Name: Zmodyfikowana metoda heterotopowego przeszczepu serca myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-23T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę heterotopowego przeszczepu serca u myszy, obejmującą mikrochirurgiczne techniki anastomozy naczyń i ocenę odrzucania przeszczepu. Ta procedura umożliwia badanie zgodności genetycznej szczepów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Health and Medical Research Council (NHMRC) of Australia Project Grant 1029205, przez Microsearch Foundation of Australia oraz przez Myee Codrington Medical Research Foundation.

Przed rozpoczęciem eksperymentów, uzyskaj zgodę Komisji Etyki Opieki nad Zwierzętami odpowiedniej instytucji na planowane eksperymenty. Utrzymuj myszy w zgodzie z wymaganiami swojej instytucji. Poniższy protokół został zatwierdzony przez komitety Uniwersytetu w Sydney i Królewskiego Szpitala Księcia Alfreda.
Przed rozpoczęciem operacji, wszystkie narzędzia powinny być dokładnie oczyszczone i wysterylizowane przez namoczenie w 80% etanolu. Niektóre instytucje wymagają sterylizacji w autoklawie, jednak w dłuższej perspektywie może to uszkodzić drobne narzędzia mikrochirurgiczne. Jeśli to możliwe, używaj sterylnego sprzętu jednorazowego użytku.
1. Znieczulenie
<ol>
	<li>Znieczulij mysz izofluranem w szczelnie zamkniętym pojemniku, a następnie umieść ją na wznak na tablicy operacyjnej, szybko łącząc znieczulający stożek nosowy. Sprawdź adekwatność znieczulenia, ściskając tylną stopę, aby upewnić się, że nie ma odruchu.</li>
	<li>Ogol skórę ostrzem chirurgicznym i wysterylizuj 80% etanolem. Ponadto 2% chlorheksydyny w 70% alkoholu izopropylowym może być używane do sterylizacji skóry. Podczas indukcji znieczulenia stężenie izofluranu wynosi 3%, ale zmniejsza się do 1-1,5% w celu podtrzymania. Dokonaj niewielkich korekt tego stężenia, aby utrzymać regularny oddech i tętno. Utrzymuj temperaturę zwierzęcia na poduszce grzewczej.</li>
</ol>
2. Operacja dawcy
<ol>
	<li>Wykonaj torakotomię, aby odsłonić serce i naczynia, przecinając klatkę piersiową po obu stronach klatki piersiowej od krawędzi żebra do pachy, a następnie poprzeczne cięcie na poziomie wyrostka mieczykowatego, aby utworzyć płat ściany klatki piersiowej. Podnieś tę klapkę obok głowicy i przypnij ją do tablicy operacyjnej. Oderwij osierdzie, aby odsłonić serce i naczynia.</li>
	<li>Jedną ręką podnieś żyłę główną dolną za pomocą kleszczy, a drugą wstrzyknij 1 ml zimnej heparynizowanej soli fizjologicznej proksymalnie do serca przez IVC, a następnie umieść mały zacisk tętniczy na IVC, aby zapobiec przepływowi roztworu perfuzyjnego z powrotem przez otwór igły.</li>
	<li>Za pomocą gazy i wacika cofnij serce w dół, aby odsłonić aortę wstępującą i tętnicę płucną. Przełóż jedno ostrze pary mikronożyczek przez kanał (zatokę poprzeczną) z tyłu do pęczka aorty i tętnicy płucnej i przeciąć aortę i tętnicę płucną tak daleko, jak to możliwe, aby zapewnić wystarczającą długość do zespolenia.</li>
	<li>Zawiąż i podziel IVC, prawą żyłę główną górną (SVC), lewą SVC i żyły płucne za pomocą nici jedwabnej 6-0. Zawiąż IVC i prawy SVC oddzielnie, a następnie umieść pojedynczą nić za sercem, aby otoczyć lewy SVC razem z żyłami płucnymi i zawiązać go. Pobrać serce z miejsca dawczego, przecinając naczynia dystalnie do wiązań, a następnie przechowywać je w zimnym, sterylnym roztworze soli fizjologicznej w temperaturze 4 °C do czasu przeszczepienia. Powoduje to śmierć dawcy w wyniku wykrwawienia.</li>
</ol>
3. Operacja odbiorcy
<ol>
	<li>Znieczulić biorcę jak wyżej (punkt 1). Ostrożnie ogol brzuch, aby uniknąć podrażnienia, a następnie wykonaj laparotomię przez nacięcie linii środkowej od łona do xiphisternum i wycofaj się za pomocą spinaczy do papieru zgiętych w celu utworzenia retraktorów. Owiń jelita ciepłą, sterylną gazą nasączoną solą fizjologiczną i cofnij się do prawej górnej części brzucha.</li>
	<li>Aby odsłonić aortę podnerkową i IVC, należy uwolnić wiązki aorty i IVC z lewej tętnicy nerkowej i żyły do rozwidlenia biodrowego, oddzielając je od naczyń lędźwiowych za pomocą urządzenia do kauteryzacji. Zadbaj o to, aby kauteryzator miał odpowiednią temperaturę i był używany przez wystarczająco długi czas, aby podzielić i uszczelnić końce naczynia.</li>
	<li>Zastosuj małe atraumatyczne zaciski naczyniowe do segmentów aorty i IVC dystalnie i proksymalnie. Wykonaj nacięcie w przedniej ścianie aorty, najpierw nakłuwając otwór igłą 30 G; Następnie wytnij nacięcie pionowo za pomocą mikronożyczek, aby dopasować je do wielkości aorty dawcy. Przepłucz światło aorty heparynizowaną solą fizjologiczną, aby usunąć wszelkie skrzepy krwi.</li>
	<li>Przynieś serce dawcy do miejsca biorczego pokryte gazą nasączoną zimną solą fizjologiczną i umieść je po prawej stronie brzucha. Upewnij się, że aorta dawcy znajduje się obok nacięcia na aorcie biorcy, a tętnica płucna dawcy znajduje się obok IVC biorcy.</li>
	<li>Zespoleć aortę dawczą koniec do boku z aortą biorcy za pomocą biegnących szwów nylonowych 10-0, zaczynając od bliższego rogu i zszywając wzdłuż lewej strony najpierw aż do osiągnięcia dystalnego rogu, na którym to etapie zwierzę jest obracane o 180°. Delikatnie przesuń serce dawcy na lewą stronę brzucha, aby odsłonić prawą stronę aorty i kontynuuj szycie przez prawą stronę ściany aorty od dystalnego końca do bliższego końca. Przed zamknięciem zespolenia aorty delikatnie przepłucz światło heparynizowaną solą fizjologiczną, aby usunąć skrzep i powietrze.</li>
	<li>Zespolenie tętnicy płucnej dawcy (PA) z boku biorcy IVC. Wykonaj nacięcie pionowo mikronożyczkami w przedniej ścianie IVC w miejscu zgodnym z zespoleniem tętnicy. Zespolenie PA dawcy z biorcą IVC za pomocą prowadzenia nylonowych szwów 10-0, zaczynając od dystalnego końca lewej ściany w świetle IVC. Po osiągnięciu bliższego końca kontynuuj szwy wzdłuż przedniej prawej ściany bocznej aż do dystalnego końca, aby zakończyć zespolenie. Przed zamknięciem zespolenia należy delikatnie przepłukać światło, aby usunąć wszelkie skrzepy i powietrze.</li>
	<li>Przed zwolnieniem zacisków naczyń umieść kawałki pianki żelowej wokół miejsc zespolenia i delikatnie uciskaj bawełnianym aplikatorem, aż do uzyskania hemostazy. W momencie rewaskularyzacji najpierw zwolnij dystalny zacisk, a następnie zacisk proksymalny.</li>
	<li>Po rewaskularyzacji nałóż na przeszczep zewnętrznie ciepłą sól fizjologiczną w temperaturze 37 °C, aby wspomóc jego regenerację. Przeszczep zwykle natychmiast rozpoczyna migotanie i spontanicznie powraca do rytmu zatokowego w ciągu kilku minut. Wstrzyknąć podskórnie 0,6 ml ciepłej soli fizjologicznej, aby utrzymać nawodnienie biorcy. Wstrzyknąć buprenorfinę podskórnie w celu znieczulenia przed zakończeniem operacji</li>
	<li>Zamknij ranę brzuszną jednym wchłanialnym szwem biegowym 5-0 dla obu warstw. Zacznij od ukończenia warstwy wewnętrznej i kontynuuj wzdłuż skóry.</li>
</ol>
4. Odzyskiwanie i monitorowanie przeszczepów
<ol>
	<li>Wstrzyknąć ampicylinę w celu profilaktyki infekcji i umieścić biorcę na poduszce grzewczej w temperaturze 37 °C w celu wyzdrowienia. Większość zwierząt szybko wraca do zdrowia i zwykle pije i często je w ciągu 3 godzin. Jeśli mysz wykazuje oznaki niepokoju, przyjrzyj się uważnie, aby ustalić przyczynę. Jeśli nie ma oczywistej przyczyny, należy leczyć buprenorfiną i uważnie monitorować. Skonsultuj się z weterynarzem, jeśli objawy są ciężkie lub utrzymują się dłużej niż 8 godzin i rozważ eutanazję. Jeśli to konieczne, należy kontynuować wstrzykiwanie buprenorfiny co 12 godzin, aż do ustąpienia objawów. Jeśli mysz wykazuje oznaki niepokoju po 8 godzinach, należy kontynuować 12-godzinne wstrzyknięcia buprenorfiny, aż do ustąpienia. Skonsultuj się z weterynarzem, jeśli objawy utrzymują się dłużej niż 48 godzin i w razie potrzeby poddaj się eutanazji.</li>
	<li>Monitoruj bicie serca przeszczepu za pomocą bezpośredniego badania palpacyjnego jamy brzusznej i rejestruj siłę bicia jako ++++ dla zdrowego przeszczepu do + dla słabego bicia z powodu zaawansowanego odrzucenia i – jako brak bicia z powodu całkowitego odrzucenia przeszczepu. Monitoruj myszy codziennie przez pierwsze 10 dni, a następnie 3 razy w tygodniu przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
</ol>

<ol><li>Aramaki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10+but+not+transforming+growth+factor-beta+is+essential+for+generation+and+suppressor+function+of+regulatory+cells+induced+by+intratracheal+delivery+of+alloantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10 but not transforming growth factor-beta is essential for generation and suppressor function of regulatory cells induced by intratracheal delivery of alloantigen.</a> Transplantation. 79, 568-576 (2005).</li>
<li>Chen, R. H., Bushell, A., Fuggle, S. V., Wood, K. J., Morris, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+granzyme+A+and+perforin+in+mouse+heart+transplants+immunosuppressed+with+donor-specific+transfusion+and+anti-CD4+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Expression of granzyme A and perforin in mouse heart transplants immunosuppressed with donor-specific transfusion and anti-CD4 monoclonal antibody.</a> Transplantation. 61, 625-629 (1996).</li>
<li>Poulin, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-9+promotes+eosinophilic+rejection+of+mouse+heart+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-9 promotes eosinophilic rejection of mouse heart allografts.</a> Transplantation. 76, 572-577 (2003).</li>
<li>Ono, K., Lindsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+technique+of+heart+transplantation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thorac.+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Improved technique of heart transplantation in rats.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57, 225-229 (1969).</li>
<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primarily+vascularized+allografts+of+heart+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Primarily vascularized allografts of heart in mice.</a> Transplantation. 16, 343-350 (1973).</li>
<li>Larsen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-gp39+interactions+play+a+critical+role+during+allograft+rejection.+Suppression+of+allograft+rejection+by+blockade+of+the+CD40-gp39+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">CD40-gp39 interactions play a critical role during allograft rejection. Suppression of allograft rejection by blockade of the CD40-gp39 pathway.</a> Transplantation. 61, 4-9 (1996).</li>
<li>Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+induction+of+transplantation+tolerance+with+a+nondepleting+anti-Cd4+monoclonal+antibody+and+donor-specific+transfusion+before+transplantation.+A+critical+period+of+time+is+required+for+development+of+immunological+unresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness.</a> Transplantation. 61, 1642-1647 (1996).</li>
<li>Callaghan, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+allograft+survival+by+inhibitory+FcgammaRIIb+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of allograft survival by inhibitory FcgammaRIIb signaling.</a> J. Immunol. 189, 5694-5702 (2012).</li>
<li>Qian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+donor+MHC+Class+I+or+Class+II+antigen+deficiency+on+first-+and+second-set+rejection+of+mouse+heart+or+liver+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Impact of donor MHC Class I or Class II antigen deficiency on first- and second-set rejection of mouse heart or liver allografts.</a> Immunology. 88, 124-129 (1996).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+acceptance+of+mouse+kidney+allografts+is+associated+with+increased+Foxp3+expression+and+differences+in+the+B+and+T+cell+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous acceptance of mouse kidney allografts is associated with increased Foxp3 expression and differences in the B and T cell compartments.</a> Transpl. Immunol. 24, 149-156 (2011).</li>
<li>Liu, F., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Heart+Transplantation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Heart Transplantation in Mice.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Mottram, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocardiographic+monitoring+of+cardiac+transplants+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice.</a> Cardiovasc. Res. 22, 315-321 (1988).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przeszczep serca myszy to trudna metoda mikrochirurgiczna, której opanowanie wymaga znacznych umiejętności chirurgicznych. Najtrudniejszym aspektem jest mała średnica zbiorników. Ponadto konieczne jest ograniczenie czasu operacji biorcy i krwawienia. Technika przeszczepu serca myszy została po raz pierwszy opisana przez Corry'ego i wsp. w 1973 r., a następnie przez Mottram i wsp. 12. Nasze modyfikacje obejmują następujące punkty. Po pierwsze, natychmiastowa perfuzja serca dawcy zimnym heparyn...

Zwierzęce modele transplantacji narządów mogą dostarczyć cennych informacji dla poprawy leczenia klinicznych pacjentów po przeszczepach. Modele mysie są szczególnie przydatne do badania mechanizmu immunologicznego odrzucenia lub akceptacji przeszczepu narządu ze względu na szeroką gamę genetycznie modyfikowanych myszy i odczynników specyficznych dla myszy, które nie są dostępne dla innych modeli zwierzęcych1-3. Wyzwaniem związanym z mysimi modelami transplantacji jest niewielki rozmiar dawców i biorców, co wymaga znacznych umiejętności technicznych, aby osiągnąć zadowalające wyniki.
Po raz pierwszy opisano technikę heterotopowego przeszczepu serca u szczurów4, która następnie została zaadaptowana do przeszczepu serca myszy przez Corry'ego i wsp.5. Technika ta polegała na przygotowaniu biorcy przed operacją dawcy i braku perfuzji serca dawcy, co może zagrozić przeżyciu przeszczepionego serca lub biorcy. Procedura ta jest szeroko stosowana, zgodnie z pierwotnym opisem, w celu zbadania mechanizmów odrzucenia przeszczepu i tolerancji6-8. Inni zaadaptowali oryginalną procedurę przeszczepu serca szczura Ono i Lindsey do przeszczepów serca u myszy9,10. Niedawno opublikowano technikę przeszczepu serca u myszy, która przezwyciężyła niektóre problemy związane z metodą Corry'ego i wsp. 11. Opisany tutaj protokół zawiera nasze modyfikacje, oparte na metodzie Mottram i wsp. 12, które obejmują: perfuzję in situ zimną heparynizowaną solą fizjologiczną natychmiast po torakotomii i wykonanie operacji dawcy przed operacją biorcy w celu zminimalizowania czasu operacji biorcy. Ponadto używamy małych atraumatycznych zacisków naczyniowych zamiast jedwabnych wiązań 6-0. Chociaż zaciski do naczyń mają tę wadę, że zajmują więcej miejsca, są łatwiejsze do kontrolowania niż opaski, które nie powinny być zbyt ciasne ani luźne i są mniej łatwe do usunięcia niż zaciski. W naszej metodzie wykorzystuje się pojedynczy szew biegowy do zespolenia naczyniowego, chociaż w początkowych etapach nauki alternatywą jest stosowanie szwów rozciągowych w narożniku bliższym i dalszym, aby zapewnić równość szwów, a tym samym drożność zespolenia.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop operacyjny&nbsp;</td><td>Leica, Heerbrugg, Szwajcaria</td><td>M651</td><td>10-25X powiększenie</td></tr><tr><td>Maszyna anestezjologiczna&nbsp;</td><td>Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia</td><td>Vett3</td><td>Zdolny do dostarczania mieszaniny izofluranu i tlenu w powietrzu&nbsp;</td></tr><tr><td>Tablica operacyjna&nbsp;</td><td>Sklep z narzędziami lub dostawca</td><td></td> biurowy <td>Gęsty korek lub syntetyczny zdolny do przyjmowania szpilek</td></tr><tr><td>Heparynizowana sól fizjologiczna (5 U/ml, 4 & deg; C)</td> <td>Pfizer, USA</td><td>FW25</td><td>W strzykawce 1 ml z igłą 23 G na lodzie</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna (37 &deg; C)</td> <td>AstraZeneca Pty Ltd, Australia</td><td>4538</td><td>Strzykawka w 1 ml z igłą 23 G na ciepłej podkładce</td></tr><tr><td>Szwy 10-nylonowe, 5-0 Vicryl</td><td>Ethicon, Inc. NJ, USA</td><td>2870G/J421H</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (0,05 mg/kg w 0,1 ml soli fizjologicznej)</td><td>Reckitt Benckiser, Sydney, Australia</td><td></td><td>W strzykawce 1 ml z igłą 23 G na lodzie</td></tr><tr><td>Ampułkilina (5 mg/kg w 0,1 ml soli fizjologicznej)</td><td>Osika, Sydney, Australia</td><td></td><td>W strzykawce 1 ml z igłą 23 G na lodzie</td></tr><tr><td>Gel Foam</td><td>Pharmacia & Upjohn Co. USA</td><td>801289304</td><td>Pocięte na małe kawałki</td></tr><tr><td>Wysokotemperaturowe urządzenie do kauteryzacji</td><td>Medtronic, USA</td><td>8444000</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza / Prawa temperatura</td><td>Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumenty mikrochirurgiczne:</td><td>Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.,&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroigłowniki</td><td>Szanghaj, Chiny</td><td>WT2020</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td> <td>Mikrokleszcze WT1020</td><td></td></tr><tr><td>(końcówka prosta)</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td><td>WA3010</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokleszcze (zakrzywiona końcówka)</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td>Zaciski do mikrokomarów <td>WA3020</td><td></td></tr><tr><td>(1 para)</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td><td>W40350</td><td></td></tr><tr><td>Zaciski atraumatyczne mikronaczyniowe (1 para)</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; "</td><td>W40130/W40150</td><td></td></tr></tbody></table>

zmodyfikowana metoda heterotopowego przeszczepu serca myszy

A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

Myszy są często wykorzystywane jako dawcy i biorcy przeszczepów serca w badaniach immunologii transplantacyjnej ze względu na szeroki zakres dostępnych transgenicznych myszy i odczynników. Trudność wynika z niewielkich rozmiarów zwierzęcia i znacznych wyzwań technicznych związanych z mikrochirurgią związaną z przeszczepem serca. W szczególności wysoki odsetek niepowodzeń technicznych wcześnie po przeszczepie może wynikać ze śmierci biorcy i powikłań pooperacyjnych, takich jak paraliż kończyn tylnych lub niebijące serce. Zademonstrowano tu pełną technikę heterotopowego przeszczepu serca myszy, polegającą na pobraniu serca dawcy, a następnie jego wszczepieniu myszowi biorcy. Serce dawcy pobiera się natychmiast po perfuzji in situ zimną heparynizowaną solą fizjologiczną i przecięciu aorty wstępującej i tętnicy płucnej. Operacja biorcy polega na przygotowaniu aorty brzusznej i żyły głównej dolnej (IVC), a następnie zespoleniu końca do boku aorty dawcy z aortą biorcą za pomocą pojedynczego mikroszwu 10-0 i podobnego zespolenia tętnicy płucnej dawcy z IVC biorcy. Po operacji zwierzęciu wstrzykuje się podskórnie 0,6 ml soli fizjologicznej i pozostawia do odzyskania sił na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C. Wyniki 227 przeszczepów serca myszy są podsumowane ze wskaźnikiem sukcesu po 48 godzinach wynoszącym 86,8%. Spośród 13,2% niepowodzeń w ciągu 48 godzin, 5 (2,2%) doświadczyło paraliżu kończyn tylnych, 10 (4,4%) miało niebijące serce z powodu urazu niedokrwiennego przeszczepu i/lub zakrzepicy, a 15 (6,6%) zmarło w ciągu 48 godzin.

Po wstępnym okresie szkolenia przeanalizowano 227 przypadków heterotopowego przeszczepienia serca u myszy przeprowadzonych w naszej grupie. Wskaźnik sukcesu w ciągu pierwszych 24 h wyniósł 90,3%, a w 48 h było to 86,8%. spośród 30 (13,2%) niepowodzeń w ciągu 48 h, u 5 (2,2%) wystąpił paraliż kończyn tylnych i zwierzęta musiały zostać poddane eutanazji, u 10 (4,4%) stwierdzono brak pracy serca z powodu uszkodzenia niedokrwiennego przeszczepu i/lub zakrzepicy, natomiast 15 (6,6%) padło w ciągu 48 h. Niektóre wyniki przeżyc...

Technika jest demonstrowana dla procedury mikrochirurgicznej do heterotopowego przeszczepu serca u myszy, w tym uproszczone metody pobierania dawców i zespolenia naczyń biorców.

Zmodyfikowana metoda heterotopowego przeszczepu serca myszy

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

Ogólnym celem tej procedury jest przeszczepienie serca od myszy dawcy do myszy biorcy. Jest to realizowane poprzez najpierw usunięcie serca z klatki piersiowej dawcy i przechowywanie go w zimnej soli fizjologicznej. Kolejne kroki polegają na przeszczepieniu serca do jamy brzusznej biorcy, a następnie monitorowaniu pracy przeszczepionego serca.W końcowej fazie odrzucenie przeszczepu potwierdza się za pomocą inspekcji wizualnej oraz analizy patomorfologicznej. Ostatecznie wyniki wykazują, że serca przeszczepione pomiędzy niepowiązane linie myszy są odrzucane, podczas gdy serca przeszczepione w obrębie tej samej linii są przyjmowane. Długoterminowa demonstracja wideo tego pomiaru jest kluczowa, ponieważ etapy mikroschirurgiczne są trudne do opanowania ze względu na bardzo mały rozmiar zwierząt dawcy i biorcy.Złożoność procedury chirurgicznej oraz potrzeba zwiększenia dokładności i szybkości przeprowadzania operacji u biorcy wymagają szczególnej staranności. Należy zawsze upewnić się, że wszystkie instrumenty zostały dokładnie oczyszczone i wysterylizowane w 80% etanolu. Zaleca się stosowanie jednorazowego sterylnego sprzętu. Po znieczuleniu myszy dawcy w komorze z izofluranem, należy ułożyć ją na plecach na stole operacyjnym.Następnie szybko podłącz stożek nosowy, podając środek znieczulający. Należy sprawdzić jakość znieczulenia, wykonując ucisk tylnej łapy. W przypadku braku reakcji odruchowej można przystąpić do golenia skóry za pomocą skalpela chirurgicznego.Następnie wysterylizuj skórę, przecierając ją trzykrotnie naprzemiennie 2% chlorheksydyną w 70% alkoholu izopropylowym w trakcie całego zabiegu. Monitoruj wizualnie oddech i tętno zwierzęcia. Dostosuj odpowiednio podawanie izofluranu.Należy rozpocząć od wykonania torakotomii w celu odsłonięcia serca i naczyń, otwierając klatkę piersiową po obu stronach klatki żebrowej. Wykonać cięcie od krawędzi żebra w górę w stronę pach i poprzecznie na poziomie mostka. Pozwala to na utworzenie płata ściany klatki piersiowej.Przypnij otwartą klapę do stołu operacyjnego w pobliżu głowy. Następnie usuń osierdzie z okolic serca. Unieś żyłę główną dolną pęsetą i wstrzyknij jeden mililitr zimnej soli fizjologicznej z heparyną do IVC proksymalnie względem serca.Następnie przymocuj mały zacisk tętniczy do IVC, aby zapobiec cofaniu się roztworu przez otwór po igle, używając gazy i aplikatora bawełnianego. Przesuń serce w dół, aby odsłonić aortę i tętnicę płucną. Zatoka poprzeczna jest kanałem znajdującym się za pęczkiem aorty i tętnicy płucnej.Następnie należy przeciąć aortę oraz tętnicę płucną tak dystalnie, jak to możliwe, aby zmaksymalizować długość naczyń do anastomozy. Teraz należy przeciąć żyłę główną dolną (IVC), prawą żyłę główną górną (SVC), lewą żyłę główną górną (SVC) oraz żyły płucne. Każde z tych naczyń należy oddzielić poprzez podwiązanie nicią jedwabną 6.0.Najpierw podwiąż IVC oraz prawą SVC. Następnie podwiąż lewą SVC i żyły płucne. Teraz usuń serce, przecinając wszystkie naczynia dystalnie od wiązań.Przechowywać serce w zimnej, sterylnej soli fizjologicznej w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu transplantacji. Po przygotowaniu zwierzęcia do zabiegu zgodnie z opisem dla dawcy, należy rozpocząć od wykonania laparotomii. Przeciąć linię środkową od spojewnika do wyrostka mostka.Użyj spinaczy do papieru wygiętych w formie retraktorów. Otwórz jamę brzuszną, owiń jelita gazą nasączoną ciepłą solą fizjologiczną i odsunie je w prawą górną część jamy brzusznej. Następnie odsłoń aortę podnerkową oraz żyłę główną dolną (IVC) pomiędzy bifurkacją tętnic biodrowych a lewą tętnicą i żyłą nerkową.Uwolnić związany odcinek aorty i żyły głównej dolnej (IVC). Następnie oddzielić aortę i żyłę główną dolną od naczyń lędźwiowych za pomocą kalibrowanego urządzenia do kauteryzacji. Nałożyć małe zaciski atraumatyczne na proksymalny i dystalny koniec uwolnionego odcinka aorty i żyły głównej dolnej.Używając igły o rozmiarze 30 G, wykonaj otwór w przedniej ścianie aorty, przechodząc przez nacięcie pionowe, tak aby otwór miał rozmiar odpowiadający aorcie dawcy. Wykorzystaj tę okazję, aby usunąć wszelkie skrzepy krwi z światła aorty, płucząc je roztworem soli fizjologicznej z heparyną. Następnie wprowadź serce dawcy w zimnej soli fizjologicznej.Umieść serce dawcy obok nacięcia w aorcie biorcy. Ustaw tętnicę płucną dawcy obok dolnej żyły głównej (IVC) biorcy, używając szwów nylonowych 10 oh. Wykonaj anastomozę aorty koniec-bok.Zacznij od narożnika proksymalnego i wykonaj szwy wzdłuż lewej strony aż do narożnika dystalnego. Następnie obróć zwierzę o 180 stopni. Odsuń serce i kontynuuj szycie wzdłuż prawej strony ściany aorty, kierując się od strony dystalnej do proksymalnej.Przed zamknięciem anastomozy delikatnie przepłucz światło solą fizjologiczną z heparyną, aby usunąć skrzepy i powietrze. Następnie zakończ szycie. W kolejnym kroku wykonaj pionowe nacięcie w przedniej ścianie żyły głównej dolnej (IVC) w miejscu, w którym zostanie wykonana anastomoza z tętnicą płucną.Po drugie, do anastomozy należy użyć szwów ciągłych 10-0. Naczynia zaczynamy od końca dystalnego lewej ściany w obrębie światła żyły głównej dolnej (IVC) na końcu proksymalnym. Kontynuuj wzdłuż przedniej prawej ściany i zszywaj aż do końca dystalnego. Powtórz czynność.Przed zakończeniem anastomozy należy dokładnie przepłukać światło naczynia. Następnie wokół miejsca zespolenia należy umieścić kawałki gąbki żelowej. Hemostazę uzyskuje się poprzez wywieranie delikatnego nacisku za pomocą aplikatorów bawełnianych.Aby przeprowadzic rewakularyzację biorcy. Najpierw zwolnić zacisk dystalny, a następnie zacisk proksymalny. Podczas operacji biorcy kluczowe jest zoptymalizowanie precyzji i szybkości zabiegu.Zatem czas zaciskania klem jest idealnie krótszy niż 30 minut. Aby wspomóc rekonwalescencję, należy zastosować ciepłą sól fizjologiczną o temperaturze 37 °C w miejscu przeszczepu. Fibrylacja powinna wystąpić natychmiast i samoistnie przejść w rytm zatokowy w ciągu kilku minut.Przed zamknięciem pola operacyjnego należy podać buprenorfinę w zastrzyku domięśniowym. Operację kończy się zamknięciem rany za pomocą jednego szwu ciągłego z nici wchłanialnej 5-0 we wszystkich warstwach tkanek. Po zamknięciu rany operacyjnej należy podać zwierzęciu biorcy ampicylinę oraz podskórny zastrzyk 0,6 milliliters soli fizjologicznej.Aby wspomóc nawodnienie, umieść zwierzę na podkładce grzewczej ustawionej na 37 °C A, aż odzyska ono przytomność. Większość zwierząt pije, a nawet je w ciągu trzech godzin po zabiegu. Jeśli po ośmiu godzinach mysz nadal wykazuje oznaki dyskomfortu, podawaj iniekcje buprenorfiny co 12 godzin, aż objawy ustąpią.Jeśli mysz pozostaje w stanie stresu przez ponad 48 godzin, w ciągu pierwszych 10 dni po operacji należy skontaktować się z lekarzem weterynarii. Bezpośrednio monitoruj bicie serca przeszczepionego narządu poprzez palpację brzuszną. Codziennie zapisuj siłę skurczów w skali od 4+ dla zdrowego przeszczepu do 1+ w przypadku słabego bicia wynikającego z zaawansowanego odrzucenia.Przeszczep niebijący należy zarejestrować jako negatywny ze względu na całkowite odrzucenie przeszczepu po 10 dniach. Kontynuuj monitorowanie tętna przeszczepionego serca trzy razy w tygodniu; po 227 heterotopowych przeszczepach serca 90,3% zakończyło się sukcesem przez 24 godziny, a 86,8% przez 48 godzin. Niepowodzenia obejmowały paraliż kończyn tylnych, brak bicia serca z powodu odrzutu przeszczepu, uszkodzenie niedokrwienne i/lub zakrzepicę oraz śmierć; skatalogowano przeżywalność przeszczepów.Przyczyna niepowodzenia przeszczepu serca została ustalona badaniem patomorfologicznym. Analiza przeszczepionego serca, oznaczonego tutaj strzałką, wykazała zakrzepicę i zawał tkanki serca, co było przyczyną niewydolności tego przeszczepionego organu w kombinacji szczepów dawcy i biorcy C 57 Black six; w pozostałych przypadkach nie nastąpiło odrzucenie serca, a przeszczepione organy przeżyły ponad 100 dni. W tym konkretnym przypadku serce nieznacznie zmniejszyło swoją wielkość z powodu zaniku mięśnia wtórnego do braku funkcji podtrzymujących życie.W przeciwieństwie do tego, w kombinacji szczepów odrzucających, gdzie dawcą był DBA 2, a biorcą C57BL/6, przeszczepione serce przestało bić do siódmego dnia i wykazywało oznaki odrzucenia w 100. dniu. To samo serce po wyjęciu było całkowicie zwłókniałe i pomarszczone. Technika ta może zostać wykonana w czasie 90 milionów lub krócej, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo; należy pamiętać, że praca z gazem fluorowym może być niezwykle niebezpieczna.Zaleca się stosowanie systemu odprowadzania gazów anestetycznych.

a-modified-method-for-heterotopic-mouse-heart-transplantion

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zmodyfikowana metoda przeszczepiania serca mysiego heterotopowo

Model heterotopowego przeszczepienia serca u myszy został uznany przez wielu badaczy za istotną metodę badania mechanizmów odrzutu i odpowiedzi immunologicznej. Jednak techniki z nią związane wciąż stanowią wyzwanie. Dzięki modyfikacji standardowych metod z sukcesem przeprowadziliśmy ponad 1000 przeszczepów.

Heterotopowe przeszczepienie serca u myszy

Model przeszczepu mysiego serca szyjnego doskonale nadaje się do badań immunologicznych i niedokrwiennych uszkodzeń reperfuzyjnych. Zmodyfikowaliśmy procedurę przy użyciu techniki mankietu bez szwów i przeprowadziliśmy ponad 1000 udanych przeszczepów przy użyciu tego podejścia. Niniejszym podajemy dodatkowe szczegóły tej techniki, aby uzupełnić film.

Mysi model przeszczepu szyjki macicy przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietowej

W manuskrypcie opisano kroki wymagane do przeprowadzenia heterotopowego przeszczepu serca u myszy.

Mysia heterotopowa technika przeszczepu serca

Technika mankietowa skraca i ułatwia model heterotopowego przeszczepu szyjki macicy u myszy, unikając technicznie trudnych zespoleń szwów w małych naczyniach. Szczegóły techniczne przedstawione w tym artykule wideo powinny pozwolić naukowcom na ustalenie tego modelu w swoich laboratoriach.

Heterotopowy przeszczep szyjki macicy u myszy

Wprowadzamy podejście z rurką wewnętrzną do techniki mankietu do heterotopowego przeszczepu szyjki macicy u myszy, aby pomóc w przeprowadzeniu naczynia nad mankietem. Odkryliśmy, że współpraca dwóch doświadczonych chirurgów znacznie skraca czas operacji.

Optymalizacja techniki mankietowej do przeszczepu serca u myszy

Pokazano nowatorską technikę rekonstrukcji obwodu krwi w heterotopowym modelu przeszczepu serca myszy w jamie brzusznej.

Rekonstrukcja obwodu krwi w modelu przeszczepu serca myszy w jamie brzusznej

W obecnym protokole, model przeszczepu serca myszy jest używany do badania mechanizmu odrzucania przeszczepu alloprzeszczepu serca. W tym heterotopowym modelu przeszczepu serca poprawia się efektywność operacji, a przeżycie przeszczepów serca jest zapewnione dzięki zespoleniu implantacji serca w szyjce macicy od końca do końca przy użyciu zmodyfikowanej techniki Cuff.

Zmodyfikowana technika mankietowa dla heterotopowego modelu przeszczepu szyjki macicy serca u myszy

Modele transplantacji serca u myszy stanowią cenne narzędzia badawcze do badania immunologii transplantacyjnej. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje heterotopowy przeszczep serca szyjki macicy u myszy, który polega na umieszczeniu mankietów na wspólnej tętnicy szyjnej biorcy i pniu tętnicy płucnej dawcy, aby umożliwić laminarny przepływ krwi.

Heterotopowy przeszczep szyjki macicy u myszy z wykorzystaniem mankietów naczyniowych

Niniejszy artykuł opisuje zmodyfikowaną technikę heterotopowego przeszczepu unaczynionego serca z zaktualizowaną techniką aseptyczną, analgezją i znieczuleniem.

Zmodyfikowany protokół przeszczepu serca heterotopowego u myszy zgodny ze współczesnymi standardami techniki aseptycznej, anestezjologii i analgezji

Ten protokół przedstawia uproszczoną technikę anastomozy szwu końcowo-bocznego do przeszczepu serca szyjnego u myszy, zapewniając solidny i możliwy do powtórzenia model do badania immunologii przeszczepów.

Przeszczepienie heterotopowe serca mysiego w okolicy szyjnej z zastosowaniem techniki anastomozy końca z boku w celu badania immunologii przeszczepów

Poznaj zmodyfikowaną metodę heterotopowego przeszczepu serca u myszy, obejmującą mikrochirurgiczne techniki anastomozy naczyń i ocenę odrzucania przeszczepu. Ta procedura umożliwia badanie zgodności genetycznej szczepów.

Zmodyfikowana metoda heterotopowego przeszczepu serca myszy

Przeglądaj więcej filmów