Szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest badanie przesiewowe interesujących związków w celu określenia ich cytotoksyczności komórkowej i zdolności do hamowania wirusa HIV typu dzikiego lub opornego na leki, jeden w jednym rundzie testu zakaźności. Osiąga się to poprzez najpierw wystawienie komórek na działanie związków w celu wychwytu, a następnie inkubację leczonych komórek lucyferazyą wykazującą ekspresję wirusa HIV typu dzikiego lub opornego na leki. Następnie można zmierzyć aktywność lucyferazy wirusa.

Ostatecznie sygnał odczytu lucyferazy może być wykorzystany do ilościowego określenia hamowania replikacji jednego wektora wirusowego HIV V przez związki. Technika ta ma implikacje terapeutyczne, ponieważ może być stosowana do badań przesiewowych nowych związków, które wykazują lepszą skuteczność przeciwko lekoopornemu wirusowi HIV. Takie związki mogłyby być potencjalnie stosowane w terapiach antyretrowirusowych u pacjentów z HIV jeden W dniu poprzedzającym transfekcję płytka 2 93 komórki na 100 milimetrowych szalkach o gęstości 1 500 000 komórek.

Następnego dnia przetransfekować komórki 16 mikrogramami wirusa HIV typu dzikiego lub zmutowanego i czterema mikrogramami VSV przy użyciu metody fosforanu wapnia app. Sześć godzin później przemyć 2 93 komórki dwukrotnie PBS, a następnie inkubować je ze świeżą pożywką przez 48 godzin. Dwa dni później należy zebrać wirusa zawierającego supernatanty S z szalek o średnicy 100 milimetrów i sklarować supernatanty przez wirowanie z niską prędkością przez 10 minut w temperaturze 1 620 G w temperaturze pokojowej.

Następnie przefiltruj supernatanty przez 45-mikromolowy filtr strzykawkowy o wielkości porów i potraktuj zawiesiny wirusa turbo DNA. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej rozcieńczyć wirusa świeżą pożywką i przechowywać go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić badanie przesiewowe związków w teście zakaźności w dniu poprzedzającym eksperyment, należy zasiać 4 000 komórek będących przedmiotem zainteresowania w każdym dołku 96.

Dobrze rozcieńczyć w 100 mikrolitrach pożywki i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. 24 godziny później seryjnie rozcieńczyć związek z roztworu podstawowego do świeżej pożywki. Ostateczne wybrane stężenia będą zależały od empirycznie określonego zakresu stężeń, jak przedstawiono w tabeli.

Następnie dodać seryjne rozcieńczenie związków do studzienek w trzech dołach. Przy jednej dziesiątej objętości końcowego stężenia inkubować odpowiednie rozcieńczenie związków z komórkami przez co najmniej trzy godziny. Po inkubacji za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonego wirusa do każdej z studzienek.

Zaakceptuj studzienki kontroli ujemnej. Następnie inkubuj płytki przez kolejne 48 godzin. Po inkubacji użyj szklanej pipety wyposażonej w końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby zassać pożywkę z dołków, zaczynając od góry pożywki i powoli kierując się w dół w kierunku dolnego rogu dołka.

Natychmiast dodaj 100 mikrolitrów PBS uzupełnionego 0,5 milimolowym chlorkiem magnezu do każdej studzienki, a następnie, aby zmierzyć aktywność lucyferazy, dodaj 10 mikrolitrów buforu substratu z testu genu reporterowego luminescencji do każdej fiolki dostarczonego liofilizowanego odczynnika. Następnie dodaj 100 mikrolitrów odczynnika odtworzonego do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić rozwinięcie się sygnału. Na koniec odczytaj 96-dołkową płytkę za pomocą luminometru mikropłytki.

Wartości lucyferazy z udanej procedury przesiewowej związku przedstawiono w tabeli. Należy zauważyć, że potencjalnie silne związki wykazują zwiększoną aktywność lucyferazy, przy czym grupa kontrolna wykazuje najwyższy sygnał w tym reprezentatywnym przeszczepie Kaleido. Stężenie związku w stosunku do procentowego zahamowania aktywności Lucyfera zostało wykreślone w celu określenia, czy związek jest skuteczny w hamowaniu replikacji wirusa HIV typu dzikiego lub opornego na leki.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby dokładnie rozprowadzić jednolitą ilość komórek i wirusa we wszystkich dołkach płytek oraz upewnić się, że do każdej studzienki trafia się odpowiednie stężenie związków.