Separacje metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i testy biologiczne ekstraktów roślinnych w celu identyfikacji związków przeciwdrobnoustrojowych

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie metabolitów roślinnych wykazujących działanie przeciwdrobnoustrojowe wobec bakterii beztlenowych. Osiąga się to poprzez wstępne rozdzielenie ekstraktu roślinnego za pomocą cienkowarstwowej chromatografii (TLC). Następnie chromatogram wycina się w strefy zawierające jedną lub więcej związków.

Następnie strefy umieszcza się na agarze zaszczepionym bakteriami beztlenowymi i inkubuje. Po inkubacji strefy są usuwane, a płytki barwione w celu zidentyfikowania związków hamujących wzrost bakterii. Uzyskane dane wykazują obecność lub brak przeciwmikrobowych metabolitów roślinnych.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie żywienia przeżewaczy, takie jak wpływ wtórnych metabolitów roślinnych na wykorzystanie składników odżywczych przez konkretne mikroorganizmy. Chociaż metoda ta pozwala zidentyfikować związki roślinne hamujące wzrost bakterii żwacza, może być ona również zastosowana do wykrywania związków hamujących wzrost innych bakterii lub grzybów.

W niniejszym protokole związki fenolowe z koniczyny czerwonej zostaną wykorzystane do zademonstrowania identyfikacji związków przeciwdrobnoustrojowych za pomocą autobiografii kontaktowej. Pracę należy rozpocząć od oczyszczenia płytek do cienkowarstwowej chromatografii (TLC), pracując pod wyciągiem. Należy przygotować odpowiednią ilość rozpuszczalnika czyszczącego, aby pokryć dno komory wywoławczej TLC, a także dolną krawędź płytki TLC.

Przygotowuje się mieszaninę octanu etylu i metanolu w proporcji 2:1, którą następnie umieszcza się w komorze. Następnie, w rękawiczkach i pod wyciągiem, należy za pomocą nożyczek dociąć elastyczne płytki krzemionkowe z podkładem aluminiowym lub plastikowym tak, aby pasowały do komory rozwijania.

Włóż płytki do komory tak, aby ich górne krawędzie opierały się o ściany komory. Płytki nie powinny się ze sobą stykać. Przykryj komorę i pozwól rozpuszczalnikowi przemieszczać się w górę płytek dzięki działaniu kapilarnemu.

Gdy rozpuszczalnik dotrze do górnej krawędzi płytek, należy wyjąć je z komory i ustawić pionowo w dygestorium do czasu odparowania rozpuszczalnika. Po wyschnięciu płytek należy sprawdzić, czy zanieczyszczenia przemieściły się w pobliże górnej krawędzi płytek TLC. Będą one widoczne jako żółty prążek w świetle widzialnym lub prążek fluorescencyjny w świetle ultrafioletowym.

Jeśli większość płytki nadal ma żółtawy odcień, należy powtórzyć proces oczyszczania w tej samej komorze TLC, używając tego samego rozpuszczalnika. Po wyjęciu płytek TLC z komory należy wylać rozpuszczalnik. Przed użyciem komory do kolejnej części protokołu należy pozwolić na całkowite odparowanie pozostałego rozpuszczalnika.

Następnie, aby usunąć resztkową wilgoć, która może wpływać na migrację związków na krzemionce, ustaw płyty pionowo w suszarce w temperaturze 100 °C przez 10 do 15 minut w przypadku płyty o wymiarach 20 by 20 cm oraz przez 5 minut dla płyt o wymiarach 7 by 10 cm. Po wysuszeniu płyt należy pozwolić im ostygnąć do temperatury otoczenia przed naniesieniem ekstraktów. Aby przygotować komory do rozdziału ekstraktów, należy wyciąć nożyczkami kawałek papieru filtracyjnego o wysokości nieco mniejszej niż wysokość komory i szerokości stanowiącej około połowy obwodu komory.

Papier ten będzie służył jako knot do podciągania rozpuszczalników po ściankach komory i nasycania jej oparami rozpuszczalnika, co poprawi powtarzalność rozdzielania. W dygestorium wymieszaj rozpuszczalniki. Stosowane rozpuszczalniki to octan etylu i metanol w stosunku objętościowym 4:1. Wlej mieszaninę rozpuszczalników do komory i ją przykryj.

Za pomocą ołówka nanieś delikatnie linię startową w punkcie na płytce TLC, który znajdzie się powyżej powierzchni rozwijającego rozpuszczalnika w komorze. Jeśli adsorbent płytki TLC jest miękki i łatwo ulega uszkodzeniu, wykonaj oznaczenia na krawędziach, tak jak pokazano tutaj. Następnie rozpuść ekstrakty w wystarczającej ilości rozpuszczalnika organicznego, aby uzyskać stężony roztwór zamiast mętnej zawiesiny.

W tym przypadku jako rozpuszczalnik zastosowano metanol. Użycie mikropipet kapilarnych lub strzykawki mikrolitrowej pozwala na naniesienie standardów i próbek w postaci wąskich prążków, pozostawiając jednocentymetrowy margines po bokach płyty; wachlowanie płyty lub umieszczenie jej w dygestorium przyspiesza wysychanie prążków. Po wyschnięciu prążków nanosi się próbki ponownie w to samo miejsce (metoda over-spotting).

Jeśli na płytce wymagane jest większe stężenie próbki, powtórz procedurę w komorze TLC tak często, jak to konieczne. Upewnij się, że cały knot został nasycony rozpuszczalnikiem. Następnie za pomocą pęsety lub szczypiec umieść płytki wewnątrz komory TLC.

Płytki nie powinny dotykać knota. Przykryć komorę i pozwolić płytkom na rozwinięcie, zanim czoło rozpuszczalnika dotrze do górnej krawędzi płytki. Wyjąć płytki z komory TLC i zaznaczyć ołówkiem wysokość czoła rozpuszczalnika.

Pozostaw płytkę do wyschnięcia. W wyciągu opracuj pozostałe płytki TLC w tej samej komorze TLC, która jest zazwyczaj użyteczna przez cały dzień, jeśli pozostanie zamknięta. Jeśli ilość rozpuszczalnika w komorze wyraźnie spadnie, przygotuj nową mieszaninę rozpuszczalnika po wyschnięciu płytek.

Wizualizuj prążki w świetle widzialnym lub UV. Wygodna będzie komora do obserwacji z przenośną lampą UV, zwłaszcza jeśli lampa ta pozwala na wykrywanie związków zarówno przy krótkofalowym promieniowaniu UV o długości 254 nanometrów, jak i długofalowym UV o długości 365 nanometrów. Użyj ołówka do wyznaczenia prążków, a następnie wykorzystaj system dokumentacji fotograficznej żeli wyposażony w górne oświetlenie UV i/lub światło widzialne, aby uzyskać obrazy płytek.

Na koniec, aby pomóc w charakteryzacji prążków, oblicz współczynnik retencji lub wartości RF, mierząc najpierw odległość, jaką przebyła substancja, następnie mierząc odległość, jaką przebył rozpuszczalnik, i dzieląc pierwszą wartość przez drugą. Po zaznaczeniu położenia prążków płytki można przechowywać do późniejszego wykorzystania w bioanalizie.

Owiń płytki folią plastikową i przykryj je folią aluminiową. Przechowuj płytki w temperaturze -20 °C. Maksymalny czas przechowywania zależy od stabilności związku, ponieważ krzemionka nie jest neutralna.

Niektóre związki mogą ulegać degradacji podczas przebywania na płytce TLC. W ramach przygotowania do testu biogramu kontaktowego, należy przygotować i zaszczepić bakterie o wysokiej produkcji amoniaku lub podłoże HAB w warunkach beztlenowych. Kulturą wykorzystaną w tym przypadku jest Clostridium stickland eye strain sr.

Hodować kulturę do fazy wykładniczej lub stacjonarnej w temperaturze 39 °C. Podczas pracy z mikroorganizmami beztlenowymi należy stosować sterylne techniki beztlenowe. Przygotować roztwór o stężeniu 0,75% m/v.

Agar w tym samym medium, w którym hodowano bakterie, po obniżeniu temperatury agaru do mniej niż 60 °C. Zaszczep molten agar ilością kultury wynoszącą 1% objętościowo, delikatnie wymieszaj, natychmiast umieść w komorze beztlenowej i rozlej do plastikowych płytek Petri o wymiarach 15 by 100 mm. Wycięcie płytki TLC na strefy zawierające interesujące pasma.

Za pomocą markera niezmywalnego oznaczono tyły płytek. Jako kontrolę na płytkę z agarem położono nieużywaną pasku TLC. Następnie paski położono stroną aktywną do dołu na płytkach z agarem.

Inkubuj płytki agarową stroną do dołu w inkubatorze komory beztlenowej przez 24 godziny w temperaturze 39 °C. Za pomocą pęsety usuń prążki TLC z płytek agarowych, gdy znajdują się one w komorze beztlenowej.

Dodaj tetra oleum red kroplami na powierzchnie szalek z agarem. Pozostaw do rozwinięcia się barwy na co najmniej 20 minut. Gdy płytka kontrolna stanie się całkowicie czerwona, wyjmij płytki z komory beztlenowej.

Clostridium stick Landi jest bakterią beztlenową, w związku z czym zacznie ona tracić żywotność natychmiast po wyjęciu z komory beztlenowej, jednak kolor pozostaje stabilny przez ponad 24 godziny. Używając aparatu cyfrowego, należy sfotografować płytki w świetle widzialnym na tle zapewniającym odpowiedni kontrast. W przypadku barwienia żywych komórek zaobserwowany zostanie intensywnie czerwony kolor.

Martwe komórki nie barwią się. Przedstawiono reprezentatywne rozdziale na płytkach TLC z krzemionką ekstraktów z koniczyny czerwonej zawierających związki fenolowe. Rozdział w mieszaninie octanu etylu i heksanu w stosunku 9:1 na dystansie 8,5 cm doprowadził do powstania pięciu pręg, z czego jedna została całkowicie oddzielona od linii startowej.

Wykorzystane standardy to Formin Bio Canon A oraz Genine. Cztery paski z tej płytki naniesiono na kultury Clostridium stick Landi, ruminalną bakterię o wysokiej produkcji amoniaku, na 24 godziny i wybarwiono tetra oleum red zgodnie z opisem przedstawionym tutaj. Inkubacja z paskiem pierwszym Bio Canon A oraz częścią paska drugiego four Monon nein na posianym agarze bakteryjnym doprowadziła do powstania wyraźnej strefy zahamowania wzrostu.

Jednak inkubacja pozostałej części prążka drugiego wraz z prążkami trzecim i czwartym nie zahamowała wzrostu bakterii. Wyniki te wykazały, że bio Canon A hamował wzrost see stickland eye, natomiast form aone Nein nie wywierał takiego działania. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że technika ta jest elastyczna.

Można zastosować inne mikroorganizmy testowe, pod warunkiem doboru odpowiednich podłoży oraz uwzględnienia kontroli zapewniających kompatybilność chemii rozdziału i metody detekcji z opisywaną procedurą. Do charakterystyki związków przeciwmikrobowych zidentyfikowanych w bioanalizie można wykorzystać inne techniki, takie jak wysokosprawna chromatografia cieczowa i spektrometria mas.