Metody obrazowania immunohistochemicznego i wapniowego w siatkówce szczura
13 października 2014
Protokoły immunohistochemiczne są używane do badania lokalizacji określonego białka w siatkówce. Techniki obrazowania wapnia są wykorzystywane do badania dynamiki wapnia w komórkach zwojowych siatkówki i ich aksonach.
Ogólnym celem tej procedury jest selektywne znakowanie komórek zwojowych siatkówki w całym preparacie mocowania poprzez wstrzyknięcie do kikuta nerwu wzrokowego barwnika wskaźnikowego wapnia. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie najpierw barwnika wskaźnikowego wapnia o bardzo wysokim powinowactwie, takiego jak flow four do kikuta nerwu wzrokowego. Następnie siatkówka jest izolowana od muszli ocznej i dzielona na ćwiartki w celu zamontowania na szklanym szkiełku w komorze rejestracyjnej ustawionej tak, aby naśladować warunki fizjologiczne, wkład kanałów wapniowych bramkowanych napięciem w sygnał wapniowy.
W zwoju siatkówki komórki można mierzyć w zdepolaryzowanych komórkach za pomocą blokerów kanałów. Ostatecznie wyniki mogą dostarczyć półilościowych pomiarów udziału kanałów wapniowych edukowanych napięciem w sygnale, takim jak sygnał wapniowy o wysokim poziomie potasu. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak elektroporacja i ładowanie masowe, jest możliwość selektywnego znakowania komórek zwojowych siatkówki i ich aksonów w całym przygotowaniu do montażu Przechowuj, preparuj oczy rad i hibernuj podłoże celownicze lub podobne rozwiązanie.
Teraz, jeśli zamierzasz przeprowadzić eksperymenty obrazowania wapnia, wypełnij komórki zwojowe siatkówki przepływem czwartym. Wstrzyknąć 0,5 mikrolitra 40-milimolowej soli potasowej o przepływie czterech penta, rozpuszczonej w wodzie do nerwu wzrokowego, kikut około jednego milimetra za gałką oczną. Przenieś gałkę oczną do obrączkarzy ssaków.
Bąbelkuje 95% tlenu, 5% dwutlenku węgla lub godzinę w temperaturze pokojowej. Preparat należy przechowywać w ciemności. Przeanalizuj oczy pod mikroskopem z kontrolowanym natężeniem światła.
Za pomocą żyletki delikatnie wykonaj małe nacięcie z przodu gałki ocznej i usuń rogówkę. Następnie usuń soczewkę z wewnętrznej powierzchni siatkówki za pomocą kleszczy. Mocno trzymaj twardówkę.
Podczas usuwania ciała szklistego za pomocą innych kleszczy, delikatnie oderwij podstawę ciała szklistego w kierunku środka siatkówki. Otrzymany preparat zwany kubkiem I można przetworzyć na immunohistochemiczne przygotowanie całego wierzchowca, przygotowanie do obrazowania wapnia lub przygotować na poprzeczne odcinki siatkówki w celu uzyskania immunohistochemicznego preparatu całego mocowania. Najpierw wykonaj cztery nacięcia siatkówki, aby leżała płasko.
Umieść siatkówkę na szkiełku podstawowym warstwą komórek zwojowych skierowaną w dół. Po drugie, dodaj kroplę roztworu do siatkówki i w razie potrzeby przykryj ją celulozową bibułą filtracyjną, spłaszcz siatkówkę szczoteczką lub kleszkami. Po trzecie, gdy siatkówka jest całkowicie płaska i odczepia się od bibuły filtracyjnej, umieść ją z powrotem w roztworze.
Aby najpierw przetworzyć preparat, przenieś go do 4% aldehydu paraform na 10 do 15 minut. Następnie przemyj siatkówki trzykrotnie w 0,1-molowym buforze fosforanowym o pH 7,4 przez 30 minut na płukanie, w sumie przez 90 minut. Następnie inkubuj siatkówki w 500 mikrolitrach roztworu blokującego przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Ten roztwór to 5% normalna surowica kozia lub surowica osła w buforze fosforanowym z 0,3% tryttonem i 0,1% azydkiem sodu w ciągu następnych pięciu do siedmiu dni, inkubuj siatkówki w pierwotnym roztworze przeciwciała w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Skład tego rozwiązania musi zostać ustalony empirycznie. Zmyj roztwór przeciwciała pierwotnego w taki sam sposób, w jaki zmyto utrwalacz
.Następnie inkubuj siatkówki w przeciwciałach drugorzędowych w stężeniu od jednego do 1000 przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć przeciwciało drugorzędowe za pomocą trzech kolejnych płukań i buforu fosforanowego. Następnie zamontuj siatkówki w celu wizualizacji i uszczelnij lakierem do paznokci.
Szkiełka te muszą być przechowywane w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rozpocznij od wykonania obrazowania wapnia w celu przygotowania całego mocowania z I miseczki w dzwonkach. Najpierw pokrój tkankę siatkówki na ćwiartki.
Umieść jeden kwadrant płasko na komorze zapisu warstwą zwojową skierowaną do góry, a tym samym warstwą fotoreceptorów skierowaną w dół. Ostrożnie osusz okolicę chusteczką Kim i delikatnie połóż natłuszczoną harfę na chusteczce. Teraz załaduj preparat siatkówkowy na platformę i zakończ ustawianie ośmiokanałowego systemu superfuzji napędzanego grawitacją.
Jeśli zamontowana siatkówka przesunie się po umieszczeniu harfy, ostrożnie wyjmij i wyczyść harfę. Osusz obszar otaczający siatkówkę i ponownie zamontuj harfę. Połączyć komorę rejestracyjną z roztworem dzwonka ssaków i utrzymywać roztwór w sposób ciągły z 95% tlenu i 5% dwutlenkiem węgla.
Najpierw, jako grupa kontrolna bez leków, wykonaj dwa sparowane impulsy o wysokiej zawartości potasu od trzech milimolów do 60 milimolowych przez 33 sekundy. Depolaryzując, RGC powinien aktywować bramkowane napięciem kanały wapniowe, jeśli preparat działa. Teraz przystąp do eksperymentów.
Nifedypina i bloker kanału wapniowego bramkowany napięciem typu L jest powszechnie stosowany do oceny udziału kanałów wapniowych bramkowanych napięciem typu L w depolaryzacji wywołanego sygnałem wapniowym kobaltu. Niespecyficzny bloker kanału wapniowego może być używany do nieselektywnego blokowania kanałów wapniowych bramkowanych napięciem. Skanuj preparat co pięć sekund, aby wizualizować i uzyskiwać obrazy fluorescencyjnego rgc.
Używaj jak najmniejszej mocy lasera. Wzbudzenie powinno być ustawione na 488 nanometrów, a emisja powinna być zbierana za pomocą filtra LP 505 nanometrów. Korzystając z opisanych protokołów, przeprowadzono znakowanie immunologiczne białka komórek zwojowych R-B-P-M-S, które jest białkiem wiążącym RNA o wielokrotnym przepływie splicingowym. Cztery.
Barwienie było rzeczywiście ograniczone do komórek zwojowych w oparciu o specyfikację przeciwciał. Następnie zbadano udział kanałów wapniowych bramkowanych napięciem w sygnale wapniowym w R GCs przy użyciu wartości intensywności fluorescencji uzyskanych z rgc. Na poziomie wyjściowym aksony RGC i RGC są oznaczone przepływem czwartym.
W celu uzyskania wartości intensywności fluorescencji umieszczono ROI na komórce zwojowej, somatach i/lub aksonach. Po zastosowaniu wysokiej zawartości potasu do całego preparatu montażowego, sygnał fluorescencyjny RG C'S wzrósł. Po tym nastąpiło późniejsze zmniejszenie wartości intensywności fluorescencji w obecności kobaltu podczas drugiego wysokiego impulsu potasu.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak selektywnie ładować komórki zwojowe siatkówki syntetyczną matrycą wskaźnika wapnia w całym preparacie do mocowania.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę selektywnego znakowania komórek zwojowe siatkówki przy użyciu barwnika wskaźnika wapnia poprzez wstrzyknięcie do kikutu nerwu wzrokowego. Technika ta umożliwia badanie dynamiki wapnia w tych komórkach oraz ich aksonach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Immunohistochemia
Wstęp
- Obrazowanie wapnia jest kluczowe dla zrozumienia dynamiki komórkowej.
- Komórki zwojowe siatkówki odgrywają kluczową rolę w przetwarzaniu bodźców wzrokowych.
- Istniejące metody znakowania komórek mają swoje ograniczenia.
- Niniejsza technika oferuje bardziej selektywne podejście.
Cel badania
- Do znakowania komórek zwojowych siatkówki w preparatach całych
- Do pomiaru dynamiki wapnia w tych komórkach
- Do oceny udziału napięciowo zależnych kanałów wapniowych
Wykorzystane metody
- Wstrzyknięcie barwnika wskaźnikowego wapnia o wysokim powinowactwie do kikutu nerwu wzrokowego.
- Izolacja i podział siatkówki na kwadranty w celu ich zamontowania.
- Zastosowanie blokerów kanałów w celu oceny sygnałów wapniowych w komórkach zdepolaryzowanych.
- Rejestracja w komorze naśladującej warunki fizjologiczne.
Główne wyniki
- Skuteczne znakowanie komórek zwojowych siatkówki oraz ich aksonów.
- Pomiar sygnałów wapniowych w odpowiedzi na depolaryzację.
- Ilościowa ocena udziału napięciowo zależnych kanałów wapniowych.
- Wykazanie zalet w stosunku do metod tradycyjnych.
Wnioski
- Technika ta zapewnia niezawodną metodę badania komórek zwojowych siatkówki.
- Usprawnia ona zrozumienie dynamiki wapnia w tych neuronach.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu uzyskania dalszych informacji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia selektywne znakowanie komórek zwojowych siatkówki w preparatach całych struktur (whole mount), rozwiązując kluczowy problem w walidacji celów w neuronauce, gdzie nieswoiste znakowanie utrudnia interpretację mechanistyczną. Dzięki izolacji wkładu sygnalizacji wapniowej z napięciowo zależnych kanałów wapniowych, podejście to zwiększa pewność prognostyczną w redukcji ryzyka związanego ze szlakami sygnałowymi w procesie odkrywania neuroterapii. Technika ta dostarcza systemu istotnego chorobowo do oceny zaangażowania celu oraz odczytów funkcjonalnych w modelach komórek zwojowych siatkówki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez selektywne znakowanie komórek zwojowych siatkówki w celu wyizolowania swoistej dla celu sygnalizacji wapniowej.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez uniknięcie niespecyficznego obciążania przemieszczonych komórek amakrynowych w warstwie komórek zwojowych.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wybranego celu dzięki półilościowemu pomiarowi wkładu napięciowo-zależnych kanałów wapniowych w sygnały wywoływane przez depolaryzację.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów pracy poprzez izolację komórek zwojowych siatkówki i ich aksonów w preparacie całego organu (whole mount).
- Wyniki ilościowe: Umożliwia pomiary intensywności fluorescencji w wybranych obszarach zainteresowania (ROI) na somach i aksonach komórek zwojowych w celu przesiewania związków.
- Powtarzalność: Standaryzuje przygotowanie preparatu poprzez podział na kwadranty i montaż na szkiełkach przedmiotowych w warunkach naśladujących fizjologiczne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla badań nad chorobami: Zapewnia model komórek zwojowych siatkówki spójny ze szlakami przetwarzania sygnałów wzrokowych na potrzeby translacyjnych badań nad biomarkerami.
- Ciągłość przedkliniczna: Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez pomiar dynamiki wapnia w odpowiedzi na depolaryzację wysokim stężeniem potasu oraz zastosowanie blokerów kanałów.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia rolę wapniowych kanałów napięciowych typu L oraz niespecyficznych w sygnalizacji wapniowej z wykorzystaniem nifedipiny i kobaltu.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po ewaluację przedkliniczną, poprzez generowanie selektywnego znakowania komórkowego i funkcjonalnych odczytów poziomu wapnia.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez wstrzykiwanie wysokoafinicyjnego barwnika wskaźnikowego wapnia do kikuta nerwu wzrokowego.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy i ilościowe wyniki fluorescencji dzięki kontrolowanej depolaryzacji i obrazowaniu w komorze rejestracyjnej.
- Analityka: Umożliwia porównanie warunków z wykorzystaniem wartości natężenia fluorescencji uzyskanych przed i po zastosowaniu blokerów kanałów.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie funkcji komórek zwojowych siatkówki w systemach istotnych dla przebiegu chorób.
- Powtarzalność w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania metody badania dynamiki wapnia w preparatach neuronalnych w wielu warunkach eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: pewność prognostyczna, walidacja celu, zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w badaniach nad sygnalizacją wapniową.
- Wartość operacyjna: standaryzacja, powtarzalność i skalowalność preparatów całej siatkówki.
- Wartość strategiczna: lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach w programach celowanych neurologicznie.
- Wpływ na portfolio: priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o dalszym rozwoju w oparciu o ilościowe oceny sygnalizacji wapniowej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w mikrochirurgii w zakresie wstrzykiwania w pień nerwu wzrokowego oraz sekcji siatkówki.
- Zależy od dostępności infrastruktury mikroskopii fluorescencyjnej z wzbudzeniem 488 nm i filtrowaniem emisji LP 505 nm.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w przygotowaniu roztworów, w tym roztworu Ringera dla ssaków oraz czynników blokujących.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania do różnych systemów modelowych ze względu na gatunkowe różnice w anatomii siatkówki i efektywności ładowania barwnika.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność ładowania barwnika oraz konieczność przechowywania w ciemności w temperaturze 4°C w celu zachowania integralności sygnału.
