Name: Obrazowanie cieni o pojedynczej długości fali lokomocji Caenorhabditis elegans, w tym oszacowania siły (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj technikę obrazowania cieni z wykorzystaniem spójnego promieniowania monochromatycznego do pomiaru prędkości i sił działających na swobodnie pływające nicienie Caenorhabditis elegans. Metoda oferuje niskokosztową alternatywę dla tradycyjnej mikroskopii w badaniach biomechaniki mikroorganizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie Vassar College Undergraduate Research Summer Institute (URSI), Lucy Maynard Salmon Research Fund, NASA award No. NX09AU90A, nagroda Centrum Doskonałości Badawczej w Nauce i Technologii (NSF-CREST) , nagroda nr 0630388 oraz nagroda NSF nr 1058385.

1. Przygotowanie C. elegans
<ol>
	<li>Przygotować płytki Petriego młodych dorosłych C. elegans, jak opisano w poprzednich eksperymentach z udziałem zawiesiny C. elegans w kuwecie wypełnionej płynem11.</li>
	<li>W dniu analizy wideo należy pobrać żywe młode dorosłe nicienie bezpośrednio do kuwety wypełnionej dejonizowaną, destylowaną wodą za pomocą platynowego kilofa, jak opisano w kroku 2.</li>
	<li>Przygotować martwe C. elegans z ekspozycją na chloroform. Kontynuuj, postępując zgodnie z procedurą opisaną dla zbierania żywych nicieni opisaną w kroku 2.</li>
</ol>
2. Konfiguracja optyczna do analizy wideo
<ol>
	<li>Zmontuj konfigurację eksperymentalną, aby utworzyć obrazy cieni, jak pokazano na rysunku 1. Kamerę można umieścić w dowolnej odległości od ekranu, o ile jest w stanie uchwycić widok ekranu z przodu. Dobre miejsce znajduje się obok kuwety skierowanej w stronę ekranu.
	<ol>
		<li>Użycie co najmniej dwóch luster do skierowania przestrajalnego lasera helowo-neonowego do ekspandera wiązki Galileusza, tak aby wiązka została rozszerzona do średnicy 12 mm.</li>
		<li>Umieść jeden lub dwa otwory w ścieżce belki tak, aby belka przechodziła przez otwory bez przeszkód. Użyj otworów, aby upewnić się, że wyrównanie jest zachowane.</li>
		<li>Skieruj rozszerzoną belkę na zamontowaną kuwetę kwarcową o szerokości 10 mm, głębokości 10 mm i wysokości 4 cm.</li>
		<li>Powiększ wiązkę za pomocą soczewki płasko-wypukłej o dodatniej ogniskowej 75 mm.</li>
		<li>Umieść ekran projekcyjny w odległości około 120 cm od obiektywu. Odległości większe niż ta spowodują większe powiększenie obrazu w cieniu. Jednak jakość obrazu będzie się pogarszać wraz z mniejszym natężeniem światła i zwiększoną zauważalną interferencją dyfrakcyjną.</li>
		<li>Umieść szybką kamerę, która jest w stanie uzyskać co najmniej 60 kl./s, tuż obok kuwety skierowanej w stronę ekranu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść mikroskop preparacyjny w pobliżu układu optycznego, aby szybko przenieść nicienie do kuwety.</li>
	<li>Tymczasowo zabezpiecz przezroczystą linijkę z podziałkami mm do środka uchwytu kuwety prostopadle do rozszerzonej wiązki, tak aby wiązka rzutowała powiększony obraz linijki na ekran. Ustaw skalę długości dla analizy wideo.
	<ol>
		<li>Na ekranie projekcyjnym zaznacz odległość skali za pomocą przezroczystej linijki poza środkiem wyświetlanego obrazu, aby uniknąć zakłóceń projekcji. <a href="Video_1_633nm.MOV" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.</a></li>
		<li>Nagraj ten obraz i zmierz powiększenie. Usuń linijkę z konfiguracji. Powtórz ten krok dla innych długości fal, ponieważ kąt załamania światła dla każdej długości fali przez soczewkę będzie się różnić z powodu aberracji chromatycznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymień kuwetę i napełnij ją wodą destylowaną z dokładnością do 1 mm od obręczy.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie, gdy światło w pomieszczeniu jest włączone, tak aby odległość skali była uwzględniona w tym samym materiale filmowym, co wyświetlany obraz. Wyłącz światło.</li>
	<li>Używając cienkiego, spłaszczonego szpikulca z drutu platynowego, przesuwaj pojedyncze młode dorosłe C. elegans pojedynczo z płytki agarowej do kuwety, dotykając kilofem powierzchni wody. Nicienie staną się widoczne w słupie wody, gdy dostaną się do wiązki z powodu rozproszonego światła. <a href="Video_2_CB678_633nm.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.</a></li>
	<li>Sfilmuj wyświetlane obrazy robaków, gdy przechodzą przez rozszerzoną wiązkę laserową. Ważne jest, aby pamiętać, że wyświetlany obraz jest odwrócony, a robaki będą wydawać się poruszać w kierunku przeciwnym do ich rzeczywistego ruchu. Robaki, które opadają z grawitacją, wydają się poruszać w górę na ekranie (Rysunek 2).</li>
</ol>
3. Przygotowanie danych wideo
<ol>
	<li>Zaimportuj wideo do programu do analizy wideo.</li>
	<li>Ustaw skalę za pomocą wcześniej ustalonego współczynnika powiększenia.</li>
	<li>Śledź liniowe przemieszczenie głowy nicienia cienistego za pomocą co najmniej 10 punktów danych na całej przebytej ścieżce.</li>
	<li>Znajdź prędkość w kierunku pionowym, biorąc pochodną ("Y", "Czas") i podziel tę wartość przez współczynnik powiększenia określony w kroku 2.2.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Przeanalizuj liniowe zejście C. elegans:
	<ol>
		<li>Upewnij się, że punkty danych na wykresie pozycji pionowej w funkcji czasu zazwyczaj tworzą linię prostą. Niektóre odchylenia można zignorować ze względu na ruch głowy nicienia. Jeżeli punkty danych zazwyczaj tworzą linię prostą, należy przejść do kroku 4.1.2, w przeciwnym razie spadek jest nieliniowy i analizę należy kontynuować zgodnie z krokiem 5.1 niniejszego protokołu.</li>
		<li>Utwórz linię regresji liniowej, dopasowując linię prostą12 do danych z menu Analiza. Nachylenie tej linii jest wówczas prędkością pionową C. elegans. Nachylenie to zmiana położenia podzielona przez zmianę czasu w określonym przedziale czasu. W ten sposób określ prędkość opadania żywych i martwych robaków (rysunek 3).</li>
		<li>Uśrednić pionowe prędkości pływania nicieni. Wystarczająca jest próbka o wielkości około 50 robaków. Porównaj prędkości pływania u żywych robaków z prędkościami dryfu u martwych robaków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza ruchu nieliniowego C. elegans
<ol>
	<li>Z sekcji 3 wybierz analizowany plik wideo, który pokazuje nieliniowe opadanie w obrębie słupa wody (rysunek 4). Nieliniowe zejście można zidentyfikować za pomocą kroku 4.1.1 w niniejszym protokole.</li>
	<li>Wybierz opcję "Dopasowanie krzywej" z menu "Analiza" w oprogramowaniu do analizy wideo. Wybierz wielomian drugiego rzędu (kwadratowy). Dopasuj krzywą.</li>
	<li>W przypadku obszaru zainteresowania dostosuj dopasowanie na wykresie, przesuwając nawiasy po obu stronach dopasowania na wykresie, aż krzywa znajdzie się bardzo blisko punktów danych w pasowaniu i/lub dobrze w paskach błędów. Program dopasowania podaje wyrażenie matematyczne dla dopasowanej krzywej, które jest położeniem pionowym w funkcji czasu. Należy wziąć pod uwagę błędy dopasowanej krzywej podane przez program związane z właściwościami fizycznymi. Błąd względny wynoszący 15% lub mniej jest zwykle dopuszczalny.</li>
	<li>Dodaj więcej pasowań krzywych, aby pokryć dodatkowe sekcje danych. Splajn13 funkcje zapewniające optymalne pokrycie: upewnij się, że krzywa pasuje do nakładania się i spróbuj wyrównać sąsiednie krzywe tak, aby nachylenia pasowały do nakładających się obszarów.</li>
	<li>Prędkość dla obszaru zainteresowania należy uzyskać, biorąc pochodną dopasowanej krzywej, korzystając z wyrażenia matematycznego otrzymanego w kroku 5.1.3. Prędkości mogą się zmieniać w czasie. Zauważ, że pochodna jest nachyleniem funkcji. Pochodną można uzyskać matematycznie lub graficznie. W takim przypadku praktyczne jest użycie podanego wyrażenia matematycznego.</li>
	<li>Weź drugą pochodną dopasowanych krzywych, aby uzyskać przyspieszenie. Przyspieszenie może się zmieniać w czasie.</li>
	<li>Pomnóż przyspieszenie przez masę ślimaka, aby obliczyć ciąg, jaki wywiera robak. Rozsądna szacowana masa to 3 μg, przy założeniu, że robak składa się głównie z wody.</li>
</ol>

<ol><li>Ward, A., Lie, J., Feng, Z., Xu, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neurosci. 11, 916-922 (2008).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 105-20987 (2008).</li>
<li>Vidal-Gadea, A. G., Davis, S., Becker, L., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+behavioral+hierarchies+during+environmental+transitions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Worm%22%5BJournal%5D)">Coordination of behavioral hierarchies during environmental transitions in Caenorhabditis elegans.</a> Worm. 1, 5-11 (2012).</li>
<li>Berri, S., Boyle, J. H., Tassieri, M., Hope, I. A., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+locomotion+of+the+nematode+C.+elegans+is+achieved+through+modulation+of+a+single+gait%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+Journal%22%5BJournal%5D)">Forward locomotion of the nematode C. elegans is achieved through modulation of a single gait.</a> HFSP Journal. 3, 186-193 (2009).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeller%2C+HE+%22Objective+Lenses+for+Confocal+Microscopy.+Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Objective Lenses for Confocal Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. , 3rd Edition, Springer. New York. (2006).</li>
<li>Conrad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth+of+Field+in+Depth%5BTitle%5D)+AND+%22Large+Format+Page+Retrieved%22%5BJournal%5D)">Depth of Field in Depth.</a> Large Format Page Retrieved. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf">http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf</a> (2011).</li>
<li>Demtröder, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDemtr%C3%B6der%2C+W+%22Laser+Spectroscopy+Basic+Concepts+and+Instrumentation%22">Laser Spectroscopy Basic Concepts and Instrumentation</a>. , Springer 3rd Ed. New York. (2003).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+Using+Laser+Diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Open+J.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction.</a> Open J. Biophys. 2 (3), 101-107 (2012).</li>
<li>Mood, A., Graybill, F., Boes, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMood%2C+A+%22Introduction+to+the+Theory+of+Statistics%22">Introduction to the Theory of Statistics</a>. , 3rd edition, McGraw-Hill. (1974).</li>
<li>Taylor, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaylor%2C+JR+%22Classical+Mechanics%22">Classical Mechanics</a>. , University Science Books. (2005).</li>
<li>Magnes, J., Susman, K., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Locomotion+Study+of+Freely+Swimming+Micro-organisms+Using+Laser+Diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction.</a> J. Vis. Exp. (68), (2012).</li>
<li>Bevington, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBevington%2C+PR+%22Data+Reduction+and+Error+Analysis+for+the+Physical+Sciences%22">Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences</a>. , McGraw-Hill Book Company. New York. (1969).</li>
<li>Lyche, T., Schumaker, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+spline+approximation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Approximation+Theory%22%5BJournal%5D)">Local spline approximation methods.</a> Journal of Approximation Theory. 15 (4), 294-325 (1975).</li>
<li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. -J., Zoval, J. V., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+Force+Transduced+by+the+MEC-4%2FMEC-10+DEG%2FENaC+Channel+Modulates+DAF-16%2FFoxO+Activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Gravity Force Transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/ENaC Channel Modulates DAF-16/FoxO Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Technika SWSI zapewnia dodatkowy sposób na zrozumienie zdolności lokomotorycznych mikroskopijnych organizmów, takich jak wolno żyjące nicienie. W tej technice rozróżniliśmy aktywną lokomocję (pływanie) i bierne dryfowanie z powodu grawitacji działającej na martwe nicienie. Ponadto, gdy nicienie swobodnie pływające zmieniają kierunek podczas poruszania się w wodzie, jesteśmy w stanie zmierzyć siły oporu i siły kątowe, które działają na nicienie i są wywierane przez nicienie.
Nicienie napotykają różne warunki środowiskowe w glebie. W glebie znajdują się kieszenie wodne, a także cząstki stałe i materiały biologiczne o różnych kształtach i teksturach. Ponadto nicienie istnieją w środowisku grawitacyjnym, na które reagują14. Ponadto nicienie w pobliżu powierzchni gleby są narażone na różne długości fal światła, zmiany temperatury i wilgotności, a także zmienne biologiczne, takie jak bakterie, grzyby drapieżne i inne organizmy glebowe. Nicienie muszą reagować na wszystkie te różne zmienne, pływając i pełzając w różnych mediach, obracając się i zmieniając strategie nawigacyjne. Wszystkie te złożone obliczenia są wykonywane przez zaledwie 302 neurony, z których podzbiór bierze udział w lokomocji, oraz 95 komórek mięśniowych ściany ciała. Pomiary tego rodzaju opisane techniką SWSI dostarczają ważnych informacji na temat tego, w jaki sposób nicienie osiągają tę nawigacyjną złożoność.
W pierwszej części zmierzyliśmy ogólne tempo opadania dzikiego typu C. elegans w świetle 633 nm. Korzystając z tych pomiarów, możemy oszacować siłę oporu, jaką napotyka robak.
W przypadku nicienia przyspieszającego, zaangażowane siły zmieniają się w sposób ciągły, ponieważ siła oporu zmienia się wraz z prędkością. Jest kilka stwierdzeń, które jesteśmy w stanie wypowiedzieć na temat sił działających na robaka. Gdy robak zwalnia i próbuje płynąć w górę, pionowa składowa siły oporu maleje, aż osiągnie zero w najniższym punkcie trajektorii nicienia. W tym momencie robak musi mieć siłę skierowaną w górę, aby podpłynąć.
Ta metoda może być modyfikowana na kilka sposobów. Każdy mikroskopijny gatunek, który porusza się w klarownej cieczy, może być śledzony za pomocą SWSI. Badania można prowadzić na dowolnych długościach fal, które są dostępne dla aparatów cyfrowych. Aparaty cyfrowe zazwyczaj odbierają fale o długości od UV do bliskiej podczerwieni. Ponadto badania poziome można przeprowadzić, kierując laser pionowo do góry. Gatunki można następnie umieścić na poziomej przezroczystej powierzchni, takiej jak szkiełko mikroskopowe. Regulacja ekspandera wiązki lub soczewki powiększającej za ekspanderem wiązki może wyostrzyć rozmyte obrazy. Użytkownik powinien upewnić się, że wszystkie elementy są przymocowane do stołu, aby zapewnić spójne i łatwe wyrównanie belki.
Metoda jest ograniczona dostępnymi długościami fal lasera i rozdzielczością. Zasadniczo zalety tej metody w porównaniu z istniejącymi mikroskopami, którymi są elastyczność w kierunkach i długościach fal, są również słabościami, ponieważ konfiguracja jest prosta. Niewyszukana optyka i plamki lasera ograniczają rozdzielczość. Niektóre z tych wad z pewnością można poprawić w przyszłości, włączając filtr przestrzenny i wyświetlając obraz bezpośrednio na kamerze CCD.
Najbardziej krytycznych kroków w protokole można się łatwo nauczyć, gdy eksperyment jest wykonywany po raz pierwszy. Umieszczenie nicienia w kuwecie bez tworzenia turbulencji ma kluczowe znaczenie. Ponadto wibracje mogą zakłócać konfigurację i zmieniać zachowanie robaków. Pamiętaj, aby ograniczyć moc, która jest używana do cieniowania obrazu. 2 mW dla wiązki laserowej o średnicy 1 mm powinno być maksymalnym, aby uniknąć efektów nagrzewania. Konfiguracja powinna zostać przetestowana pod kątem efektów rozpraszania podczas używania cieczy innych niż woda destylowana.
Obecnie większość mikroskopów działa w płaszczyźnie poziomej przy użyciu światła białego lub filtrów kolorowych, które nadal są bardzo szerokie w zakresie długości fal. Mikroskopy, które naprawdę wykorzystują pojedyncze długości fal i mają elastyczność w scenariuszu oglądania, tj. umieszczeniu poziomym, są zwykle ograniczone do jednej lub drugiej zalety. Ponadto tego typu mikroskopy są zwykle bardzo drogie i nadal ograniczają się do płaszczyzn ogniskowych, w przeciwieństwie do naszej metody. Nasz zestaw można łatwo zbudować przy wyjątkowo niskim budżecie. Metoda ta jest gotowa do wykorzystania przez szkoły, firmy ekologiczne, a także inne podmioty, które działają z niewielkimi funduszami. W przyszłości metoda ta może być wykorzystana w bardzo wyrafinowanym układzie do badania wpływu w czasie rzeczywistym na lokomocję i mechanosensację mikroskopijnych gatunków. Ta metoda sprawia, że badania pojedynczej długości fali w szerokim zakresie kątów i głębokości widzenia są łatwo dostępne.

Caenorhabditis elegans to wolnożyjący, pożyteczny nicień glebowy, który stanowi potężny organizm modelowy do badania mechanizmów regulacji genów, rozwoju, a w ostatnim czasie także do zrozumienia biologii sensorycznej i zachowania. Mimo posiadania jedynie 302 neuronów, C. elegans są zdolne do złożonych wzorców lokomocyjnych, zachowań rozrodczych, nawigacji, chemotaksji i wielu innych zachowań. C. elegans posiadają mechanoreceptory, chemoreceptory, a nawet wykrywają niebieskie długości fal świetlnych (Ward et al., 2008)1. Choć wiele wiadomo o obwodach neuronalnych funkcji sensoryczno-motorycznych i ogólnych wzorcach lokomocyjnych u C. elegans, mniej wiadomo o reakcjach na wiele jednoczesnych bodźców lub bardziej złożone warunki środowiskowe, niż te, które można modelować pod mikroskopem. Kilka badań wykazało bardziej złożone wzorce lokomocyjne, które wykazują wysoką plastyczność2,3,4. Nasze podejście metodologiczne umożliwi badania nicieni w roztworze w czasie rzeczywistym, w którym możemy łatwo zapewnić wiele jednoczesnych warunków środowiskowych. Kwestia ta jest trudna do rozstrzygnięcia przy użyciu konwencjonalnych technik obrazowania opartych na mikroskopie. Opracowaliśmy technikę obrazowania, która pozwala nam umieścić nicienie w kolumnie wody w celu zbadania zachowań lokomocyjnych, a także określenia zdolności nicieni do zmiany lokomocji w odpowiedzi na różne warunki środowiskowe.
W niniejszej pracy po raz pierwszy zaprezentowano obrazowanie cieni w pojedynczej długości fali (SWSI), aby rozwiązać problemy wynikające z ograniczeń tradycyjnych mikroskopów. Tradycyjne mikroskopy ograniczają obserwację organizmów do poziomej płaszczyzny ogniskowania o głębokości zaledwie kilku mikronów5,6. W odniesieniu do badań w pojedynczej długości fali, większość tradycyjnych mikroskopów wykorzystuje filtry kolorystyczne do bardzo szerokiego filtrowania białego światła, zazwyczaj w zakresie 50-100 nm. Zastosowanie lasera w metodzie SWSI zawęża wybór długości fali do mniej niż 1 nm, przy jednoczesnym zachowaniu znacznej intensywności światła7. Podobnie, pojedyncze długości fal były wykorzystywane do pomiaru częstotliwości pływania C. elegans w czasie rzeczywistym8.
W ramach pierwszej demonstracji naszej metody monitorujemy pozycję poziomą, x, oraz pozycję pionową, y, swobodnie pływającego nicienia C. elegans w kolumnie wody, na odcinku około jednego centymetra. W szczególności interesuje nas ruch pionowy, ponieważ grawitacja również działa w pionie. Nachylenie dopasowania liniowego do pozycji pionowej określa prędkość pionową, vy, nicienia podczas opadania w kolumnie wody: 
<img alt="Równanie prędkości, vy=dy/dt, wzór opisujący zależność prędkości od czasu, wyrażenie matematyczne." fo:content-width="0.5in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq1.jpg" width="50" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Wzór">     (1)
Pierwiastek błędu średniokwadratowego (RMSE)9 określa jakość dopasowania i wskazuje, czy prędkość opadania jest ogólnie stała. Następnie oblicza się średnie prędkości pionowe dla każdego gatunku oraz dla martwych nicieni. Na podstawie tych wyników można oszacować siłę oporu, jakiej podlegają nicienie.
W ramach drugiej demonstracji naszej metody wybraliśmy osobniki C. elegans, które w przeciwieństwie do większości obserwowanych nicieni nie opadały ze stałą prędkością. Wybrane nicienie albo zawracały i płynęły w górę, albo zawisały w toni na pewien czas przed kontynuowaniem opadania. Pod kątem fizycznym to studium przypadku pokazuje, że można obliczyć siłę ciągu płynącego mikroorganizmu. Prawa Newtona stanowią, że ciało zmieniające kierunek ruchu przyspiesza, co oznacza, że działa na nie wypadkowa siła, <img alt="Symbol wektora siły wypadkowej, równanie równowagi statycznej, koncepcja fizyczna." fo:content-width="0.3in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq.jpg" width="25" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Formula 1">10: 
<img alt="Równanie siły wypadkowej, F_net = dp/dt, ilustrujące drugą zasadę dynamiki Newtona, wzór fizyczny." fo:content-width="0.7in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq2.jpg" width="70" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Formula 2">     (2)
gdzie <img alt="Notacja wektorowa pędu, symbol \( \vec{p} \), w równaniach fizycznych." fo:content-width="0.1in" src="/files/ftp_upload/51424/51424p.jpg" width="10" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="p"> oznacza pęd liniowy, a t to czas. Przyspieszenie dżdżownicy jest wprost proporcjonalne do siły działającej na dżdżownicę, ponieważ jej masa pozostaje stała. W rezultacie wypadkowa siła w pionie wynosi: 
<img alt="Równanie drugiej zasady dynamiki Newtona, Fy=may, ilustrujące równowagę dynamiczną w formule fizycznej." fo:content-width=".8in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq3.jpg" width="70" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Formula 3"> (3)
gdzie m oznacza masę dżdżownicy, a ay reprezentuje przyspieszenie w pionie. Siła wypadkowa w kierunku pionowym stanowi zatem siłę ciągu dżdżownicy w tym samym kierunku. Całkowity ciąg można obliczyć, uwzględniając składową poziomą.

<table><tbody><tr><td>Przestrajalny laser helowo-neonowy&nbsp;</td><td>Elektrooptyka badawcza</td><td>30602</td><td>Można wybrać cztery długości fal od 543 nm do 633 nm.</td></tr><tr><td>2 Aluminiowe lusterka na przedniej powierzchni</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-F01</td><td></td></tr><tr><td>Szybka kamera Exilim Casio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuweta kwarcowa</td><td>Starna Cells</td><td>21/G/5</td><td></td></tr><tr><td>LoggerPro (oprogramowanie)</td><td>Noniusz</td><td></td><td>http://www.vernier.com/products/software/lp/</td></tr> <tr><td>Mathematica 8</td><td>Wolfram</td><td></td><td>http://www.wolfram.com/</td></tr><tr><td>5x-10x zmienny zoom Ekspander wiązki Galileusza</td><td>Thorlabs</td><td>BE05-10-A</td><td></td></tr><tr><td>Plano-wypukły obiektyw o dodatniej ogniskowej 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1257</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie cieni o pojedynczej długości fali lokomocji caenorhabditis elegans, w tym oszacowania siły

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

To badanie demonstruje tanią i prostą technikę, która pozwala na pomiar właściwości fizycznych, takich jak pozycja, prędkość, przyspieszenie i siły związane z zachowaniem lokomotorycznym nicieni zawieszonych w słupie wody w odpowiedzi na pojedyncze długości fal światła. Pokazujemy, jak ocenić lokomocję mikroskopijnego organizmu za pomocą obrazowania cienia o pojedynczej długości fali (SWSI) na dwóch różnych przykładach.
Pierwszy przykład to systematyczne i statystycznie opłacalne badanie średniego spadku C. elegans w słupie wody. Do tego badania wykorzystaliśmy żywe i martwe dzikie typy C. elegans. Kiedy porównaliśmy prędkość i kierunek aktywnego ruchu nicieni z biernym opadaniem martwych robaków w polu grawitacyjnym, badanie to nie wykazało różnicy w czasie opadania. Średnie opadanie wynosiło 1,5 mm/s ± 0,1 mm/s zarówno dla żywych, jak i martwych robaków przy użyciu spójnego światła 633 nm.
Drugi przykład to studium przypadku wybranych pojedynczych C. elegans zmieniających kierunek podczas opadania w pionowym słupie wody. Przyspieszenie i siła są analizowane w tym przykładzie. To studium przypadku pokazuje zakres innych właściwości fizycznych, które można ocenić za pomocą SWSI, jednocześnie oceniając zachowanie przy użyciu pojedynczych długości fal w środowisku, które nie jest dostępne dla tradycyjnych mikroskopów. Korzystając z tej analizy, oszacowaliśmy, że pojedynczy nicień jest zdolny do pchania z siłą przekraczającą 28 nN.
Nasze odkrycia wskazują, że żywe nicienie wywierają 28 nN, gdy skręcają, czyli poruszają się w kierunku przeciwnym do pola grawitacyjnego. Odkrycia sugerują ponadto, że nicienie pasywnie opadają w słupie wody, ale mogą aktywnie opierać się sile grawitacji, głównie poprzez kierunek skrętu.

Równomierne opadanie
Pierwsze badanie nie wykazuje zauważalnej różnicy w prędkościach opadania C. elegans podczas SWSI przy użyciu 633 nm. Stwierdzono, że prędkości opadania były stałe i wynosiły 1,5 mm/sec ± 0,1 mm/sec zarówno dla żywych, jak i martwych C. elegans. Próba 50 osobników pozwoliła uzyskać rozsądną wariancję na poziomie 7% dla nicieni żywych i martwych. Na nicienie nie działa przyspieszenie, ponieważ prędkość opadania jest stała, zatem siła oporu jest równa sile grawitacji pomniejszonej o siłę wyporu. Implikuje to, że gęstość nicienia jest nieco większa niż gęstość wody; niemniej jednak, dla poniższych szacunków nadal praktyczne jest założenie, że gęstość nematody jest w przybliżeniu równa gęstości wody.
Zmiana kierunku
Drugie badanie, będące studium przypadku, wykazuje, że nicienie są zdolne do zmiany kierunku i mogą płynąć w górę przeciwko grawitacji. Do pionowego przemieszczenia nicienia dopasowano dwie krzywe w taki sposób, aby drugie pochodne tych krzywych mogły zostać wykorzystane do wykreślenia zależności przyspieszenia od czasu (Rysunek 5). Zaleca się utrzymywanie możliwie niskiego stopnia wielomianu przy jednoczesnym zachowaniu dobrego dopasowania. Niższy stopień wielomianu oznacza mniejszą zmienność przyspieszenia w czasie. Wyższe stopnie składników wielomianowych będą pomijalne, a zatem niepotrzebne, jeśli stopień wielomianu będzie zbyt wysoki. Ten osobnik zwalnia ze stałą prędkością 0,110 mm/sec2 ± 0,002 mm/sec2, zawraca i przyspiesza z taką samą prędkością 0,110 mm/sec2 ± 0,002 mm/sec2 aż do momentu niedługo po punkcie zwrotnym. C. elegans kontynuuje ruch w górę ze zmniejszającym się przyspieszeniem wynoszącym 1,252 - 0,00708 t w mm/sec2, aż do spadku przyspieszenia do zera. Biorąc pod uwagę Równanie 3 oraz szacowaną masę nicienia wynoszącą 3 μg, na nicienia działa wypadkowa siła pionowa, FNy, o wartości 0,33 pN aż do momentu niedługo po punkcie zwrotnym.
Zstępowanie: Na dżdżownicę do momentu osiągnięcia punktu zwrotnego działają trzy rodzaje sił: grawitacja, opór, wyporność i siła napędowa (Rycina 6a). Siła wypadkowa jest równa sumie wektorowej tych trzech sił. Tutaj rozważamy wyłącznie składowe pionowe: 
FNy = FDy+FTy-Fg+FB     (4)
gdzie FB jest siłą wyporu. Fg ma taką samą wartość, ale przeciwny kierunek co siła wyporu, zakładając, że gęstość dżdżownicy jest równa gęstości wody. Równanie 4 można zatem zapisać w następujący sposób: 
FNy = FDy+FTy     (5)
FNy pozostaje stałe podczas opadania. Oznacza to, że suma FDy+FTy pozostaje stała, dopóki nicień nie dotrze do punktu zwrotnego. FDy jest największe na górze, czyli na początku ścieżki, i stopniowo zmniejsza się do zera, aż prędkość osiągnie zero w punkcie zwrotnym, podczas gdy FTy musi wzrosnąć, aby utrzymać stałą wartość FNy.
Punkt zwrotny: W punkcie zwrotnym w kierunku pionowym nie występuje siła oporu, ponieważ prędkość pionowa w tym punkcie wynosi zero. Jedynymi siłami działającymi w kierunku pionowym są grawitacja, -Fg, siła wyporu, FB oraz pionowa siła ciągu nicienia, FTy, jak przedstawiono na Rysunku 6b. W tym punkcie można wyznaczyć siłę ciągu C. elegans: 
FTy = FNy  (6)
Siła ciągu na dole trajektorii wynosi wówczas w przybliżeniu 0,33 pN, co stanowi około 0,001% masy nicienia. Biorąc pod uwagę, że szacowany ciężar Fg C. elegans wynosi 28 nN,
Wznoszenie: Podobnie, podczas wznoszenia siła oporu wzrasta, ale jest skierowana w dół (Rysunek 6c): 
FNy = -FDy+FTy(7)
Siła ciągu wywierana przez dżdżownicę musi teraz być jeszcze większa i równać się sumie siły oporu i ciężaru. Dżdżownica zwalnia po rozpoczęciu płynięcia w górę. Aby płynąć w górę z taką samą prędkością, z jaką dżdżownica opadała, musiałaby ona wywrzeć siłę ciągu w górę wynoszącą co najmniej dwa razy jej ciężar.
Lewitacja
Przykład nicienia, który spowalnia swoje opadanie przez około 3 sec, przedstawiono na Rysunku 7. Wielomian 3ego stopnia stanowi odpowiednie dopasowanie do całej ścieżki. Błędy przyspieszenia i prędkości wynikające z tego dopasowania są mniejsze niż 15%. Nicień zaczyna od znacznego pchnięcia w górę, zwalnia i zaczyna zawracać w 68 sec; jednak przyspieszenie w górę stale maleje (Rysunek 8) do momentu, gdy wypadkowe przyspieszenie zrówna się z zerem około 68,5 sec. Prowadzi to ostatecznie do wypadkowego przyspieszenia w kierunku w dół, po którym następuje kolejny punkt zerowy prędkości (Rysunek 9) i w 69 sec nicień ponownie zaczyna opadać.
Interesujące jest to, że maksymalne zaobserwowane przyspieszenie pionowe w tym przypadku wynosi 2,7 mm/sec2. Przyspieszenia w punktach zwrotnych wynoszą odpowiednio 0,455 mm/sec2 oraz - 0,455 mm/sec2, co jest wartością około czterokrotnie większą niż w przypadku nicienia, który odwraca się i płynie w górę. Korzystając z równania 6, można oszacować, że siła ciągu skierowana w górę w pierwszym punkcie zwrotnym wynosi około 1,32 pN. W drugim punkcie zwrotnym wypadkowe przyspieszenie jest ujemne, zatem siła ciągu w górę wynosi 1,32 pN.
<img alt="Schemat ustawienia lasera: rozszerzacz wiązki, kuweta; badanie optyczne, spektroskopia laserowa, analiza fotoniczna." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Układ doświadczalny. Laser, rozszerzacz wiązki, soczewka i ekran są kluczowe dla układu doświadczalnego. Lustra kierujące i otwory pinowe mogą zostać pominięte, jednak spowoduje to mniejszą stabilnośćy wyrównania optycznego.
<img alt="Wzór interferencyjny, zielony laser, schemat optyczny, zniekształcenie czoła fali, znacznik strzałki w górę." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Obraz cienia o pojedynczej długości fali (SWSI). Przy użyciu światła laserowego o mocy 2 mW i długości fali 543 nm cień nicznia zostaje rzutowany na ekran. Obraz jest odwrócony, przez co niczeń wydaje się spadać w górę.
<img alt="wykres analizy regresji liniowej; dane czasu względem przemieszczenia pionowego z wstawkami nachylenia i korelacji" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Pionowe opadanie pojedynczego dzikiego typu C. elegans w kolumnie wody. Ten nicień był oświetlony spójnym światłem o długości fali 633 nm. Nachylenie dopasowania liniowego wskazuje na prędkość opadania wynoszącą 1.09 mm/sec ± 0.01 mm/sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres analizy ruchu oscylacyjnego; przemieszczenie pionowe w funkcji czasu z równaniami dopasowania krzywej." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Wykres przemieszczenia pojedynczego osobnika typu dzikiego C. elegans płynącego w górę. Dwa dopasowania metodą splajnów śledzą całkowitą ścieżkę nicienia. Druga pochodna dopasowania ujawnia przyspieszenie. Maksymalne przyspieszenie można łatwo wyznaczyć z pierwszego dopasowania: 0,110 mm/sec2 ± 0,002 mm/sec2. Wyświetlono tylko kilka słupków błędów, aby punkty danych i dopasowanie pozostały widoczne. Nicień ten był oświetlony spójnym światłem o długości fali 633 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig4highres.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres przyspieszenia pionowego w funkcji czasu; równania a=0,11, a=-0,00708t+1,252; analiza danych." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Wykres przyspieszenia pojedynczego osobnika dzikiego typu C. elegans. Ten nicień utrzymuje stałe przyspieszenie skierowane w górę o wartości 0,110 mm/sec2 ± 0,002 mm/sec2, co powoduje jego zwolnienie, a następnie ruch w górę. Krótko po punkcie zwrotnym przyspieszenie stale maleje, a wypadkowe przyspieszenie zmniejsza się do zera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig5highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat równowagi statycznej z wektorami sił: ΣFy=0, składowe FNy, FTy, FDy." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Diagramy sił dla fazy opadania, punktu zwrotnego i fazy wznoszenia. Siła wyporu i siła grawitacji mają taką samą wartość i przeciwne kierunki, zatem ich działanie znosi się wzajemnie. Z tego powodu nie zostały one naniesione na tych diagramach. (a) Robak opada, przy czym siła oporu i siła ciągu są skierowane w górę. (b) Robak znajduje się w najniższym punkcie trajektorii, bez siły oporu. Siła ciągu jest skierowana w górę. (c) Robak wznosi się, przy czym siła oporu jest skierowana w dół, a siła ciągu w górę.
<img alt="Przemieszczenie w pionie względem czasu; wykres z dopasowaniem krzywej; analiza danych; słupki błędów; wykres naukowy." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 7"> 
Rysunek 7. Wykres przemieszczenia pojedynczego zawisłego nicienia. Nicień zwalnia i zaczyna zawracać około 68 s, ale zaczyna opadać około 69 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig7highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres przyspieszenia pionowego w funkcji czasu, ay=0 w 68,5s, schemat analizy ruchu." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8. Wykres przyspieszenia pojedynczego zawisającego nicienia. Nicień ten rozpoczyna ruch z przyspieszeniem skierowanym w górę wynoszącym 2,7 mm/sec2, które następnie spada do zera, aż w końcu osiąga przyspieszenie skierowane w dół o wartości -2,6 mm/sec2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig8highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres ruchu parabolicznego; vy=0 w 68s, 69s; prędkość pionowa w funkcji czasu; analiza rzutu." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9. Wykres prędkości pojedynczego zawieszonego nicienia. Nicień ten zatrzymuje się w 68 s i zaczyna poruszać się w górę, zwalnia i osiąga prędkość zero w kierunku pionowym w 69 s, po czym następuje opadanie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig9highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Tabela danych dotyczących prędkości pionowej; porównanie próbek żywych i martwych wraz ze średnimi i wariancją." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424table1.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Średnie prędkości opadania N2 C. elegans. Śledzono opadanie 50 żywych i 50 martwych nicieni. Średnia prędkość opadania była taka sama dla osobników żywych i martwych: 1.5 mm/sec ± 0.1 mm/sec.

Przedstawiona tutaj technika mierzy ścieżkę swobodnie pływających mikroskopijnych gatunków za pomocą ekspozycji na pojedynczej długości fali. C. elegans są używane do demonstracji obrazowania cieni jako niedrogiej alternatywy dla kosztownych mikroskopów. Technikę tę można dostosować do różnych orientacji, środowisk i gatunków w celu pomiaru kierunku, prędkości, przyspieszenia i sił.

Obrazowanie cieni o pojedynczej długości fali lokomocji Caenorhabditis elegans, w tym oszacowania siły

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar i ocena prędkości przemieszczania się w pionie oraz sił wywieranych przez swobodnie pływającego nicienia przy użyciu spójnego promieniowania monochromatycznego. W tym celu w pierwszej kolejności przygotowuje się układ do eksperymentu cieniowego z wykorzystaniem spójnego promieniowania monochromatycznego dla swobodnie pływającego *C. elegans*. Następnie pojedynczy dorosły osobnik *C. elegans* jest umieszczany w komorze obserwacyjnej układu eksperymentu cieniowego, która znajduje się w...Cień nicienia podczas opadania przez wiązkę lasera jest rejestrowany w formie filmu, który następnie służy do analizy ruchu zwierzęcia. W ten sposób wyznaczana jest trajektoria swobodnie pływającego nicienia oraz generowane z nią siły. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjna mikroskopia w płaszczyźnie poziomej, jest możliwość badania ruchu swobodnie pływających mikroorganizmów przy użyciu szerokiego zakresu światła monochromatycznego i niskim koszcie.Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące sił generowanych przez nicienie lub sił, na które nicienie reagują w środowisku ciekłym. Pomysł na tę metodę pojawił się po raz pierwszy, gdy zaczęliśmy badać kwestię ruchu pionowego gatunków mikroskopijnych. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ kroki proceduralne są trudne do opanowania, a poprawne ustawienie laserów wymaga praktyki.Ponadto konieczne jest spędzenie pewnego czasu w laboratorium biologicznym, aby nauczyć się przygotowywać nicienie. Zmontuj układ eksperymentalny do tworzenia obrazów cieniowych. Użyj dwóch lub więcej luster, aby skierować wiązkę lasera helowo-neonowego do galileuszowego rozszerzacza wiązki, gdzie jej średnica powinna zwiększyć się do 12 milimetrów. Umieść jeden lub dwa otwory w torze wiązki, aby zapewnić jej odpowiednie wyrównanie po wyjściu z rozszerzacza.Skieruj wiązkę na zamontowany kwarcowy Q-switch. Po przejściu wiązki, Q-switch powiększa ją za pomocą soczewki plano-konweks o dodatkowej ogniskowej 75 mm. Następnie umieść ekran w odległości około 120 cm od soczewki, co stanowi optymalną odległość rozdzielczości.Ustaw kamerę wysokich prędkości w taki sposób, aby mogła obrazować ekran, na przykład obok urządzenia Q vet. W pobliżu qve powinien znajdować się również stereomikroskop do wybierania nicieni. Tymczasowo przymocuj przezroczną linijkę z podziałką milimetrową do środka uchwytu QVAD na ekranie, blisko krawędzi pola widzenia kamery.Użyj linii linijki, aby zaznaczyć odległość skali dla jednego milimetra. Powtórz tę czynność dla każdej użytej długości fali, ponieważ refrakcja będzie się różnić ze względu na aberracje chromatyczne w QV oraz zmiany powiększenia, o których wspomniano wcześniej. W JoVE przygotuj młode dorosłe nicienie do qve.Należy również przygotować nicienie zabite poprzez ekspozycję na chloroform. Rozpocznij od napełnienia Q Vet wodą destylowaną do poziomu jednego milimetra od krawędzi. Uruchom nagrywanie przy włączonym oświetleniu pomieszczenia, aby linia na ekranie była początkowo widoczna, a następnie wyłącz światła w pomieszczeniu.Następnie należy zebrać nicienia za pomocą platynowej igły. Ważne jest, aby umieścić organizmy w naczyniu, delikatnie dotykając powierzchni wody igłą, tak aby nie wzbudzać medium. Obraz rzutowany nicienia oraz słupa wody jest odwrócony.Robaki opadające pod wpływem grawitacji będą sprawiać wrażenie, że poruszają się w górę ekranu. Dla każdego robaka należy zarejestrować około 20 sekund nagrania i sfilmować około 50 robaków dla każdej z warunków. Najpierw zaimportuj wideo do programu do analizy obrazu.Ustaw skalę, korzystając z oznaczeń długości w filmie, aby określić stopień powiększenia. Następnie rozpocznij śledzenie liniowego przemieszczenia głowy zacienionego nicienia. Wybierz co najmniej 10 punktów danych na przebytej drodze, mniej więcej co 0,3 sekundy.Prędkość pionowa jest następnie obliczana poprzez podzielenie pochodnej przez czynnik powiększenia. Kluczowe jest stworzenie oddzielnych krzywych dla przemieszczenia poziomego i pionowego, ponieważ grawitacja działa wyłącznie w kierunku pionowym.Jeśli punkty danych tworzą w przybliżeniu linię prostą, tor jest liniowy. Można pominąć niewielkie odchylenia ruchu głowy. Następnie, z menu analizy, należy utworzyć linię regresji liniowej poprzez dopasowanie linii prostej do danych.Nachylenie linii odpowiada prędkości pionowej dżdżownicy. Jeśli dżdżownica porusza się nieliniowo, należy wybrać opcję dopasowania krzywej (curve fit) z menu analizy. Następnie należy dopasować krzywą do wielomianu drugiego lub trzeciego stopnia.Wielomian dla każdej krzywej na ścieżce dopasowuje krzywą do danych. Przesuwając nawiasy po obu stronach wykresu, wyświetlany jest zapis matematyczny krzywej. Dopuszczalny błąd względny wynosi tutaj do 15%.W razie potrzeby dodaj dodatkowe krzywe, aby objąć wszystkie punkty danych, i spróbuj zastosować funkcje typu spline. Dopasowania krzywych powinny mieć ten sam nachylenie w miejscach ich nakładania się. Pierwsza i druga pochodna krzywej określają prędkość i przyspieszenie.Siłę ciągu obliczono, przyjmując masę nicienia podczas dryfu jako 3 µg; nie stwierdzono wyraźnej różnicy w prędkościach opadania żywych i martwych osobników. Szybkość dryfu w dół dla obu grup wynosiła 1,5 mm/s. Jednak żywe nicienie są zdolne do zmiany kierunku i pływania przeciwko grawitacji; do pionowego przemieszczenia nicienia dopasowano krzywe, a przyspieszenie obliczono z ich drugiej pochodnej.Siłami działającymi na dżdżownicę do momentu osiągnięcia przez nią punktu zawrócenia są grawitacja, opór hydrodynamiczny, wyporność oraz siła ciągu. Siła wypadkowa jest równa ich sumie wektorowej. Rozważmy pionowe składowe sił.Siła grawitacji jest równa wartością sile wyporu, przy założeniu, że gęstość dżdżownicy jest zbliżona do gęstości wody, zatem równanie można uprościć aż do momentu punktu zwrotnego. Opór oraz siła ciągu są stałe. Opór jest początkowo większy, ale stopniowo zmniejsza się do zera, podczas gdy siła ciągu wzrasta w punkcie zwrotnym; w trakcie ruchu dżdżownicy nie występuje pionowy opór, a siła ciągu jest skierowana w górę.Opór podczas wznoszenia pionowego wzrasta w kierunku w dół, zatem siła ciągu musi być większa od sumy oporu i ciężaru. Przeanalizowano nieliniową ścieżkę tego nicienia. Zmieniał on kierunki ruchu.Analizując przemieszczenie, można zauważyć, że obiekt zwolnił i zaczął zawracać w 68 sekundzie. Jednak przyspieszenie w górę stale malało, aż wypadkowe przyspieszenie osiągnęło zero w 68,5 sekundzie. Następnie obiekt zaczął przyspieszać w kierunku ujemnym, aby ponownie opaść.Zatem w momencie, gdy prędkość wynosiła zero, robak generował znaczną siłę ciągu w górę, obliczoną na 1,32 pN. Po opanowaniu tej metody dane można zebrać w ciągu 10 minut, pod warunkiem że robaki są gotowe do pobrania z świdra. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o utrzymaniu stałej częstotliwości rejestracji obrazu dla wszystkich pobieranych danych, ponieważ w programie do analizy wideo należy odpowiednio dostosować liczbę klatek na sekundę zgodnie z tą procedurą. Można przeprowadzić również inne badania, takie jak badania przy pojedynczej długości fali, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące sił działających w różnych kierunkach, zarówno w pionie, jak i w poziomie.Na przykład ta technika optyczna mogłaby zostać wykorzystana przez innych biologów zainteresowanych właściwościami lokomocyjnymi małych organizmów, takich jak pierwotniaki czy inna fauna wodna. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dość dobre pojęcie o tym, jak analizować ruch swobodnie pływających mikroorganizmów, wykorzystując powiększenie obrazów cieni, a następnie program do analizy wideo.

single-wavelength-shadow-imaging-caenorhabditis-elegans-locomotion

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Jednofalcowy system cieniowania obrazowania Caenorhabditis elegans obejmujący oszacowanie sił lokomocji

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Opracowaliśmy system mikroskopu śledzącego w czasie rzeczywistym, który umożliwia rejestrację i kwantyfikację zachowania C. elegans z wysoką rozdzielczością i przy dużych prędkościach. Opracowaliśmy również metody obliczeniowe pozwalające na redukcję wymiarowości obrazów nicieni do podstawowego zestawu pomiarów, które w pełni opisują kształt organizmu.

Śledzenie i pomiar zachowania C. elegans

Mikroskopijne organizmy, takie jak wolno pływający nicień C. elegans, żyją i zachowują się w złożonym trójwymiarowym środowisku. Przedstawiamy nowatorskie podejście umożliwiające analizę C. elegans z wykorzystaniem wzorów dyfrakcyjnych. Metoda ta polega na śledzeniu periodyczności czasowej wzorów dyfrakcyjnych generowanych poprzez kierowanie wiązki lasera przez kuwetę.

Ilościowe badanie lokomocji swobodnie pływających mikroorganizmów z wykorzystaniem dyfrakcji laserowej

Ten film opisuje użycie oprogramowania do nagrywania ruchu robaków na arenie. Przykładowy protokół mierzy wpływ ekspozycji na etanol na poruszanie się robaków.

C. elegans (C. elegans) Śledzenie ruchu: metoda oceny lokomocji u robaków

Opisano półautomatyczną metodę mikro-elektro-fluidyczną do wywoływania lokomocji na żądanie u Caenorhabditis elegans. Metoda ta opiera się na neurofizjologicznym zjawisku robaków reagujących na łagodne pola elektryczne ("elektrotaksję") wewnątrz kanałów mikroprzepływowych. Elektrotaksja mikroprzepływowa służy jako szybka, czuła, tania i skalowalna technika badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na zdrowie neuronów.

Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

FIM to nowatorski, ekonomiczny system obrazowania przeznaczony do śledzenia małych poruszających się obiektów, takich jak C. elegans, planaria czy larwy Drosophila. Towarzyszący mu program FIMTrack został zaprojektowany tak, aby zapewnić szybką i wydajną analizę danych. Razem narzędzia te umożliwiają wysokoprzepustową analizę cech behawioralnych.

FIM Imaging i FIMtrack: dwa nowe narzędzia umożliwiające wysokowydajną i ekonomiczną analizę lokomocji

Ten manuskrypt opisuje, jak rozróżniać różne nicienie za pomocą sygnatur dyfrakcyjnych dalekiego pola. Porównujemy lokomocję 139 dzikich i 108 "rolkowych" C. elegans, uśredniając częstotliwości związane z czasową sygnaturą dyfrakcyjną Fraunhofera w jednym miejscu za pomocą lasera o fali ciągłej.

Analiza dyfrakcyjna oparta na Fourierze żywych Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

Ten artykuł opisuje prostą, tanią metodę rejestrowania zachowania Caenorhabditis elegans polegającego na unikaniu trawnika, przy użyciu łatwo dostępnych przedmiotów, takich jak smartfon i kaseton świetlny z diodą elektroluminescencyjną (LED). Udostępniamy również skrypt w języku Python do przetwarzania pliku wideo do formatu bardziej podatnego na zliczanie.

Metoda obrazowania oparta na smartfonach do oznaczania unikania trawników C. elegans

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Badanie to analizuje wpływ wieku na lokomocję u C. elegans poprzez pomiar największego wykładnika Lyapunova (LLE). Wraz z wiekiem C. elegans wykazują wzrost i późniejszy spadek kontroli motorycznej. Wyniki pokazują szczyt LLE po pięciu dniach, a następnie spadek wraz z wiekiem robaków.

Wiekowa dynamika lokomocji u Caenorhabditis elegans: analiza wykładnika Lyapunova

Poznaj technikę obrazowania cieni z wykorzystaniem spójnego promieniowania monochromatycznego do pomiaru prędkości i sił działających na swobodnie pływające nicienie Caenorhabditis elegans. Metoda oferuje niskokosztową alternatywę dla tradycyjnej mikroskopii w badaniach biomechaniki mikroorganizmów.

Obrazowanie cieni o pojedynczej długości fali lokomocji Caenorhabditis elegans, w tym oszacowania siły

Przeglądaj więcej filmów