Analiza globalnej syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki po niedotlenieniu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest fluorescencyjne znakowanie i ilościowe oznaczenie nascentnego RNA wytwarzanego w warunkach traktowania, z wykorzystaniem ilościowej analizy obrazowej w celu osiągnięcia tego celu. Hodowle komórkowe wysiane na szkiełkach podstawowych są traktowane zmodyfikowaną zasadą alkinową, 5-etalurydyną, zwaną w dalszej części tekstu 5-EU, i inkubowane w warunkach hipoksji.

Podczas inkubacji, w trakcie syntezy RNA, wbudowywane jest 5 EU bez zakłócania komórkowego mechanizmu transkrypcji. Następnie wbudowane 5 EU jest znakowane fluorescencyjnie poprzez przeprowadzenie miedziowo katalizowanej cykloaddycji azydkowo-alkinowej, czyli reakcji klik. Następnie fluorescencyjnie znakowane nowo powstałe RNA jest obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a uzyskane obrazy są analizowane w celu porównania ilości RNA wytworzonego w warunkach doświadczalnych i kontrolnych.

Analiza statystyczna uzyskanych danych wykazuje zmiany w generowaniu nowo powstałego RNA w odpowiedzi na hipoksję poprzez ilościowe oznaczenie wbudowania EU i detekcję za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ilościowe qPCR, jest to, że umożliwia ona bezpośrednią wizualizację produkcji RNA w komórkach na poziomie pojedynczej komórki. Chociaż w tym przypadku wykorzystujemy tę metodę do badania reakcji komórek na niski poziom tlenu, może ona być również stosowana do badania odpowiedzi na leki chemioterapeutyczne.

Procedurę dotyczącą dodatkowych reakcji stresowych zaprezentują John Leston, doktorant z mojego laboratorium, przy pomocy ish Kova, również doktoranta, oraz Humana Druker, pracownika postdoctoral. Na koniec Gus Ferguson zademonstruje użycie oprogramowania do wizualizacji obrazów. Eksperyment należy rozpocząć od zanurzenia kilku szkiełek podstawkowych w 70% etanolu w celu ich sterylizacji.

Umieść szkiełka nakrywki na krawędzi płytki w komorze do hodowli tkanek i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu w przepływie laminarnym. Po wyschnięciu szkiełek nakrywek umieść po jednym z nich w sześciu naczyniach o średnicy 3,5 centymetra. Do każdego naczynia dodaj dwa mililitry ocieplonego, kompletnego DMEM.

Docisnąć pęsetą, aby upewnić się, że każde szkiełko nakrywowe pozostaje przytwierdzone do dna dołka. Następnie, aby odkleić komórki U2 OS od naczynia hodowlanego, przemyć raz 3 mL PBS. Następnie dodać 4 mL ciepłej trypsyny 0,05%, EDTA 1% i inkubować w temperaturze 37 °C przez siedem minut.

Po upływie siedmiu minut od dodania Resus, zawiesić komórki w 6 ml ciepłego, kompletnego DMEM, aby dezaktywować trypsynę z EDTA. Policzyć komórki za pomocą komory licznikowej, a następnie do każdej szalki o średnicy 3,5 cm zawierającej szkiełka nakrywkowe zasiać 2 × 10⁵ komórek. Delikatnie zakołysać szalką, aby zapewnić równomierny rozkład komórek, i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, przy 21% tlenu i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić adhezję komórek.

Następnego dnia wyjmij pięć naczyń z inkubatora. Pozostałe naczynie pozostaw nienaruszone; posłuży ono jako normoksyczna kontrola pozytywna.

Umieść cztery szalki w stacji roboczej do hipoksji. Poddaj komórki działaniu warunków hipoksyjnych przez 75 minut, 90 minut, dwie godziny oraz 24 godziny. Do pozostałej szalki.

Dodaj aktonomycynę D do medium do końcowego stężenia 10 µg/mL i umieść naczynie z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C w normalnych warunkach natlenienia na cztery godziny. Szalka ta służy jako normoksyczna kontrola negatywna. Podczas inkubacji komórek przygotuj i zgromadź następujące odczynniki w celu przeprowadzenia testu click-it.

Zestaw do analizy Click-it, PBS o pH od 7,2 do 7,6, 3,7% paraformaldehydu w PBS, 1% Triton X 100 w PBS, woda dejonizowana, dimetylosulfoksyd, 10 M wodorotlenek sodu, 37% kwas solny oraz paski wskaźnikowe pH. Należy zaplanować rozpoczęcie analizy z użyciem znaczników w odpowiednich warunkach. Na jedną godzinę przed zakończeniem traktowania hipoksją, w celu oznakowania komórek, należy przygotować dwukrotny roztwór roboczy EU z zapasu 100 mM w uprzednio ogrzanym pełnym medium.

Następnie do pożywki w naczyniu zawierającym komórki traktowane aktonomycyną D należy dodać taką samą objętość 2X EU, rozcieńczając w ten sposób EU do stężenia roboczego. Następnie w komorze hipoksji należy dodać roztwór stokowy EU do komórek poddanych hipoksji. Inkubować przez jedną godzinę w warunkach hodowli komórkowej po traktowaniu hipoksją lub przez cztery godziny w przypadku kontroli.

Każdą płytkę należy przemyć raz PBS, a następnie dodać jeden mililitr 3,7% roztworu Paraformaldehydu w warunkach traktowania i inkubować przez 15 minut w tych samych warunkach. Po utrwaleniu należy wyjąć komórki z komory hipoksyjnej i umieścić je w dygestorium. Odlać utrwalacz, dbając o odpowiedzialną utylizację odpadów zawierających paraformaldehyd.

Następnie raz przemyj komórki roztworem PBS. Kolejne etapy przeprowadź w temperaturze pokojowej, przechowując wszystkie roztwory na lodzie w temperaturze od 2 do 6 °C. Aby zpermeabilizować komórki, odlej roztwór do mycia i dodaj do każdej studzienki 1 ml 1% Triton X 100 w PBS, a następnie inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Usunąć bufor do permeabilizacji i raz wypłukać każdą studzienkę za pomocą PBS. Odessać roztwór płuczący z komórek i dodać 500 µl świeżo przygotowanego koktajlu reakcyjnego z zestawu do obrazowania RNA do każdej próbki. Chronić komórki przed światłem i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji usunąć koktajl reakcyjny i płukanie z zestawu do obrazowania RNA. Po przemyciu próbki 1 ml buforu płuczącego z zestawu do obrazowania RNA, w tym momencie należy przeprowadzić wszelkie dodatkowe znakowanie przeciwciałami. Aby zabarwić DNA, przemyć próbki PBS, a następnie rozcieńczyć herst 3, 3, 3, 4, 2 w stosunku 1:1000.

Do PBS dodać jeden mililitr rozcieńczonego roztworu HERC do każdej próbki. Chronić przed światłem i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usunąć roztwór HERC i dwukrotnie przemyć komórki PBS w celu zamontowania szkiełek nakrywkowych.

Nanieś 10 µL medium montażowego na środek standardowego szkiełka przedmiotowego. Połóż szkiełko cover slip stroną z komórkami skierowaną w dół na kroplę medium montażowego. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one utrudnić późniejszą akwizycję obrazu.

Na obwód szkiełka nakrywki nanieś bezbarwny lakier do paznokci, aby przymocować je do preparatu. Pozostaw lakier do wyschnięcia przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Próbki chronione przed światłem można przechowywać w temperaturze -20 °C.

Po zamocowaniu preparatu należy wykonać zdjęcia przy użyciu mikroskopu szerokopolowego z możliwością detekcji fluorescencji. Obrazowanie należy przeprowadzić przy użyciu obiektywu imersyjnego olejowego 40x 1,30 NA, a obrazy należy zarejestrować za pomocą chłodzonej kamery CCD. Należy przeprowadzić akwizycję obrazu dla minimum 30 komórek.

Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazów w celu przeprowadzenia dewolucji obrazów. Pozwoli to skorygować dystorsję optyczną poprzez zastosowanie matematycznego wzoru programowego do przechwyconych obrazów. Wynikiem jest wyraźniejszy obraz, który zapewni, że późniejsza analiza będzie ograniczona wyłącznie do obrazowanych komórek.

Następnie zaimportuj obrazy do programu Omer O. Miniatury wszystkich uzyskanych obrazów zostaną wyświetlone w celu normalizacji ustawień renderowania dla wszystkich obrazów w ramach tego samego eksperymentu. Zastosuj ustawienia renderowania z kontrolnych komórek w warunkach normoksji do wszystkich pozostałych warunków, korzystając z narzędzia wyznaczania obszaru zainteresowania ROI w oprogramowaniu analitycznym.

Wybierz jądra komórkowe z każdego obrazu w oprogramowaniu. Wybierz opcję analizy intensywności i wyznacz średnie intensywności dla każdego ROI dla 30 do 50 komórek. Zapisz dane, a następnie oblicz średnią i odchylenie standardowe dla każdego wariantu.

Na koniec, przy użyciu oprogramowania do wykresów, należy sporządzić wykresy punktowe wszystkich indywidualnych wartości średniej intensywności, aby odzwierciedlić zmienność między komórkami w każdym z warunków. Przedstawienie danych o intensywności w ten sposób jest użyteczne, ponieważ pozwala na szybkie porównanie wyników traktowania i wyraźnie wykazuje znaczną heterogenność w populacji komórek poddanych danej procedurze, która w przeciwnym razie byłaby zamaskowana przy zastosowaniu standardowej reprezentacji danych. Alternatywnie można sporządzić wykresy słupkowe przedstawiające średnią z wartości średniej intensywności wraz z odchyleniem standardowym dla nowo powstałego RNA, aby ilościowo określić całkowitą syntezę RNA; komórki U2 OS poddane hipoksji i hodowane w obecności 5-etynylurydyny lub EU zostały następnie przetworzone i przeanalizowane.

Jak pokazano w tym filmie, wyliczono średnie intensywności fluorescencji dla wszystkich komórek w każdej populacji badanej i naniesiono je na wykres. Na tym wykresie słupkowym zastosowano test t-studenta, aby obliczyć prawdopodobieństwo statystyczne istotnej różnicy między każdą grupą badawczą a grupą kontrolną. Co ciekawe, dane te wykazują statystycznie istotny wzrost globalnej syntezy RNA w czasie.

Gdy komórki U2 OS są poddawane hipoksji przez czas dłuższy niż półtorej godziny, zgodnie z oczekiwaniem, traktowanie aktynomycyną D całkowicie znosi intensywność fluorescencji. Dane te sugerują, że po dłuższych okresach ekspozycji na hipoksję komórka koncentruje swoje wysiłki na produkcji RNA, nawet w tym nieprzyjaznym środowisku hipoksycznym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak znakować i kwantyfikować nowo powstałe RNA na poziomie pojedynczej komórki w warunkach hipoksji i normoksji; po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu dwóch godzin zgodnie z opisaną procedurą.

Aby ustalić, czy poziomy polimerazy RNA uległy zmianie oraz czy HIF został aktywowany, można zastosować inne metody, takie jak barwienie współistniejące z przeciwciałami przeciwko polimerazie RNA i HIF. Należy pamiętać, że praca z formaldehydem podczas wykonywania tej procedury może być niezwykle niebezpieczna. Zawsze należy używać rękawiczek i pracować pod wyciągiem chemicznym.