Analiza globalnej syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki po niedotlenieniu
13 maja 2014
Opisujemy technikę analizy globalnej syntezy RNA w hipoksji za pomocą obrazowania. Znakowanie chemiczne RNA metodą kliknięcia nie było wcześniej wykonywane w warunkach hipoksji i umożliwia wizualizację globalnych zmian RNA na poziomie pojedynczej komórki. Podejście to uzupełnia istniejące techniki uśredniania RNA, umożliwiając bezpośrednią wizualizację zmian między komórkami w globalnej syntezie RNA.
Ogólnym celem tej procedury jest fluorescencyjne znakowanie i ilościowe określenie ilości powstającego RNA wytwarzanego w warunkach leczenia przy użyciu ilościowej analizy obrazowania, aby to osiągnąć. Hodowane komórki platerowane na szkle nakrywkowym są traktowane zmodyfikowaną bazą alkeinową. Pięć erydyny etalowej, zwanych dalej pięcioma UE, inkubowanych w warunkach niedotlenienia.
Podczas inkubacji podczas syntezy RNA włącza się pięć EU bez przerywania maszynerii transkrypcji komórkowej. Następnie, włączone pięć EU jest następnie znakowane fluorescencyjnie, wykonując katalizowaną miedzią edycję azydku aine cyclo lub reakcję klikania. Znakowany fluorescencyjnie powstający RNA jest następnie obrazowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a uzyskane obrazy są analizowane w celu porównania ilości RNA wygenerowanego w warunkach leczenia i kontroli.
Analiza statystyczna uzyskanych danych pokazuje zmiany w powstającym wytwarzaniu RNA w odpowiedzi na niedotlenienie poprzez kwantyfikację pięciu inkorporacji UE i detekcję za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ilościowy BCR, jest to, że umożliwia bezpośrednią wizualizację produkcji RNA w komórkach na poziomie pojedynczej komórki. Chociaż tutaj używamy tej metody do badania, jak komórki reagują na niski poziom tlenu, można ją również wykorzystać do badania odpowiedzi na leki chemioterapeutyczne.
Naszą reakcją na dodatkowe reakcje stresowe demonstrujące procedurę będą John Leston, doktorant z mojego laboratorium z pomocą ish Kova, również doktoranta, oraz Humana Druker, doktorantka. Na koniec Gus Ferguson zademonstruje zastosowanie oprogramowania do wizualizacji obrazu. Rozpocznij ten eksperyment od zanurzenia kilku szkiełek nakrywkowych w 70% etanolu, aby je wysterylizować.
Umieść szkiełka nakrywkowe na krawędzi płytki w kapturze do hodowli tkankowych i pozwól im wyschnąć na powietrzu przy przepływie laminarnym. Gdy szkiełka nakrywkowe wyschną, umieść po jednym w każdym z sześciu 3.5-centymetrowych naczyń. Dodaj dwa mililitry ciepłego kompletnego DMEM do każdego dania.
Dociśnij kleszczami, aby upewnić się, że każde szkiełko nakrywkowe pozostaje przyklejone do dna studzienki. Następnie, aby odłączyć komórki U2 OS od naczynia do hodowli tkankowej, przemyj raz trzema mililitrami PBS. Następnie nałóż cztery mililitry ciepłej 0,05% trypsyny, 1% EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem minut.
Po upływie siedmiu minut Resus zawieś komórki w sześciu mililitrach ciepłego, kompletnego DMEM, aby dezaktywować trypsynę EDTA. Policz komórki za pomocą cytometru hemocytometrycznego, zasiewając każdą z 3,5-centymetrowych szalek zawierających szkiełka nakrywkowe dwa razy od 10 do piątej komórki. Delikatnie kołysz naczyniem, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek, inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 21% tlenu, 5% dwutlenku węgla, aby komórki przylegały.
Następnego dnia wyjmij pięć szalek z inkubatora. Pozostaw pozostałe danie w spokoju. Będzie on stosowany jako normoksyczna kontrola pozytywna.
Umieść cztery naczynia w stacji roboczej do hipoksji. Wystaw komórki na warunki niedotlenienia przez 75 minut, 90 minut, dwie godziny i 24 godziny. Do drugiego dania.
Dodaj akton mycynę D do pożywki do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr i umieść ją z powrotem w inkubatorze 37 stopni w normalnych warunkach tlenowych na cztery godziny. To danie funkcjonuje jako normoksyczna kontrola negatywna. Podczas inkubacji komórek przygotuj i zbierz następujące odczynniki, aby przygotować się do testu kliknięcia.
Zestaw testowy click it PBS przy pH od 7,2 do 7,6 3,7% aldehyd paraform w PBS 1%, Triton X 100 w PBS woda dejonizowana, dimetylosulfotlenek 10 molowy wodorotlenek sodu, 37% kwas solny i paski wskaźnikowe pH. Powinieneś zaplanować, aby być gotowym do rozpoczęcia oznakowanego testu w warunkach niedostatecznego leczenia. Na godzinę przed zakończeniem zabiegu hipoksji Aby oznaczyć komórki, przygotuj dwa x roztwór roboczy UE ze 100-milimolowego zapasu w wstępnie podgrzanym kompletnym podłożu.
Następnie dodać równą objętość dwóch XEU do pożywki w naczyniu zawierającym komórki poddane działaniu akton mycyny D, rozcieńczając w ten sposób UE do stężenia roboczego. Następnie w komorze do hipoksji dodaj bulion UE do komórek poddanych hipoksji. Inkubować przez jedną godzinę w warunkach hodowli komórkowej poddanej działaniu substancji po podaniu działaniu hipoksji lub po czterech godzinach w przypadku kontroli.
Umyj każde naczynie raz PBS i dodaj jeden mililitr 3,7% bulionu aldehydu Paraform w warunkach traktowania, inkubować przez 15 minut w warunkach traktowania. Po utrwaleniu należy wyjąć komórki z komory hipoksji i umieścić je w dygestorium. Odlej utrwalacz, uważając, aby odpowiedzialnie pozbyć się odpadów paraformaldehydu.
Następnie umyj komórki raz za pomocą PBS. Kolejne kroki wykonuj w temperaturze pokojowej, utrzymując wszystkie roztwory na lodzie w temperaturze od dwóch do sześciu stopni Celsjusza. Obok przeczesywania komórek usuń roztwór płuczący i dodaj po jednym mililitrze 1% tritton X 100 w PBS do każdego, dobrze inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Usunąć bufor przenikający i przemyć każdą studzienkę raz PBS. Usuń roztwór płuczący z komórek i dodaj 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego koktajlu reakcyjnego zestawu do obrazowania RNA do każdej próbki. Chronić komórki przed światłem i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Po inkubacji wyjmij zestaw do obrazowania RNA, reakcję koktajlową i przemyj. Raz z jednym mililitrem reakcji zestawu do obrazowania RNA, przepłukać, buforować, w tym czasie należy wykonać wszelkie dodatkowe znakowanie przeciwciał. Aby wybarwić DNA, umyj próbki PBS, a następnie rozcieńcz najmniejsze 3, 3, 3, 4, 2 do jednego do 1000.
W PBS dodać jeden mililitr rozcieńczonego roztworu HERC do każdego. Dobrze chronić przed światłem i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usunąć roztwór HERC i dwukrotnie przemyć komórki PBS w celu zamontowania szkiełek nakrywkowych.
Umieść 10 mikrolitrów podłoża montażowego na środku standardowego mikroskopu. Przesuń i umieść komórkę szkiełka nakrywkowego stroną do dołu na kropli medium montażowego. Unikaj generowania bąbelków, ponieważ zasłania to późniejsze pozyskiwanie obrazu.
Nałóż bezbarwny lakier do paznokci na obwód szkiełka nakrywkowego, aby przymocować go do szkiełka mikroskopowego. Pozostaw lakier do wyschnięcia na pięć minut w temperaturze pokojowej. Chronione przed światłem próbki mogą być przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.
Po zamontowaniu uzyskaj obrazy za pomocą mikroskopu szerokokątnego zdolnego do wykrywania fluorescencji. Wykonuj obrazowanie za pomocą obiektywu zanurzeniowego 40 V 1.30 NA i rejestruj obrazy za pomocą chłodzonego obrazu z kamery CCD. Co najmniej 30 komórek po pobraniu obrazu.
Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby przekazać obrazy. Pozwoli to skorygować zniekształcenia optyczne poprzez zastosowanie formuły matematycznej opartej na oprogramowaniu do przechwyconych obrazów. Rezultatem jest wyraźniejszy obraz, który zapewni, że późniejsza analiza będzie ograniczona tylko do zobrazowanych komórek.
Następnie zaimportuj obrazy do klienta Omer O. Miniatury wszystkich uzyskanych obrazów zostaną wyświetlone obok normalizacji ustawień renderowania dla wszystkich obrazów w tym samym eksperymencie. Zastosuj ustawienia renderowania z kontrolnych komórek normoksycznych do wszystkich innych warunków za pomocą narzędzia ROI obszaru zainteresowania w oprogramowaniu do analizy.
Wybierz jądra z każdego obrazu w oprogramowaniu. Wybierz opcję analizy intensywności i uzyskaj średnie intensywności dla każdego zwrotu z inwestycji dla 30 do 50 komórek. Zapisz dane, a następnie oblicz średnią i normę dla każdego warunku.
Wreszcie, korzystając z oprogramowania do tworzenia wykresów danych, konstruuje wykresy rozrzutu wszystkich indywidualnych średnich wartości intensywności, aby odzwierciedlić zmienność między komórkami w każdych warunkach. Wykreślanie danych dotyczących intensywności w ten sposób jest przydatne, ponieważ umożliwia szybkie porównanie wyników leczenia i wyraźnie pokazuje znaczną heterogeniczność w populacji komórek poddanych zabiegowi, która w przeciwnym razie byłaby zasłonięta przy użyciu standardowej reprezentacji danych. Alternatywnie, skonstruuj wykresy słupkowe reprezentujące średnią intensywność plus odchylenie standardowe powstającego RNA, aby ilościowo określić całkowitą syntezę RNA U2 OS Komórki poddane hipoksji i hodowane w obecności pięciu al urydyny lub UE zostały następnie przetworzone i przeanalizowane.
Jak pokazano w tym filmie, intensywność fluorescencji ze wszystkich komórek w każdej populacji leczonej została uśredniona i wykreślona. Na tym wykresie słupkowym test T studenta został wykorzystany do obliczenia statystycznego prawdopodobieństwa, że każda grupa leczona różni się znacznie od grupy kontrolnej. Co ciekawe, dane te pokazują, że w czasie następuje statystycznie istotny wzrost globalnej syntezy RNA.
Gdy komórki U2 OS są traktowane hipoksją dłużej niż półtorej godziny, zgodnie z oczekiwaniami, leczenie ACTO mycyną D całkowicie abluje intensywność fluorescencji. Dane te sugerują, że po dłuższych okresach leczenia hipoksją komórka koncentruje swoje wysiłki na produkcji RNA, nawet w tym nieprzyjaznym niedotlenionym środowisku. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak znakować i określać ilościowo powstające RNA na poziomie pojedynczej komórki w hipoksji i normoksji po opanowaniu, technikę tę można wykonać w ciągu dwóch godzin po tej procedurze.
Inne metody, takie jak barwienie co przeciwciałami dla polimerazy RNA i HIF, można przeprowadzić w celu określenia, czy poziomy polimerazy RNA są zmienione i czy HIF jest aktywowany. Nie zapominaj, że praca z formaldehydem może być bardzo niebezpieczna podczas wykonywania tej procedury. Zawsze pamiętaj, aby nosić rękawice i pracować pod wyciągiem.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje nowatorską technikę analizy globalnej syntezy RNA w warunkach hipoksji z wykorzystaniem obrazowania. Metoda ta wykorzystuje znakowanie RNA za pomocą chemii klik, co umożliwia wizualizację zmian w RNA na poziomie pojedynczej komórki, stanowiąc uzupełnienie tradycyjnych technik analizy uśrednionego poziomu RNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Analiza RNA
Wstęp
- Zrozumienie syntezy RNA w warunkach hipoksji jest kluczowe dla badania odpowiedzi komórkowych na niski poziom tlenu.
- Istniejące metody często uśredniają dane dotyczące RNA, co maskuje odpowiedzi poszczególnych komórek.
- Znakowanie z wykorzystaniem chemii klikowej pozwala na bezpośrednią wizualizację produkcji RNA.
- Technikę tę można również zastosować do badania odpowiedzi na leki chemioterapeutyczne.
Cel badania
- Aby przeprowadzić fluorescencyjne znakowanie i kwantyfikację nowo powstałego RNA produkowanego w warunkach hipoksji.
- Aby zwizualizować zmiany w syntezie RNA zachodzące między poszczególnymi komórkami.
- Aby udoskonalić istniejące techniki analizy RNA.
Zastosowane metody
- Komórki traktuje się zasadą modyfikowaną alkeenem i inkubuje w warunkach hipoksji.
- Wbudowany RNA jest znakowany fluorescencyjnie za pomocą reakcji click.
- Do obrazowania znakowanego RNA wykorzystuje się mikroskopię fluorescencyjną.
- Przeprowadza się analizę statystyczną w celu porównania syntezy RNA w różnych warunkach.
Główne wyniki
- Technika ta umożliwia bezpośrednią wizualizację produkcji RNA na poziomie pojedynczej komórki.
- Analiza statystyczna wykazuje istotne zmiany w syntezie RNA w odpowiedzi na hipoksję.
- Metoda ta wykazuje przewagę nad tradycyjnymi technikami ilościowymi.
- Potencjalne zastosowania obejmują badanie różnych odpowiedzi komórkowych na stres.
Wnioski
- To nowatorskie podejście pogłębia zrozumienie dynamiki RNA w warunkach stresu.
- Stanowi ono potężne narzędzie dla badaczy analizujących reakcje komórkowe na hipoksję oraz inne rodzaje oddziaływań.
- Wszechstronność tej metody umożliwia szersze zastosowania w badaniach nad biologią komórki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia bezpośrednią wizualizację syntezy nowo powstającego RNA z rozdzielczością pojedynczej komórki w warunkach hipoksji, rozwiązując kluczowy problem testów uśrednionych dla całej populacji, które maskują heterogeniczne odpowiedzi komórkowe. Poprzez kwantyfikację zmienności czasowej i międzykomórkowej w produkcji RNA, metoda ta wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w walidacji celów terapeutycznych oraz zwiększa pewność predykcyjną w modelach przedklinicznych chorób indukowanych hipoksją, takich jak nowotwory i niedokrwienie. Podejście to zwiększa ciągłość translacyjną poprzez powiązanie fenotypów molekularnych z wynikami funkcjonalnymi w układach istotnych dla przebiegu choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie heterogeniczności transkrypcyjnej w hipoksycznych mikrośrodowiskach, wyjaśniając aktywację szlaków sygnałowych oraz oddziaływanie na cele terapeutyczne.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowe wyniki oparte na obrazowaniu do oceny modulacji celu w pojedynczych komórkach, ograniczając poleganie na średnich z całej populacji.
- Wartość prognostyczna: Wspiera przesiew fenotypowy poprzez identyfikację subpopulacji o zróżnicowanych odpowiedziach syntezy RNA na stres hipoksyczny lub działanie związków chemicznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia uzyskanie ustandaryzowanych i powtarzalnych pomiarów wbudowy nowo powstałego RNA za pomocą znakowania EU i detekcji z wykorzystaniem chemii klik.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z mikroskopią fluorescencyjną i rurociągami analizy obrazu pozwala na stosowanie skalowalnych, multipleksowych formatów testów do przesiewania związków.
- Gotowość testu: Pozwala na uzyskanie mierzalnych danych dotyczących natężenia fluorescencji, które mogą zostać znormalizowane i poddane analizie statystycznej w celu porównania efektów zabiegów w różnych warunkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Modeluje stres hipoksyczny w komórkach nowotworowych (U2 OS), co jest istotne w badaniach nad mikrośrodowiskiem guza oraz terapiami ukierunkowanymi na angiogenezę.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wczesne odpowiedzi transkrypcyjne z późniejszymi adaptacjami fenotypowymi, wspierając decyzje o dalszym rozwoju w fazie przedklinicznej w oparciu o ocenę ryzyka.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Wykazuje utrzymującą się syntezę RNA podczas przedłużonej hipoksji, co wskazuje na adaptacyjne programy transkrypcyjne, które mogą wpływać na oporność terapeutyczną lub szlaki przeżycia.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących celu terapeutycznego, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną, szczególnie w przypadku celów modulowanych przez sygnalizację hipoksyczną lub adaptację metaboliczną.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących szlaków wykrywania tlenu i regulatorów transkrypcyjnych poprzez wizualizację dynamiki syntezy RNA w czasie rzeczywistym z rozdzielczością pojedynczej komórki.
- Przesiewanie: Umożliwia opracowanie testów dla związków modyfikujących odpowiedź na hipoksję, z ilościowymi wynikami obrazowania wspierającymi walidację trafień oraz badania zależności struktura-aktywność.
- Analityka: Generuje dane dotyczące średniej intensywności fluorescencji i odchylenia standardowego dla każdego stanu, co pozwala na porównanie statystyczne (np. test t-Studenta) zmian w syntezie RNA pomiędzy grupami traktowanymi i w różnych punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Łączy aktywność transkrypcyjną indukowaną hipoksją z adaptacją komórkową w modelach chorobowych, wspierając dopasowanie biomarkerów i wgląd w mechanizmy w ramach przepływów pracy przedklinicznych.
- Zastosowania korporacyjne: Tworzy wielokrotnego użytku platformę opartą na obrazowaniu do oceny odpowiedzi transkrypcyjnych na różne stresory, w tym środki chemioterapeutyczne i stany niedokrwienne.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez ujawnienie heterogeniczności syntezy RNA między komórkami, co redukuje liczbę wyników fałszywie ujemnych wynikających z uśredniania danych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiar syntezy RNA za pomocą znakowania z wykorzystaniem chemii klik (click-chemistry) oraz mikroskopii fluorescencyjnej, co poprawia powtarzalność w różnych laboratoriach i eksperymentach.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań poprzez identyfikację subpopulacji o utrzymanej aktywności transkrypcyjnej w warunkach stresu, co wskazuje na potencjalne mechanizmy oporności.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich wpływ na programy transkrypcyjne w warunkach hipoksji oraz odpowiedzi adaptacyjne.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek, obsłudze stacji hipoksji oraz obrazowaniu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
- Zależne od odczynników do chemii klikalnej (EU, barwniki azydowe, katalizator miedziowy) oraz kompatybilnych systemów obrazowania z odpowiednimi zestawami filtrów.
- Wymaga standaryzacji protokołów fiksacji, permeabilizacji i znakowania w celu zapewnienia spójnego wykrywania sygnału we wszystkich próbkach.
- Wymaga dostosowania czasów inkubacji i stężeń EU przy zastosowaniu w różnych typach komórek lub w warunkach stresu innych niż hipoksja.
- Ograniczone koniecznością posiadania specjalistycznego sprzętu do inkubacji w kontrolowanej hipoksji oraz ostrożnego obchodzenia się z utrwalaczami na bazie formaldehydu.
