Name: Separacje metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i testy biologiczne ekstraktów roślinnych w celu identyfikacji związków przeciwdrobnoustrojowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-27T22:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Poznaj metodę chromatografii cienkowarstwowej i bioautografii kontaktowej do identyfikacji przeciwdrobnoustrojowych metabolitów roślinnych z koniczyny czerwonej przeciwko beztlenowym bakteriom.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy zmarłemu Dr. Normowi Taylorowi, Wydziałowi Nauk o Roślinach i Glebie Uniwersytetu Kentucky, za umożliwienie nam wykorzystania próbek z jego działek koniczyny czerwonej do tego badania. Projekt ten został sfinansowany przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych.

1. Przygotowanie ekstraktu roślinnego
<ol>
	<li>Zobacz Kagan i Flythe10 dla ekstrakcji związków fenolowych z Trifolium pratense cv. Kenland. </li>
	<li>Aby wyekstrahować inne związki w innych roślinach, zapoznaj się z literaturą dotyczącą analizy fitochemicznej pod kątem metod ekstrakcji specyficznych dla roślin lub metabolitów (wiele z nich jest opisanych) lub poszukaj protokołów, takich jak te Khurrama i wsp.7,8, które izolują wiele związków o szerokim zakresie polarności.</li>
</ol>
2. Przygotowanie płyt cienkowarstwowych
<ol>
	<li>Oczyścić płytki TLC, rozwijając je w jednym lub kilku polarnych, obojętnych rozpuszczalnikach, w celu usunięcia zaadsorbowanych zanieczyszczeń z dala od strefy rozwoju.
	<ol>
		<li>W dygestorii przygotuj wystarczającą ilość rozpuszczalnika czyszczącego (np. 15-100 ml octanu etylu i metanolu w stosunku 2:1, v/v), aby pokryć dno komory wywoływania TLC, a także dolną krawędź płytki TLC, gdy jest umieszczona w komorze.</li>
		<li>Używaj dostępnych w handlu szklanych komór do wywoływania TLC (dostępne różne rozmiary, z pokrywkami) lub pokrytych folią zlewek Pyrex lub słoików do wekowania.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek wycinaj (elastyczne) płytki z żelu krzemionkowego na podłożu aluminiowym lub plastikowym, które są dostępne w różnych rozmiarach (20 cm x 20 cm i mniejsze), aby pasowały do dostępnej komory wywoływania. (Uwaga: krzemionka może spowodować uszkodzenie płuc w przypadku wdychania. Pracuj pod wyciągiem i obchodź się z płytkami TLC w rękawiczkach, aby uniknąć dostania się olejków skórnych na krzemionkę.)</li>
		<li>Włóż płytki do komory, tak aby wierzchołki opierały się o ścianki komory. Talerze nie powinny się stykać. Przykryj komorę i pozwól rozpuszczalnikowi przesunąć się w górę płytki poprzez działanie kapilarne.</li>
		<li>Gdy rozpuszczalnik dotrze do górnej części płytek, wyjmij płytki z komory i ułóż je w pozycji stojącej w dygestorium, aż rozpuszczalnik odparuje.</li>
		<li>Sprawdź, czy zanieczyszczenia migrowały w pobliżu górnej części płytki TLC, szukając żółtego pasma w świetle widzialnym lub pasma fluorescencyjnego w świetle ultrafioletowym (UV) (patrz "front zanieczyszczeń" lub IF na rysunku 2B). Jeśli większość płytki nadal ma żółtawy odcień, powtórz proces czyszczenia.</li>
		<li>Po wyjęciu płytek TLC z komory należy wyrzucić rozpuszczalnik. Poczekaj, aż resztki rozpuszczalnika całkowicie odparują przed użyciem komory dla protokołu 2.</li>
		<li>Aby usunąć wilgoć resztkową, która może wpływać na migrację związków na krzemionce16, podeprzyj płytki pionowo w piecu do suszenia w temperaturze 100 °C (10-15 minut w przypadku płyt o wymiarach 20 cm x 20 cm i 5 minut w przypadku płyt o wymiarach 7 cm x 10 cm).</li>
		<li>Jeśli suszarka o temperaturze 100 °C nie jest dostępna, podgrzewaj płyty przez dłuższy czas w niższych temperaturach (np. 40 minut w temperaturze 60 °C).</li>
		<li>Po wyschnięciu płyt pozwól im ostygnąć do temperatury otoczenia przed załadowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie komór do separacji ekstraktów
<ol>
	<li>Użyj nożyczek, aby przeciąć kawałek bibuły filtracyjnej nieco poniżej wysokości komory i około połowy obwodu komory. Papier ten działa jak do wciągania rozpuszczalnika w górę ścianki komory i nasycania komory oparami rozpuszczalnika, poprawiając w ten sposób odtwarzalność separacji1.</li>
	<li>W dygestorium wymieszaj rozpuszczalniki (octan etylu-metanol 4:1, v/v, do tego badania). Wlej mieszaninę rozpuszczalnika do komory i przykryj. Poczekaj, aż cały zostanie zwilżony rozpuszczalnikiem, wskazując nasycenie komory, aby włożyć płytki do komory.</li>
</ol>
4. Ładowanie i rozwój płytek TLC
<ol>
	<li>Delikatnie zaznacz początek układu współrzędnych ołówkiem. Jeśli adsorbent płytkowy TLC jest miękki i łatwo ulega uszkodzeniu, zrób ślady na krawędziach. Związki powinny znajdować się nad powierzchnią rozwijającego się rozpuszczalnika, gdy płytki są wkładane do komory TLC.</li>
	<li>Rozpuść ekstrakty w wystarczającej ilości rozpuszczalnika organicznego (w tym przypadku metanolu), aby uzyskać stężony roztwór zamiast mętnej zawiesiny.</li>
	<li>Próbki i wzorce należy ładować w postaci wąskich pasm za pomocą mikrolitrowej strzykawki lub mikropipet kapilarnych, pozostawiając 1 cm obwódkę po bokach płytki. Pozostaw opaski do wyschnięcia (pomocne jest wachlowanie płyty lub załadowanie jej do dygestorium).</li>
	<li>Jeżeli potrzebne jest większe stężenie próbki na płytce, należy przeprowadzić "overspot" poprzez ponowne obciążenie próbek na wysuszone pasma.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy lub szczypiec umieść płytkę (płytki) wewnątrz nasyconej komory TLC. Płytki nie powinny dotykać, ponieważ może on dostarczać rozpuszczalnik do płytek w punktach styku, zmieniając w ten sposób ścieżkę migracji związku. Przykryj komorę i pozwól płytkom się rozwinąć.</li>
</ol>
5. Przygotowanie płytek do testu biologicznego
<ol>
	<li>Wyjąć płytkę (płytki) ze zbiornika TLC, zanim czoło rozpuszczalnika dotrze do górnej części płytki, i zaznaczyć ołówkiem wysokość czoła rozpuszczalnika. Pozostaw płytkę do wyschnięcia w dygestorium.
	<ol>
		<li>Wszelkie pozostałe płytki TLC należy umieścić w tej samej komorze TLC, która zazwyczaj nadaje się do użytku przez cały dzień, jeśli jest zamknięta. Ponownie przygotować mieszaninę rozpuszczalników do komory TLC, jeśli ilość rozpuszczalnika w komorze znacznie się zmniejszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wyschnięciu płytek zwizualizuj pasma w świetle widzialnym lub UV i nakreśl pasma ołówkiem. Komora obserwacyjna z przenośną lampą UV jest wygodna, zwłaszcza jeśli lampa może wykrywać związki zarówno przy 254 nm (krótkofalowe UV), jak i 365 nm (długofalowe UV). 
	Uwaga: W tym momencie lub po następnym kroku talerze można zawinąć w folię, przykryć folią i przechowywać w temperaturze -20 °C. Maksymalny czas przechowywania zależy od stabilności mieszanki. Ponieważ krzemionka nie jest obojętna, niektóre związki mogą ulegać degradacji na płytce TLC.</li>
	<li>Sfotografuj lub narysuj płyty.
	<ol>
		<li>Korzystaj z systemu do fotodokumentacji żelowej, jeśli jest wyposażony w górne światło UV i/lub światło widzialne.</li>
		<li>Jeśli nie jest dostępny komercyjny system dokumentacji fotograficznej, klisze fotograficzne w pudełku wyłożonym ciemnym papierem lub tkaniną, z aparatem fotograficznym ustawionym na statywie i przenośną lampą UV przymocowaną do stojaka pierścieniowego17. Podczas fotografowania klisz, które nie mają wskaźnika fluorescencyjnego, użyj filtra światła niebieskiego na obiektywie aparatu, aby poprawić wygląd pasma17.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby pomóc w scharakteryzowaniu pasm, należy obliczyć wartości współczynnika retencji (Rf), mierząc odległości przebyte przez front związku i rozpuszczalnika oraz dzieląc ten pierwszy przez drugi (rysunek 2A).</li>
</ol>
6. Hodowla i test bakteryjny
<ol>
	<li>Przygotować i zaszczepić pożywkę w warunkach beztlenowych. Kulturą użytą w tym przypadku był szczep Clostridium sticklandii SR, który uzyskano z kolekcji kultur Jamesa B. Russella, Cornell University, Ithaca, NY.
	<ol>
		<li>Zobacz Flythe i Kagan13 oraz listę materiałów, aby zapoznać się z opisem mediów HAB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwijaj kulturę do fazy wykładniczej lub stacjonarnej. Stosuj sterylne techniki beztlenowe podczas pracy z mikroorganizmami beztlenowymi.</li>
	<li>Zaszczepić kulturę (1% v/v) w stopionym agarze po tym, jak temperatura agaru (0,75% w/v) spadnie poniżej 60 °C. Delikatnie wymieszać i natychmiast wprowadzić do komory beztlenowej (95% CO2-5% atmosfery H2 dla pożywek HAB) w celu nalania.</li>
	<li>Wlać do plastikowych szalek Petriego o wymiarach 15 mm x 100 mm i pozostawić do zestalenia.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek pokrój płytkę TLC na strefy zawierające paski będące przedmiotem zainteresowania. Połóż banderole stroną zadrukowaną do dołu na płytkach agarowych, zaznaczając pasma na podłożu płytki, aby zachować oryginalną orientację na płytce TLC. Połóż niewykorzystany pasek TLC na płytce agarowej jako kontrolę.</li>
	<li>Inkubować płytki agarowe stroną agarową do dołu w komorze beztlenowej (24 godziny, 39 °C).</li>
</ol>
7. Wizualizacja biologicznie badanych płytek agarowych
<ol>
	<li>Za pomocą kleszczy usuń pasma z płytek agarowych, gdy znajdują się one w komorze beztlenowej.</li>
	<li>Dodać kroplami 1% (w/v) czerwieni tetrazolowej, przygotowanej w wodzie, na powierzchnie płytek agarowych. Pozostawić kolor do rozwinięcia się przez co najmniej 20 minut lub do momentu, gdy płytka kontrolna zmieni kolor na całkowicie czerwony, przed wyjęciem z komory beztlenowej. Bakterie beztlenowe zaczną tracić żywotność natychmiast po wyjęciu z komory beztlenowej, ale kolor jest stabilny przez ponad 24 godziny.</li>
	<li>Fotografuj w świetle widzialnym.</li>
</ol>

<ol><li>Stahl, E., Ashworth, M. R. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStahl%2C+E+%22Thin-layer+chromatography%22">Thin-layer chromatography</a>. , Springer. (1969).</li>
<li>Marston, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography+with+biological+detection+in+phytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry.</a> J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.</li>
<li>Homans, A. L., Fuchs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+bioautography+on+thin-layer+chromatograms+as+a+method+for+detecting+fungitoxic+substances%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances.</a> J. Chromatogr. 51, 327-329 Forthcoming.</li>
<li>Lund, B. M., Lyon, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+inhibitors+of+Erwinia+carotovora+and+E.+herbicola+on+thin-layer+chromatograms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms.</a> J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).</li>
<li>Betina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioautography+in+paper+and+thin-layer+chromatography+and+its+scope+in+the+antibiotic+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field.</a> J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).</li>
<li>Weltzien, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ein+biologischer+Test+f%C3%BCr+fungizide+Substanzen+auf+dem+Papierchromatogramm%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm.</a> Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).</li>
<li>Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+activities+of+Dodonaea+viscosa+using+contact+bioautography+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique.</a> Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).</li>
<li>Khurram, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+anticandidal+potential+of+Quercus+baloot+Griff.+using+contact+bioautography+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Afr.+J.+Pharm.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique.</a> Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).</li>
<li>Robinson, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobinson%2C+T+%22The+Organic+Constituents+of+Higher+Plants%22">The Organic Constituents of Higher Plants</a>. , Burgess Publishing Co. (1963).</li>
<li>Kagan, I. A., Flythe, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+separation+and+bioactivity+of+red+clover+%28Trifolium+pratense%29+extracts+assayed+against+Clostridium+sticklandii%2C+a+ruminal+hyper+ammonia-producing+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prod.+Commun%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium.</a> Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).</li>
<li>Mattila, P., Kumpulainen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+free+and+total+phenolic+acids+in+plant-derived+foods+by+HPLC+with+diode-array+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection.</a> J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).</li>
<li>Hamburger, M. O., Cordell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+bioautographic+TLC+assay+for+compounds+possessing+antibacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nat.+Prod%22%5BJournal%5D)">A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity.</a> J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).</li>
<li>Flythe, M., Kagan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+effect+of+red+clover+%28Trifolium+pratense%29+phenolic+extract+on+the+ruminal+hyper+ammonia-producing+bacterium%2C+Clostridium+sticklandii%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii.</a> Curr. Microbiol. 61, 125-131 Forthcoming.</li>
<li>Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioautographic+agar+overlay+method+for+the+detection+of+antifungal+compounds+from+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem.+Anal%22%5BJournal%5D)">A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants.</a> Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).</li>
<li>Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antigonococcal+activity+of+Coscinium+fenestratum+stem+extract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract.</a> J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).</li>
<li>Stahl, E., Kaldewey, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spurenanalyse+physiologisch+aktiver%2C+einfacher+Indolderivate%5BTitle%5D)+AND+%22Hoppe-Seyler%E2%80%99s+Z.+Physiol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate.</a> Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 Forthcoming.</li>
<li>Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+ecotype+variability+in+camalexin+production+and+reaction+to+infection+by+Alternaria+brassicicola%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola.</a> J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).</li>
<li>Kline, R. M., Golab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+in+developing+thin-layer+bioautographs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">A simple technique in developing thin-layer bioautographs.</a> J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).</li>
<li>Wedge, D. E., Nagle, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+2D-TLC+bioautography+method+for+the+discovery+of+novel+antifungal+agents+to+control+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nat.+Prod%22%5BJournal%5D)">A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens.</a> J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).</li>
<li>Beck, A. B., Knox, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acylated+isoflavone+glycosides+from+subterranean+clover+and+red+clover%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Chem%22%5BJournal%5D)">The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover.</a> Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).</li>
<li>Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+reconstitution+of+cytochrome+P450ox+and+in+vitro+reconstitution+of+the+entire+biosynthetic+pathway+of+the+cyanogenic+glucoside+dhurrin+from+sorghum%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum.</a> Plant Physiol. 115 (4), (1997).</li>
<li>Peterson, C. A., Edgington, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+estimation+of+the+fungicide+benomyl+using+a+bioautograph+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agr.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique.</a> J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).</li>
</ol>

Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w artykule służy wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznacza rekomendacji ani poparcia ze strony USDA. Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten opisuje prostą metodę rozdzielania ekstraktu na podzbiory związków i oznaczania tych podzbiorów za pomocą bioautografii kontaktowej. Metoda jest dość podobna do tej stosowanej przez Chomnawanga i wsp.15 do badań przesiewowych w kierunku metabolitów roślinnych hamujących bakterie wywołujące rzeżączkę. Rodzaj bioautografii zastosowanej do badań przesiewowych pod kątem przeciwdrobnoustrojowych związków roślinnych zależy od wielu czynników, w tym mikroorganizmu testowego, konfiguracji laborat...

Badanie obecności związków przeciwdrobnoustrojowych w roślinach wymaga rozdzielenia składników ekstraktu roślinnego, poddania mikroorganizmu testowego działaniu tych składników i ustalenia, czy wzrost mikroorganizmu jest hamowany przez którykolwiek z tych związków. Rozdzielanie za pomocą chromatografii papierowej lub cienkowarstwowej (PC lub TLC) jest wygodne, ponieważ wiele związków można rozdzielić na powierzchni płaskiej. Rozdzielanie opiera się na polarności, przy czym niektóre związki silnie wiążą się z adsorbentem (celulozą w przypadku PC i różnymi adsorbentami w przypadku TLC) i migrują w mniejszym stopniu niż inne1. Rysunek 1 przedstawia przykład względnych pozycji polarnych i niepolarnych związków fenolowych po rozdzieleniu na płytce TLC z krzemionką.
<img alt="Schemat struktur chemicznych flawonoidów i klowamidu wraz z wzorami cząsteczkowymi." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat ilustrujący rozmieszczenie związków o różnej polarności po rozdziale na płytce do cienkowarstwowej chromatografii (TLC) z krzemionką. Jako przykład wykorzystano związki fenolowe koniczyny czerwonej (Trifolium pratense L.). Związki polarne, takie jak klowamid, wykazują silne powinowactwo do polarnego adsorbenta, jakim jest krzemionka, i pozostają w pobliżu linii startu (OR), natomiast związki mniej polarne, takie jak trzy izoflawony w pobliżu czoła rozpuszczalnika (SF), łatwiej rozdzielają się do rozpuszczalników (które są mniej polarne niż krzemionka, chyba że dodano wodę, kwasy lub zasady) i migrują wyżej na płytce.
Po rozdzieleniu ekstraktu na płytce TLC, mikroorganizmy testowe mogą zostać poddane działaniu wszystkich związków na płytce, co przyspiesza identyfikację aktywnych składników ekstraktu2. Jeśli hodowla grzybów lub bakterii zostanie naniesiona na chromatogram, wzrost drobnoustrojów będzie następował wszędzie z wyjątkiem obszarów zawierających związki hamujące wzrost. Strefy inhibicji można następnie zwizualizować, obserwując kontrast między wzrostem grzybni a obszarami wolnymi od wzrostu w przypadku zastosowania grzybów3 lub poprzez opryskiwanie związkami, które zmieniają kolor podczas redukcji lub hydrolizy przez żywe komórki4. Choć zastosowanie chromatogramów papierowych lub cienkowarstwowych w testach przeciwdrobnoustrojowych było pierwotnie stosowane w odniesieniu do antybiotyków5 i fungicydów3,6, obecnie za pomocą tej metody, często nazywanej bioautografią, często przesiewowo bada się ekstrakty roślinne pod kątem związków przeciwdrobnoustrojowych. Opisane tutaj protokoły dotyczą bioautografii chromatogramów cienkowarstwowych. TLC jest szeroko stosowane, ponieważ jest stosunkowo szybkie i może być wykonywane na różnych adsorbentach (np. krzemionka, skrobia, tlenek glinu), a także zapewnia dobrą rozdzielczość i czułość1.
Ekstrakty roślinne do TLC można przygotować na wiele sposobów. Powszechnie stosowane metody obejmują ekstrakcję materiału roślinnego w mieszaninach alkoholowo-wodnych, takich jak 80% etanol7,8, opcjonalnie z dodatkiem kwasu lub zasady9. Po ekstrakcji w takich rozpuszczalnikach, które zawierają wodę i mogą być kwaśne lub zasadowe, ekstrakty należy zagęścić, aby można było nanieść je na płytki TLC w minimalnej objętości. Zagęszczanie ekstraktów alkoholowo-wodnych można osiągnąć poprzez rozdział z organicznymi rozpuszczalnikami niemieszalnymi z wodą8 lub mieszaniną takich rozpuszczalników, np. octanu etylu i eteru etylowego (1:1, v/v)10,11. Różne metabolity roślinne są ekstrahowane do różnych rozpuszczalników organicznych w zależności od ich polarności. Aby zapewnić ekstrakcję organicznych kwasów lub zasad roślinnych do rozpuszczalników organicznych na tym etapie, pH ekstraktu alkoholowo-wodnego można podnieść lub obniżyć za pomocą rozpuszczalnego w wodzie kwasu lub zasady, aby przekształcić zdysocjowane anality w ich formy niedysocjowane, które są następnie rozpuszczalne w obojętnych rozpuszczalnikach organicznych9. Fazę organiczną można następnie odparować pod zmniejszonym ciśnieniem lub w strumieniu azotu i doprowadzić do pożądanej objętości do analizy TLC. Mało prawdopodobne jest, aby pH ekstraktu było letalne dla mikroorganizmów w bioanalizie ze względu na rozdział analitów do obojętnych rozpuszczalników, małą objętość końcową oraz odparowanie ekstraktu z płytki TLC przed rozdzieleniem.
Zarówno grzyby, jak i bakterie są wykorzystywane jako mikroorganizmy testowe w bioautografii ekstraktów roślinnych2. Zarodniki niektórych grzybów, takich jak Cladosporium cucumerinum, kiełkują na płytkach TLC (z wyjątkiem obszarów zawierających związki hamujące), jeżeli zostaną rozpylone na płytki w roztworze odżywczym i inkubowane w wilgotnym środowisku przez kilka dni3. Ciemna grzybnia C. cucumerinum w strefach niehamujących stanowi wyraźny kontrast dla stref wolnych od wzrostu grzybni. Chociaż bakterie były nanoszone na płytki do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) w ten sam sposób4,12, są one również wylewane na powierzchnie płytek TLC w formie warstw agaru13,14. Drożdże, takie jak Candida albicans, mogą być również nanoszone w warstwach agaru14. Alternatywnie, płytki TLC można położyć stroną aktywną do dołu na agar zaszczepiony bakteriami10,15 lub drożdżami8, co jest metodą znaną jako bioautografia kontaktowa2.
Opisujemy metodę bioautografii kontaktowej do przesiewowego badania przeciwdrobnoustrojowych związków fenolowych z koniczyny czerwonej (Trifolium pratense cv. Kenland). Organizmem testowym jest Clostridium sticklandii, ruminalna bakteria o wysokiej produkcji amoniaku (HAB) i beztlenowiec obligatoryjny. Chociaż zastosowane rozdzielenia nie pozwalają na wyodrębnienie wszystkich składników ekstraktu, ułatwiają one identyfikację stref aktywności przeciwdrobnoustrojowej, zawężając tym samym pulę potencjalnych związków przeciwdrobnoustrojowych. Protokół wykorzystuje standardowe procedury TLC1. Protokół opisuje również niektóre techniki wymagane do hodowli beztlenowców obligatoryjnych w takim badaniu, zastosowanie bioautografii kontaktowej15 oraz metodę wizualizacji z użyciem soli tetrazoliowej, która barwi żywe komórki2,4.

<table><tbody><tr><td>Krzemionka F254 Płytki TLC, na podłożu aluminiowym, grubość 0,2 mm, 20 cm x 20 cm</td><td>EMD Chemicals</td><td>5554/7</td><td>Płytki te są pokryte krzemionką, która zawiera wskaźnik fluorescencyjny o długości fali 254 nm. Związki absorbujące na tej długości fali wydają się ciemne na fluorescencyjnym zielonym tle.&nbsp; Alternatywne źródła to Analtech, Selecto Scientific, Fluka.&nbsp; Mogą być potrzebne adsorbenty inne niż krzemionka. Płyty z plastikowym podkładem mogą być odpowiednie, w zależności od użytych rozpuszczalników.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ostre, wytrzymałe nożyczki&nbsp;</td><td>dowolna firma zajmująca się materiałami do szycia</td><td>podobna do Fiskars 175800-1002</td><td>Do cięcia płyt TLC.&nbsp; Można również użyć gilotyny do papieru z ostrym ostrzem.&nbsp; Nie wdychać pyłu krzemionkowego.</td></tr><tr><td>Suszarka w temperaturze 100 & stopni; C (konwekcja mechaniczna)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PR305225M</td><td>Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)</td></tr><tr><td>Komora TLC</td><td>Kimble Chase</td><td>416180-0000</td><td>Alternatywne źródła:&nbsp; Aldrich. Zlewki z Pyrexu lub słoiki do wekowania mogą być używane do małych talerzy (np. 5 cm x 10 cm).&nbsp; Przykryj folią aluminiową (pokrywki słoików mogą zawierać materiał ekstrahowany przez opary rozpuszczalnika).</td></tr><tr><td>50 &mikro; l Strzykawka z płaską końcówką igły</td><td>Hamilton</td><td>80965</td><td>Do ładowania ilości wzorca lub próbki przekraczającej 5-10 &mikro;l.&nbsp; Alternatywne źródła są równoważne.</td></tr><tr><td>Mikropipety</td><td>Drummond</td><td>2-000-001</td><td>Do ładowania małych ilości wzorców lub próbek.&nbsp; Alternatywne źródła:&nbsp; VWR.&nbsp; Ponadto pipety Pasteura można rozciągnąć do cieńszej średnicy za pomocą palnika butanowego.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna (klasa #1)</td><td>Whatman</td><td>1001 917</td><td>Służy jako komorowy.&nbsp; Inne gatunki bibuły filtracyjnej są OK.&nbsp; Ten rozmiar można przyciąć do komór mieszczących talerze o wymiarach 20 cm x 20 cm.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Szczypce do zlewek</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-186</td><td>Do wkładania i wyjmowania płytek z dużej komory TLC.&nbsp; Alternatywne źródła: VWR&nbsp;</td></tr><tr><td>Kleszczyki z płaską krawędzią</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-275</td><td>Do wkładania i wyjmowania płytek z małej komory. Alternatywne źródła: VWR </td></tr><tr><td>Mała przenośna lampa UV z żarówkami o mocy 4 W lub 6 W do oświetlenia światłem UV na krótko- i długofalowe (odpowiednio 254 i 365 nm)</td><td>Produkty ultrafioletowe</td><td>95-0271-01</td><td>Alternatywne źródła: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)</td></tr><tr><td>Szafka obserwacyjna do użytku z ręczną lampą UV</td><td>Produkty ultrafioletowe</td><td>Chromato-Vue C-10E</td><td>Pasma aktywne UV są łatwiej zakreślane, jeśli można w tym miejscu ustawić płytki.&nbsp; Alternatywne źródła: Spectronics Corporation.&nbsp;</td></tr><tr><td>System dokumentacji fotograficznej z górną lampą UV i lampą widzialną</td><td>Kodak</td><td>Gel Logic 200</td><td>&nbsp; Alternatywne źródła: Produkty ultrafioletowe (www.uvp.com).&nbsp; Zobacz protokół dla domowej alternatywy.</td></tr><tr><td>Komora beztlenowa, typ A, winylowa</td><td>Coy</td><td>7150000</td><td>Ta komora jest odpowiednia dla bakterii beztlenowych, takich jak Clostridium sticklandii, zgodnie z opisem. Jednak warunki wzrostu muszą być dostosowane do organizmu użytego w teście. W przypadku stosowania organizmów chorobotwórczych należy założyć komorę bezpieczeństwa biologicznego i zastosować inne środki ostrożności. Alternatywne źródła: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, inne&nbsp;</td></tr><tr><td>Tetrazolium red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8877</td><td>Alternatywne źródła: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar</td></tr><tr><td colspan="4">Składniki dla podłoża HAB</td></tr><tr><td>Piridoxamine &middot; 2HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9380</td><td>Dla tego i dla wszystkich innych odczynników w tej tabeli, alternatywne źródła są równoważne.</td></tr><tr><td>Ryboflawina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4500</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3902</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3376</td><td></td></tr><tr><td>D-Pantotenian wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8731</td><td></td></tr><tr><td>Kwas liponowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5625</td><td></td></tr><tr><td>Kwas p-aminobenzoesowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9878</td><td></td></tr><tr><td>Kwas foliowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8798</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Kobalamina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3607</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9130</td><td></td></tr><tr><td>Pirydoksyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5669</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan żelaza &middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8263</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan &middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek manganu &middot; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek kobaltu &middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek miedzi &middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>459097</tr><tr><td>Chlorek niklu &middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203866</td><td></td></tr><tr><td>Molibdenian sodu &middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>Tryptikaza (trawienie kazeiny przez trzustkę)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B11921</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy bezwodny</td><td>Thermo Fisher</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu i middot; H2O&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>S636</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Thermo Fisher</td><td>50841063</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu &middot; 6H2O</td><td>Thermo Fisher</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia &middot; 2H2O</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>Cysteina HCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>19464780</td><td></td></tr><tr><td>Potas fosforan dwuzasadowy bezwodny</td><td>Thermo Fisher</td><td>P290</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP358</td><td></td></tr></tbody></table>

separacje metodą chromatografii cienkowarstwowej (tlc) i testy biologiczne ekstraktów roślinnych w celu identyfikacji związków przeciwdrobnoustrojowych

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Powszechne badanie przesiewowe dla roślinnych związków przeciwdrobnoustrojowych polega na rozdzielaniu ekstraktów roślinnych za pomocą chromatografii papierowej lub cienkowarstwowej (PC lub TLC), wystawianiu chromatogramów na działanie zawiesin mikrobiologicznych (np. grzybów lub bakterii w bulionie lub agarze), dając czas na rozwój mikrobów w wilgotnym środowisku i wizualizując strefy, w których nie ma wzrostu mikroorganizmów. Skuteczność tej metody przesiewowej, znany jako bioautografia, zależy zarówno od jakości separacji chromatograficznej, jak i od dbałości o warunki hodowli drobnoustrojów. W artykule opisano standardowe protokoły TLC i bioautografii kontaktowej z nowatorskim zastosowaniem do bakterii fermentujących aminokwasy. Ekstrakt rozdziela się na elastycznych (aluminiowych) płytkach TLC z krzemionki, a pasma są wizualizowane w świetle ultrafioletowym (UV). Strefy są wycinane i inkubowane twarzą w dół na agarze zaszczepionym badanym mikroorganizmem. Pasma hamujące są wizualizowane przez barwienie płytek agarowych czerwienią tetrazolową. Metodę stosuje się do rozdzielania związków fenolowych koniczyny czerwonej (Trifolium pratense cv. Kenland) i ich badania przesiewowego pod kątem aktywności przeciwko Clostridium sticklandii, bakteria wytwarzająca hiperamoniak (HAB), która jest rodzima dla żwacza bydlęcego. Metody TLC mają zastosowanie do wielu rodzajów ekstraktów roślinnych i innych gatunków bakterii (tlenowych lub beztlenowych), a także grzybów, mogą być stosowane jako organizmy testowe, jeśli warunki hodowli zostaną zmodyfikowane w celu dopasowania do wymagań wzrostu gatunku.

Reprezentatywne rozdzialy TLC na żelu krzemionkowym ekstraktów z koniczyny czerwonej (Trifolium pratense cv. Kenland), zawierających związki fenolowe, przedstawiono na Rysunku 2. Rozdział ekstraktu z koniczyny czerwonej w mieszaninie octan etylu-heksan (9:1, v/v), na odcinku 8,5 cm, doprowadził do powstania pięciu pręg, z których jedna nie została w pełni oddzielona od linii startu (Rysunek 2A). Jednakże Rysunek 2B wykazuje, że ujawniono około dwa razy więcej pr...

Opisano metody cienkowarstwowej chromatografii (TLC) separacji ekstraktów roślinnych i kontaktowej bioautografii w celu identyfikacji metabolitów przeciwbakteryjnych. Metody te stosuje się do badań przesiewowych związków fenolowych koniczyny czerwonej hamujących bakterie wytwarzające hiperamoniak (HAB) pochodzące ze żwacza bydła.

Separacje metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i testy biologiczne ekstraktów roślinnych w celu identyfikacji związków przeciwdrobnoustrojowych

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie metabolitów roślinnych wykazujących działanie przeciwdrobnoustrojowe wobec bakterii beztlenowych. Osiąga się to poprzez wstępne rozdzielenie ekstraktu roślinnego za pomocą cienkowarstwowej chromatografii (TLC). Następnie chromatogram wycina się w strefy zawierające jedną lub więcej związków.Następnie strefy umieszcza się na agarze zaszczepionym bakteriami beztlenowymi i inkubuje. Po inkubacji strefy są usuwane, a płytki barwione w celu zidentyfikowania związków hamujących wzrost bakterii. Uzyskane dane wykazują obecność lub brak przeciwmikrobowych metabolitów roślinnych.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie żywienia przeżewaczy, takie jak wpływ wtórnych metabolitów roślinnych na wykorzystanie składników odżywczych przez konkretne mikroorganizmy. Chociaż metoda ta pozwala zidentyfikować związki roślinne hamujące wzrost bakterii żwacza, może być ona również zastosowana do wykrywania związków hamujących wzrost innych bakterii lub grzybów.W niniejszym protokole związki fenolowe z koniczyny czerwonej zostaną wykorzystane do zademonstrowania identyfikacji związków przeciwdrobnoustrojowych za pomocą autobiografii kontaktowej. Pracę należy rozpocząć od oczyszczenia płytek do cienkowarstwowej chromatografii (TLC), pracując pod wyciągiem. Należy przygotować odpowiednią ilość rozpuszczalnika czyszczącego, aby pokryć dno komory wywoławczej TLC, a także dolną krawędź płytki TLC.Przygotowuje się mieszaninę octanu etylu i metanolu w proporcji 2:1, którą następnie umieszcza się w komorze. Następnie, w rękawiczkach i pod wyciągiem, należy za pomocą nożyczek dociąć elastyczne płytki krzemionkowe z podkładem aluminiowym lub plastikowym tak, aby pasowały do komory rozwijania.Włóż płytki do komory tak, aby ich górne krawędzie opierały się o ściany komory. Płytki nie powinny się ze sobą stykać. Przykryj komorę i pozwól rozpuszczalnikowi przemieszczać się w górę płytek dzięki działaniu kapilarnemu.Gdy rozpuszczalnik dotrze do górnej krawędzi płytek, należy wyjąć je z komory i ustawić pionowo w dygestorium do czasu odparowania rozpuszczalnika. Po wyschnięciu płytek należy sprawdzić, czy zanieczyszczenia przemieściły się w pobliże górnej krawędzi płytek TLC. Będą one widoczne jako żółty prążek w świetle widzialnym lub prążek fluorescencyjny w świetle ultrafioletowym.Jeśli większość płytki nadal ma żółtawy odcień, należy powtórzyć proces oczyszczania w tej samej komorze TLC, używając tego samego rozpuszczalnika. Po wyjęciu płytek TLC z komory należy wylać rozpuszczalnik. Przed użyciem komory do kolejnej części protokołu należy pozwolić na całkowite odparowanie pozostałego rozpuszczalnika.Następnie, aby usunąć resztkową wilgoć, która może wpływać na migrację związków na krzemionce, ustaw płyty pionowo w suszarce w temperaturze 100 °C przez 10 do 15 minut w przypadku płyty o wymiarach 20 by 20 cm oraz przez 5 minut dla płyt o wymiarach 7 by 10 cm. Po wysuszeniu płyt należy pozwolić im ostygnąć do temperatury otoczenia przed naniesieniem ekstraktów. Aby przygotować komory do rozdziału ekstraktów, należy wyciąć nożyczkami kawałek papieru filtracyjnego o wysokości nieco mniejszej niż wysokość komory i szerokości stanowiącej około połowy obwodu komory.Papier ten będzie służył jako knot do podciągania rozpuszczalników po ściankach komory i nasycania jej oparami rozpuszczalnika, co poprawi powtarzalność rozdzielania. W dygestorium wymieszaj rozpuszczalniki. Stosowane rozpuszczalniki to octan etylu i metanol w stosunku objętościowym 4:1. Wlej mieszaninę rozpuszczalników do komory i ją przykryj.Za pomocą ołówka nanieś delikatnie linię startową w punkcie na płytce TLC, który znajdzie się powyżej powierzchni rozwijającego rozpuszczalnika w komorze. Jeśli adsorbent płytki TLC jest miękki i łatwo ulega uszkodzeniu, wykonaj oznaczenia na krawędziach, tak jak pokazano tutaj. Następnie rozpuść ekstrakty w wystarczającej ilości rozpuszczalnika organicznego, aby uzyskać stężony roztwór zamiast mętnej zawiesiny.W tym przypadku jako rozpuszczalnik zastosowano metanol. Użycie mikropipet kapilarnych lub strzykawki mikrolitrowej pozwala na naniesienie standardów i próbek w postaci wąskich prążków, pozostawiając jednocentymetrowy margines po bokach płyty; wachlowanie płyty lub umieszczenie jej w dygestorium przyspiesza wysychanie prążków. Po wyschnięciu prążków nanosi się próbki ponownie w to samo miejsce (metoda over-spotting).Jeśli na płytce wymagane jest większe stężenie próbki, powtórz procedurę w komorze TLC tak często, jak to konieczne. Upewnij się, że cały knot został nasycony rozpuszczalnikiem. Następnie za pomocą pęsety lub szczypiec umieść płytki wewnątrz komory TLC.Płytki nie powinny dotykać knota. Przykryć komorę i pozwolić płytkom na rozwinięcie, zanim czoło rozpuszczalnika dotrze do górnej krawędzi płytki. Wyjąć płytki z komory TLC i zaznaczyć ołówkiem wysokość czoła rozpuszczalnika.Pozostaw płytkę do wyschnięcia. W wyciągu opracuj pozostałe płytki TLC w tej samej komorze TLC, która jest zazwyczaj użyteczna przez cały dzień, jeśli pozostanie zamknięta. Jeśli ilość rozpuszczalnika w komorze wyraźnie spadnie, przygotuj nową mieszaninę rozpuszczalnika po wyschnięciu płytek.Wizualizuj prążki w świetle widzialnym lub UV. Wygodna będzie komora do obserwacji z przenośną lampą UV, zwłaszcza jeśli lampa ta pozwala na wykrywanie związków zarówno przy krótkofalowym promieniowaniu UV o długości 254 nanometrów, jak i długofalowym UV o długości 365 nanometrów. Użyj ołówka do wyznaczenia prążków, a następnie wykorzystaj system dokumentacji fotograficznej żeli wyposażony w górne oświetlenie UV i/lub światło widzialne, aby uzyskać obrazy płytek.Na koniec, aby pomóc w charakteryzacji prążków, oblicz współczynnik retencji lub wartości RF, mierząc najpierw odległość, jaką przebyła substancja, następnie mierząc odległość, jaką przebył rozpuszczalnik, i dzieląc pierwszą wartość przez drugą. Po zaznaczeniu położenia prążków płytki można przechowywać do późniejszego wykorzystania w bioanalizie.Owiń płytki folią plastikową i przykryj je folią aluminiową. Przechowuj płytki w temperaturze -20 °C. Maksymalny czas przechowywania zależy od stabilności związku, ponieważ krzemionka nie jest neutralna.Niektóre związki mogą ulegać degradacji podczas przebywania na płytce TLC. W ramach przygotowania do testu biogramu kontaktowego, należy przygotować i zaszczepić bakterie o wysokiej produkcji amoniaku lub podłoże HAB w warunkach beztlenowych. Kulturą wykorzystaną w tym przypadku jest Clostridium stickland eye strain sr.Hodować kulturę do fazy wykładniczej lub stacjonarnej w temperaturze 39 °C. Podczas pracy z mikroorganizmami beztlenowymi należy stosować sterylne techniki beztlenowe. Przygotować roztwór o stężeniu 0,75% m/v.Agar w tym samym medium, w którym hodowano bakterie, po obniżeniu temperatury agaru do mniej niż 60 °C. Zaszczep molten agar ilością kultury wynoszącą 1% objętościowo, delikatnie wymieszaj, natychmiast umieść w komorze beztlenowej i rozlej do plastikowych płytek Petri o wymiarach 15 by 100 mm. Wycięcie płytki TLC na strefy zawierające interesujące pasma.Za pomocą markera niezmywalnego oznaczono tyły płytek. Jako kontrolę na płytkę z agarem położono nieużywaną pasku TLC. Następnie paski położono stroną aktywną do dołu na płytkach z agarem.Inkubuj płytki agarową stroną do dołu w inkubatorze komory beztlenowej przez 24 godziny w temperaturze 39 °C. Za pomocą pęsety usuń prążki TLC z płytek agarowych, gdy znajdują się one w komorze beztlenowej.Dodaj tetra oleum red kroplami na powierzchnie szalek z agarem. Pozostaw do rozwinięcia się barwy na co najmniej 20 minut. Gdy płytka kontrolna stanie się całkowicie czerwona, wyjmij płytki z komory beztlenowej.Clostridium stick Landi jest bakterią beztlenową, w związku z czym zacznie ona tracić żywotność natychmiast po wyjęciu z komory beztlenowej, jednak kolor pozostaje stabilny przez ponad 24 godziny. Używając aparatu cyfrowego, należy sfotografować płytki w świetle widzialnym na tle zapewniającym odpowiedni kontrast. W przypadku barwienia żywych komórek zaobserwowany zostanie intensywnie czerwony kolor.Martwe komórki nie barwią się. Przedstawiono reprezentatywne rozdziale na płytkach TLC z krzemionką ekstraktów z koniczyny czerwonej zawierających związki fenolowe. Rozdział w mieszaninie octanu etylu i heksanu w stosunku 9:1 na dystansie 8,5 cm doprowadził do powstania pięciu pręg, z czego jedna została całkowicie oddzielona od linii startowej.Wykorzystane standardy to Formin Bio Canon A oraz Genine. Cztery paski z tej płytki naniesiono na kultury Clostridium stick Landi, ruminalną bakterię o wysokiej produkcji amoniaku, na 24 godziny i wybarwiono tetra oleum red zgodnie z opisem przedstawionym tutaj. Inkubacja z paskiem pierwszym Bio Canon A oraz częścią paska drugiego four Monon nein na posianym agarze bakteryjnym doprowadziła do powstania wyraźnej strefy zahamowania wzrostu.Jednak inkubacja pozostałej części prążka drugiego wraz z prążkami trzecim i czwartym nie zahamowała wzrostu bakterii. Wyniki te wykazały, że bio Canon A hamował wzrost see stickland eye, natomiast form aone Nein nie wywierał takiego działania. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że technika ta jest elastyczna.Można zastosować inne mikroorganizmy testowe, pod warunkiem doboru odpowiednich podłoży oraz uwzględnienia kontroli zapewniających kompatybilność chemii rozdziału i metody detekcji z opisywaną procedurą. Do charakterystyki związków przeciwmikrobowych zidentyfikowanych w bioanalizie można wykorzystać inne techniki, takie jak wysokosprawna chromatografia cieczowa i spektrometria mas.

thin-layer-chromatographic-tlc-separations-bioassays-plant-extracts

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Chromatografia warstwowa cienka (TLC) separacji i badań biologicznych ekstrakcji roślinnych w celu identyfikacji związków przeciwdrobnousstrojowych

Skład ekstraktów lipidów polarnych oraz skład kwasów tłuszczowych poszczególnych gliceryolipidów są określane w prostym i niezawodnym eksperymencie profilowania lipidów. W tym celu gliceryolipidy są izolowane za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, a następnie poddawane transmetylacji ich grup acylowych. Estry metylowe kwasów tłuszczowych są oznaczane ilościowo za pomocą chromatografii gazowo-cieczowej.

Profilowanie polarnych glicerolipidów Arabidopsis thaliana za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) sprzężonej z chromatografią gazowo-cieczową (GLC)

Produkty naturalne stanowią obiecujące punkty wyjścia dla rozwoju nowych leków i środków terapeutycznych. Jednak ze względu na dużą różnorodność chemiczną znalezienie nowych związków terapeutycznych z roślin jest trudnym i czasochłonnym zadaniem. Opisujemy uproszczone podejście do identyfikacji cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych i antybiofilmu z ekstraktów i frakcji roślinnych.

Systematyczne podejście do identyfikacji nowych cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych i przeciwbiofilmowych z ekstraktów i frakcji roślinnych w celu zapobiegania próchnicy zębów

Obecny protokół opracował metodę szacowania wydajności związków na płytce TLC przy użyciu techniki niebieskiego oświetlenia LED. Zaletą tego podejścia jest to, że jest bezpieczne, skuteczne, niedrogie i pozwala badaczowi na jednoczesny pomiar wielu próbek.

Szacowanie uzysku związków na płytce TLC za pomocą techniki oświetlenia niebieską diodą LED

Opisujemy użycie chromatografii cienkowarstwowej, bezpośredniego testu bioautografii i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas do identyfikacji naturalnych produktów mikrobiologicznych, które wykazują antagonizm wobec patogenów grzybowych, używając patogenu Sclerotinia sclerotiorum i biopestycydowych izolatów Bacillus jako systemu modelowego.

Identyfikacja produktów naturalnych pod kontrolą biologiczną za pomocą chromatografii cienkowarstwowej - bioautografia bezpośrednia

Niniejsze badanie opracowało metodę chromatografii cieczowej wysokiej rozdzielczości połączoną ze spektrometrią mas z potrójnym kwarcykiem (HPLC-QQQ-MS) w celu identyfikacji i ilościowego określania alkaloidów tropanowych (hioscyjamina, anizodamina, skopolamina) w Anisodus tanguticus. Metoda ta okazała się szybką, dokładną i niezawodną dla analizy wysokowydajnej roślin leczniczych.

Skuteczną i szybką metodę HPLC-QQQ-MS do ilościowego oznaczania alkaloidów tropanowych w roślinach leczniczych

Powłoka ssaków zawiera lipidy ekstrahowane rozpuszczalnikiem, które mogą dostarczyć składu chemicznego charakterystycznego dla poszczególnych gatunków.  W pracy przedstawiono rutynową metodę rozdzielania szerokich klas lipidów izolowanych z tkanek powłokowych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej i oznaczania profilu triacyloglicerydów za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą.

Profilowanie zawartości triacyloglicerydów w lipidach powłokowych nietoperzy za pomocą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej i spektrometrii mas MALDI-TOF

Opisano dwie metody przypisywania sygnałów magnetycznego rezonansu jądrowego α- i ε-dimetyloaminy redukcyjnie 13C-metylowanej N-końcowej lizyny. Jedna metoda wykorzystuje selektywność reakcji metylacji redukcyjnej wywołanej pH, a druga wykorzystuje aminopeptydazę do selektywnego usuwania N-końcowej lizyny.

Metody identyfikacji rezonansów NMR 13C-dimetylo-N-końcowej aminy na redukcyjnie metylowanych białkach

Ten film przedstawia protokół do analizy spektrometrycznej mas związków lotnych i wrażliwych na utlenianie za pomocą jonizacji uderzeniowej elektronów. Przedstawiona technika jest szczególnie interesująca dla chemików nieorganicznych, pracujących z metalami organicznymi, silanami lub fosfanami, z którymi należy obchodzić się w warunkach obojętnych, takich jak technika Schlenka.

Analiza związków lotnych i wrażliwych na utlenianie przy użyciu systemu zimnego wlotu i spektrometrii mas z uderzeniem elektronów

Ten protokół opisuje specyficzne techniki używane do strukturalnej charakterystyki sekwencji glikozylu na końcu redukującym (RE) i obszarze wewnętrznym heteroksylanów poprzez znakowanie RE 2 aminobenzamidem przed hydrolizą enzymatyczną (endoksylanazą), a następnie analizę powstałych oligosacharydów za pomocą spektrometrii mas (MS) i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

Sekwencjonowanie heteroksylanów ścian roślin z wykorzystaniem technik enzymatycznych, chemicznych (metylacja) i fizycznych (spektrometria mas, magnetyczny rezonans jądrowy)

Metoda łącząca kompleksową dwuwymiarową chromatografię gazową z detekcją chemiluminescencji azotu została opracowana i zastosowana do analizy on-line związków zawierających azot w złożonej matrycy węglowodorowej.

Analiza on-line związków zawierających azot w złożonych matrycach węglowodorowych

Poznaj metodę chromatografii cienkowarstwowej i bioautografii kontaktowej do identyfikacji przeciwdrobnoustrojowych metabolitów roślinnych z koniczyny czerwonej przeciwko beztlenowym bakteriom.

Separacje metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i testy biologiczne ekstraktów roślinnych w celu identyfikacji związków przeciwdrobnoustrojowych (Wideo) | JoVE Journal

Separacje metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i testy biologiczne ekstraktów roślinnych w celu identyfikacji związków przeciwdrobnoustrojowych

Przeglądaj więcej filmów