Name: Analiza globalnej syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki po niedotlenieniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Poznaj metodę analizy globalnej syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki w warunkach niedotlenienia z wykorzystaniem chemii klik i mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta pozwala wizualizować zmiany transkrypcji w komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JB jest stypendystą klinicznym CRUK, AS jest doktorantem Wellcome Trust, laboratorium SR jest finansowane przez CRUK Senior Research Fellowship (C99667/A12918). Prace te zostały wsparte dwiema nagrodami Wellcome Trust Strategic Award (097945/B/11/Z i 095931/Z/11/Z).

1. Hodowla komórkowa i leczenie
<ol>
	<li>Zebrać odczynniki i sprzęt wymieniony w Tabeli 1 do hodowli komórek ludzkiego kostniakomięsaka (U2OS). Przygotuj wszystkie odczynniki i przeprowadź wszystkie techniki hodowli tkankowej w okapie z laminarnym przepływem powietrza, aby zapewnić sterylność</li>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną w następujący sposób: Dodać 50 ml FCS, 5 ml L-glutaminy i 5 ml penicyliny/streptomycyny do DMEM, aby osiągnąć końcowe stężenia 10% (FCS), 2 mM (L-glutamina), 50 U/ml (penicylina) i 50 U/ml (streptomycyna). Ogrzać pożywkę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Przygotuj komórki do zabiegu:
	<ol>
		<li>Wysterylizuj kilka szkiełek nakrywkowych w 70% etanolu, pozostaw do wyschnięcia na powietrzu i umieść jedno na dnie sześciu płytek o średnicy 3,5 cm.</li>
		<li>Zanurzyć szkiełka nakrywkowe w 2 ml ogrzanego kompletnego DMEM (37 °C), dociskając kleszcze do szkiełek nakrywkowych, aby upewnić się, że pozostają przyklejone do dna studzienek.</li>
		<li>Odłączyć komórki U2OS od płytki do hodowli tkankowej, przemywając je raz 3 ml PBS, stosując 4 ml ogrzanej 0,05% trypsyny-EDTA (1%) i inkubując w temperaturze 37 °C przez 7 minut.</li>
		<li>Ponownie zawieś komórki w 6 ml podgrzanego kompletnego DMEM, aby dezaktywować trypsynę-EDTA i policz za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Tabliczka 2 x 105 komórek na każdą z płytek o średnicy 3,5 cm przygotowanych w pkt 1.3.1. Delikatnie kołysz płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Pozwól komórkom przylegać przez noc przed zabiegiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddać je działaniu substancji, umieszczając cztery płytki o średnicy 3,5 cm w stacji roboczej do hipoksji, a pozostałe dwie płytki o średnicy 3,5 cm należy pozostawić w inkubatorze w temperaturze 37 °C w normalnych warunkach tlenowych. Należy być gotowym do rozpoczęcia testu znakowania RNA w warunkach poddanych działaniu substancji (w komorze hipoksji dla komórek poddanych hipoksji) na 1 godzinę przed zakończeniem leczenia hipoksją.</li>
	<li>Wystaw komórki na niedotlenienie przez 1 godzinę 15 minut, 1 godzinę 30 minut, 2 godziny i 24 godziny. Te punkty czasowe są elastyczne i określane przez użytkownika.</li>
	<li>Stosować normoksyjną płytkę o średnicy 3,5 cm jako kontrolę dodatnią i normoksyjną płytkę o średnicy 3,5 cm potraktowaną aktynomycyną D (stężenie końcowe 10 μg/ml) przez 4 godziny jako kontrolę ujemną. Aktynomycyna D jest inhibitorem globalnej syntezy RNA.</li>
</ol>
Przestrogi:
Hoechst 33342 to znany mutagen. 
DMSO jest znany z tego, że ułatwia wnikanie cząsteczek organicznych do tkanek. 
NaOH jest. 
HCl jest. 
Paraformaldehyd jest wysoce toksyczny dla wszystkich zwierząt i może powodować śmierć u ludzi. 
Triton X-100 może powodować podrażnienie skóry w przypadku bezpośredniego kontaktu. 
Aktynomycyna D jest toksyczna w kontakcie ze skórą lub po połknięciu. 
Podejmij odpowiednie środki ostrożności podczas obchodzenia się ze wszystkimi niebezpiecznymi chemikaliami.
2. Test Click-iT
<ol>
	<li>Zbierz następujące odczynniki, które są wymagane oprócz zestawu testowego Click-iT: sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) pH 7,2 - 7,6, 3,7% paraformaldehyd (PFA) w PBS, 1% Triton X-100 w PBS, woda dejonizowana (dH2O), dimetylosulfotlenek (DMSO), 10 M wodorotlenek sodu (NaOH) i 37% kwas solny (HCl); Dodatkowo - paski wskaźnikowe pH.</li>
	<li>Przygotuj świeży roztwór podstawowy PFA przed wykonaniem reakcji Click-iT w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Umieścić 1,85 g PFA, 3,5 mldH2O i 10 μl 10 M NaOH w 50 ml probówce Falcon. Zagotuj 300 - 400 mlH2Ow dużej zlewce w kuchence mikrofalowej, aby uzyskać kąpiel wodną i umieść ją w dygestorium.</li>
		<li>Umieścić 50 ml Falcona w łaźni wodnej i delikatnie mieszać przez 10 minut, okresowo zwalniając pokrywkę, aż PFA się rozpuści.</li>
		<li>Przelej roztwór PFA przez filtr 0,2 μm do kolejnej probówki Falcon o pojemności 50 ml, otrzymując 37% roztwór.</li>
		<li>Rozcieńczyć to 10x, dodając PBS i doprowadzić pH do 6,8, dodając około 12 μl stężonego HCl. Opcja: Potwierdź prawidłowe pH za pomocą pasków wskaźnikowych w dygestorium.</li>
		<li>Zużyć natychmiast lub przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe zestawu do obrazowania RNA w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Dodać 373 μl dH2O do składnika A, otrzymując roztwór podstawowy 100 mM UE. Przechowywać w temperaturze -20 °C do jednego miesiąca.</li>
		<li>Dodać 85 μl DMSO do składnika B (Alexa Fluor 594) i wymieszać przez pipetowanie lub wirowanie. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do jednego roku.</li>
		<li>Dodać 2 ml dH2O do składnika E, aby uzyskać 10-krotny roztwór dodatku buforowego do obrazowania reakcji zestawu do obrazowania RNA. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do jednego roku, wyrzucić, gdy roztwór uzyska brązowy kolor.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etykietowanie komórek za pomocą UE: Przygotować 2X roztwór roboczy UE z 100 mM zapasu przygotowanego w kroku 2.3 we wstępnie podgrzanym kompletnym pożywce (37 °C). Wykonaj pozostałą część tego kroku i krok 2.5 w komorze hipoksji dla komórek poddanych hipoksji. Rozcieńczyć do 1X, dodając równą objętość tego 2X roztworu roboczego do pożywki zawierającej komórki. Inkubować przez 1 godzinę w warunkach hodowli komórkowej poddanej działaniu substancji.</li>
	<li>Utrwalanie komórek: Umyj każdą studzienkę raz PBS i dodaj 1 ml 3,7% bulionu PFA przygotowanego w kroku 2.2 powyżej w warunkach traktowania. Inkubować przez 15 minut w warunkach zabiegowych. W tym momencie próbki poddane działaniu hipoksji można usunąć z komory hipoksji. Usuń utrwalacz i umyj każdą studzienkę raz za pomocą PBS (należy uważać, aby odpowiedzialnie utylizować odpady PFA). Kolejne kroki wykonaj w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepuszczalność: Usunąć roztwór płuczący i dodać 1 ml 1% Triton X-100 w PBS do każdej studzienki. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć bufor przepuszczalny i przemyć każdą studzienkę raz PBS.</li>
	<li>Znakowane wykrywanie RNA:
	<ol>
		<li>Przygotować świeży roztwór roboczy 1X dodatku buforowego do zestawu do obrazowania RNA, rozcieńczając roztwór 10X (przygotowany w kroku 2.3) w stosunku 1:10 w dH2O.</li>
		<li>Przygotować koktajl reakcyjny zestawu do obrazowania RNA zgodnie z tabelą 2 do użycia natychmiast po przygotowaniu.</li>
		<li>Usunąć roztwór płuczący i dodać 500 μl koktajlu reakcyjnego zestawu do obrazowania RNA do każdej próbki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.</li>
		<li>Wyjąć koktajl reakcyjny zestawu do obrazowania RNA i przemyć go raz 1 ml buforu do płukania reakcyjnego zestawu do obrazowania RNA (składnik F), a następnie usunąć bufor do płukania reakcji zestawu do obrazowania RNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcjonalna reakcja multipleksowa: W tym momencie należy wykonać dodatkowe znakowanie przeciwciałami próbek zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Barwienie DNA: Umyj próbki PBS, a następnie usuń roztwór do mycia. Rozcieńczyć Hoechst 33342 (składnik G) w stosunku 1:1,000 w PBS. Dodać 1 ml rozcieńczonego Hoechst 33342 do każdego dołka i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem. Usunąć roztwór Hoechst 33342 i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Usuń roztwór płuczący i przystąp do mikroskopii świetlnej.</li>
</ol>
3. Mikroskopia świetlna
<ol>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe:
	<ol>
		<li>Umieść 10 μl medium montażowego na środku standardowego szkiełka mikroskopowego.</li>
		<li>Umieść szkiełko nakrywkowe komórką do dołu na środku szkiełka mikroskopowego, aby zakryć porcję podłoża montażowego. Należy uważać, aby nie dopuścić do powstawania pęcherzyków powietrza w podłożu montażowym, ponieważ zasłania to późniejszą akwizycję obrazu.</li>
		<li>Przyklej szkiełko nakrywkowe do szkiełka mikroskopowego, nakładając na jego obwód bezbarwny lakier do paznokci. Pozostawić do wyschnięcia na 5 minut w temperaturze pokojowej. Chronić przed światłem. Po zamontowaniu próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazu: Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu szerokokątnego zdolnego do wykrywania fluorescencji. Przybliżone maksima emisji fluorescencji/wzbudzenia dla barwnika Alexa Fluor i Hoechst 33342 związanego z DNA przedstawiono w tabeli 3.</li>
	<li>Wykonuj obrazowanie za pomocą obiektywu olejowego 40X/1,30 NA i rejestruj obrazy za pomocą chłodzonej kamery CCD.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Dekonwoluuj obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu (patrz tabela Materiały) przed zaimportowaniem do klienta OMERO. Znormalizuj ustawienia renderowania dla wszystkich obrazów w tym samym eksperymencie w oprogramowaniu do wizualizacji i analizy obrazów mikroskopowych, stosując ustawienia renderowania z kontrolnych komórek normoksycznych do wszystkich innych warunków.</li>
	<li>Użyj narzędzia Region Of Interest (ROI) w oprogramowaniu do wizualizacji i analizy obrazu mikroskopowego (patrz tabela materiałów), aby wybrać jądra z każdego obrazu. Uzyskaj średnie intensywności dla każdego zwrotu z inwestycji i oblicz średnią i odchylenie standardowe dla każdego warunku, wybierając opcję analizy intensywności, w tym liczbę z zakresu 30-50 komórek.</li>
	<li>Skonstruuj wykresy punktowe za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów danych (patrz tabela materiałów), wykreślając wszystkie indywidualne średnie wartości intensywności uzyskane w kroku 4.2, aby odzwierciedlić zmienność między komórkami w każdym warunku. Alternatywnie skonstruuj wykresy słupkowe, aby przedstawić średnią intensywność plus odchylenie standardowe powstającego RNA.</li>
</ol>

<ol><li>Kenneth, N. S., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gene+expression+by+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of gene expression by hypoxia.</a> Biochem J. 414, 19-29 (2008).</li>
<li>Appelhoff, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+function+of+the+prolyl+hydroxylases+PHD1%2C+PHD2%2C+and+PHD3+in+the+regulation+of+hypoxia-inducible+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor.</a> J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).</li>
<li>Lancaster, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+dimerization+and+substrate+phosphorylation+inhibit+factor+inhibiting+hypoxia-inducible+factor+%28FIH%29+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity.</a> Biochem J. 383, 429-437 (2004).</li>
<li>Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+under+low+oxygen%3A+holding+your+breath+for+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription.</a> Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).</li>
<li>Schodel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+genome-wide+mapping+of+HIF-binding+sites+by+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq.</a> Blood. 117, (2011).</li>
<li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).</li>
<li>Breinbauer, R., Kohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azide-alkyne+coupling%3A+a+powerful+reaction+for+bioconjugate+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry.</a> Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugation+by+copper%28I%29-catalyzed+azide-alkyne+%5B3+%2B+2%5D+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition.</a> J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%22ligation%22+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry%3A+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li>
<li>Allan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMERO%3A+flexible%2C+model-driven+data+management+for+experimental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology.</a> Nat Methods. 9, 245-253 (2012).</li>
<li>Culver, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+hypoxia-induced+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB.</a> Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry+of+DNA+replication+and+RNA+synthesis%3A+Historical+perspective+and+recent+advances+based+on+%22click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on "click chemistry.</a> Cytometry A. 79, 328-337 (2011).</li>
</ol>

J.R.S. jest założycielem Glencoe Software, Inc., amerykańskiej firmy komercyjnej typu open source, która przyczynia się do rozwoju OMERO.

Opisaliśmy nasze użycie zestawu do obrazowania RNA do zbadania wpływu niedotlenienia na syntezę RNA w komórkach kostniakomięsaka (U2OS). Ta technika jest stosunkowo prosta i dostarcza danych o globalnej transkrypcji na poziomie pojedynczej komórki. Zmodyfikowaliśmy konwencjonalny protokół dla tego zestawu, aby uwzględnić etykietowanie w komorze hipoksji. Według naszej wiedzy jest to pierwsze doniesienie o zastosowaniu tej techniki do pomiaru zmian w syntezie RNA w hipoksji. Użyty przez nas zestaw do obrazowania RNA nadaje się do eksperymentów w hipoksji, ponieważ nie wymaga izotopów promieniotwórczych i jest technicznie kompatybilny z ograniczeniami pracy w kontrolowanej atmosferze. Typowe problemy związane z tą techniką dotyczą skutecznego utrwalania i etykietowania próbki. Niezwykle ważne jest, aby PFA używany do utrwalania próbki był świeży, a etapy mycia, które następują po reakcji "kliknięcia", były wykonywane zgodnie z opisem, aby zapewnić niskie zabarwienie tła próbki. Jeśli fluorescencja tła staje się problemem, zaleca się ponowne przemycie 1 ml zestawu do obrazowania RNA buforem do płukania reakcji po kroku 2.7.4.
Wspomniany tutaj zestaw do obrazowania RNA stanowi znaczący postęp w technologii obrazowania RNA pod względem łatwości użycia oraz swoistości i szybkości reakcji. Technika ta jest przede wszystkim ograniczona czasem potrzebnym na oznaczenie próbki. Zestaw do obrazowania RNA wymaga 1-godzinnego okresu znakowania, co zapobiega badaniu szybkich zmian w globalnym RNA, które zwykle wystąpiłyby w tym czasie. Z tego powodu nasz pierwszy punkt czasowy jest ograniczony do 1 godziny i 15 minut. Technika ta wiąże się z kilkoma innymi ograniczeniami, które w dużej mierze odnoszą się do kompatybilności odczynników z innymi markerami fluorescencyjnymi, na przykład ten zestaw do obrazowania RNA nie jest kompatybilny z barwieniem falloidyną.
Wszystkie istniejące podejścia do badania syntezy RNA w komórkach opierają się na włączaniu zmodyfikowanych nukleozydów do powstającego RNA i wykrywaniu włączonych znaczników za pomocą różnych środków. Pionierskie podejście opierało się na wykorzystaniu znakowanych radioaktywnie prekursorów RNA, a następnie detekcji za pomocą autoradiografii. Metoda ta doprowadziła do odkrycia etapów cyklu komórkowego i innych ważnych odkryć; Ma jednak wiele wad, takich jak uciążliwy charakter pracy radioaktywnej, długie czasy naświetlania i obrazy autoradiografii o niskiej rozdzielczości6. Kolejny postęp w tej dziedzinie wykorzystywał środki immunochemiczne w celu wyeliminowania konieczności radioaktywności. RNA znakowano przez włączenie BrU, a następnie detekcję immunochemiczną. Jednak skuteczne wiązanie przeciwciał wymagało denaturacji kwasów nukleinowych w celu poprawy dostępu do DNA lub RNA, co powodowało utratę morfologii komórek i uszkadzało epitopy wielu białek, uniemożliwiając ich dalsze wykrywanie za pomocą przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie13. Wprowadzenie technologii "chemii kliknięć" uprościło etap wykrywania i procedurę w porównaniu z autoradiografią i immunochemią. Technologia opiera się na reakcji cykloaddycji azydkowo-alkinowej Huisgen, w której końcowy alkin 5-etynilurydyny wiąże się z azydkiem sprzężonym z fluoroforem w obecności Cu(I). Reakcja jest specyficzna, szybka, nie wymaga żadnych dodatkowych kroków i jest łatwo kompatybilna z immunochemicznym wykrywaniem innych składników komórek.
Korzystając z tej technologii obrazowania RNA, wykazaliśmy, że komórki w tej samej populacji jednowarstwowej mają różne poziomy syntezy RNA w odpowiedzi na niedotlenienie. Ograniczyliśmy nasz eksperyment tylko do zbadania wpływu produkcji RNA; jednak dzięki temu zestawowi do obrazowania RNA możliwe jest wykonywanie zmodyfikowanych, dodatkowych reakcji multipleksowych, które pozwalają na bardziej złożoną analizę produkcji RNA. Na przykład możliwe jest wtórne barwienie przy użyciu przeciwciała specyficznego dla markerów aktywnej transkrypcji, takich jak poziomy fosforylowanej polimerazy RNA II, a nawet składników maszynerii translacyjnej, aby wskazać ilość tego nowo wytworzonego RNA, który jest przekształcany w białko. Dodatkowe białka, takie jak aktyna, białko, które nie powinno się znacząco zmieniać wraz z niedotlenieniem, mogą być testowane jako dodatkowa kontrola. Co więcej, można testować różne typy komórek, ponieważ jest bardzo prawdopodobne, że różne komórki będą miały różne tempo syntezy RNA, a nawet różne reakcje na niedotlenienie.
Korzystanie z tego zestawu do obrazowania RNA jest dość proste, pod warunkiem, że kroki są wykonywane zgodnie z opisem. Krytyczne kroki w protokole obejmują posiewanie komórek, utrwalanie i barwienie komórek oraz pozyskiwanie obrazu. Ważne jest, aby pokryć komórki o opisanej gęstości, aby zapobiec nadmiernej lub niedostatecznej konfluencji podczas eksperymentów, co znacząco wpłynie na wynik. Ważne jest również, aby używać świeżego utrwalacza, zapewniając wykonanie najlepszej "migawki" komórki i zachować ostrożność podczas mycia komórek po barwieniu, aby zredukować tło do poziomu, który jest akceptowalny dla efektywnej analizy. Wreszcie, metoda pozyskiwania obrazów jest niezwykle ważna, aby uzyskać obrazy o wystarczająco dobrej jakości, aby można je było później analizować. Zalecamy użycie najlepszego dostępnego mikroskopu świetlnego do optycznego badania próbek, takiego jak mikroskop używany w tym protokole, który jest dostępny w większości ośrodków intensywnie prowadzących badania na całym świecie.

Niedotlenienie (niskie ciśnienie tlenu) występuje, gdy normalny dopływ tlenu do tkanki jest zakłócony. Tlen środowiskowy jest zarówno składnikiem odżywczym, jak i cząsteczką sygnałową, dostarczając ważnych wskazówek dla wielu typów komórek. Zmiany w tlenie środowiskowym są wyczuwane przez grupę dioksygenaz, które kontrolują aktywność niezbędnej rodziny czynników transkrypcyjnych, znanej jako czynniki indukowane hipoksją (HIF). HIF składają się z dwóch podjednostek, α i β. Znane są trzy izoformy HIF-α (1, 2 i 3) oraz wiele wariantów splicingu HIF-1β. HIF-1β ulega konstytutywnej ekspresji i nie jest regulowany przez poziom tlenu w środowisku1. Członkowie rodziny HIF-α są dynamicznie regulowani przez klasę hydroksylaz prolilowych (PHD) i czynnik hamujący HIF (FIH); oba wymagają tlenu jako kofaktora do katalizowania hydroksylacji HIF-α2,3. W normoksji członkowie rodziny HIF-α są hydroksylowani i znakowani do degradacji proteosomalnej przez ligazę E3, von Hippel Lindau (vHL). W niedotlenieniu doktorzy i FIH są nieaktywni lub mają zmniejszoną aktywność. Izoformy HIF-α stabilizują się, tworzą heterodimer z HIF-1β i wpływają na transkrypcję genów, które zapewniają odpowiedź komórkową na środowisko niedotlenienia (Figura 1A)4.
Obecne techniki analizy RNA koncentrują się na kwantyfikacji uśrednionych wartości w danej populacji komórek. Komórki reagują na bodziec hipoksyjny, inicjując transkrypcję niezliczonych genów, które pozwalają im przystosować się do nieprzyjaznego środowiska5. Jednak niedotlenienie często występuje jako gradient, a komórki w niedotlenionym środowisku nie są poddawane jednolitemu bodźcowi hipoksyjnemu. Opisujemy implementację zestawów do obrazowania RNA Click-iT w stacji roboczej z kontrolą tlenu w celu zbadania globalnej syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki w niedotlenieniu.
Zestaw do obrazowania RNA wykorzystuje modyfikowany alkinami nukleozyd, 5-etynylourydynę (EU) i chemoselektywną ligację, aby umożliwić wykrycie globalnej syntezy RNA w czasie i przestrzennie w komórkach i tkankach6. Krótko mówiąc, komórki są poddawane hipoksji i hodowane w obecności EU. Następnie są one utrwalane i przepuszczalne, a włączenie UE do powstającego RNA jest wykrywane przez chemoselektywną ligację UE z barwnikiem zawierającym azydek. Typowy przebieg tej reakcji przedstawiono na rysunku 1B. Użyliśmy zestawu do obrazowania RNA do zbadania syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki, która powstała w wyniku leczenia hipoksją.
Mały rozmiar znacznika alkinowego umożliwia efektywne włączenie zmodyfikowanego nukleozydu do RNA. Chemoselektywna ligacja lub reakcja "klik" jest bardzo wydajna, szybka i specyficzna7-10. Wszystkie składniki reakcji są bioobojętne, a reakcja nie wymaga ekstremalnych temperatur ani rozpuszczalników. Reakcja kliknięcia eliminuje wymóg konwencjonalnego znakowania radioizotopowego i umożliwia bezpośrednią wizualizację wyników, ponieważ wynik jest niewielki. Ponadto cząsteczka detekcyjna może z łatwością przenikać do złożonych próbek, umożliwiając analizę multipleksową z uwzględnieniem przeciwciał do wykrywania białek interaktywnych z RNA. Ten test obrazowania RNA jest kompatybilny z barwnikami organicznymi, w tym Alexa, Fluor i fluoresceiną (FITC).
Zmierzyliśmy zmianę w syntezie RNA po leczeniu naszych komórek za pomocą implementacji otwartego środowiska mikroskopowego dla odległych obiektów (OMERO). OMERO to oprogramowanie typu open source, dostępne pod adresem <a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a> . To oprogramowanie do wizualizacji i analizy obrazów mikroskopowych umożliwia dostęp do szerokiego zakresu danych biologicznych i korzystanie z nich, w tym zarządzanie wielowymiarowymi, heterogenicznymi zestawami danych. Aplikacja kliencka umożliwia zdalną wizualizację i analizę złożonych danych obrazu biologicznego11; użyliśmy go do ilościowego określenia wizualnych zmian w globalnej i jednokomórkowej syntezie RNA. Te dane i kroki wymagane do analizy naszego eksperymentu z obrazowaniem RNA przy użyciu tego oprogramowania do wizualizacji i analizy obrazów mikroskopowych przedstawiono poniżej.
Przyjrzeliśmy się zmianom w globalnej syntezie RNA po leczeniu komórek ludzkiego kostniakomięsaka (U2OS) z niedotlenieniem przez okres do 24 godzin. We wszystkich warunkach wykryliśmy zmienność poziomu produkcji RNA między komórkami. Krótkie czasy ekspozycji na niedotlenienie nie powodowały istotnych zmian w poziomie powstającego RNA w komórkach. Jednak narażenie na 24-godzinną hipoksję spowodowało znaczny wzrost ilości RNA wytwarzanego w komórkach. Większość odpowiedzi komórkowych na niedotlenienie mierzy się po dłuższych okresach ekspozycji, takich jak od 4 do 24 godzin. Niektóre mechanizmy są jednak wprowadzane znacznie wcześniej, na przykład; Aktywacja NF-κB następuje w ciągu 5-15 minut od ekspozycji naniedotlenienie 12. Badanie krótszych czasów ekspozycji na hipoksję jest zatem uzasadnione i może odwrócić uwagę od bardziej skomplikowanych reakcji, takich jak cykl komórkowy i apoptoza.

<table><tbody><tr><td>U2OS Primary Cells</td><td>Europejska kolekcja kultur komórkowych</td><td>92022711</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Lonza</td><td>DE17-603E</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA (1%)</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Komora hipoksji</td><td>Ruskinn</td><td>InVivo2 300</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy Click-iT</td><td>Invitrogen</td><td>C-10329/C10330</td><td></td></tr><tr><td>pFA</td><td>Sigma</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>37% HCl</td><td>VWR</td><td>20252.335</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield Medium montażowe</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>Sigma</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Deltavision Core Microscope</td><td>Applied Precision</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>softWoRx</td><td>Applied Precision</td><td>N/A</td><td>Określany w tekście jako oprogramowanie do przetwarzania obrazu.</td></tr><tr><td>Kamera CCD CoolSnap HQ2</td><td>Fotometria</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Otwarte środowisko mikroskopowe dla odległych obiektów (OMERO)</td><td>OME</td><td>N/A</td><td>Określane w tekście jako oprogramowanie do wizualizacji i analizy obrazów mikroskopowych.</td></tr><tr><td>SigmaPlot v12.0</td><td>Systat Software Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Określane w tekście jako oprogramowanie do tworzenia wykresów danych.</td></tr></tbody></table>

analiza globalnej syntezy rna na poziomie pojedynczej komórki po niedotlenieniu

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Niedotlenienie lub obniżenie dostępności tlenu jest związane z wieloma procesami fizjologicznymi i patologicznymi. Na poziomie molekularnym komórki inicjują określony program transkrypcyjny w celu uzyskania odpowiedniej i skoordynowanej odpowiedzi komórkowej. Komórka posiada kilka enzymów czujnika tlenu, które wymagają tlenu cząsteczkowego jako kofaktora swojej aktywności. Obejmują one zarówno hydroksylazy prolilowe, jak i demetylazy histonowe. Większość badań analizujących odpowiedzi komórkowe na niedotlenienie opiera się na populacjach komórkowych i badaniach średnich, w związku z czym rzadko przeprowadza się analizę pojedynczych komórek niedotlenionych komórek. W tym miejscu opisujemy metodę analizy globalnej syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki w hipoksji przy użyciu zestawów do obrazowania RNA Click-iT w stacji roboczej z kontrolacją tlenu, a następnie analizy mikroskopowej i kwantyfikacji.  Używając komórek rakowych wystawionych na niedotlenienie przez różny czas, RNA jest znakowane i mierzone w każdej komórce. Analiza ta pozwala na wizualizację czasowych i międzykomórkowych zmian w globalnej syntezie RNA po stresie niedotlenieniowym.

Schemat reakcji zestawu do obrazowania RNA przedstawiono na Rysunku 1B. Reakcję tę wykorzystaliśmy do ilościowego oznaczenia całkowitej syntezy RNA w komórkach U2OS po poddaniu ich hipoksji, zarówno na poziomie indywidualnym (pojedyncza komórka), jak i globalnym (populacja komórek). Komórki poddano hipoksji i hodowano w obecności EU. Następnie zostały one utrwalone i permeabilizowane, a wbudowanie EU wykryto za pomocą chemoselektywnego ligowania EU z barwnikiem zawierającym grupę azydkową. Ta reakcja typu „click” prowadzi do emisji fluorescencji, którą można wykryć i ilościowo ocenić przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Rysunek 2A przedstawia typowy wynik tego eksperymentu. Komórki znakowane fluorescencyjnie są zaznaczone pseudokolorem czerwonym, a obraz otwarto w programie Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO). To oprogramowanie do wizualizacji i analizy obrazów mikroskopowych posiada wbudowane narzędzie ROI, które można wykorzystać do zaznaczania poszczególnych struktur wewnątrzkomórkowych i ilościowej analizy intensywności obrazu w wybranym obszarze. Typowy przykład danych wyjściowych po zastosowaniu tego narzędzia w programie klienckim przedstawiono na Rysunku 2B; intensywności poszczególnych komórek pokazano obok reprezentatywnego obrazu z eksperymentu, który służy jako wizualna weryfikacja poprawności danych.
Intensywności fluorescencji poszczególnych komórek można przedstawić na wykresie rozrzutu, aby ukazać rozkład intensywności poszczególnych komórek w obrębie populacji komórek poddanych działaniu czynnika. Przykład tego typu wykresu znajduje się na Rysunku 2C. Przedstawienie danych o intensywności w ten sposób jest przydatne, ponieważ pozwala na szybkie porównanie wyników zabiegów i wyraźnie demonstruje znaczną heterogeniczność w obrębie populacji komórek traktowanych, która w przeciwnym razie byłaby niewidoczna przy zastosowaniu standardowej reprezentacji danych. Heterogeniczność odpowiedzi jest interesująca w tym eksperymencie, ponieważ mimo zastosowania jednorodnego bodźca hipoksycznego wobec komórek, ewidentne jest, że każda komórka z tej samej populacji monowarstwy reaguje na ten bodziec w inny sposób.
Rycina 2D przedstawia ogólny wynik naszego eksperymentu. Intensywności fluorescencji ze wszystkich komórek w ramach populacji poddanej danej próbie zostały uśrednione, a następnie naniesione na ten wykres słupkowy. Do obliczenia prawdopodobieństwa statystycznego istotnej różnicy każdej grupy badawczej w stosunku do grupy kontrolnej wykorzystano test t-Studenta. Co ciekawe, dane te wykazują statystycznie istotny wzrost globalnej syntezy RNA w czasie, gdy komórki U2OS są poddawane hipoksji (w czasie przekraczającym 1 hr 30 min. *p &lt; 0.01; **p &lt; 0.05 oraz ***p &lt; 0.001 i n &gt; 30). Dane te wskazują, że po dłuższych okresach traktowania hipoksją komórka koncentruje swoje zasoby na produkcji RNA, nawet w tym nieprzyjaznym środowisku hipoksycznym. Traktowanie aktynomycyną D całkowicie znosi intensywność fluorescencji, zgodnie z oczekiwaniami.
<img alt="Schemat ścieżki HIF; degradacja proteasomalna, wiązanie z DNA, etapy leczenia hipoksją; regulacja genów." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
	Rycina 1. A. System HIF reaguje na zmiany poziomu tlenu w komórkach. Na tym uproszczonym schemacie hipoksja stabilizuje heterodimer HIF, zapobiegając hydroksylacji (-OH) HIF-α przez enzymy prolylowe hydroksylazy (PHDs) oraz jego późniejszej poliubikwitynacji przez białko von-Hippel Lindau (vHL). Stabilizacja HIF prowadzi do aktywacji licznych genów, które pomagają komórce odpowiedzieć na hipoksję komórkową. B. Syntezę RNA można wykryć za pomocą testu Click-IT; komórki są znakowane EU, a po przeprowadzeniu zabiegu reakcja Click wykrywa syntezę RNA, którą można ilościowo określić za pomocą intensywności fluorescencji i mikroskopii świetlnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza syntezy RNA; mikroskopia, tabela danych, wykres rozrzutu i wykres słupkowy; wyniki badania hipoksji." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
	Rycina 2. A. Zrzut ekranu z programu OMERO przedstawiający typowy wynik mikroskopowy po znakowaniu RNA. To oprogramowanie do wizualizacji i analizy obrazów mikroskopowych pozwala na szybkie wyodrębnienie danych o intensywności na poziomie pojedynczej komórki przy użyciu wbudowanego makra ROI. Zrzut ekranu z wyniku tego polecenia przedstawiono w części B. Ogólną syntezę RNA można wywnioskować z intensywności pojedynczych komórek, której zakres widoczny jest na wykresie rozrzutu C. Formalną reprezentację tych zagregowanych danych przedstawiono w części D. *p &lt; 0.01; **p &lt; 0.05 oraz ***p &lt; 0.001 i n &gt; 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynniki do hodowli komórkowych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor fosforanowo-solny (PBS) pH 7,2–7,6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pożywka Eagle'a modyfikowana przez Dulbecco (DMEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterylizowana przez filtrowanie płodowa surowica cielęca (FCS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicylina/streptomycyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,05% trypsyna-EDTA (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% etanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aktynomycyna D (1 μg/μl roztwór zapasowy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wyposażenie do hodowli komórek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterylne pipety Pasteura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gama wyrobów z tworzyw sztucznych traktowanych do hodowli komórkowych, odpowiednich do utrzymywania i traktowania komórek w kulturze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kąpiel wodna ustawiona na 37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkubator ustawiony na 37 °C, 5% CO22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stacja robocza do badań nad hipoksją ustawiona na 37 °C, 5% CO22, 1% O22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szkiełka nakrywkowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pinceta precyzyjna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komora odliczająca (hemocytometr)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Odczynniki i sprzęt wymagane do hodowli komórek U2OS.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="514">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Składniki reakcji</td>
			<td colspan="6">Liczba szkiełek podstawowych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor reakcyjny Click-iT RNA (Component C)</td>
			<td>428 μl</td>
			<td>856 μl</td>
			<td>1.7 ml</td>
			<td>2.1 ml</td>
			<td>2.58 ml</td>
			<td>4.3 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 (Component D)</td>
			<td>20 μl</td>
			<td>40 μl</td>
			<td>80 μl</td>
			<td>100 μl</td>
			<td>120 μl</td>
			<td>200 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azydek Alexa Fluor (przygotowany w kroku 2.3)</td>
			<td>1.8 μl</td>
			<td>3.7 μl</td>
			<td>7.4 μl</td>
			<td>9.3 μl</td>
			<td>11.28 μl</td>
			<td>18.8 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodatek do buforu reakcyjnego Click-iT (przygotowany w kroku 2.3)</td>
			<td>50 μl</td>
			<td>100 μl</td>
			<td>200 μl</td>
			<td>250 μl</td>
			<td>300 μl</td>
			<td>500 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przybliżona objętość całkowita</td>
			<td>500 μl</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>2 ml</td>
			<td>2.5 ml</td>
			<td>1.5 ml</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Koktajle reakcyjne zestawu do obrazowania RNA: Tabela referencyjna szczegółowo określająca stosunek składników master mixu dla reakcji z użyciem zestawu do obrazowania RNA w zależności od liczby szkiełek podstawowych przeznaczonych do barwienia.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorofor</td>
			<td>Wzbudzenie (nm)</td>
			<td>Emisja (nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>495</td>
			<td>519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 związany z DNA</td>
			<td>350</td>
			<td>461</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3. Maksima emisji/wzbudzenia fluorescencji: Przybliżone maksima emisji/wzbudzenia fluorescencji dla barwnika Alexa Fluor oraz Hoechst 33342 związanego z DNA.

Opisujemy technikę analizy globalnej syntezy RNA w hipoksji za pomocą obrazowania. Znakowanie chemiczne RNA metodą kliknięcia nie było wcześniej wykonywane w warunkach hipoksji i umożliwia wizualizację globalnych zmian RNA na poziomie pojedynczej komórki. Podejście to uzupełnia istniejące techniki uśredniania RNA, umożliwiając bezpośrednią wizualizację zmian między komórkami w globalnej syntezie RNA.

Analiza globalnej syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki po niedotlenieniu

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest fluorescencyjne znakowanie i ilościowe oznaczenie nascentnego RNA wytwarzanego w warunkach traktowania, z wykorzystaniem ilościowej analizy obrazowej w celu osiągnięcia tego celu. Hodowle komórkowe wysiane na szkiełkach podstawowych są traktowane zmodyfikowaną zasadą alkinową, 5-etalurydyną, zwaną w dalszej części tekstu 5-EU, i inkubowane w warunkach hipoksji.Podczas inkubacji, w trakcie syntezy RNA, wbudowywane jest 5 EU bez zakłócania komórkowego mechanizmu transkrypcji. Następnie wbudowane 5 EU jest znakowane fluorescencyjnie poprzez przeprowadzenie miedziowo katalizowanej cykloaddycji azydkowo-alkinowej, czyli reakcji klik. Następnie fluorescencyjnie znakowane nowo powstałe RNA jest obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a uzyskane obrazy są analizowane w celu porównania ilości RNA wytworzonego w warunkach doświadczalnych i kontrolnych.Analiza statystyczna uzyskanych danych wykazuje zmiany w generowaniu nowo powstałego RNA w odpowiedzi na hipoksję poprzez ilościowe oznaczenie wbudowania EU i detekcję za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ilościowe qPCR, jest to, że umożliwia ona bezpośrednią wizualizację produkcji RNA w komórkach na poziomie pojedynczej komórki. Chociaż w tym przypadku wykorzystujemy tę metodę do badania reakcji komórek na niski poziom tlenu, może ona być również stosowana do badania odpowiedzi na leki chemioterapeutyczne.Procedurę dotyczącą dodatkowych reakcji stresowych zaprezentują John Leston, doktorant z mojego laboratorium, przy pomocy ish Kova, również doktoranta, oraz Humana Druker, pracownika postdoctoral. Na koniec Gus Ferguson zademonstruje użycie oprogramowania do wizualizacji obrazów. Eksperyment należy rozpocząć od zanurzenia kilku szkiełek podstawkowych w 70% etanolu w celu ich sterylizacji.Umieść szkiełka nakrywki na krawędzi płytki w komorze do hodowli tkanek i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu w przepływie laminarnym. Po wyschnięciu szkiełek nakrywek umieść po jednym z nich w sześciu naczyniach o średnicy 3,5 centymetra. Do każdego naczynia dodaj dwa mililitry ocieplonego, kompletnego DMEM.Docisnąć pęsetą, aby upewnić się, że każde szkiełko nakrywowe pozostaje przytwierdzone do dna dołka. Następnie, aby odkleić komórki U2 OS od naczynia hodowlanego, przemyć raz 3 mL PBS. Następnie dodać 4 mL ciepłej trypsyny 0,05%, EDTA 1% i inkubować w temperaturze 37 °C przez siedem minut.Po upływie siedmiu minut od dodania Resus, zawiesić komórki w 6 ml ciepłego, kompletnego DMEM, aby dezaktywować trypsynę z EDTA. Policzyć komórki za pomocą komory licznikowej, a następnie do każdej szalki o średnicy 3,5 cm zawierającej szkiełka nakrywkowe zasiać 2 × 10⁵ komórek. Delikatnie zakołysać szalką, aby zapewnić równomierny rozkład komórek, i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, przy 21% tlenu i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić adhezję komórek.Następnego dnia wyjmij pięć naczyń z inkubatora. Pozostałe naczynie pozostaw nienaruszone; posłuży ono jako normoksyczna kontrola pozytywna.Umieść cztery szalki w stacji roboczej do hipoksji. Poddaj komórki działaniu warunków hipoksyjnych przez 75 minut, 90 minut, dwie godziny oraz 24 godziny. Do pozostałej szalki.Dodaj aktonomycynę D do medium do końcowego stężenia 10 µg/mL i umieść naczynie z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C w normalnych warunkach natlenienia na cztery godziny. Szalka ta służy jako normoksyczna kontrola negatywna. Podczas inkubacji komórek przygotuj i zgromadź następujące odczynniki w celu przeprowadzenia testu click-it.Zestaw do analizy Click-it, PBS o pH od 7,2 do 7,6, 3,7% paraformaldehydu w PBS, 1% Triton X 100 w PBS, woda dejonizowana, dimetylosulfoksyd, 10 M wodorotlenek sodu, 37% kwas solny oraz paski wskaźnikowe pH. Należy zaplanować rozpoczęcie analizy z użyciem znaczników w odpowiednich warunkach. Na jedną godzinę przed zakończeniem traktowania hipoksją, w celu oznakowania komórek, należy przygotować dwukrotny roztwór roboczy EU z zapasu 100 mM w uprzednio ogrzanym pełnym medium.Następnie do pożywki w naczyniu zawierającym komórki traktowane aktonomycyną D należy dodać taką samą objętość 2X EU, rozcieńczając w ten sposób EU do stężenia roboczego. Następnie w komorze hipoksji należy dodać roztwór stokowy EU do komórek poddanych hipoksji. Inkubować przez jedną godzinę w warunkach hodowli komórkowej po traktowaniu hipoksją lub przez cztery godziny w przypadku kontroli.Każdą płytkę należy przemyć raz PBS, a następnie dodać jeden mililitr 3,7% roztworu Paraformaldehydu w warunkach traktowania i inkubować przez 15 minut w tych samych warunkach. Po utrwaleniu należy wyjąć komórki z komory hipoksyjnej i umieścić je w dygestorium. Odlać utrwalacz, dbając o odpowiedzialną utylizację odpadów zawierających paraformaldehyd.Następnie raz przemyj komórki roztworem PBS. Kolejne etapy przeprowadź w temperaturze pokojowej, przechowując wszystkie roztwory na lodzie w temperaturze od 2 do 6 °C. Aby zpermeabilizować komórki, odlej roztwór do mycia i dodaj do każdej studzienki 1 ml 1% Triton X 100 w PBS, a następnie inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Usunąć bufor do permeabilizacji i raz wypłukać każdą studzienkę za pomocą PBS. Odessać roztwór płuczący z komórek i dodać 500 µl świeżo przygotowanego koktajlu reakcyjnego z zestawu do obrazowania RNA do każdej próbki. Chronić komórki przed światłem i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po inkubacji usunąć koktajl reakcyjny i płukanie z zestawu do obrazowania RNA. Po przemyciu próbki 1 ml buforu płuczącego z zestawu do obrazowania RNA, w tym momencie należy przeprowadzić wszelkie dodatkowe znakowanie przeciwciałami. Aby zabarwić DNA, przemyć próbki PBS, a następnie rozcieńczyć herst 3, 3, 3, 4, 2 w stosunku 1:1000.Do PBS dodać jeden mililitr rozcieńczonego roztworu HERC do każdej próbki. Chronić przed światłem i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usunąć roztwór HERC i dwukrotnie przemyć komórki PBS w celu zamontowania szkiełek nakrywkowych.Nanieś 10 µL medium montażowego na środek standardowego szkiełka przedmiotowego. Połóż szkiełko cover slip stroną z komórkami skierowaną w dół na kroplę medium montażowego. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one utrudnić późniejszą akwizycję obrazu.Na obwód szkiełka nakrywki nanieś bezbarwny lakier do paznokci, aby przymocować je do preparatu. Pozostaw lakier do wyschnięcia przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Próbki chronione przed światłem można przechowywać w temperaturze -20 °C.Po zamocowaniu preparatu należy wykonać zdjęcia przy użyciu mikroskopu szerokopolowego z możliwością detekcji fluorescencji. Obrazowanie należy przeprowadzić przy użyciu obiektywu imersyjnego olejowego 40x 1,30 NA, a obrazy należy zarejestrować za pomocą chłodzonej kamery CCD. Należy przeprowadzić akwizycję obrazu dla minimum 30 komórek.Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazów w celu przeprowadzenia dewolucji obrazów. Pozwoli to skorygować dystorsję optyczną poprzez zastosowanie matematycznego wzoru programowego do przechwyconych obrazów. Wynikiem jest wyraźniejszy obraz, który zapewni, że późniejsza analiza będzie ograniczona wyłącznie do obrazowanych komórek.Następnie zaimportuj obrazy do programu Omer O. Miniatury wszystkich uzyskanych obrazów zostaną wyświetlone w celu normalizacji ustawień renderowania dla wszystkich obrazów w ramach tego samego eksperymentu. Zastosuj ustawienia renderowania z kontrolnych komórek w warunkach normoksji do wszystkich pozostałych warunków, korzystając z narzędzia wyznaczania obszaru zainteresowania ROI w oprogramowaniu analitycznym.Wybierz jądra komórkowe z każdego obrazu w oprogramowaniu. Wybierz opcję analizy intensywności i wyznacz średnie intensywności dla każdego ROI dla 30 do 50 komórek. Zapisz dane, a następnie oblicz średnią i odchylenie standardowe dla każdego wariantu.Na koniec, przy użyciu oprogramowania do wykresów, należy sporządzić wykresy punktowe wszystkich indywidualnych wartości średniej intensywności, aby odzwierciedlić zmienność między komórkami w każdym z warunków. Przedstawienie danych o intensywności w ten sposób jest użyteczne, ponieważ pozwala na szybkie porównanie wyników traktowania i wyraźnie wykazuje znaczną heterogenność w populacji komórek poddanych danej procedurze, która w przeciwnym razie byłaby zamaskowana przy zastosowaniu standardowej reprezentacji danych. Alternatywnie można sporządzić wykresy słupkowe przedstawiające średnią z wartości średniej intensywności wraz z odchyleniem standardowym dla nowo powstałego RNA, aby ilościowo określić całkowitą syntezę RNA; komórki U2 OS poddane hipoksji i hodowane w obecności 5-etynylurydyny lub EU zostały następnie przetworzone i przeanalizowane.Jak pokazano w tym filmie, wyliczono średnie intensywności fluorescencji dla wszystkich komórek w każdej populacji badanej i naniesiono je na wykres. Na tym wykresie słupkowym zastosowano test t-studenta, aby obliczyć prawdopodobieństwo statystyczne istotnej różnicy między każdą grupą badawczą a grupą kontrolną. Co ciekawe, dane te wykazują statystycznie istotny wzrost globalnej syntezy RNA w czasie.Gdy komórki U2 OS są poddawane hipoksji przez czas dłuższy niż półtorej godziny, zgodnie z oczekiwaniem, traktowanie aktynomycyną D całkowicie znosi intensywność fluorescencji. Dane te sugerują, że po dłuższych okresach ekspozycji na hipoksję komórka koncentruje swoje wysiłki na produkcji RNA, nawet w tym nieprzyjaznym środowisku hipoksycznym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak znakować i kwantyfikować nowo powstałe RNA na poziomie pojedynczej komórki w warunkach hipoksji i normoksji; po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu dwóch godzin zgodnie z opisaną procedurą.Aby ustalić, czy poziomy polimerazy RNA uległy zmianie oraz czy HIF został aktywowany, można zastosować inne metody, takie jak barwienie współistniejące z przeciwciałami przeciwko polimerazie RNA i HIF. Należy pamiętać, że praca z formaldehydem podczas wykonywania tej procedury może być niezwykle niebezpieczna. Zawsze należy używać rękawiczek i pracować pod wyciągiem chemicznym.

analysis-global-rna-synthesis-at-single-cell-level-following

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza globalnej syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki po hipoksji

W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę izolacji pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronalnych szczura oraz późniejszą analizę transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Metoda ta może zostać zastosowana do każdego typu komórek.

Analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Całkowite komórkowe RNA stanowi kiepski szablon do badania krótkoterminowych zmian w syntezie i rozpadzie RNA, jak również kinetyki przetwarzania RNA. W tym miejscu opisujemy znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA za pomocą 4-tiourydyny, a następnie biotynylację specyficzną dla tiolu i oczyszczanie nowo transkrybowanego RNA, co pozwala przezwyciężyć te ograniczenia.

Znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA w celu profilowania ekspresji genów w wysokiej rozdzielczości syntezy, przetwarzania i rozpadu RNA w hodowli komórkowej

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić specyficzną dla typu komórki translację mRNA. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony izolacji mRNA w rzadkich populacjach komórek zarodków Drosophila.

TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli komórek ludzkich do analizy czynników inicjacji translacji, które wiążą 5' czapeczkę mRNA podczas fizjologicznych warunków tlenowych. Metoda ta wykorzystuje analog kapu m7GTP sprzężonego z agarozą i jest odpowiednia do badania czynników wiążących kap i ich oddziałujących partnerów.

Analiza białek wiążących czapeczki w komórkach ludzkich wystawionych na fizjologiczne warunki tlenowe

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący sekwencję RNA do monitorowania poziomów mRNA w czasie podczas niedotlenienia komórek S. cerevisiae. Metodę tę można dostosować do analizy ekspresji genów podczas dowolnej odpowiedzi komórkowej.

Pomiar poziomu mRNA w czasie podczas odpowiedzi niedotlenienia drożdży S. cerevisiae

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Ta metoda może być użyta do pomiaru syntezy RNA. 5-bromourydyna jest dodawana do komórek i włączana do syntetyzowanego RNA. Syntezę RNA mierzy się przez ekstrakcję RNA bezpośrednio po znakowaniu, a następnie immunoprecypitację znakowanego RNA ukierunkowaną na 5-bromourydynę i analizę za pomocą odwrotnej transkrypcji i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Badanie syntezy RNA z wykorzystaniem znakowania 5-bromourydyną i immunoprecypitacji

Opisany tutaj protokół opiera się na kwantyfikacji całego genomu nowo zsyntetyzowanych mRNA oczyszczonych z komórek drożdży znakowanych 4-tiouracylem. Metoda ta pozwala na pomiar syntezy mRNA niesprzężonej z rozpadem mRNA, a tym samym zapewnia dokładny pomiar transkrypcji polimerazy II RNA.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Struktura wtórna RNA została głównie zaobserwowana w dojrzałym RNA metodami sondowania struktury. Sekwencjonowanie śledzenia struktury kotranskrypcyjnej (CoSTseq) jednoczy jądrowy run-on, który był wykorzystywany do badania pozycji polimerazy na powstającym RNA, z wykorzystaniem sondowania struktury. CoSTseq umożliwia tym samym obserwację wtórnej struktury RNA w RNA podczas aktywnej transkrypcji.

Porównawcza analiza struktury RNA transkryptów powstających i dojrzałych u Saccharomyces cerevisiae

Poznaj metodę analizy globalnej syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki w warunkach niedotlenienia z wykorzystaniem chemii klik i mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta pozwala wizualizować zmiany transkrypcji w komórkach.

Analiza globalnej syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki po niedotlenieniu

Przeglądaj więcej filmów