Name: Szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-09T21:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Poznaj metodę szybkiego przesiewowego badania związków chemicznych pod kątem cytotoksyczności komórkowej i skuteczności przeciwko HIV-1 typu dzikiego oraz opornym na leki szczepom wirusa. Wykorzystuje się testy z lucyferazą do pomiaru replikacji wirusowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Intramural Research Program NCI.

1. Przygotowanie głównych zapasów
<ol>
	<li>Wykonać zapasy wzorcowe związków, które mają być testowane w DMSO. Przygotuj zapasy w standardowym stężeniu 20 mM. 
	Uwaga: można użyć dowolnego stężenia powyżej 10 mM. Związki, które można wykorzystać jako kontrole pozytywne do walidacji tego testu, obejmują RAL, EVG i DTG.</li>
	<li>Upewnij się, że związki są rozpuszczone w DMSO, wielokrotnie wirując roztwory przez 15 sekund i inkubując w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przechowywać roztwory podstawowe 20 mM w ciemności w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie 96-dołkowych płytek do badania przesiewowego
<ol>
	<li>Należy wybrać linię komórkową, która ma być badana (np. HOS lub TZM-bl) i zasiać 100 μl tych komórek o gęstości 4 x 104 komórek/ml (4 000 komórek/basenik) w pożywce (np. zmodyfikowanej pożywce Eagle's lub DMEM firmy Dulbecco uzupełnionej 5% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej, 5% surowicy nowonarodzonej cielętej, i penicylina (50 jednostek/ml) plus streptomycyna).</li>
</ol>
3. Generowanie zapasów wirusów
Wyprodukuj wirusa HIV o pseudonimie VSV-g poprzez transfekcję 293 komórek (jak pokazano na rysunku 1, krok 1)32-34.
<ol>
	<li>W dniu poprzedzającym transfekcję płytkować 293 komórki na szalkach o średnicy 100 mm o gęstości 1,5 x 106 komórek.</li>
	<li>W dniu transfekcji należy przetransfekować 293 komórki 16 μg wirusa HIV typu dzikiego lub zmutowanego (pNLNgoMIVR-ΔLUC) i 4 μg VSV (pHCMV-g) metodą fosforanu wapnia35.</li>
	<li>Około 6 godzin po dodaniu osadu fosforanu wapnia przemyć 293 komórki dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i inkubować ze świeżą pożywką przez 48 godzin. [DMEM uzupełniony 5% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej, 5% surowicy nowonarodzonych cieląt i penicyliny (50 jednostek/ml) plus streptomycyny (50 μg/ml)].</li>
	<li>Zebrać supernatanty zawierające wirusa poprzez usunięcie pożywki z szalek o średnicy 100 mm, sklarować supernatanty przez odwirowanie na niskiej prędkości przy 3 000 obr./min przez 10 minut, przefiltrować supernatanty przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 45 μm, potraktować supernatanty Turbo DNazą przez 30 minut w temperaturze pokojowej i rozcieńczyć supernatanty w pożywce w celu przygotowania w testach infekcji. Supernatanty wirusowe należy przechowywać zamrożone, w porcjach, w temperaturze -80 °C. 
	Uwaga: ilość p24 w supernatancie określa się za pomocą zestawu do oznaczania immunoenzymu HIV-1 p24. Stężenie p24 służy do kontrolowania ilości wirusa w próbce. Około 500 ng wirusa dodaje się do komórek HOS posianych na szalkach o średnicy 60 mm w gęstości 1,5 x 105 komórek/szalkę w dniu poprzedzającym zakażenie. Po 48 godzinach inkubacji komórki są zbierane, zbierane przez wirowanie, przemywane i ponownie zawieszane w 100 μl PBS. Dodać równą ilość odczynnika do oznaczania genu reporterowego Luminescence i zmierzyć aktywność lucyferazy zgodnie z opisem w punktach 5.4.1 i 5.4.2. Na tej podstawie można dokonać odpowiedniego rozcieńczenia wirusa, jak omówiono w kroku 4.6.</li>
</ol>
4. Badanie przesiewowe złożone na płytkach 96-dołkowych
Przesiewaj każdy związek w trzech egzemplarzach i uśredniaj wyniki.
Uwaga: wpływ każdego związku na replikację wirusa jest korygowany przez normalizację do poziomu replikacji uzyskanego przy braku jakiegokolwiek związku.
<ol>
	<li>Określić empiryczny zakres stężeń, który ma być poddany badaniom przesiewowym. 
	Uwaga: zazwyczaj sita z 11 seryjnymi rozcieńczeniami są wykonywane przez dodawanie związku do kolumny płytkowej po kolumnie, a sita z 7 seryjnymi rozcieńczeniami są wykonywane przez dodawanie związku po rzędach. Jeden potrójny zestaw studzienek musi być zarezerwowany dla kontroli bez związku. Ponadto jedna kolumna lub jeden wiersz musi pozostać pusty, aby działał jako kontrola negatywna/tła. Wreszcie, o tym, czy jest to test cytotoksyczności komórkowej czy zakaźności, będzie decydowało o tym, czy wirus zostanie dodany. </li>
	<li>Przygotować seryjne rozcieńczenia z roztworu podstawowego o stężeniu 20 mM. Stężenia dobiera się w zależności od empirycznie określonego zakresu stężeń, które mają być badane (jak pokazano w tabeli 1). Przygotować rozcieńczenia w pożywce o stężeniu 10-krotnym od pożądanego końcowego stężenia, tj. jeśli końcowe stężenie ma wynosić 100 μM, należy wykonać zapas roboczy o masie 1 mM. 
	Uwaga: związki o IC50s powyżej 5-10 μM zwykle nie są dobrymi kandydatami do opracowania leków. We wstępnych testach testujemy związki tylko w stosunku do wektora WT. Obiecujące związki, które skutecznie hamują wektor WT, są następnie testowane pod kątem panelu mutantów opornych na leki. </li>
	<li>Wyjąć 96-dołkowe płytki z inkubatora i dodać seryjne rozcieńczenia badanych związków do studzienek w trzech dowartościach (jak pokazano na rysunku 1, krok 2). 
	Uwaga: objętość dodana do studzienki powinna wynosić 1/10 objętości końcowego stężenia. W ten sposób dodać 22 μl/basenik (końcowa objętość po dodaniu wirusa wynosi 220 μl) do testów zakaźności. W przypadku testów cytotoksyczności dodać 11 μl/basenik (końcowa objętość wynosi 110 μl/basenik).</li>
	<li>Włożyć 96-dołkowe płytki z powrotem do inkubatora. W celu przeprowadzenia badania przesiewowego cytotoksyczności komórkowej inkubować 96-dołkowe płytki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i nie są potrzebne żadne dalsze manipulacje w Protokole 4: należy przejść do Protokołu 5. W przypadku testów zakaźności należy postępować zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole 4.</li>
	<li>Tylko testy zakaźności. Wyjąć płytki z inkubatora po co najmniej 3 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C ze związkami, które mają być analizowane. 
	Uwaga: pozwala to na wchłonięcie związku przez komórki przed zakażeniem wektorem HIV.</li>
	<li>Przygotować podstawowy rozcieńczenie wirusa33,34 (zwykle w stosunku 1:3), który wytworzy sygnał lucyferazy między 0,2-1,5 względnymi jednostkami lucyferazy (RLU) w komórkach nieleczonych. Cała płytka zajmie około 10 ml rozcieńczonego wirusa. Dodać 100 μl wirusa do każdej z studzienek, używając pipetora wielokanałowego z 8 lub 12 kanałami. Nie dodawaj wirusa do studzienek kontrolnych negatywnych/tła. Włóż płytki do inkubatora w temperaturze 37 °C na 48 godz. 
	Uwaga: podstawowe rozcieńczenie wirusa w stosunku 1:3 jest typowym rozcieńczeniem, które wytwarza sygnał lucyferazy między 0,2 -1,5 RLU w oparciu o test p24 wykazujący, że stężenie wirusa w supernatancie wynosi około 500 ng w 1,0 ml.</li>
</ol>
5. Przygotowanie i pomiar cytotoksyczności i zakaźności na płytkach 96-dołkowych
<ol>
	<li>Odessać pożywkę ze studzienek (czerwień fenolowa w pożywce może zakłócać sygnał lucyferazy). Użyj szklanej pipety z końcówką do pipety o pojemności 200 μl przymocowaną do końca. Zacznij od góry nośnika i powoli przesuwaj się w dół w kierunku dolnego rogu studni. Nie spędzaj zbyt wiele czasu na dnie studni, ponieważ komórki mogą zostać usunięte ze studni.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 100 μl PBS uzupełnionego 0,5 mM MgCl2. Należy to zrobić natychmiast po usunięciu pożywki, aby komórki nie wyschły.</li>
	<li>Tylko w przypadku testów cytotoksyczności dodać 5 ml buforu substratowego z testu wykrywania ATP luminescencji do każdej fiolki dostarczonego liofilizowanego odczynnika. Jedna fiolka wystarcza na płytkę 96-dołkową.
	<ol>
		<li>Do każdej studzienki dodać 50 μl buforu do lizy komórek z testu detekcji luminescencji ATP. Potrząsaj 96-dołkową płytką z prędkością 700 obr./min w temperaturze pokojowej przez 5 minut za pomocą kompaktowego termomiksera.</li>
		<li>Dodać 50 μl odczynnika do oznaczania neutralności luminescencji ATP do wszystkich studzienek z wyjątkiem studzienek kontroli ujemnej/tła. Wstrząsać z prędkością 700 obr./min w temperaturze pokojowej przez 5 minut za pomocą kompaktowego termomiksera. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby dać czas na rozwinięcie sygnału.</li>
		<li>Odczytać 96-dołkową płytkę za pomocą luminometru mikropłytki. 
		Uwaga: otwórz program luminometru mikropłytki SoftMax Pro. Upewnij się, że luminometr jest ustawiony na pomiar luminescencji przy czułości 5 odczytów/studzienkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tylko w przypadku testów zakaźności dodać 10 ml buforu substratowego z testu genu reporterowego luminescencji do każdej fiolki dostarczonego liofilizowanego odczynnika. Jedna fiolka wystarcza na każdą płytkę 96-dołkową.
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl odczynnika do testu genu reporterowego Luminescence do każdego dołka. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby dać czas na rozwinięcie sygnału.</li>
		<li>Odczytać 96-dołkową płytkę za pomocą luminometru mikropłytki, jak to opisano w sekcji 5.3.3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Wyznaczanie wartości CC50 i IC50 dla związków
<ol>
	<li>Przenieś dane lucyferazy z luminometru mikropłytki do arkusza kalkulacyjnego Excel.
	<ol>
		<li>Uśrednić zarówno dane lucyferazy w trzech egzemplarzach, jak i dane dotyczące tła/sygnału kontrolnego. Odejmij średni sygnał tła/kontrolny od średniego sygnału potrójnego dla całego zakresu stężeń.</li>
		<li>Znormalizować skorygowany w tle średni sygnał dla zakresów stężeń w zależności od aktywności, niezależnie od tego, czy jest to cytotoksyczność, czy zakaźność, przy braku jakiegokolwiek związku, aby określić procentową inhibicję. 
		Uwaga: procentowe hamowanie definiuje się jako aktywność lucyferazy w obecności leku podzieloną przez aktywność lucyferazy przy braku leku pomnożoną przez 100. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj oprogramowania Kaleidagraph, aby uzyskać wartości CC50 i IC50
	<ol>
		<li>Przenieś zarówno empirycznie określony zakres stężeń, jak i procentowe zahamowanie aktywności lucyferazy do Kaleidagraph.</li>
		<li>Wykreśl dane z zakresem stężeń na osi x i procentowym hamowaniem aktywności lucyferazy na osi y.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mouton, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+protease+inhibitors+on+AIDS-defining+events+and+hospitalizations+in+10+French+AIDS+reference+centres.+Federation+National+des+Centres+de+Lutte+contre+le+SIDA%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Impact of protease inhibitors on AIDS-defining events and hospitalizations in 10 French AIDS reference centres. Federation National des Centres de Lutte contre le SIDA.</a> AIDS. , 101-105 (1997).</li>
<li>Hammer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+controlled+trial+of+two+nucleoside+analogues+plus+indinavir+in+persons+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+CD4+cell+counts+of+200+per+cubic+millimeter+or+less+AIDS+Clinical+Trials+Group+320+Study+Team%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team.</a> New Eng. J. Med. 337, 725-733 (1997).</li>
<li>Hogg, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+among+HIV-infected+patients+after+initiation+of+triple-drug+antiretroviral+regimens%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Improved survival among HIV-infected patients after initiation of triple-drug antiretroviral regimens.</a> Can. Med. Assoc. 160, 659-665 (1999).</li>
<li>Egger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+new+antiretroviral+combination+therapies+in+HIV+infected+patients+in+Switzerland%3A+prospective+multicentre+study.+Swiss+HIV+Cohort+Study%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Impact of new antiretroviral combination therapies in HIV infected patients in Switzerland: prospective multicentre study. Swiss HIV Cohort Study.</a> BMJ. 315, 1194-1199 (1997).</li>
<li>Gulick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+indinavir%2C+zidovudine%2C+and+lamivudine+in+adults+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+prior+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy.</a> New Eng. J. Med. 337, 734-739 (1997).</li>
<li>Perelson, A. S., Neumann, A. U., Markowitz, M., Leonard, J. M., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+dynamics+in+vivo%3A+virion+clearance+rate%2C+infected+cell+life-span%2C+and+viral+generation+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time.</a> Science. 271, 1582-1586 (1996).</li>
<li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Pearson, C. R., Malow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+promoting+adherence+to+antiretroviral+therapy%3A+a+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Infect.+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">Strategies for promoting adherence to antiretroviral therapy: a review of the literature.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 10, 515-521 (2008).</li>
<li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Smith, L., Nelson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiretroviral+adherence+interventions%3A+translating+research+findings+to+the+real+world+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+HIV%2FAIDS+Rep%22%5BJournal%5D)">Antiretroviral adherence interventions: translating research findings to the real world clinic.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 7, 44-51 (2010).</li>
<li>Volberding, P. A., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiretroviral+therapy+and+management+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Antiretroviral therapy and management of HIV infection.</a> Lancet. 376, 49-62 (2010).</li>
<li>Acosta, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+to+assess+antiretroviral+target+trough+concentrations+using+in+vitro+susceptibility+data%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr%22%5BJournal%5D)">Novel method to assess antiretroviral target trough concentrations using in vitro susceptibility data.</a> Antimicr. 56, 5938-5945 (2012).</li>
<li>Rockstroh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+treatment+with+raltegravir+or+efavirenz+combined+with+tenofovir%2Femtricitabine+for+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus-1-infected+patients%3A+156-week+results+from+STARTMRK%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Long-term treatment with raltegravir or efavirenz combined with tenofovir/emtricitabine for treatment-naive human immunodeficiency virus-1-infected patients: 156-week results from STARTMRK.</a> Clin. Infect. Dis. 53, 807-816 (2011).</li>
<li>Fernandez-Montero, J. V., Eugenia, E., Barreiro, P., Labarga, P., Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiretroviral+drug-related+toxicities+-+clinical+spectrum%2C+prevention%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Opin.+Drug+Safety%22%5BJournal%5D)">Antiretroviral drug-related toxicities - clinical spectrum, prevention, and management.</a> Exp. Opin. Drug Safety. , (2013).</li>
<li>Lunzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Once+daily+dolutegravir+%28S%2FGSK1349572%29+in+combination+therapy+in+antiretroviral-naive+adults+with+HIV%3A+planned+interim+48+week+results+from+SPRING-1%2C+a+dose-ranging%2C+randomised%2C+phase+2b+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Once daily dolutegravir (S/GSK1349572) in combination therapy in antiretroviral-naive adults with HIV: planned interim 48 week results from SPRING-1, a dose-ranging, randomised, phase 2b trial.</a> Lancet Infect Dis. 12, 111-118 (2012).</li>
<li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-formulated+elvitegravir%2C+cobicistat%2C+emtricitabine%2C+and+tenofovir+versus+co-formulated+efavirenz%2C+emtricitabine%2C+and+tenofovir+for+initial+treatment+of+HIV-1+infection%3A+a+randomised%2C+double-blind%2C+phase+3+trial%2C+analysis+of+results+after+48+weeks%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Co-formulated elvitegravir, cobicistat, emtricitabine, and tenofovir versus co-formulated efavirenz, emtricitabine, and tenofovir for initial treatment of HIV-1 infection: a randomised, double-blind, phase 3 trial, analysis of results after 48 weeks.</a> Lancet. 379, 2439-2448 (2012).</li>
<li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abacavir%2Flamivudine+versus+tenofovir+DF%2Femtricitabine+as+part+of+combination+regimens+for+initial+treatment+of+HIV%3A+final+results%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Abacavir/lamivudine versus tenofovir DF/emtricitabine as part of combination regimens for initial treatment of HIV: final results.</a> Infect. Dis. 204, 1191-1201 (2011).</li>
<li>Kellam, P., Larder, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+virus+assay%3A+a+rapid%2C+phenotypic+assay+for+assessment+of+drug+susceptibility+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates.</a> Antimicr. Agents Chemother. 38, 23-30 (1994).</li>
<li>Hertogs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+simultaneous+detection+of+phenotypic+resistance+to+inhibitors+of+protease+and+reverse+transcriptase+in+recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+from+patients+treated+with+antiretroviral+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs.</a> Antimicr. Agents Chemother. 42, 269-276 (1998).</li>
<li>Petropoulos, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+phenotypic+drug+susceptibility+assay+for+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1.</a> Antimicr. Agents Chemother. 44, 920-928 (2000).</li>
<li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+DNA+integration%3A+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67, 1211-1221 (1991).</li>
<li>Hazuda, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+strand+transfer+that+prevent+integration+and+inhibit+HIV-1+replication+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells.</a> Science. 287, 646-650 (2000).</li>
<li>Nguyen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raltegravir%3A+the+first+HIV-1+integrase+strand+transfer+inhibitor+in+the+HIV+armamentarium%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Raltegravir: the first HIV-1 integrase strand transfer inhibitor in the HIV armamentarium.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222, 83-89 (2011).</li>
<li>Wills, T., Vega, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elvitegravir%3A+a+once-daily+inhibitor+of+HIV-1+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Opin.+Invest.+Drugs%22%5BJournal%5D)">Elvitegravir: a once-daily inhibitor of HIV-1 integrase.</a> Exp. Opin. Invest. Drugs. 21, 395-401 (2012).</li>
<li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+antiretroviral+properties+of+S%2FGSK1349572%2C+a+next-generation+HIV+integrase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In Vitro antiretroviral properties of S/GSK1349572, a next-generation HIV integrase inhibitor.</a> Antimicr. Agents Chemother. 55, 813-821 (2011).</li>
<li>Cooper, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subgroup+and+resistance+analyses+of+raltegravir+for+resistant+HIV-1+infection.+Eng%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med%22%5BJournal%5D)">Subgroup and resistance analyses of raltegravir for resistant HIV-1 infection. Eng.</a> J. Med. 359, 355-365 (2008).</li>
<li>Briz, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raltegravir+and+etravirine+are+active+against+HIV+type+1+group+O%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Raltegravir and etravirine are active against HIV type 1 group O.</a> AIDS Res.Human Retroviruses. 25, 225-227 (2009).</li>
<li>Fransen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+raltegravir+susceptibility+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+is+conferred+via+multiple+nonoverlapping+genetic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Loss of raltegravir susceptibility by human immunodeficiency virus type 1 is conferred via multiple nonoverlapping genetic pathways.</a> J. Virol. 83, 11440-11446 (2009).</li>
<li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mutations+selected+in+vitro+with+raltegravir+confer+large+fold+changes+in+susceptibility+to+first-generation+integrase+inhibitors%2C+but+minor+fold+changes+to+inhibitors+with+second-generation+resistance+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Primary mutations selected in vitro with raltegravir confer large fold changes in susceptibility to first-generation integrase inhibitors, but minor fold changes to inhibitors with second-generation resistance profiles.</a> Virology. 402, 338-346 (2010).</li>
<li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+selected+with+elvitegravir+confer+reduced+susceptibility+to+a+wide+range+of+integrase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase selected with elvitegravir confer reduced susceptibility to a wide range of integrase inhibitors.</a> J. Virol. 82, 10366-10374 (2008).</li>
<li>Canducci, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+patterns+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+gene+evolution+in+patients+failing+raltegravir-based+salvage+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Dynamic patterns of human immunodeficiency virus type 1 integrase gene evolution in patients failing raltegravir-based salvage therapies.</a> AIDS. 23, 455-460 (2009).</li>
<li>Ceccherini-Silberstein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+structural+analysis+of+HIV-1+integrase+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Rev%22%5BJournal%5D)">Characterization and structural analysis of HIV-1 integrase conservation.</a> AIDS Rev. 11, 17-29 (2009).</li>
<li>Charpentier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+profiles+for+the+HIV+integrase+gene+in+patients+failing+raltegravir+salvage+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+Med%22%5BJournal%5D)">Drug resistance profiles for the HIV integrase gene in patients failing raltegravir salvage therapy.</a> HIV Med. 9, 765-770 (2008).</li>
<li>Julias, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li>
<li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+%28S%2FGSK1349572%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li>
<li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li>
<li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2%27%2C3%27-dideoxy-3%27-thiacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li>
<li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li>
<li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li>
<li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy szybki, wydajny i powtarzalny test, który może być stosowany do badań przesiewowych związków pod kątem cytotoksyczności i ich zdolności do hamowania replikacji zarówno WT, jak i lekoopornego HIV-1. Zdolność do szybkiej identyfikacji związków i testowania ich skuteczności i cytotoksyczności ma kluczowe znaczenie w opracowywaniu nowych i ulepszonych leków przeciwko HIV-1. Po zidentyfikowaniu związków ołowiu można wyprodukować i przetestować analogi związku ołowiu przy użyciu tego samego testu. Test jest stosunkowo prosty. Istnieją zarówno kontrole pozytywne, jak i negatywne, które pozwalają użytkownikowi zdiagnozować najczęstsze problemy (związki toksyczne, problemy z zasobem wektora). Użycie potrójnego zestawu studzienek bez dodatku związku pokazuje, że doszło do infekcji wirusowej. Fakt, że cytotoksyczność jest mierzona w niezależnym teście, pozwala uniknąć błędnej interpretacji zmniejszenia lucyferazy spowodowanego cytotoksycznością jako specyficznego wpływu na replikację wirusa.
Krytycznymi krokami w protokole jest przygotowanie płytek tak, aby komórki były równomiernie rozmieszczone w studzienkach, aby studzienki miały odpowiednie stężenia związków do testowania, dodanie tej samej ilości wirusa do każdej ze studni i pomiar aktywności lucyferazy w celu określenia wartości CC50 i IC50 .
Test jest bezpieczny, ilościowy i powtarzalny. Test jest bezpieczny, ponieważ wektor jest wadliwy w replikacji. Test jest ilościowy i powtarzalny, ponieważ opiera się na pojedynczym okrągłym wektorze, który wyraża lucyferazę, którą można dokładnie i wygodnie oznaczyć. W wielorundowym teście replikacji wirusa zmierzona IC50 zależy od liczby cykli życiowych wirusa; Jest to szczególny problem, gdy testy obejmują zarówno wirusy oporne na WT, jak i lekooporne, które mogą mieć znacznie różne zdolności replikacji.
Wcześniej zgłoszono kilka testów enzymatycznych, które można wykorzystać do badań przesiewowych na obecność inhibitorów IN. Testy, które wykorzystują technologię PCR w czasie rzeczywistym do pomiaru zintegrowanego DNA, wymagają oczyszczonych rekombinowanych białek i są na ogół zarówno bardziej pracochłonne, jak i kosztowne36,37. Chociaż możliwe jest stosowanie testów enzymatycznych do pomiaru wpływu związków na inne enzymy wirusowe (RT i proteazę), każdy enzym wymaga własnego systemu testów. Test z jednym okrągłym wektorem, jak opisano, może być stosowany, bez modyfikacji, do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów RT. Podobny test można zastosować do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów proteazy; Jednak w teście inhibitora proteazy związki muszą zostać dodane do komórek używanych do produkcji wektorów. Pokrewny test, wykorzystujący różne komórki i wektory, może być również wykorzystany do badań przesiewowych pod kątem otoczki (env) i inhibitorów fuzji wnikania wirusa HIV. Wreszcie, test może być stosowany, na większą skalę, za pomocą zautomatyzowanych dozowników zrobotyzowanych. W związku z tym test może być stosowany do badań przesiewowych dużych bibliotek związków przeciwko WT i zmutowanemu wirusowi HIV. Jednak fakt, że test może wykryć inhibitor replikacji wirusa HIV, który działa na różnych etapach cyklu życiowego wirusa, wskazuje na ograniczenie w interpretacji danych. Sam w sobie test nie określa, który etap cyklu życia jest blokowany przez związek. Jeśli pojawi się to pytanie, można je rozwiązać, stosując testy czasu dodania38 i testując związek w porównaniu z oczyszczonymi rekombinowanymi białkami wirusowymi.
Niestety, pomimo sukcesu leków przeciw HIV, nadal istnieją problemy zarówno z opornością, jak i toksycznością. Wobec braku skutecznej szczepionki przeciw HIV istnieje potrzeba nie tylko opracowania nowych leków terapeutycznych, które będą skuteczne przeciwko istniejącym mutantom opornym na leki, ale także opracowania leków profilaktycznych, które mogą ograniczyć rozprzestrzenianie się wirusa. Jeżeli profilaktyczne stosowanie leków przeciw HIV obejmuje leczenie osób niezakażonych, takie podejście będzie stanowić szczególne obciążenie dla opracowywania leków, które mają niewielką lub żadną długoterminową toksyczność.

Dostępność leków ukierunkowanych na kilka kluczowych etapów cyklu życia wirusa HIV-1 doprowadziła do skojarzonej terapii lekowej (zwanej wysoce aktywną terapią antyretrowirusową lub HAART), która znacznie poprawiła leczenie zakażeń HIV-1 i długoterminowe przeżycie pacjentów. HAART, który zazwyczaj wykorzystuje kombinacje dwóch nukleozydowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy (RT) oraz inhibitora proteazy lub nienukleozydowego inhibitora RT, przekształciła śmiertelną chorobę w stan trwający całe życie1-5. Jednak pomimo wielu sukcesów HAART w trwałym tłumieniu replikacji wirusa, ma on ograniczenia. HAART nie eliminuje wirusa HIV, więc pacjenci nie są wyleczeni, a terapia trwa przez całe życie. Istnieją problemy z toksycznością leków i pojawianiem się szczepów lekoopornych. Oporność może wystąpić na wszystkie zatwierdzone leki przeciw HIV, w tym nowo zatwierdzone leki, które są ukierunkowane na integrazę HIV (IN). Oporność na leki prawdopodobnie powstaje z powodu spontanicznych mutacji, które zachodzą podczas replikacji wirusa (wskaźnik błędów 3 x 10-5 mutacji/zasada/cykl replikacji)6. Kiedy pojawiają się mutacje w genach kodujących cele leków antyretrowirusowych, niewielki podzbiór tych mutacji doprowadzi do zmniejszenia podatności szczepu wirusa na leki. Aby uniknąć rozwoju oporności na leki, stężenia leków muszą być utrzymywane na poziomie, który w pełni hamuje replikację wirusa HIV. Słabe przestrzeganie schematu terapeutycznego zaostrza problem i może prowadzić do szybkiego rozwoju oporności7-9. Chociaż stężenia leków mogą się różnić u pacjentów ze względu na różne poziomy wchłaniania, metabolizmu, dystrybucji i wydalania, wysokie stężenia leków mogą prowadzić do toksyczności10. Ponieważ terapia jest kontynuowana przez całe życie pacjenta, istnieją poważne obawy dotyczące bezpieczeństwa dotyczące długoterminowej toksyczności leków antyretrowirusowych. Leki przeciwretrowirusowe powszechnie stosowane w HAART mogą mieć działania niepożądane i zdarzały się przypadki, w których skutki uboczne zagrażały życiu11-15. Problemy, jakie napotykają pacjenci w związku z rozwojem oporności i toksyczności, leżą u podstaw potrzeby opracowania nowych leków, które skutecznie blokują replikację powszechnie stosowanych lekoopornych szczepów wirusa przy niewielkiej lub zerowej toksyczności długoterminowej.
Dlatego istnieje potrzeba testu, który może szybko wykryć związki, które blokują kluczowe etapy cyklu życia wirusa. W tym miejscu opisujemy skuteczny test, który można wykorzystać do oceny cytotoksyczności związków i ich zdolności do szybkiego i skutecznego blokowania replikacji zarówno WT, jak i lekoopornych szczepów HIV. Test, którego używamy, jest podobny do testu, który został opracowany w celu badania przesiewowego pod kątem oporności na leki u wirusa wyizolowanego od pacjentów wwieku 16-18 lat.
Chociaż test może być używany bez modyfikacji do badań przesiewowych pod kątem związków, które mogą blokować odwrotną transkrypcję HIV, opiszemy użycie testu do oceny inhibitorów IN. IN jest niezbędnym enzymem wirusowym, który wprowadza wirusowe DNA do genomu komórkowego19. Chociaż opracowywanych jest wiele obiecujących inhibitorów IN, z których niektóre są obecnie w fazie badań klinicznych, tylko Isentress20,21 (znany również jako Raltegravir lub RAL), a ostatnio Elvitegravir (EVG)22 i Dolutegravir (DTG)23 zostały zatwierdzone przez FDA. Związki te są aktywne zarówno przeciwko podtypom HIV B, jak i innym niż B w hodowli komórkowej i u pacjentów24, Lokal mieszkalny 25. Jednak leczenie RAL selekcjonuje lekooporne mutanty HIV-1 IN, w tym Y143R, N155H i G140S/Q148H 24,26-31. N155H i G140S/Q148H zmniejszają również skuteczność EVG, co podkreśla potrzebę zaprojektowania i opracowania inhibitorów transferu nici IN drugiej generacji (INSTI), które są skuteczne przeciwko tym mutacjom oporności.

<table><tbody><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-017</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite System detekcji luminescencji ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016941</td><td></td></tr><tr><td>Steady Lite Plus Reporter o wysokiej czułości System oznaczania genów luminescencji</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016751</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco</td><td>Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini EM</td> Urządzenia <td></td><td></td><td>molekularne</td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 Microwell Biała płyta polistyrenowa</td><td>Thomas Scientific</td><td>12-566-26</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer Compact</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1442-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca Millex HA, 0,45 i mikro; M</td><td>Millipore</td><td>SLAHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEK050B001KT</td><td></td></tr><tr><td>komórki HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>komórki TZM-bl</td><td>NIH AIDS Program odczynnikowy</td><td>8129</td><td></td></tr><tr><td>pNL4.3 i Delta; </td> Program oporności na leki Env.LUC <td>NIH-NCI HIV - Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>NIH-NCI Hiv Program oporności na leki - Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Molecular Devices</td><td>0200-310</td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy hiv

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Chociaż zatwierdzono wiele leków przeciw HIV, nadal występują problemy z toksycznością i opornością na leki. Wskazuje to na potrzebę identyfikacji nowych związków, które mogą hamować zakażenie powszechnymi lekoopornymi szczepami HIV-1 przy minimalnej toksyczności. Tutaj opisujemy skuteczny test, który można wykorzystać do szybkiego określenia cytotoksyczności komórkowej i skuteczności związku przeciwko WT i zmutowanym szczepom wirusa.
Pożądana docelowa linia komórkowa jest wysiewana na 96-dołkowej płytce i po 24 godzinnej inkubacji dodawane są seryjne rozcieńczenia testowanych związków. Nie są konieczne żadne dalsze manipulacje w przypadku testów cytotoksyczności komórkowej; w przypadku testów przeciwko HIV do komórek dodaje się z góry określoną ilość wektora WT lub lekoopornego wektora HIV-1, który wyraża lucyferazy. Cytotoksyczność mierzy się za pomocą testu luminescencji zależnego od ATP, a wpływ związków na zakaźność mierzy się, określając ilość lucyferazy w obecności lub braku przypuszczalnych inhibitorów.
Ten test przesiewowy trwa 4 dni i wiele związków może być badanych równolegle. Związki są badane w trzech egzemplarzach, a dane są normalizowane do poziomów zakaźności/ATP w przypadku braku związków docelowych. Technika ta zapewnia szybki i dokładny pomiar skuteczności i toksyczności potencjalnych związków anty HIV.

Jeśli test (Rysunek 1, kroki 1 i 2) został przeprowadzony pomyślnie, wartości lucyferazy powinny być zbliżone do danych przedstawionych w Tabeli 2. Należy przeanalizować zakres stężeń; potencjalnie silny związek wykaże wzrost aktywności lucyferazy od lewej do prawej strony, a kontrola powinna wykazywać najwyższą aktywność lucyferazy. Jeśli aktywność lucyferazy nie przekracza 0,1 Relative Luciferase Units (RLUs) w całym zakresie stężeń, zazwyczaj wskazuje to na to, że związek zabił komórki. Jeśli dane dotyczące lucyferazy są większe lub równe 2,0 RLUs we wszystkich rozcieńczeniach seryjnych, oznacza to, że związki nie były w stanie zahamować infekcji HIV-1 w testowanych stężeniach.
Przedstawienie zależności stężenia związków od procentowego zahamowania aktywności lucyferazy w programie Kaleidagraph (Tabela 3, część A), po przeprowadzeniu analizy regresji liniowej, pozwoli na uzyskanie wyników podobnych do tych przedstawionych w Tabeli 3, część B.
<img alt="Schemat badania lucyferazy: transfekcja 293Ts, zbiór wirusa, infekcja komórek Hos, pomiar aktywności." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przygotowanie zapasów wirusa HIV-1 oraz konfiguracja testów cytotoksyczności komórkowej i jednorazowej zakaźności. W kroku 1 komórki 293T są transfekowane pNL4.3ΔEnv.LUC oraz VSV-G i inkubowane przez 48 hr w celu produkcji wirusa34. Wirus jest zbierany i przechowywany (zamrożony w aliquotach w temperaturze -80 °C) do czasu użycia w testach zakaźności. W kroku 2 komórki HOS są wysiewane na płytkę 96-dołkową i inkubowane przez 24 hr. Następnie komórki są preinkubowane z szeregowymi rozcieńczeniami testowanych związków przez 3 hr, a następnie infekowane wirusem (typu WT lub opornym na leki). Po 48 hr inkubacji mierzy się aktywność lucyferazy.
<img alt="Tabela rozcieńczeń chemicznych, stężenia w mikromolach, przygotowanie eksperymentalne, dane laboratoryjne." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" width="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Prototyp rozcieńczeń seryjnych w badaniach przesiewowych leków. Bardziej rygorystyczne badanie przesiewowe obejmuje 11 rozcieńczeń seryjnych, które zazwyczaj zaczynają się od 10 µM i kończą na 0,0005 µM. Rozcieńczenia seryjne przygotowuje się w stężeniu 10x (w każdej studzience znajduje się 100 µl komórek i 100 µl wirusa). Przy tej objętości i zgodnie z tymi obliczeniami, rozcieńczenia seryjne będą wystarczające dla 3 rzędów całej płytki 96-dołkowej. Testy cytotoksyczności przygotowuje się w podobny sposób; jednak 11 rozcieńczeń seryjnych zaczyna się od 250 μM i kończy na 0,05 μM. Do studzienek na płytce zawierających 100 μl komórek dodaje się tylko 11 μl rozcieńczeń. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Tabela danych z testu lucyferazy przedstawiająca sygnał zależny od stężenia oraz analizę % inhibicji." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 2"> 
Tabela 2. Odczyt danych sygnału lucyferazy oraz oznaczenie procentowej inhibicji aktywności lucyferazy. Tabela danych przedstawia typowy zestaw danych lucyferazy dla skutecznego związku. W tabeli zaprezentowano również dodatkowe obliczenia niezbędne do wyznaczenia procentowej inhibicji aktywności lucyferazy oraz wartości CC50 i IC50 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza krzywej inhibicji; wykres przedstawia % inhibicji w funkcji stężenia; wyświetlone równanie dopasowanego modelu danych." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 3"> 
Tabela 3. Tabela danych analizy regresji liniowej. Część A. Wykreślenie zakresu zastosowanych stężeń w stosunku do procentowej inhibicji aktywności lucyferazy w programie Kaleidagraph pozwoli na uzyskanie odpowiednich krzywych inhibicji. Część B. Krzywe inhibicji są zdefiniowane przez 3-parametryczną funkcję sigmoidalną i dopasowane do danych za pomocą analizy regresji liniowej18. Tabela danych ta jest następnie wykorzystywana w programie Microsoft Excel do obliczenia stężeń leku wymaganych do zahamowania integracji wirusa oraz cytotoksyczności komórkowej o 50%, np. IC50 i CC50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Tutaj opisujemy cytotoksyczność komórkową i testy zakaźności w pojedynczej rundzie, które pozwalają na szybkie i dokładne badanie przesiewowe związków w celu określenia ich cytotoksyczności komórkowej (CC50) i wartości IC50 przeciwko WT i lekoopornemu HIV-1.

Szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przesiewanie wybranych związków w celu określenia ich cytotoksyczności komórkowej oraz zdolności do hamowania wirusa HIV-1 typu dzikiego lub lekoopornego w jednorazowym teście zakaźności. Osiąga się to poprzez uprzednią ekspozycję komórek na związki w celu ich wchłonięcia, a następnie inkubację potraktowanych komórek z wirusem HIV-1 typu dzikiego lub lekoopornego wykazującym ekspresję lucyferazy. Następnie można zmierzyć aktywność lucyferazy wirusa.Ostatecznie sygnał odczytu lucyferazy może zostać wykorzystany do ilościowego określenia inhibicji replikacji wektora wirusowego HIV V1 przez badane związki. Technika ta ma znaczenie terapeutyczne, ponieważ może być stosowana do przesiewania nowych związków wykazujących lepszą skuteczność przeciwko lekoopornym szczepom HIV. Takie związki mogłyby potencjalnie znaleźć zastosowanie w terapiach antiretrowirusowych u pacjentów z HIV 1. W dniu poprzedzającym transfekcję wysiej komórki 2 93 na szalkach 100 mm z gęstością 1 500 000 komórek.Następnego dnia przeprowadź transfekcję komórek przy użyciu 16 µg HIV typu dzikiego lub zmutowanego oraz czterech µg VSV metodą fosforanu wapnia. Po około sześciu godzinach przemyj komórki 293 dwukrotnie PBS, a następnie inkubuj je w świeżej pożywce przez 48 godzin. Po dwóch dniach zbierz nadsączniki zawierające wirusy z naczyń o średnicy 100 mm i oczyść je poprzez wirowanie z niską prędkością przez 10 minut przy 1 620 ×g w temperaturze pokojowej.Następnie przefiltruj nadsączniki przez filtr strzykawkowy o rozmiarze porów 45 µm i potraktuj zawiesiny wirusowe preparatem turbo DNase. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej rozcieńcz wirusa świeżą pożywką i przechowuj go w temperaturze -80 °C. Aby przeprowadzić przesiew związków w teście zakaźności, w dniu poprzedzającym eksperyment wysiej 4 000 wybranych komórek do każdego dołka płytki 96-dołkowej.Wypełnij płytkę do hodowli 100 µL pożywki i inkubuj w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2. Po 24 godzinach wykonaj rozcieńczenia szeregowe związku z roztworu zapasowego w świeżej pożywce. Wybrane stężenia końcowe będą zależeć od empirycznie określonego zakresu stężeń, zgodnie z zestawieniem w tabeli.Następnie do dołków dodaje się rozcieńczenia seryjne związków w trzech powtórzeniach. Stosując objętość stanowiącą 1/10 objętości końcowej stężenia, inkubuje się odpowiednie rozcieńczenie związków z komórkami przez co najmniej trzy godziny. Po inkubacji za pomocą pipety wielokanałowej dodaje się 100 µl rozcieńczonego wirusa do każdego z dołków.Zaakceptuj dołki kontroli negatywnej. Następnie inkubuj płytki przez kolejne 48 godzin. Po inkubacji, używając pipety szklanej z końcówką o pojemności 200 µL, odessij pożywkę z dołków, zaczynając od górnej warstwy medium i powoli przesuwając się w dół w stronę narożnika dna dołka.Natychmiast dodaj 100 µL PBS uzupełnionego o 0,5 mM chlorku magnezu do każdego dołka, a następnie, aby zmierzyć aktywność lucyferazy, dodaj 10 µL buforu substratowego z zestawu do analizy luminescencyjnego genu reporterowego do każdej fiolki z dostarczonym liofilizowanym odczynnikiem. Następnie dodaj 100 µL zrekonstytuowanego odczynnika do każdego dołka i inkubuj płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić rozwój sygnału. Na koniec odczytaj płytkę 96-dołkową za pomocą luminometru do mikropłytek.W tabeli przedstawiono wartości lucyferazy uzyskane w wyniku pomyślnej procedury screeningu związków. Należy zauważyć, że potencjalnie silne związki wykazują zwiększoną aktywność lucyferazy, przy czym kontrola wykazuje najwyższy sygnał w tym reprezentatywnym przeszczepie Kaleido. Wykreślono zależność stężenia związku od procentowego zahamowania aktywności lucyferazy, aby określić, czy związek jest skuteczny w hamowaniu replikacji typu dzikiego lub lekoopornego HIV.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby precyzyjnie rozdzielić jednorodną liczbę komórek i wirusa do wszystkich dołków płytek oraz upewnić się, że do każdego dołka wprowadzono odpowiednie stężenie związków.

rapid-screening-of-hiv-reverse-transcriptase-and-integrase-inhibitors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Szybkie badanie inhibitorów odwrotnej transkryptazy HIV i integrazy

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Testy in vitro do pomiaru replikacji wirusa zostały znacznie ulepszone dzięki rozwojowi rekombinowanych wirusów RNA wyrażających lucyferazy lub inne enzymy zdolne do bioluminescencji. W tym miejscu szczegółowo opisujemy wysokoprzepustową linię badań przesiewowych, która łączy takie rekombinowane szczepy wirusów odry i chikungunya w celu wyizolowania leków przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania z bibliotek chemicznych.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania

Testy oporności na leki dla osób zakażonych wirusem HIV-1, u których nie powiodła się terapia antyretrowirusowa (ART), mogą ukierunkować przyszłe terapie i poprawić wyniki leczenia. Optymalizacja indywidualnych i populacyjnych wyników zdrowotnych w warunkach wysokiego rozpowszechnienia HIV, ale ograniczonych zasobów, będzie ostatecznie wymagała przystępnych cenowo i dostępnych metod genotypowania i interpretacji oporności na leki.

Przystępna cenowo metoda monitorowania oporności na leki HIV-1 w warunkach ograniczonych zasobów

Ten raport opisuje test in vitro do pomiaru aktywności integracyjnej ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) związanego z kompleksem preintegracji () w ekstraktach cytoplazmatycznych ostro zakażonych komórek. Integracja DNA HIV-1 związanego z z heterologicznym docelowym DNA jest określana ilościowo przy użyciu zagnieżdżonej strategii reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym.

Pomiar aktywności integracyjnej in vitro kompleksów przedintegracyjnych HIV-1

Ten manuskrypt opisuje procedurę eksperymentalną i analizę oprogramowania dla dwukierunkowego testu miejsca integracji, który może jednocześnie analizować DNA połączenia wektor-gospodarz w górę i w dół. Dwukierunkowe produkty PCR mogą być używane na dowolnej platformie sekwencjonowania niższego szczebla. Uzyskane dane są przydatne do wysokoprzepustowego, ilościowego porównania zintegrowanych celów DNA.

Dwukierunkowa metodologia PCR w miejscu integracji retrowirusowej i przepływ pracy analizy danych ilościowych

Rekombinowana integraza retrowirusowa i oligomery DNA naśladujące końcówki DNA wirusa mogą tworzyć enzymatycznie aktywny kompleks znany jako intasom. Intasomy mogą być wykorzystywane do badań biochemicznych, strukturalnych i kinetycznych. Protokół ten szczegółowo opisuje, jak składać i oczyszczać prototypowe pieniste intasomy wirusa.

Montaż i oczyszczanie prototypowych pienistych intasomów wirusowych

Opisujemy test oparty na komórkach, który informuje o fuzji HIV-1 poprzez ekspresję białka zielonej fluorescencji wykrywalnego za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Może być stosowany do testowania inhibitorów wnikania wirusa (szczególnie na etapie fuzji) w systemach infekcji bezkomórkowych i międzykomórkowych.

Wysokoprzepustowy test fuzji błony wirusowej aktywowanej Cre-Lox w celu identyfikacji inhibitorów fuzji błony wirusowej HIV-1

Tutaj prezentujemy podejście do głębokiego sekwencjonowania, które zapewnia bezstronne określenie powstających 3'-końców, jak również profili mutacyjnych jednoniciowych cząsteczek DNA. Głównym zastosowaniem jest charakterystyka powstających retrowirusowych komplementarnych DNA (cDNA), produktów pośrednich powstających w procesie retrowirusowej odwrotnej transkrypcji.

Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Protokół o wysokiej przepustowości do oceny funkcjonalnej skutecznej reaktywacji i usuwania utajonych prowirusów HIV jest opisany i stosowany poprzez testowanie wpływu interwencji na transkrypcję i splicing HIV. Przedstawiono reprezentatywne wyniki wpływu czynników odwracających opóźnienia na transkrypcję i splicing sterowany przez LTR.

Wysokoprzepustowa ocena in vitro czynników odwracających opóźnienia w transkrypcji i splicingu HIV

W tej pracy opisujemy protokoły używane w testach opartych na replikonie i enzymach wirusowych do badań przesiewowych na obecność inhibitorów replikacji wirusa Zika w formacie wysokoprzepustowych.

Wysokoprzepustowe testy przeciwwirusowe do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów replikacji wirusa Zika

W tym badaniu wykorzystano strategie in-silico, aby zidentyfikować enumerowaną etrawirynę jako obiecujący środek terapeutyczny dla HIV. Nasze odkrycia dotyczące interakcji molekularnych i dynamiki wspierają racjonalne projektowanie nowych NNRTI jako możliwych alternatyw leczenia HIV.

Ilościowa zależność struktura-aktywność, przewidywanie aktywności i dynamika molekularna nienukleotydowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy

Poznaj metodę szybkiego przesiewowego badania związków chemicznych pod kątem cytotoksyczności komórkowej i skuteczności przeciwko HIV-1 typu dzikiego oraz opornym na leki szczepom wirusa. Wykorzystuje się testy z lucyferazą do pomiaru replikacji wirusowej.

Szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV

Przeglądaj więcej filmów