Obrazowanie cieni o pojedynczej długości fali lokomocji Caenorhabditis elegans, w tym oszacowania siły

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar i ocena prędkości przemieszczania się w pionie oraz sił wywieranych przez swobodnie pływającego nicienia przy użyciu spójnego promieniowania monochromatycznego. W tym celu w pierwszej kolejności przygotowuje się układ do eksperymentu cieniowego z wykorzystaniem spójnego promieniowania monochromatycznego dla swobodnie pływającego *C. elegans*. Następnie pojedynczy dorosły osobnik *C. elegans* jest umieszczany w komorze obserwacyjnej układu eksperymentu cieniowego, która znajduje się w...

Cień nicienia podczas opadania przez wiązkę lasera jest rejestrowany w formie filmu, który następnie służy do analizy ruchu zwierzęcia. W ten sposób wyznaczana jest trajektoria swobodnie pływającego nicienia oraz generowane z nią siły. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjna mikroskopia w płaszczyźnie poziomej, jest możliwość badania ruchu swobodnie pływających mikroorganizmów przy użyciu szerokiego zakresu światła monochromatycznego i niskim koszcie.

Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące sił generowanych przez nicienie lub sił, na które nicienie reagują w środowisku ciekłym. Pomysł na tę metodę pojawił się po raz pierwszy, gdy zaczęliśmy badać kwestię ruchu pionowego gatunków mikroskopijnych. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ kroki proceduralne są trudne do opanowania, a poprawne ustawienie laserów wymaga praktyki.

Ponadto konieczne jest spędzenie pewnego czasu w laboratorium biologicznym, aby nauczyć się przygotowywać nicienie. Zmontuj układ eksperymentalny do tworzenia obrazów cieniowych. Użyj dwóch lub więcej luster, aby skierować wiązkę lasera helowo-neonowego do galileuszowego rozszerzacza wiązki, gdzie jej średnica powinna zwiększyć się do 12 milimetrów. Umieść jeden lub dwa otwory w torze wiązki, aby zapewnić jej odpowiednie wyrównanie po wyjściu z rozszerzacza.

Skieruj wiązkę na zamontowany kwarcowy Q-switch. Po przejściu wiązki, Q-switch powiększa ją za pomocą soczewki plano-konweks o dodatkowej ogniskowej 75 mm. Następnie umieść ekran w odległości około 120 cm od soczewki, co stanowi optymalną odległość rozdzielczości.

Ustaw kamerę wysokich prędkości w taki sposób, aby mogła obrazować ekran, na przykład obok urządzenia Q vet. W pobliżu qve powinien znajdować się również stereomikroskop do wybierania nicieni. Tymczasowo przymocuj przezroczną linijkę z podziałką milimetrową do środka uchwytu QVAD na ekranie, blisko krawędzi pola widzenia kamery.

Użyj linii linijki, aby zaznaczyć odległość skali dla jednego milimetra. Powtórz tę czynność dla każdej użytej długości fali, ponieważ refrakcja będzie się różnić ze względu na aberracje chromatyczne w QV oraz zmiany powiększenia, o których wspomniano wcześniej. W JoVE przygotuj młode dorosłe nicienie do qve.

Należy również przygotować nicienie zabite poprzez ekspozycję na chloroform. Rozpocznij od napełnienia Q Vet wodą destylowaną do poziomu jednego milimetra od krawędzi. Uruchom nagrywanie przy włączonym oświetleniu pomieszczenia, aby linia na ekranie była początkowo widoczna, a następnie wyłącz światła w pomieszczeniu.

Następnie należy zebrać nicienia za pomocą platynowej igły. Ważne jest, aby umieścić organizmy w naczyniu, delikatnie dotykając powierzchni wody igłą, tak aby nie wzbudzać medium. Obraz rzutowany nicienia oraz słupa wody jest odwrócony.

Robaki opadające pod wpływem grawitacji będą sprawiać wrażenie, że poruszają się w górę ekranu. Dla każdego robaka należy zarejestrować około 20 sekund nagrania i sfilmować około 50 robaków dla każdej z warunków. Najpierw zaimportuj wideo do programu do analizy obrazu.

Ustaw skalę, korzystając z oznaczeń długości w filmie, aby określić stopień powiększenia. Następnie rozpocznij śledzenie liniowego przemieszczenia głowy zacienionego nicienia. Wybierz co najmniej 10 punktów danych na przebytej drodze, mniej więcej co 0,3 sekundy.

Prędkość pionowa jest następnie obliczana poprzez podzielenie pochodnej przez czynnik powiększenia. Kluczowe jest stworzenie oddzielnych krzywych dla przemieszczenia poziomego i pionowego, ponieważ grawitacja działa wyłącznie w kierunku pionowym.

Jeśli punkty danych tworzą w przybliżeniu linię prostą, tor jest liniowy. Można pominąć niewielkie odchylenia ruchu głowy. Następnie, z menu analizy, należy utworzyć linię regresji liniowej poprzez dopasowanie linii prostej do danych.

Nachylenie linii odpowiada prędkości pionowej dżdżownicy. Jeśli dżdżownica porusza się nieliniowo, należy wybrać opcję dopasowania krzywej (curve fit) z menu analizy. Następnie należy dopasować krzywą do wielomianu drugiego lub trzeciego stopnia.

Wielomian dla każdej krzywej na ścieżce dopasowuje krzywą do danych. Przesuwając nawiasy po obu stronach wykresu, wyświetlany jest zapis matematyczny krzywej. Dopuszczalny błąd względny wynosi tutaj do 15%.

W razie potrzeby dodaj dodatkowe krzywe, aby objąć wszystkie punkty danych, i spróbuj zastosować funkcje typu spline. Dopasowania krzywych powinny mieć ten sam nachylenie w miejscach ich nakładania się. Pierwsza i druga pochodna krzywej określają prędkość i przyspieszenie.

Siłę ciągu obliczono, przyjmując masę nicienia podczas dryfu jako 3 µg; nie stwierdzono wyraźnej różnicy w prędkościach opadania żywych i martwych osobników. Szybkość dryfu w dół dla obu grup wynosiła 1,5 mm/s. Jednak żywe nicienie są zdolne do zmiany kierunku i pływania przeciwko grawitacji; do pionowego przemieszczenia nicienia dopasowano krzywe, a przyspieszenie obliczono z ich drugiej pochodnej.

Siłami działającymi na dżdżownicę do momentu osiągnięcia przez nią punktu zawrócenia są grawitacja, opór hydrodynamiczny, wyporność oraz siła ciągu. Siła wypadkowa jest równa ich sumie wektorowej. Rozważmy pionowe składowe sił.

Siła grawitacji jest równa wartością sile wyporu, przy założeniu, że gęstość dżdżownicy jest zbliżona do gęstości wody, zatem równanie można uprościć aż do momentu punktu zwrotnego. Opór oraz siła ciągu są stałe. Opór jest początkowo większy, ale stopniowo zmniejsza się do zera, podczas gdy siła ciągu wzrasta w punkcie zwrotnym; w trakcie ruchu dżdżownicy nie występuje pionowy opór, a siła ciągu jest skierowana w górę.

Opór podczas wznoszenia pionowego wzrasta w kierunku w dół, zatem siła ciągu musi być większa od sumy oporu i ciężaru. Przeanalizowano nieliniową ścieżkę tego nicienia. Zmieniał on kierunki ruchu.

Analizując przemieszczenie, można zauważyć, że obiekt zwolnił i zaczął zawracać w 68 sekundzie. Jednak przyspieszenie w górę stale malało, aż wypadkowe przyspieszenie osiągnęło zero w 68,5 sekundzie. Następnie obiekt zaczął przyspieszać w kierunku ujemnym, aby ponownie opaść.

Zatem w momencie, gdy prędkość wynosiła zero, robak generował znaczną siłę ciągu w górę, obliczoną na 1,32 pN. Po opanowaniu tej metody dane można zebrać w ciągu 10 minut, pod warunkiem że robaki są gotowe do pobrania z świdra. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o utrzymaniu stałej częstotliwości rejestracji obrazu dla wszystkich pobieranych danych, ponieważ w programie do analizy wideo należy odpowiednio dostosować liczbę klatek na sekundę zgodnie z tą procedurą. Można przeprowadzić również inne badania, takie jak badania przy pojedynczej długości fali, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące sił działających w różnych kierunkach, zarówno w pionie, jak i w poziomie.

Na przykład ta technika optyczna mogłaby zostać wykorzystana przez innych biologów zainteresowanych właściwościami lokomocyjnymi małych organizmów, takich jak pierwotniaki czy inna fauna wodna. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dość dobre pojęcie o tym, jak analizować ruch swobodnie pływających mikroorganizmów, wykorzystując powiększenie obrazów cieni, a następnie program do analizy wideo.