Profilowanie transkryptu i metabolitów w celu oceny drzewa tytoniowego i topoli jako surowca dla przemysłu biotechnologicznego

Ogólnym celem tej procedury jest ustalenie i optymalizacja danych sekwencjonowania metabolitów i RNA z materiału liści drzewa tytoniowego w celu oszacowania zorientowanego na biologię systemową. Osiąga się to poprzez uprzednie zebranie materiału biologicznego z rozwojowej serii liści. Drugim krokiem jest przeprowadzenie ekstrakcji materiału przy użyciu odpowiednich rozpuszczalników w zależności od późniejszej analizy.

Następnie metabolity i węglowodory są mierzone za pomocą chromatografii gazowej, spektrometrii mas lub GCMS, a transkrypty są analizowane za pomocą akwizycji danych sekwencjonowania RNA. Ostatecznie połączenie profilowania metabolitów i profilowania transkrypcyjnego za pomocą sekwencjonowania RNA wykorzystuje się do pokazania, w jaki sposób liście drzewa tytoniowego wytwarzają długołańcuchowe węglowodory i inne ważne związki. Metoda ta może być stosowana do identyfikacji i ilościowego określania ważnych użytecznych metabolitów wytwarzanych w liściach drzewa tytoniowego.

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w metabolom drzewa tytoniowego. Może być również stosowany do innych systemów, takich jak tytoń lub gatunki pokrewne. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ liście drzewa tytoniowego są trudne do ekstrakcji dobrego RNA.

W tym filmie multi Bioo PRO zobaczysz, jak członkowie grupy FERNA wyodrębniają i profilują metabolizowanie. Korzystając z GCMS, zobaczysz również, jak członek z Fraser Group ekstrahuje węglowodory, a także jeden członek z mojej własnej grupy, który wyekstrahuje RNA do sekwencjonowania RNA Zacznij od uprawy roślin neko Oceana Glauca w doniczkach o średnicy 30 centymetrów zawierających M dwa profesjonalne podłoża do uprawy, jak wyszczególniono w protokole tekstowym w celu przygotowania pierwotnych metabolitów, Zbierz liście i łodygi rośliny i natychmiast zamroź materiał Liofilizuj zamrożone materiały roślinne przez liofilizację przez trzy dni, a następnie zmiel liofilizowane próbki za pomocą młyna mieszającego z metalowymi kulkami, podwielokrotność powstałych drobno zmielonych suchych materiałów do dwumililitrowej probówki wirówkowej lub szklanej fiolki. Następnie podnieś 10 miligramów liści lub 20 miligramów łodygi zmielonego suchego materiału roślinnego do dwóch mililitrów zakręcanych rurek z okrągłym dnem.

Dodaj 1,4 mililitra 100% metanolu i wiruj przez 10 sekund. Następnie dodaj 60 mikrolitrów żeberka atolu jako wewnętrzny wzorzec ilościowy przed wirowaniem. Przez dodatkowe 10 sekund dodaj jedną kulkę ze stali nierdzewnej i homogenizuj materiał za pomocą młynka miksującego przez dwie minuty w częstotliwości 25 Hz po odwirowaniu przez 10 minut.

Przy 11 000 razy większej grawitacji przenieść supernatant do szklanej fiolki. Dodaj 750 mikrolitrów chloroformu i 1,5 mililitra wody przed wirowaniem mieszanki przez 10 sekund. Następnie przenieś 150 mikrolitrów z górnej fazy do świeżej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej.

Następnie wysuszyć próbki za pomocą odkurzacza szybkoobrotowego. Konieczne jest, aby próbki były redukowane do stanu suchego przez okres od trzech do 24 godzin, aż nie będzie w nich żadnych pozostałości cieczy. Po wyschnięciu dodaj 40 mikrolitrów chlorowodorku metyny.

Następnie potrząsaj mieszanką w poziomym wytrząsarce z blokiem grzewczym przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj 70 mikrolitrów mieszanki M-S-T-F-A, a następnie ponownie wstrząsaj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odkręć krople na pokrywie przez krótkie odwirowanie przed przeniesieniem płynu do szklanych fiolek odpowiednich do analizy GC MS.

Podążając za GCMS, analizuj dane, konfigurując oprogramowanie do analizy danych spektrometrii mas i wybierając analizę danych do przetworzenia. Przygotować tabelę wykrytych pików zainteresowania zgodnie z klasą złożoną. Identyfikuj piki za pomocą koalicji związków wzorcowych, a następnie opisuj wykryte piki za pomocą analizy spektrometrii mas, algorytmów charakterystyki strukturalnej, przeglądu literatury i wyszukiwania w bazie danych metabolitów do ekstrakcji węglowodorów.

Zanurz około 200 miligramów świeżo zebranych liści ncoa glauco w stanie niewypłacalności na dwie do 20 minut, usuń liście i całkowicie wysusz rozpuszczalniki przez odparowanie rotacyjne. Następnie ponownie zawieś próbki w jednym mililitrze heksanu klasy HPLC. Przejdź do przeprowadzenia analizy GCM próbek przy użyciu parametrów, które są szczegółowo opisane w protokole tekstowym.

Wstępnie przetworzyć składniki chromatogramu za pomocą zautomatyzowanego MS. System dekonwolucji i identyfikacji oraz NIST 98 MS. Biblioteka. Potwierdzić identyfikację nasyconych długołańcuchowych węglowodorów typu acan, porównując czasy retencji i klasyczne wzorce fragmentacji ze znanymi autentycznymi wzorcami. Następnie należy określić ilościowo węglowodory, porównując zintegrowane obszary pików z krzywymi dawka-odpowiedź.

Zbudowany na podstawie autentycznych standardów, oblicz średnie i błąd standardowy średnich za pomocą oprogramowania Excel. Protokół ten łączy ekstrakcję RNA TRIOL z łatwym zestawem RN w celu uzyskania wysokiej jakości RNA: zmiel 100 miligramów zamrożonego materiału roślinnego w dwumililitrowych probówkach wirówkowych z metalową kulką za pomocą młynka mieszającego. Po homogenizacji próbki dodaj jeden mililitr triolu po odwirowaniu materiału przez 10 minut w temperaturze 12 000 razy grawitacji i czterech stopniach Celsjusza.

Przenieść supernatant do nowej probówki reakcyjnej. Dodaj 200 mikrolitrów chloroformu i kilkakrotnie odwróć probówkę przed inkubacją przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu mieszaniny przez 15 minut.

Tak jak poprzednio, przenieś górną fazę wodną do nowej probówki reakcyjnej. Dodaj około 2,5 objętości etanolu. Odwróć probówkę kilka razy i inkubuj przez 30 minut w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Następnie przenieś próbkę, w tym osad, do kolumny wirowej. Odwirować kolumnę przez 15 sekund przy 8 000 razy większej grawitacji i odrzucić przepływ. Dodać 700 mikrolitrów buforu płuczącego RW jeden, który znajduje się w zestawie ekstrakcyjnym, do kolumny wirowej i wirówki.

Ponownie, po odrzuceniu przepływu, dodaj 500 mikrolitrów drugiego buforu myjącego, RPE również dostarczanego przez zestaw do kolumny wirowej. Ponownie odwirować kolumnę i odrzucić przepływ przed dodaniem większej ilości buforu RPE i odwirowaniem. Tak jak poprzednio, umieść kolumnę wirową w nowej 1,5-mililitrowej probówce reakcyjnej i dodaj 50 mikrolitrów wirówki wodnej wolnej od RNA, kolumnę na jedną minutę przy 8 000 razy grawitacji, aby wymyć RNA.

Usuń resztki DNA za pomocą zestawu bez DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Na koniec określ jakość RNA. RNA powinno mieć liczbę integralności RNA powyżej ośmiu przed wysłaniem RNA do sekwencjonowania nowej generacji.

Profil HPLC przedstawia reprezentatywny wynik analizy izoprenoidowej ekstraktów z liści ncoa glauca. Różne ISOPRENOIDY C 40 i wyższe zostały wykryte za pomocą detektora z matrycą fotodiodową. Piki zostały oznaczone adnotacjami na podstawie chromatografii kodowej i porównania spektralnego między autentycznymi wzorcami.

Dwa chromatogramy MS są wynikiem analizy metabolitów pierwotnych z NCOA, liści glauco i materiału łodygowego. Podano również widmo MS piku odpowiadającego serynie, jako przykład pokazano reprezentatywne wyjście bioanalizatora użytego do określenia jakości RNA. Dwa główne piki na chromatogramie odpowiadają rybosomom 18 s i 25 s, przy czym RNA wskazuje na nienaruszony RNA w tej próbce.

Dodatkowe piki rozdrobnionego rybosomalnego RNA pojawiłyby się w przypadku częściowo lub silnie zdegradowanego RNA po opanowaniu. Technikę tę można przeprowadzić szybko i jest ona zgodna z analizą innych metabolitów Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak PCR w czasie rzeczywistym lub inne sposoby analizy RNA, mogą być wykorzystane w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak produkcja małych RNA lub ekspresja określonych genów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć bardzo dobrą wiedzę na temat tego, jak ekstrahować i oceniać dane dotyczące metabolitów z drzewa tytoniowego.