotowej przez 2,5 godziny.</li>
	Granulki osadzać <li>przez odwirowanie przy 2 500 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant, ale pozostawić około 250 μl w probówce. Zawiesić kulki w pozostałym supernatantze i przenieść do kolumny wirowej o pojemności 1,5 ml z filtrem porowym 10 μm.</li>
	<li>Odwirować kolumnę wirową o stężeniu 12 000 x g przez 10 sekund i odrzucić przepływ.</li>
	<li>Przemyć kulki, dodając 200 μl buforu do przemywania (0,1 M glicyny, 1 M NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,1% Tween-20, w PBS). Odwirować kolumnę o stężeniu 12 000 x g przez 10 sekund i wyrzucić płukanie. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Dodać 40 μl buforu elucyjnego (2 mg/ml peptydu HA w PBS) do kulek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut, delikatnie mieszając co 5 minut. Odwirować kolumnę o stężeniu 12 000 x g przez 10 sekund i zebrać eluat.</li>
	<li>Potwierdzić elucję kompleksu za pomocą analizy western-blot przy użyciu przeciwciała anty-HA13.</li>
</ol>

<ol><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome research. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA+binding+sites+by+CLIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq.</a> Methods. , (2013).</li>
<li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+mass+spectrometry+%3A+JMS%22%5BJournal%5D)">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).</li>
<li>Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+role+of+specific+Tudor+domains+in+Tudor-Aubergine+protein+complex+assembly+and+distribution+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis.</a> Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).</li>
<li>Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Tudor+domains+in+germline+development+and+polar+granule+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture.</a> Development. 133, 4053-4062 (2006).</li>
<li>Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+gene+required+for+assembly+of+the+germ+plasm+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster.</a> Cell. 43, 97-104 (1985).</li>
<li>Thomson, T., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tudor+is+essential+for+polar+granule+assembly+and+pole+cell+specification%2C+but+not+for+posterior+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning.</a> Genesis. 40, 164-170 (2004).</li>
<li>Arkov, A. L., Ramos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+RNA-protein+granules%3A+insight+from+the+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Building RNA-protein granules: insight from the germline.</a> Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).</li>
<li>Gao, M., Arkov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+organelles%3A+Structure+and+role+of+germ+granules+in+the+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+reproduction+and+development%22%5BJournal%5D)">Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline.</a> Molecular reproduction and development. , (2012).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+methylarginine-dependent+recognition+of+Aubergine+by+Tudor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor.</a> Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).</li>
<li>Liu, N., Han, H., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasa+promotes+Drosophila+germline+stem+cell+differentiation+by+activating+mei-P26+translation+by+directly+interacting+with+a+%28U%29-rich+motif+in+its+3%5BTitle%5D)+AND+%22UTR.+Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3.</a> UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).</li>
<li>Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatthews%2C+KA+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+new+polar+granule+components+in+Drosophila+reveals+P+body+and+ER+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins.</a> Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).</li>
<li>Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein-protein+interactions+using+in+vivo+cross-linking+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry.</a> Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).</li>
<li>Klockenbusch, C., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+formaldehyde+cross-linking+for+protein+interaction+analysis+of+non-tagged+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1.</a> J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).</li>
<li>Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li>
<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694(2006).</li>
<li>Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+facets+interacts+with+vasa+in+the+Drosophila+pole+plasm+and+protects+it+from+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation.</a> Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Formaldehyd jest powszechnie stosowany jako odczynnik sieciujący do identyfikacji interakcji białko-białko i białko-kwas nukleinowy. Jego dobra rozpuszczalność i przepuszczalność błony komórkowej, wraz z kompatybilnością z dalszymi procedurami spektrometrii mas, sprawiają, że formaldehyd jest idealnym kandydatem do zastosowań wewnątrzkomórkowych3,15-17. W szczególności z powodzeniem wykorzystano go do identyfikacji mRNA związanych z Vasa, krytyczną helikazą RNA komórki rozrodczej u Drosophila11</...

Izolacja wielopodjednostkowych zespołów białkowych i kompleksów DNA- lub RNA-białkowych jest przeprowadzana w celu identyfikacji kompleksów białkowych, loci genomowych rozpoznawanych przez białka regulatorowe wiążące DNA lub cele RNA białek wiążących RNA. Różne metody umożliwiają identyfikację całego genomu miejsc DNA rozpoznawanych przez czynniki transkrypcyjne lub białka chromatyny (ChIP-seq)1 oraz cele RNA związane z danym białkiem wiążącym RNA (CLIP-seq)2. Biblioteki cDNA pochodzących z RNA lub celów DNA są następnie głęboko sekwencjonowane. Metody te wykorzystują sieciowanie chemiczne lub indukowane promieniowaniem UV w celu ustabilizowania kompleksów, a następnie immunoprecypitację (IP) przeciwciałem przeciwko składnikowi białkowemu badanego kompleksu.
Podczas rozwoju organizmu, wiele kompleksów białkowych tworzy się przejściowo. Dlatego tak ważne jest przeanalizowanie składu i funkcji tych kompleksów in vivo, aby zrozumieć mechanizmy molekularne kontrolujące rozwój. Taka analiza in vivo byłaby lepsza od podejścia in vitro, ponieważ praktycznie niemożliwe jest odtworzenie natywnych stężeń oddziałujących składników i komórkowego środowiska biochemicznego in vitro. W tym miejscu demonstrujemy podejście in vivo, które z powodzeniem stosujemy do izolowania dużych kompleksów białkowych z zarodków Drosophila. W tej metodzie kompleksy białkowe w żywych zarodkach są sieciowane z niskim stężeniem formaldehydu, a następnie kompleksy białkowe będące przedmiotem zainteresowania są izolowane przez IP z przeciwciałem przeciwko znanemu składnikowi kompleksów, a następnie oczyszczane żelem kompleksów i analiza spektrometrii mas w celu identyfikacji nieznanych składników kompleksu. Ponieważ formaldehyd jest w stanie przenikać przez błonę komórkową i ma zakres sieciowania 2,3-2,7A3, kompleksy białkowe mogą być sieciowane in vivo, a składniki kompleksu prawdopodobnie znajdują się blisko siebie. W artykule opisujemy tę metodę na przykładzie izolacji kompleksu białkowego Tudor (Tud). Tud jest białkiem linii zarodkowej, które jest niezbędne do rozwoju linii zarodkowej4-7. Białko to zawiera 11 domen Tud, o których wiadomo, że oddziałują z metylowanymi argininami lub lizynami innych polipeptydów8-10.
Poprzednio wygenerowaliśmy transgeniczną linię Drosophila, która wyraża oznaczoną HA funkcjonalną Tud5 i dlatego specyficzne przeciwciało anty-HA jest używane do ściągania kompleksu Tud po usieciowaniu.
Oprócz wiązań białkowo-białkowych, formaldehyd może generować wiązania krzyżowe kwas-białko nukleinowy i jest używany w eksperymentach ChIP-seq. Co więcej, u Drosophila sieciowanie in vivo formaldehydem umożliwiło identyfikację celu RNA białka helikazyVasa RNA 11.
Chociaż w tym artykule opisujemy metodę sieciowania in vivo i oczyszczania kompleksów białkowych z zarodków Drosophila, ta metoda może być dostosowana do innych organizmów i tkanek.

<table><tbody><tr><td>Drosophila agar</td><td>Lab Scientific (http://www.labscientific.com/)</td><td>FLY-8020-1</td><td>Nie sterylizuj w autoklawie mieszanki wody i agaru przez dłuższy czas, ponieważ spowoduje to, że płytki soku jabłkowego staną się kruche</td></tr><tr><td>4-hydroksybenzoesan metylu</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>H5501</td><td>Inna nazwa: TEGOSEPT</td></tr><tr><td>Klatka populacyjna</td><td>Flystuff ( http://www.flystuff.com/)</td><td>59-104</td><td></td></tr><tr><td>Drobna siatka nylonowa</td><td>Flystuff (http://www.flystuff.com/)</td><td>57-102</td><td>Podczas wykonywania kosza zbiorczego należy przyciąć siatkę nieco większą niż otwór nasadki rurki sokoła, aby zapewnić szczelne uszczelnienie</td></tr><tr><td>Homogenizator Dounce</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>D8938-1SET</td><td>Przed użyciem schłodzić homogenizator na lodzie i wstępnie spłukać zimnym buforem do lizy, aby zapobiec degradacji białek</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy&nbsp;</td><td>Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)</td><td>4693132001</td><td>PBS może być stosowany do przygotowania stężonego roztworu podstawowego inhibitora proteazy</td></tr><tr><td>Anty-HA kulki agarozowe</td><td>MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>W skład zestawu wchodzi również peptyd HA oraz kolumny spinowe HA-peptide</td></tr><tr><td></td><td>MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>Przygotować do dawki 2 mg/ml z PBS&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolumna wirująca</td><td>MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>Kolumny wirujące są częścią zestawu</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td></td><td></td>BP26324</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Heptan</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>H350-4</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)</td><td>AM9625</td><td>Rozcieńczyć od 10X do 1X wodą nanoczystą przed użyciem</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0724</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0730</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>P7626-1G</td><td>Przygotować 200 mM roztwór podstawowy w izopropanolu, a następnie rozcieńczyć do stężenia roboczego 2 mM w buforze do lizy</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>I8896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>15-ml probówki</td><td>USA Scientific (http://www.usascientific.com/)</td><td>1475-0511</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td>marki</td><td></td> Clorox <td>Rozcieńczyć równą objętością wody nanoczystej, aby uzyskać 50% wybielacz</td></tr><tr><td>50-ml probówki</td><td>BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Sito wierzchniej warstwy</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>04-884-1AK</td><td></td></tr><tr><td>Sito dolnej warstwy</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>04-884-1BA</td><td></td></tr></tbody></table>

sieciowanie in vivo w celu wyizolowania kompleksów białkowych z zarodków drosophila

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Wiele procesów komórkowych jest kontrolowanych przez wielopodjednostkowe kompleksy białkowe. Często kompleksy te tworzą się przejściowo i wymagają natywnego środowiska do złożenia. Dlatego, aby zidentyfikować te funkcjonalne kompleksy białkowe, ważne jest, aby ustabilizować je in vivo przed lizą komórek i późniejszym oczyszczeniem. Tutaj opisujemy metodę stosowaną do izolowania dużych kompleksów białkowych w dobrej wierze z zarodków Drosophila. Metoda ta opiera się na przenikaniu zarodków i stabilizacji kompleksów wewnątrz zarodków poprzez sieciowanie in vivo przy użyciu niskiego stężenia formaldehydu, który może łatwo przenikać przez błonę komórkową. Następnie interesujący kompleks białkowy jest oczyszczany immunologicznie, a następnie oczyszczany żelem i analizowany za pomocą spektrometrii mas. Metodę tę ilustrujemy za pomocą oczyszczania kompleksu białek Tudorów, który jest niezbędny do rozwoju linii zarodkowej. Tudor to duże białko, które zawiera wiele domen Tudorów - małych modułów, które oddziałują z metylowanymi argininami lub lizynami docelowych białek. Metoda ta może być dostosowana do izolacji natywnych kompleksów białkowych z różnych organizmów i tkanek.

Skuteczność sieciowania oraz pomyślną puryfikację sieciowanego kompleksu białkowego Tud przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE na żelu gradientowym 3% - 7% (przedstawionym na Rysunku 1), a następnie za pomocą western blot (Rysunek 2).
Celem zastosowania żelu stopniowanego 3% - 7% jest efektywna separacja sieciowanego kompleksu białka Tud od pozostałego niesieciowanego białka Tud oraz zagęszczenie kompleksu. W zastosowanych powyżej warunkach sieciowania in vivo...

Wieloskładnikowe kompleksy białkowe odgrywają kluczową rolę podczas funkcjonowania i rozwoju komórek. W tym miejscu opisujemy metodę stosowaną do izolowania natywnych kompleksów białkowych z zarodków Drosophila po sieciowaniu in vivo, a następnie oczyszczeniu usieciowanych kompleksów w celu późniejszej analizy strukturalno-funkcjonalnej.

Sieciowanie in vivo w celu wyizolowania kompleksów białkowych z zarodków Drosophila

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest uzyskanie kompleksów białkowych z żywych embrionów muszki owocówki przy użyciu metody sieciowania in vivo. Osiąga się to poprzez umieszczenie tysięcy much w klatce populacyjnej i zebranie wczesnych embrionów. Następnie białka są sieciowane in vivo za pomocą formaldehydu, co stabilizuje ich wewnętrzne kompleksy białkowe.Następnie z embryos poddanych sieciowaniu przygotowuje się ekstrakty białkowe w celu immunoprecypitacji kompleksów białkowych. Wyniki pozwalają zidentyfikować wyizolowane kompleksy białkowe za pomocą analizy Western blot. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak tradycyjna izolacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem podejść in vitro, jest fakt, że to podejście in vivo pozwala na uchwycenie przejściowych, lecz funkcjonalnie istotnych oddziaływań białko-białko, których nie udałoby się wykryć za pomocą tradycyjnych metod in vitro.Technikę zaprezentuje dr Min Gao, stażysta podoktorski z mojego laboratorium. Najpierw wymieszaj wodę z agarem muchowym za pomocą mieszadła magnetycznego. Poddaj tę mieszaninę autoklawowaniu podczas cyklu pracy autoklawu.Wymieszaj sacharozę z sokiem jabłkowym i podgrzej roztwór do 70 °C na płycie grzejnej. Następnie połącz mieszaniny i pozostaw je do ostygnięcia na 15 minut, aż agar stężeje. Przygotuj świeży roztwór czterohydroksybenzoesanu metylu w etanolu.Jest to konserwant. Należy dodać go do mieszaniny utwardzającej i mieszać przez pięć minut. Następnie wlać mieszaninę do plastikowych lub styropianowych płytek o powierzchni 300 cm², unikając powstawania pęcherzyków powietrza.Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu tygodnia. Przygotować klatkę populacyjną zawierającą od 40 do 50 000 much, z której będą zbierane embriony. Do klatki populacyjnej dołączyć dwie świeże płytki z pożywką z mąki kukurydzianej i melasy, posypując ich powierzchnię około 4 g drożdży piekarskich.Pozostaw muchy na tych płytkach na 48 godzin w temperaturze 25 °C. Po dwóch dniach posyp około jednego grama drożdży na dwie płytki z agarem z sokiem jabłkowym, a następnie zastąp płytki w klatce z populacją tymi nowymi płytkami. Po godzinie zastąp płytki w klatce kolejnymi dwiema płytkami tego samego rodzaju.Dwie płytki zbiorcze, z których muchy korzystały przez godzinę, będą zawierać zarodki. Zawiesić zarodki wraz z wodą na płytce i za pomocą pędzla pomóc w ich usunięciu. Następnie przelać je przez dwuwarstwowe sito.Warstwa wierzchnia to stalowe sito o oczkach 850 µm, a warstwa dolna to stalowe sito o oczkach 75 µm. Zarodki zbiorą się na gęstszym sicie, skąd należy je oddzielić od grubych zanieczyszczeń za pomocą pędzla. Przenieś zarodki do koszyczka z gęstej nylonowej siatki wykonanego z górnej części probówki stożkowej o pojemności 50 ml.Opłukać zarodki w wodzie i osuszyć je w siatce, dociskając do ręcznika papierowego. Następnie zanurzyć zarodki w 50% roztworze wybielacza na trzy minuty. Zamieszać zarodki w wybielaczu, a następnie dokładnie opłukać je wodą i osuszyć przez dociskanie.Następnie zarodki zanurza się w izopropanolu na około 15 sekund. Delikatne mieszanie w sposób wirowy pozwala rozbić skupiska zarodków; proces ten nie powinien trwać dłużej niż 30 sekund. Zarodki należy osuszyć za pomocą papierowego ręcznika, a następnie przenieść do roztworu heptanu na pięć minut.Często pipetować heptan nad zarodkami, aby zapobiec ich zlepianiu się, osuszyć zarodki za pomocą papierowego ręcznika i przepłukać je w PBST. Po trzech minutach płukania zarodków przenieść je wraz z siatką do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBST. Usunąć siatkę, pozostawiając zarodki w roztworze, i odmierzyć od 100 do 300 µl zawiesiny zarodków.Odstaw próbki do osadzenia na dnie, odessaj PBST i niezwłocznie przystąp do sieciowania zarodków. Najpierw dodaj do zarodków 10 milliliters świeżo przygotowanego 0.2% formaldehydu w PBST. Inkubuj je przy łagodnym mieszaniu w temperaturze 25 degrees Celsius przez 10 minut.Po 10 minutach reakcji należy pozwolić zarodkom opaść na dno i usunąć roztwór. Następnie należy szybko zastąpić go 10 mililitrami 0,25 M glicyny w PBST, aby przerwać reakcję. Probowkę należy inkubować wstrząsając przez kolejne pięć minut. Po przerwaniu reakcji należy usunąć roztwór i wypłukać zarodki trzykrotnie, używając za każdym razem 10 mililitrów PBST.Usunąć pozostały PBST za pomocą aspiracji pipetą i przechowywać zarodki w temperaturze -80°C do momentu ich użycia. Używając homogenizatora typu dounce i 2 mL buforu lizującego, zhomogenizować 500 µL sieciowanych zarodków. Wymaga to około 15 ruchów dopasowanym tłuczkiem.Przenieś lizat do probówki do mikrocentryfugi i ustaw urządzenie na łagodne kołysanie przez 15 minut. Następnie odwiruj lizat przy 16 000 GS przez pięć minut. Przenieś nadsącz do probówki o pojemności 15 ml.Osad można zutylizować. Do nadpływu należy teraz dodać 40 µL zawiesiny kulek przeciw-HA. Pozostawić na wytrząsarce na około 2,5 godziny, aż koniugacja z kuleczkami zostanie zakończona.Odwirować kuleczki z prędkością 2 500 G przez pięć minut. Pozostawić w probówce około 250 µL supernatantu i w nim resuspender kuleczki. Przenieść zawiesinę kuleczek na filtr o wielkości porów 10 µm w kolumnie wirówkowej.Usuń roztwór, wirując próbkę przez 10 s przy 12 000 Gs. Przemyj kuleczki na kolumnie 200 µL buforu do płukania i ponownie odwiruj. Powtórz tę czynność łącznie trzy razy. Następnie dodaj do kuleczek 40 µL buforu do elucji i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez 15 minut.W tym czasie delikatnie wstrząsaj probówką co pięć minut, aby zebrać osad. Ponownie odwiruj kolumnę z prędkością 12 000 GS przez 10 sekund. Skuteczność sieciowania oraz oczyszczania sieciowanych kompleksów dwóch białek przeanalizowano za pomocą elektroforezy SDS-PAGE na żelu gradientowym od 3 do 7%, a następnie przeprowadzono western blot. Do monitorowania zakresu sieciowania i testowania różnych stężeń formaldehydu w protokole wykorzystano embriony wykazujące ekspresję tagu HA oraz białka GFP.Większość GFP w potraktowanych embrionach nie uległa sieciowaniu, zatem proces ten nie zachodzi. Losowo sieciowany kompleks dwóch białek porównano z kontrolą nie sieciowaną. Dwa białka, które nie uległy sieciowaniu, widoczne są jako pasmo 285 kilodalton, które migruje swobodnie.Produkt sieciowania dwóch białek jest cięższy i migruje wolniej w surowym lizacie białkowym. Około połowy z tych dwóch białek uległo sieciowaniu in vivo. Elucja partnerów oddziałujących za pomocą peptydu HA wykazała w frakcji elucyjnej obecność zarówno kompleksu, jak i wolnego białka, po uprzednim przemyciu kulek.Po usunięciu SDS otrzymuje się w większości wolne białka w probówce przy minimalnej ilości kompleksów. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak spektrometria mas, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące metod, na przykład w celu identyfikacji komponentów białkowych w wyizolowanych kompleksach.

an-vivo-crosslinking-approach-to-isolate-protein-complexes-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In vivo metoda crosslinkingu do izolowania kompleksów białkowych z zarodków Drosophila

Opisujemy usprawniony protokół przygotowywania preparatów typu „fillet” (filetowanie) zarodków Drosophila o określonych genotypach. Protokół ten umożliwia efektywne przeprowadzanie różnorodnych przesiewów genetycznych. Pozwala on również na doskonałą wizualizację struktur w późnym stadium rozwoju zarodka.

Żywa dyssekcja zarodków Drosophila: Usprawnione metody przesiewania kolekcji mutantów za pomocą barwienia przeciwciałami

Przepuszczalny przez błony komórkowe czynnik sieciujący DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizuje przejściowe i nietrwałe oddziaływania in vivo, co umożliwia ich izolację przy użyciu rygorystycznych technik oczyszczania kompleksów białkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy technikę sieciowania komórek hodowlanych, a następnie izolacji kompleksów białkowych metodą immunoprecypitacji.

Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Opisujemy metodę rozdzielania organelli według gęstości w żywych embrionach Drosophila. Embriony są zatapiane w agarze i poddawane wirowaniu. Technika ta pozwala na powtarzalne rozdzielenie głównych organelli wzdłuż osi przednio-tylnej embrionu. Metoda ta ułatwia przeprowadzanie eksperymentów kolokalizacyjnych i pozwala na uzyskanie frakcji organelli do analizy biochemicznej oraz eksperymentów z transplantacją.

In-vivo wirowanie zarodków Drosophila

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Ten protokół pokazuje, jak można użyć testu ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji in situ białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila. Dzięki tej technice wykazano, że duże dyski i Hu-li tai shao tworzą kompleks w regionie postsynaptycznym, związek wcześniej zidentyfikowany poprzez koimmunoprecypitację.

Wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Celem tego protokołu jest zapewnienie prostego i taniego podejścia do zbierania zarodków Drosophila na średnią skalę (0,5-1 g) i przygotowywania ekstraktów białkowych, które mogą być używane w dalszych zastosowaniach proteomicznych, takich jak spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS).

Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Poznaj metodę sieciowania in vivo do izolacji kompleksów białkowych z zarodków Drosophila. Technika umożliwia uchwycenie przejściowych interakcji białkowych kluczowych dla funkcji komórkowych.

Sieciowanie in vivo w celu wyizolowania kompleksów białkowych z zarodków Drosophila

Przeglądaj więcej filmów