Name: Metody obrazowania immunohistochemicznego i wapniowego w siatkówce szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Naucz się selektywnego znakowania komórek zwojowych siatkówki szczura za pomocą wskaźnika wapniowego wstrzykiwanego do pnia nerwu wzrokowego. Ta metoda umożliwia pomiar dynamiki wapnia i ocenę roli kanałów wapniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr S. Stelli i Helen Vuong za wkład w protokół obrazowania wapnia. Dziękujemy dr K. Sheetsowi za nakręcenie scen wywiadu. Dziękujemy dr Arlene Hirano za jej komentarze na temat manuskryptu. Ten projekt badawczo-rozwojowy został przeprowadzony przez autorów w David Geffen School of Medicine na UCLA i jest możliwy dzięki umowie kontraktowej, która została przyznana i zarządzana przez Dowództwo Badań Medycznych i Materiałów Armii Stanów Zjednoczonych (USAMRMC) oraz Centrum Badań Telemedycyny i Zaawansowanych Technologii (TATRC) w Fort Detrick, MD pod numerem umowy: W81XWH-10-2-0077. Wsparcie dla tych badań pochodziło również z NIH EY04067 i VA Merit Review (NB). NCB jest naukowcem zajmującym się karierą naukową w VA.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt doświadczalnych wydanymi przez Politykę Publicznej Służby Zdrowia Stanów Zjednoczonych dotyczącą opieki nad ludźmi i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz Komitet Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Kalifornijskiego-Los Angeles (UCLA). Wykorzystano dorosłe samce i samice szczurów Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) w wieku od 3 do 5 tygodni.
1. Przygotowanie zwierząt i tkanek do całościowego badania siatkówki oraz protokół immunohistochemiczny
<ol>
	<li>Przygotuj następujące materiały i narzędzia: mikroskop preparacyjny, 2 kleszcze z bardzo cienkimi końcówkami, nożyczki, celulozową bibułę filtracyjną, plastikową pipetę i szkiełko mikroskopowe.</li>
	<li>Poddaj szczura eutanazji w zamkniętej komorze poprzez głębokie znieczulenie zwierzęcia 1-3% izofluranem, a następnie ścięcie głowy gilotyną. Usuń oczy nożyczkami do tęczówki i umieść na szalce Petriego zawierającej roztwór zewnątrzkomórkowy. Zalecane jest hibernowanie A, Ames Medium lub roztwory fizjologiczne.</li>
	<li>[Opcjonalny krok, jeśli pożądane jest zasypywanie RGC Fluo-4]. Wykonaj etykietowanie Fluo-4 zgodnie z opisem w krokach 2.3-2.4.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu preparacyjnego (natężenie światła: 1,6 x 108 fotonów/mm2⋅s), usuń rogówkę, odcinając przednią część gałki ocznej. Usuń soczewkę i ciało szkliste z wewnętrznej powierzchni siatkówki za pomocą kleszczy. Aby usunąć ciało szkliste, ustabilizuj gałkę oczną, mocno przytrzymując twardówkę jednym kleszkiem. Delikatnie oderwij podstawę ciała szklistego w kierunku środka siatkówki za pomocą drugiego kleszcza. Preparat na tym etapie nazywa się muszlą oczną, która służy do kriosekcji. Więcej szczegółów na temat kriosekcji można znaleźć w piśmiennictwie 14,15.</li>
	<li>Zdejmij siatkówkę z muszli ocznej. Następnie wykonaj cztery nacięcia, aby siatkówka mogła ułożyć się płasko. Delikatnie zamontuj siatkówkę na szkiełku mikroskopowym warstwą fotoreceptora do góry. Dodaj jedną kroplę roztworu do siatkówki i połóż celulozową bibułę filtracyjną na siatkówce. Gdy siatkówka przyczepi się do bibuły filtracyjnej, umieść siatkówkę z powrotem w roztworze. W razie potrzeby spłaszcz siatkówkę szczoteczką lub kleszkami.</li>
	<li>Umieść całe zamontowane siatkówki w 4% PFA na 10-15 minut w celu utrwalenia.</li>
	<li>Przemyj całą siatkówkę trzy razy przez 30 minut w 0,1 M buforze fosforanowym (PB) o pH 7,4. Zablokować siatkówki 5% normalną surowicą kozią lub surowicą osła w 0,1 PB zawierającym 0,3% Triton-X 100 i 0,1% NaN3 w temperaturze 4 °C przez noc. Zalecamy końcową objętość 500 μl na wszystkie etapy oszczędzania roztworów blokujących i przeciwciał.</li>
	<li>Następnego dnia należy inkubować siatkówki w całości z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 5-7 dni w temperaturze 4 °C. Użytkownik musi określić optymalne rozcieńczenia.</li>
	<li>Przemyć siatkówki 3 x 30 minut w PB 0,1 M i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w odpowiednim przeciwciałie drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem, skierowanym przeciwko gatunkom przeciwciała pierwszorzędowego (stężenie 1:1 000).</li>
	<li>Po trzech końcowych płukaniach po 30 minut każde PB, zamontuj siatkówki w podłożu montażowym. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci w celu przedłużonego przechowywania. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem.</li>
</ol>
2. Znakowanie komórek zwojowych i aksonów w siatkówkach szczurów za pomocą barwnika wskaźnikowego wapnia
<ol>
	<li>Przygotować 1 000 ml ssaków Ringera zawierającego (w mM) 125 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 25 NaHCO3 i 10 pęcherzyków glukozy z 95% O2/ 5% CO2 .</li>
	<li>Wykonaj sekcję zgodnie z opisem w krokach 1.2-1.4.</li>
	<li>Aby załadować komórki zwojowe siatkówki (RGC) i ich aksony barwnikiem wskaźnikowym wapnia, wstrzyknąć 0,5 μl soli pentapotasowej Fluo-4 (40 mM zapas w H2O) do kikuta nerwu wzrokowego około 1 mm za gałką oczną za pomocą strzykawki. Do pomiaru dynamicznego wzrostu liczby komórek zwojowych [Ca2+]i optymalny jest wskaźnik o wysokim powinowactwie, taki jak Fluo-4 o Kd wynoszącym 345 nM. Fluo-4 oferuje dodatkową korzyść w postaci bardzo wysokiej wydajności kwantowej, co skutkuje wzrostem emisji o >100 razy po związaniu z wapniem.</li>
	<li>Umieść muszlę oczną w ssakach Ringer's bąbelkowanym 95% O2/5% CO2 na 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
</ol>
3. Protokół obrazowania wapnia dla komórek zwojowych siatkówki i aksonów.
<ol>
	<li>Usuń oko, soczewkę i ciało szkliste zgodnie z opisem w krokach 1.1-1.4. Odizoluj siatkówkę od muszli ocznej i podziel ją na ćwiartki. Zamontuj jedną komórkę zwojową stroną do góry na szklanym szkiełku i użyj siatki harfy, aby ją ustabilizować. Pozostałe kawałki należy przechowywać w ciemności w ssakach Ringer's bąbelkowane 95% O2/5% CO2 na lodzie do późniejszego wykorzystania.</li>
	<li>Połączyć komorę rejestracyjną z roztworem Ringera u ssaków i utrzymywać roztwór w sposób ciągły z 95% O2/5% CO2 .</li>
	<li>Zobrazuj tkankę pod mikroskopem. Przeprowadzaj eksperymenty w temperaturze pokojowej (~23 °C) lub osiągaj temperatury fizjologiczne poprzez podgrzanie sceny, podgrzanie łaźni wodnej pod próbką lub przyłożenie ciepłego powietrza do powierzchni próbki. 
	Uwaga: Ważne jest, aby pamiętać, że wiele funkcji komórkowych jest regulowanych przez temperaturę, która odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy wewnątrzkomórkowej16. Jednak wprowadzenie środków ocieplających może zwiększyć tempo fotowybielania, parowania podłoża i dryfu ogniska spowodowanego rozszerzalnością cieplną17. Stosowanie temperatury pokojowej zmniejsza wewnątrzkomórkową kompartmentalizację Fluo-418.</li>
	<li>Wykonaj kontrolę dwóch sparowanych impulsów o wysokim poziomie K+ przy braku leków. Depolaryzacja RGC i aksonów RGC poprzez podniesienie [K+]o z 3 mM do 60 mM przez 33 sekundy podczas każdego impulsu, aby aktywować VGCC za pomocą ośmiokanałowego systemu superfuzji napędzanego grawitacją. Zmniejsz Na+ o 57 mM, aby utrzymać izosmolarność w podwyższonym roztworze K+.</li>
	<li>Oceń udział różnych VGCC w sygnale wapniowym za pomocą ogólnych lub swoistych blokerów kanału Ca. Na przykład zmniejszenie sygnału wapniowego po podaniu niespecyficznego blokera kanału wapniowego, kobaltu, zapewniło półilościową miarę udziału VGCC w sygnale wapnia o wysokim poziomie K+.</li>
	<li>Uzyskaj wartości intensywności fluorescencji, umieszczając obszar zainteresowania (ROI) wokół interesujących RGC (rysunek 2).</li>
	<li>Normalizuj zmianę intensywności fluorescencji wytwarzanej przez drugi wysoki pik K+ do zmiany wywołanej przez pierwszy wysoki pik K+. Następnie, w celu zbadania specyficznych blokerów kanału wapniowego, należy stosować leki tylko podczas drugiego impulsu o wysokim poziomie K+ pary i normalizować ten pik w stosunku do pierwszej wartości szczytu. Aby zmierzyć wpływ leku na wysoki pik K+, podziel amplitudę drugiego piku K+ przez amplitudę pierwszego. Należy przeprowadzić analizę tych wartości w odniesieniu do ich pasujących kontroli pochodzących z sparowanych pików o wysokim K+ mierzonych przy braku leku.</li>
	<li>Rejestruj obrazy w odstępach 5 sekund. Aby uniknąć fotowybielania, utrzymuj wzbudzenie lasera na jak najniższym poziomie. Zapewnij wzbudzenie przez linię 488 nm lasera argonowego, podczas gdy lampa fotopowielacza zbiera emisję fluorescencyjną przez filtr LP 505 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Guenther, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+calcium+currents+in+retinal+ganglion+cells+from+postnatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat.</a> Brain Res. 633, 223-235 (1994).</li>
<li>Farrell, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+voltage-gated+ion+channels+in+rat+retinal+ganglion+cells+mediated+by+somatostatin+receptor+subtype+4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4.</a> J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).</li>
<li>Caterall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+regulation+of+voltage-gated+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium--a+life+and+death+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium--a life and death signal.</a> Nature. 395, 645-648 (1998).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+microdomains+Organization+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium microdomains Organization and function.</a> Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).</li>
<li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+diversity+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li>
<li>Rottman, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribonuclease+protection+assay+a+powerful+tool+for+the+veterinary+pathologist%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist.</a> Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li>
<li>Segev, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+spikes+from+a+large+fraction+of+the+ganglion+cells+in+a+retinal+patch%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch.</a> Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).</li>
<li>Jeon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).</li>
<li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+and+extrasynaptic+factors+governing+glutamatergic+retinal+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves.</a> Neuron. 62, 230-241 (2009).</li>
<li>Daniels, B. A., Baldridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((d-Serine+enhancement+of+NMDA+receptor-mediated+calcium+increases+in+rat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells.</a> J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).</li>
<li>Weitz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+response+of+the+retina+to+electrical+stimulation+with+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators.</a> J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).</li>
<li>Pérez de Sevilla Müller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+voltage-gated+calcium+channel+%CE%B1%282%29%CE%B4%284%29+subunits+in+the+mouse+and+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina.</a> J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).</li>
<li>Hirano, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP25+expression+in+mammalian+retinal+horizontal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells.</a> J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+dynamics%2C+homeostasis+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).</li>
<li>Dailey, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+live+cells+and+tissue+slices+in+the+imaging+setup%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+ProtocI%22%5BJournal%5D)">Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup.</a> Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).</li>
<li>Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+intracellular+calcium+ion+dynamics+in+hair+cell+populations+with+Fluo-4%5BTitle%5D)+AND+%22AM.+PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4.</a> AM. PLoS One. 7, e51874(2012).</li>
<li>Kwong, J. M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).</li>
<li>Pérez deSevilla Müller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Displaced+amacrine+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Displaced amacrine cells of the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).</li>
<li>Pérez de Sevilla Müller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracer+coupling+of+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+to+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).</li>
<li>Raymond, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyan+fluorescent+protein+expression+in+ganglion+and+amacrine+cells+in+a+thy1-CFP+transgenic+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina.</a> Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).</li>
<li>Raymond, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Thy1-CFP+DBA%2F2J+mouse+line+with+cyan+fluorescent+protein+expression+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells.</a> Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).</li>
<li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeation+and+block+of+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor+channels+by+divalent+cations+in+mouse+cultured+central+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones.</a> J Physiol. 394, 501-527 (1987).</li>
<li>Ascher, P., Nowak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+divalent+cations+in+the+N-methyl-D-aspartate+responses+of+mouse+central+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture.</a> J Physiol. 399, 247-266 (1988).</li>
<li>Aizenman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+mediated+by+excitatory+amino+acid+receptors+in+solitary+retinal+ganglion+cells+from+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat.</a> J Physiol. 396, 75-91 (1988).</li>
<li>Taschenberger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+current+kinetics+in+a+solely+AMPA-receptor-operated+glutamatergic+synapse+formed+by+rat+retinal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons.</a> J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).</li>
<li>Chen, S., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+activates+extrasynaptic+NMDA+receptors+on+cells+in+the+ganglion+cell+layer+of+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina.</a> J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).</li>
<li>Jakobs, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mRNA+for+glutamate+receptor+subunits+distinguishes+the+major+classes+of+retinal+neurons%2C+but+is+less+specific+for+individual+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types.</a> Mol Vis. 13, 933-948 (2007).</li>
<li>Margolis, D. J., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+mechanisms+generate+maintained+activity+in+ON+and+OFF+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+NeurosciI%22%5BJournal%5D)">Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells.</a> J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).</li>
<li>Margolis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+calcium+signaling+in+ON+and+OFF+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).</li>
<li>Baldridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recordings+of+the+effects+of+cholinergic+ligands+on+neurons+in+the+ganglion+cell+layer+of+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina.</a> J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).</li>
<li>Hartwick, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+glutamate+clearance+mechanisms+in+a+chronic+rat+glaucoma+model+using+retinal+ganglion+cell+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging.</a> J Neurochem. 94, 794-807 (2005).</li>
<li>Badea, T. C., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+neuronal+morphologies+in+the+mouse+retina+visualized+by+using+a+genetically+directed+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter.</a> J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).</li>
<li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+activity-mediated+refinement+of+axonal+projections+from+a+mosaic+of+genetically+identified+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells.</a> Neuron. 59, 425-438 (2008).</li>
<li>Kim, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+a+retinal+cell+type+that+responds+to+upward+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion.</a> Nature. 452, 478-482 (2008).</li>
<li>Munch, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approach+sensitivity+in+the+retina+processed+by+a+multifunctional+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit.</a> Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

W tym artykule opisaliśmy dwie różne techniki: 1) Immunohistochemia w celu wykazania lokalizacji Fluo-4 w komórkach zwojowych w całych komórkach siatkówki oraz 2) Obrazowanie wapnia w celu analizy dynamiki wapnia w komórkach zwojowych siatkówki i ich aksonach.
Immunohistochemia z użyciem wholemounts została wykorzystana do ujawnienia lokalizacji białek w siatkówce gryzoni20-23. Istnieje jednak kilka ograniczeń. Jakość barwienia zależy w dużej mierze od zdolności przeciwciała do rozp...

Komórki zwojowe siatkówki (RGC) wyrażają VGCC typu L, N, P/Q i T, co zostało określone przez farmakologiczną blokadę tych składników całego kanału Ca komórkiprąd 1,2. VGCC to transbłonowe białka multimeryczne, które biorą udział w uwalnianiu przekaźnika, transkrypcji genów, regulacji komórek i plastyczności synaptycznej3,4,5. Funkcjonalne VGCC składają się z co najmniej trzech odrębnych klas podjednostek: dużych, transbłonowych podjednostek tworzących pory α1, które określają właściwości biofizyczne i farmakologiczne kanału, głównie zewnątrzkomórkowych podjednostek pomocniczychα 2δ i podjednostek β wewnątrzkomórkowych. Dwa ostatnie tworzą kompleksy heteromeryczne z różnymi podjednostkami α1 i zmieniają kinetykę bramkowania i transport kanałów do błony plazmatycznej6.
W ciągu ostatnich dziesięcioleci do badania ekspresji białek zastosowano wiele technik, takich jak immunohistochemia, test immunoenzymatyczny i cytometria przepływowa. Techniki te wymagają użycia specyficznych przeciwciał do wykrywania danego białka będącego przedmiotem zainteresowania i zapewniają potężne narzędzia do lokalizacji i dystrybucji określonych białek w różnych tkankach. Techniki stosowane do wykrywania i ilościowego określania poziomów ekspresji mRNA określonego białka, takie jak analiza northern blot, RT-PCR, ilościowy RT-PCR w czasie rzeczywistym, hybrydyzacja in situ, mikromacierze cDNA i test ochrony rybonukleazy stanowią alternatywne podejście, gdy przeciwciała nie są łatwo dostępne lub jeśli poziomy ekspresji określonego białka są niskie7. Jednak jednym z ograniczeń w stosowaniu takich technik molekularnych jest wymagana identyfikacja sekwencji genu.
Aby zlokalizować białka w siatkówce, można przeprowadzić immunohistochemię na całych siatkówkach. Ze względu na dostępność RGC, preparat wholemount stanowi doskonałą platformę do badania lokalizacji określonych białek w somatach RGC i ich aksonach.
Oprócz ich lokalizacji, niektóre funkcjonalne właściwości VGCC w RGC mogą być zademonstrowane za pomocą technik obrazowania wapnia. Opisujemy protokół obrazowania wapnia w celu selektywnego znakowania RGC barwnikiem wskaźnikowym wapnia w celu pomiaru wewnątrzkomórkowej dynamiki wapnia. Udział różnych VGCC w sygnale wapniowym w różnych przedziałach komórkowych można wyizolować za pomocą blokerów kanału Ca specyficznych dla podtypu.
Być może jednym z najbardziej korzystnych aspektów opisanej tutaj techniki obrazowania wapnia jest możliwość jednoczesnego i niezależnego zapisu z wielu RGC i ich aksonów. Chociaż wiele technik fizjologicznych, takich jak nagrywanie całych komórek z klamrami, zapewnia zapisy prądów błonowych o wysokiej rozdzielczości czasowej, somatycznego lub aksonalnego źródła tych zarejestrowanych prądów nie można rozróżnić, a nagrania można wykonać tylko z jednego neuronu na raz. Matryce wieloelektrodowe (MEA) są zdolne do jednoczesnego rejestrowania skoków z wielu komórek, ale nie mogą ani wykryć, ani rozróżnić aktywacji, na przykład, różnych podtypów kanałów wapniowych. MEA preferencyjnie rejestrują z komórek, które znajdują się w bliskiej odległości od danej elektrody8 i nagrywają z komórek, które generują duże skoki9. Metody obrazowania optycznego stanowią alternatywną strategię, która umożliwia jednoczesne i niezależne zapisy całych populacji komórek, które można zintegrować z informacjami uzyskanymi z rejestracji mikroelektrod pojedynczych komórek i patch clamp oraz zapisów MEA. Chociaż opisane tutaj techniki obrazowania wapnia zostały wykorzystane do zbadania dynamiki wapnia w RGC, patch clamp i MEA mogą być również stosowane równolegle w celu dalszego wyjaśnienia prądów jonowych i właściwości impulsowych RGC.
Ponieważ przemieszczone komórki amakrynowe stanowią około 60% populacji neuronów w warstwie komórek zwojowych w siatkówce myszy10, naszym celem było użycie techniki ładowania, która selektywnie oznacza RGC syntetycznym barwnikiem wskaźnikowym wapnia w preparacie wholemount. Chociaż syntetyczne barwniki wskaźnikowe wapnia stanowią doskonałą platformę do badania wewnątrzkomórkowej dynamiki wapnia, ich powszechne stosowanie jest utrudnione przez niemożność skutecznego obciążenia określonych populacji neuronów w danej sieci. Wiele technik, takich jak ładowanie masowe11 i elektroporacja8,12, zostało wykonanych w celu obciążenia całych populacji komórek, Jednak takie techniki nie rozróżniają określonych typów komórek. Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia zapewniają zdolność do selektywnego znakowania określonych populacji komórek, jednak takie metody wymagają generacji zwierząt transgenicznych13. Nasza technika opisuje metodę selektywnego znakowania RGC w preparacie całościowym poprzez wstrzyknięcie do kikuta nerwu wzrokowego barwnika wskaźnikowego wapnia.
Techniki strukturalne i fizjologiczne opisane w tym artykule razem wzięte, stanowią platformę do badania lokalizacji i udziału VGCC w sygnale wapniowym w RGC i ich aksonach.

<table><tbody><tr><td>Nożyczki proste</td><td>WPI</td><td>14124-G</td><td>Narzędzia preparacyjne</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>proste WPI</td><td>501985</td><td>narzędzia preparacyjne</td></tr><tr><td>Nożyczki do zakrzywionej tęczówki</td><td>Narzędzia do preparowania</td><td>WPI</td><td>504487</td></tr><tr><td>Celulozowa bibuła filtracyjna</td><td>Millipore</td><td>HABP04700</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate A</td><td>Invitrogen</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp; productID=A1247501">A12475-01</a></td><td>Media</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td><a href="https://www.google.com/url?sa=t&amp; rct=j& q=& esrc=s& source=web& cd=1& cad=rja& sqi=2& ved=0CC0QFjAA& url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279& ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw& usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA& sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg& bvm=bv.48705608,d.cGE">Podłoże montażowe do fluorescencji</a></td></tr><tr><td>Fluo-4 pentapotassium</td><td>Invitrogen</td><td>F-14200</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Laboratories</td><td>05260-05</td><td>anestezjologiczne</td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-178-277</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss LSM 5 Pascal</td><td>Obiektyw Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axioplan 40X (NA 0.8) soczewka</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L)</td><td>Sondy molekularne</td><td>A-11034</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>ProSci, Poway, CA</td><td></td><td>Przeciwciało poliklonalne królika&nbsp; został wygenerowany względem N-końca RBPMS&nbsp; polipeptyd (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, od komercyjnego dostawcy (ProSci, Poway, CA).</td></tr></tbody></table>

metody obrazowania immunohistochemicznego i wapniowego w siatkówce szczura

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

W tym artykule opisujemy narzędzia, odczynniki i praktyczne kroki, które są potrzebne do: 1) udanego przygotowania całych siatek do immunohistochemii i, 2) obrazowania wapnia do badania sygnalizacji wapniowej za pośrednictwem kanału wapniowego bramkowanego napięciem (VGCC) w komórkach zwojowych siatkówki. Opisana przez nas metoda obrazowania wapniowego omija problemy związane z niespecyficznym obciążeniem przemieszczonych komórek amakrynowych w warstwie komórek zwojowych.

Immunoznakowanie swoistymi przeciwciałami stanowi podstawę do badania lokalizacji konkretnych białek zainteresowania w siatkówce, natomiast technika obrazowania wapnia umożliwia badanie udziału VGCC w dynamice wapnia w komórkach zwojowych siatkówki i ich aksonach.
Stosując przeciwciało przeciwko białku komórek zwojowych RBPMS (RNA binding protein with multiple splicing), które selektywnie znakuje komórki zwojowe siatkówki (RGCs)19, wykazaliśmy, że znakowanie Fluo-4 ogranicza się do ...

Protokoły immunohistochemiczne są używane do badania lokalizacji określonego białka w siatkówce. Techniki obrazowania wapnia są wykorzystywane do badania dynamiki wapnia w komórkach zwojowych siatkówki i ich aksonach.

Metody obrazowania immunohistochemicznego i wapniowego w siatkówce szczura

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest selektywne znakowanie komórek zwojowych siatkówki w preparacie całego zamontowanego organu (whole mount) poprzez wstrzyknięcie barwnika wskaźnika wapnia do kikutu nerwu wzrokowego. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie do kikutu nerwu wzrokowego barwnika wskaźnika wapnia o bardzo wysokim powinowactwie, takiego jak flow four. Następnie siatkówkę izoluje się z gałki ocznej i dzieli na ćwiartki w celu zamontowania na szkiełku przedmiotowym. W komorze pomiarowej skonfigurowanej tak, aby naśladować warunki fizjologiczne, bada się wkład napięciowo zależnych kanałów wapniowych do sygnału wapniowego.W komórkach zwojowych siatkówki można przeprowadzić pomiary w komórkach zdepolaryzowanych przy użyciu blokerów kanałów. Ostatecznie wyniki te mogą dostarczyć półilościowych pomiarów wkładu napięciowo zależnych kanałów wapniowych w sygnał, taki jak sygnał wapniowy wywołany wysokim stężeniem potasu. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak elektroporacja i ładowanie masowe, jest możliwość selektywnego znakowania komórek zwojowych siatkówki oraz ich aksonów w preparacie całego narządu wzroku, wypreparowanych oczach szczura i hibe

immunohistochemical-calcium-imaging-methods-wholemount-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Metody immunohistochemiczne i obrazowania wapnia w całym okuliste szczurów

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Opisujemy protokół monitorowania dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopków za pomocą preparatu ex-vivo siatkówki myszy. Protokół ten umożliwia kompleksowe badania sygnalizacji stożka Ca2 + w ważnym systemie modelowym ssaków, myszy.

Obrazowanie dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy

Metoda postembed immunogold jest jednym z najskuteczniejszych sposobów dostarczania wysokorozdzielczych analiz subkomórkowej lokalizacji określonych molekuł. Tutaj opisujemy protokół ilościowej analizy receptorów glutaminianu w synapsach wstęgowych siatkówki.

Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki

Pokazujemy trzy różne techniki przygotowania tkanek do immunohistochemicznej wizualizacji mikrokrążeń siatkówki szczura, tj. kriosekcje, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowanie sieci naczyniowej.

Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Przedstawiamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej. Dzięki zastosowaniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym z miniaturowym mikroskopem, obrazowanie wapnia można wykorzystać do zbadania aktywności somatów nerwowych dolnych oliwek in vivo.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

Obecny protokół opisuje wykonanie dużego (6 x 3 mm2) okna czaszki przy użyciu folii spożywczej, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. To okno czaszkowe pozwala na eksperymenty in vivo z obrazowaniem wapnia w szerokim polu i z dwoma fotonami na tej samej myszy.

In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę obrazowania reakcji wapnia w górnym wzgórku (SC) obudzonych myszy, w tym obrazowanie aktywności pojedynczego neuronu za pomocą mikroskopii dwufotonowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej kory mózgowej u myszy typu dzikiego, oraz obrazowanie całego SC za pomocą mikroskopii szerokiego pola u myszy z mutacją częściowej kory  mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Protezy siatkówki mają zdolność generowania percepcji wzrokowej. Aby przyspieszyć rozwój nowych protez, potrzebne są metody ex vivo do testowania urządzeń przed implantacją. W tym artykule przedstawiono kompleksowy protokół badania aktywności wapnia w warstwie komórek zwojowych siatkówki poddanych stymulacji elektrycznej.

Obrazowanie wapnia w stymulowanych elektrycznie płaskich siatkówkach

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

Ten protokół opisuje procedurę izolowania całej siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego w celu oznaczenia wszystkich komórek zwojowych siatkówki (RGC). Po procesie następuje obrazowanie i automatyczne zliczanie RGC za pomocą oprogramowania opartego na sztucznej inteligencji, co zapewnia prostą, szybką i dokładną metodę ilościowego określania RGC w całej siatkówce myszy.

Barwienie immunologiczne w całości i automatyczne zliczanie komórek zwojowych siatkówki myszy

Naucz się selektywnego znakowania komórek zwojowych siatkówki szczura za pomocą wskaźnika wapniowego wstrzykiwanego do pnia nerwu wzrokowego. Ta metoda umożliwia pomiar dynamiki wapnia i ocenę roli kanałów wapniowych.

Metody obrazowania immunohistochemicznego i wapniowego w siatkówce szczura

Przeglądaj więcej filmów