Separacje metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i testy biologiczne ekstraktów roślinnych w celu identyfikacji związków przeciwdrobnoustrojowych

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja metabolitów roślinnych, które działają przeciwbakteryjnie w stosunku do bakterii beztlenowych. Osiąga się to poprzez najpierw oddzielenie ekstraktu roślinnego za pomocą chromatografii cienkowarstwowej lub TLC. Następnie chromatogram jest cięty na strefy zawierające jeden lub więcej związków.

Strefy są następnie umieszczane na agarze zaszczepionym bakteriami beztlenowymi i inkubowane. Po inkubacji strefy są usuwane, a płytki są barwione w celu zidentyfikowania związków hamujących rozwój bakterii. Uzyskane dane wskazują na obecność lub brak przeciwdrobnoustrojowych metabolitów roślinnych.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie żywienia przeżuwaczy, takie jak wpływ wtórnych metabolitów roślinnych na wykorzystanie składników pokarmowych przez określone mikroorganizmy. Chociaż ta metoda ujawnia związki roślinne, które są hamujące dla bakterii żwacza. Może być również stosowany do ujawniania związków hamujących inne bakterie lub grzyby.

W tym protokole związki fenolowe z koniczyny czerwonej zostaną wykorzystane do wykazania identyfikacji związków przeciwdrobnoustrojowych na podstawie biografii kontaktowej. Zacznij od oczyszczenia płytek chromatografii cienkowarstwowej lub TLC pracujących w dygestorium. Przygotuj wystarczającą ilość rozpuszczalnika czyszczącego, aby pokryć dno komory wywoływania TLC, a także dolną krawędź płytki TLC.

Po umieszczeniu w komorze tutaj przygotowuje się metanol z octanu etylu dwa do jednego. Następnie zakładanie rękawiczek i praca w dygestorium. Użyj nożyczek, aby wyciąć elastyczne płyty krzemionkowe z aluminiowym lub plastikowym podkładem, aby pasowały do komory wywoływania.

Włóż płytki do komory tak, aby wierzchołki opierały się o ścianki komory. Talerze nie powinny się stykać. Przykryj komorę i pozwól rozpuszczalnikowi przesunąć się w górę płytek poprzez działanie kapilarne.

Gdy rozpuszczalnik dotrze do górnej części płytek, wyjmij je z komory i ułóż w pozycji stojącej w dygestorium, aż rozpuszczalnik odparuje. Po wyschnięciu płytek sprawdź, czy zanieczyszczenia nie migrowały w pobliżu górnej części płytek TLC. Pojawią się one jako żółty pasek w świetle widzialnym lub fluorescencyjny pasek w świetle ultrafioletowym.

Jeśli większość płytki nadal ma żółtawy odcień, powtórz proces czyszczenia w tej samej komorze TLC, używając tego samego rozpuszczalnika. Po wyjęciu płytek TLC z komory należy wyrzucić rozpuszczalnik. Poczekaj, aż resztki rozpuszczalnika całkowicie odparują przed użyciem komory do następnej części protokołu.

Następnie, aby usunąć wilgoć resztkową, która może wpływać na migrację związków na krzemionce, ustaw płytki pionowo w piecu do suszenia w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut w przypadku płytki o wymiarach 20 na 20 centymetrów i pięć minut w przypadku płytek o wymiarach siedem na 10 centymetrów. Gdy płytki wyschną, pozwól im ostygnąć do temperatury otoczenia przed załadowaniem ich ekstraktami. Aby przygotować komory do separacji ekstraktu, za pomocą nożyczek przyciąć kawałek bibuły filtracyjnej nieco poniżej wysokości komory i około połowy obwodu komory.

Papier ten będzie działał jak do wyciągania rozpuszczalników w górę ścianki komory i nasycania komory bibułami rozpuszczalnikowymi, poprawiając w ten sposób odtwarzalność separacji W dygestorium wymieszaj tutaj rozpuszczalniki. Stosowane rozpuszczalniki to metanol z octanu etylu od czterech do jednej objętości na objętość. Wlej mieszaninę rozpuszczalnika do komory i przykryj.

Użyj ołówka, aby delikatnie zaznaczyć początek w punkcie na płytce TLC, który będzie znajdował się nad powierzchnią rozwijającego się rozpuszczalnika w komorze. Jeśli absorbent płytki TLC jest miękki i łatwo ulega uszkodzeniu, zrób ślady na krawędziach, jak pokazano tutaj. Następnie rozpuść ekstrakty w wystarczającej ilości rozpuszczalnika organicznego, aby uzyskać stężony roztwór zamiast mętnej zawiesiny.

W tym przypadku stosowanym rozpuszczalnikiem jest metanol. Za pomocą mikropipet kapilarnych lub strzykawki mikrolitrowej ładuje wzorce i próbki jako wąskie pasma, pozostawiając jednocentymetrową obwódkę po bokach płytki, pozwól pasmom wyschnąć wachlowanie płytki lub ładowanie jej do dygestorium pomaga szybciej wysuszyć paski. Po wyschnięciu pasm ponownie załaduj próbki w to samo miejsce lub nad miejscem.

Jeżeli potrzebne jest większe stężenie próbki na płytce, powtórzyć czynności w razie potrzeby w komorze TLC. Upewnij się, że cały został nasycony rozpuszczalnikiem. Następnie za pomocą kleszczy lub szczypiec umieść płytki w komorze TLC.

Talerze nie powinny dotykać. Przykryć komorę i pozwolić, aby płytki rozwinęły się, zanim czoło rozpuszczalnika dotrze do górnej części płytki. Wyjmij płytki ze zbiornika TLC i zaznacz ołówkiem wysokość czoła rozpuszczalnika.

Pozostaw talerz do wyschnięcia. W dygestorium wywołaj wszelkie pozostałe płytki TLC w tej samej komorze TLC, która zazwyczaj nadaje się do użytku przez cały dzień, jeśli jest zamknięta. Jeśli ilość rozpuszczalnika w komorze zauważalnie się zmniejszy, po wyschnięciu płytek należy przygotować więcej mieszaniny rozpuszczalników.

Wizualizuj pasma w świetle widzialnym lub UV. Komora obserwacyjna z przenośną lampą UV jest wygodna, zwłaszcza jeśli lampa może wykrywać związki zarówno przy krótkofalowym promieniowaniu UV o długości 254 nanometrów, jak i długofalowym promieniowaniu UV o długości 365 nanometrów. Za pomocą ołówka obrysuj pasma za pomocą żelowego systemu dokumentacji fotograficznej wyposażonego w światła górne, UV i/lub widzialne, aby uzyskać obrazy płytek.

Wreszcie, aby pomóc w scharakteryzowaniu pasm, oblicz współczynnik retencji lub wartości RF, najpierw mierząc odległość przebytą przez związek, a następnie mierząc odległość przebytą przez rozpuszczalnik i dzieląc tę pierwszą przez drabinę. Po zaznaczeniu lokalizacji taśm tabliczki można przechowywać na później. Zastosowanie w teście biologicznym.

Zawiń talerze w folię i przykryj folią. Przechowuj płytki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Maksymalny czas przechowywania zależy od stabilności związku, ponieważ krzemionka nie jest neutralna.

Niektóre związki mogą ulegać degradacji podczas przebywania na płytce TLC. W ramach przygotowań do testu biografii kontaktowej należy przygotować i zaszczepić bakterie wytwarzające hiperamoniak lub pożywkę HAB w warunkach beztlenowych. Kultura użyta w tym przypadku to Clostridium stickland eye strain sr.

Rozwijaj kulturę do fazy wykładniczej lub stacjonarnej w temperaturze 39 stopni Celsjusza. Stosuj sterylne techniki beztlenowe podczas pracy z mikroorganizmami beztlenowymi. Przygotuj punkt zerowy: 75% masy na objętość.

Agar w tym samym podłożu, którego użyto do hodowli bakterii, po tym, jak temperatura agaru spadła do mniej niż 60 stopni Celsjusza. Zaszczepić stopiony agar objętością 1% na objętość kultury i delikatnie wymieszać, natychmiast umieścić go w komorze beztlenowej i wlać nożyczkami do plastikowych szalek Petriego o wymiarach 15 na 100 milimetrów. Pokrój płytkę TLC na strefy zawierające pas lub pasma zainteresowania.

Za pomocą sharpie zaznacz tylne strony płyt. Umieścić niewykorzystany pasek TLC na płytce agarowej jako kontrolę. Następnie umieść banderole stroną zadrukowaną do dołu na płytkach agarowych.

Inkubować płytki stroną agarową do dołu w komorze beztlenowej. Inkubator na 24 godziny w temperaturze 39 stopni Celsjusza z kleszczami. Usuń pasma TLC z płytek agarowych, gdy znajdują się one w komorze beztlenowej.

Dodaj kroplami czerwień tetra oleum na powierzchnie płytek agarowych. Pozwól kolorowi rozwinąć się przez co najmniej 20 minut. Gdy tabliczka kontrolna zmieni kolor na całkowicie czerwony, wyjmij płytki z komory beztlenowej.

Sztyft Clostridium Landi jest bakterią beztlenową, więc zacznie tracić żywotność natychmiast po wyjęciu z komory beztlenowej, ale kolor jest stabilny przez ponad 24 godziny. Za pomocą aparatu cyfrowego sfotografuj płyty w świetle widzialnym na tle zapewniającym wystarczający kontrast. Jaskrawoczerwony kolor będzie obserwowany, gdy żywe komórki zostaną zabarwione.

Martwe komórki nie plamią się. Reprezentatywne separacje krzemionki, TLC ekstraktów z czerwonej koniczyny zawierających związki fenolowe przedstawiono tutaj. Rozdzielenie w octanie etylu heksanie dziewięć do jednego na 8,5 centymetra dało pięć pasm, z których jedno jest całkowicie rozdzielone od początku.

Wgrane wzorce to Formin Bio, Canon A i Genine. Cztery pasma z tej płytki nałożono na kultury z Clostridium stick Landi, bakterią wytwarzającą hiperamoniak w żwaczu przez 24 godziny i wybarwiono czerwienią tetra oleum, jak pokazano tutaj. Inkubacja z pasmem pierwszym Bio Canon A i częścią pasma drugiego czwartego Monon neina na agarze z nasionami bakterii spowodowała dobrze zdefiniowaną strefę inhibicji.

Jednak inkubacja pozostałej części pasma drugiego, wraz z prążkami trzecim i czwartym, nie zahamowała wzrostu bakterii. Wyniki te wykazały, że bio Canon A był hamujący, aby zobaczyć wzrost lepkiego oka, ale forma aone Nein nie. Próbując tej procedury, należy pamiętać, że technika jest elastyczna.

Inne badane mikroorganizmy mogą być stosowane, o ile wybrane zostaną odpowiednie podłoża i uwzględnione zostaną kontrole w celu zapewnienia, że skład chemiczny separacji i metoda wykrywania są zgodne z tą procedurą. Inne techniki, takie jak wysokosprawna chromatografia cieczowa i spektrometria mas, mogą być wykorzystane do scharakteryzowania związków przeciwdrobnoustrojowych zidentyfikowanych w teście biologicznym.