Name: RNAscope do wykrywania in situ transkrypcyjnie aktywnego wirusa brodawczaka ludzkiego w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj technikę RNAscope do wykrywania mRNA wirusa HPV E6/E7 w nowotworach głowy i szyi. Metoda umożliwia wizualizację pojedynczych cząsteczek RNA w tkankach utrwalonych formaliną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Częściowo wspierane przez grant NIH (R43/44CA122444) i grant DOD BRCP (W81XWH-06-1-0682) dla YL.

1. Próbka, sprzęt i przygotowanie odczynnika
<ol>
	<li>Pokrój próbkę tkanki na bloki o grubości 3-4 mm, utrwal w świeżej 10% neutralnie buforowanej formalinie przez 16-32 godziny w temperaturze pokojowej (25 °C) i zanurz w parafinie. Pociąć FFPE na odcinki o grubości 5±1 μm z bloków FFPE, zamontować sekcje na prowadnicach i wysuszyć na powietrzu. Uwaga: Szkiełka można przechowywać w temperaturze pokojowej w stanie wysuszenia do 3 miesięcy. Zamontowane szkiełka tkankowe należy piec w suchym pomieszczeniu w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę przed testem RNAscope.</li>
	<li>Rozgrzej piekarnik do hybrydyzacji do 40 °C. Umieść papier nawilżający na tacy kontroli wilgotności. Dodaj 50 mldH2Odo bibuły nawilżającej, aby całkowicie ją zwilżyć. Włóż przykrytą blachę do piekarnika, aby rozgrzać się przez co najmniej 30 minut przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować 700 ml 1x Roztwór do obróbki wstępnej 2 (10 nl, bufor cytrynianu pH 6), rozcieńczając 10 razy roztwór do obróbki wstępnej w dH2O. Podgrzej 1x roztwór do obróbki wstępnej 2 do wrzenia i utrzymuj temperaturę w zakresie 100-104 °C, zapobiegając przegotowaniu.</li>
	<li>Przygotować 3 l 1x bufor do płukania (0,1x SSC), rozcieńczając wstępnie podgrzany 50x bufor do płukania w dH2O.</li>
	<li>Przygotować 2 x 200 ml ksylenu i 2 x 200 ml 100% EtOH do odparafinowania pod wyciągiem.</li>
	<li>Przygotuj 50% roztwór do barwienia hematoksyliny i odczynnik do niebieszczenia (0,01% wody amoniakalnej) do barwienia po barwieniu pod wyciągiem.</li>
	<li>Przygotować 200 ml ksylenu, 200 ml 70% i 2 x 200 ml 100% EtOH do odwodnienia pod wyciągiem.</li>
	<li>Wstępnie rozgrzej sondy docelowe w temperaturze 40 °C przez 10 minut i doprowadź odczynnik RTU Detection Kit do temperatury pokojowej, w tym RTU Amp1, Amp2, Amp3, Amp4, Amp 5-Brown i Amp6-Brown, z wyjątkiem DAB Chromogen Brown-A i Brown-B.</li>
</ol>
2. Test RNAscope
Deparafinizacja i odwodnienie
Po upieczeniu, odparafinować skrawki tkanek w ksylenie przez 2 x 5 min z częstym mieszaniem, a następnie odwadniać w 100% EtOH przez 2 x 3 min z częstym mieszaniem. Suszyć na powietrzu przez 5 minut i narysować hydrofobową barierę wokół części tkanki za pomocą pisaka z barierą hydrofobową.
Zabiegi wstępne
<ol>
	<li>Inkubować skrawki tkanek za pomocą Pretreat 1 przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu wygaszenia endogennej aktywności peroksydazy, przepłukać w dH2O.</li>
	<li>Inkubować skrawki tkanek za pomocą Pretreat 2 utrzymywanego w temperaturze wrzenia przez 15 minut w celu pobrania RNA, płukać dwukrotnie w dH2O.</li>
	<li>Inkubować skrawki tkanek za pomocą Pretreat 3 przez 30 minut w temperaturze 40°C w celu trawienia białka w piecu HybEZ, płukać dwukrotnie w dH2O.</li>
</ol>
Hybrydyzacja sondy docelowej
Sondy docelowe HPV-HR 7 pula obejmują: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 i 58. Dodaj sondy HPV, ubikwitynę C (UBC) i sondy genowe dapB bakterii oddzielnie na trzy sąsiadujące ze sobą odcinki tkanki. Hybrydyzować w temperaturze 40 °C w piekarniku przez 2 godziny, a następnie płukać w 1x bufor do mycia przez 2 x 2 minuty w temperaturze pokojowej.
Wzmocnienie sygnału
<ol>
	<li>Inkubować skrawki tkanek za pomocą Amp1 (przedwzmacniacz) przez 30 minut w temperaturze 40 °C, Amp2 (reduktor tła) przez 15 minut w temperaturze 40 °C, Amp3 (wzmacniacz) przez 30 minut w temperaturze 40 °C i Amp4 (sonda etykietowa) przez 15 minut w temperaturze 40 °C w piecu HybEZ. Po każdym etapie hybrydyzacji płukać w 1x bufor do płukania przez 2 x 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować skrawki tkanek z Amp5 przez 30 minut i Amp6 przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po każdym etapie inkubacji płukać w 1x bufor do płukania przez 2 x 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Wykrywanie sygnału
Inkubuj skrawki tkanek z mieszanką 1:1 DAB, mieszając równą objętość Brown-A i Brown-B przez 10 minut w temperaturze RT, przepłukać dwukrotnie w dH2O.
Przeciwbarwienie
Plamić skrawki tkanek 50% roztworem Hematoksyliny przez 2 minuty w temperaturze RT, płukać dH2O, aż szkiełka będą czyste, podczas gdy tkanka pozostanie fioletowa. Zanurz się w 0,01% amoniaku wdH2O przez 5 razy, a następnie 5 zanurzeń w dH2O.
Montaż na suwaku
Odwodnić skrawki tkanek w 70%, 100% i 100% EtOH przez 2 minuty każdy, ksylen przez 5 minut, zamontuj za pomocą nośnika montażowego na bazie ksylenu.

<ol><li>Parkin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+health+burden+of+infection-associated+cancers+in+the+year+2002%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002.</a> Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).</li>
<li>Chaturvedi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+and+rising+oropharyngeal+cancer+incidence+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States.</a> J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).</li>
<li>Ang, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).</li>
<li>Smeets, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+algorithm+for+reliable+detection+of+human+papillomavirus+in+paraffin+embedded+head+and+neck+cancer+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen.</a> Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+regulation+of+NRG1+isoform+expression+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity.</a> J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).</li>
<li>Yan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+stem+cell+markers+Bmi1+and+Lgr5+identify+two+functionally+distinct+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 466-471 (2012).</li>
<li>Payne, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+circulating+tumour+cell+detection+using+multiplex+RNA+in+situ+hybridisation+predicts+progression-free+survival+in+metastatic+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Viable circulating tumour cell detection using multiplex RNA in situ hybridisation predicts progression-free survival in metastatic breast cancer patients.</a> Br. J. Cancer. 106 (11), 1790-1797 (2012).</li>
<li>Bordeaux, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+situ+measurement+of+estrogen+receptor+mRNA+predicts+response+to+tamoxifen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative in situ measurement of estrogen receptor mRNA predicts response to tamoxifen.</a> PLoS One. 7 (5), (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantitative+RNA+in+situ+hybridization+for+resolution+of+equivocal+and+heterogeneous+ERBB2+%28HER2%29+status+in+invasive+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma.</a> J. Mol. Diagn. 15 (2), 210-219 (2013).</li>
<li>Tubbs, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+RNA+in+situ+Hybridization+for+Detection+of+Restricted+Clonal+Expression+of+Low+Abundance+Immunoglobulin+Light+Chain+mRNA+in+B-Cell+Lymphoproliferative+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders.</a> Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).</li>
<li>Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. Jr. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-risk+human+papillomavirus+E6%2FE7+mRNA+detection+by+a+novel+in+situ+hybridization+assay+strongly+correlates+with+p16+expression+and+patient+outcomes+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).</li>
<li>Lewis, J. S. Jr., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptionally-active+high-risk+human+papillomavirus+is+rare+in+oral+cavity+and+laryngeal%2Fhypopharyngeal+squamous+cell+carcinomas--a+tissue+microarray+study+utilizing+E6%2FE7+mRNA+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization.</a> Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).</li>
<li>Lewis, J. S. Jr., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+p16+staining+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%3A+extent+and+pattern+correlate+with+human+papillomavirus+RNA+status%5BTitle%5D)+AND+%22Mod.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status.</a> Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).</li>
<li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+transcriptionally+active+high-risk+HPV+in+patients+with+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+as+visualized+by+a+novel+E6%2FE7+mRNA+in+situ+hybridization+method%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li>
<li>Schache AG,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+novel+diagnostic+standard+in+HPV-positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).</li>
<li>Mehrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papillary+Squamous+Cell+Carcinoma+of+the+Head+and+Neck%3A+Clinicopathologic+and+Molecular+Features+With+Special+Reference+to+Human+Papillomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol.+Jun%22%5BJournal%5D)">Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus.</a> Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).</li>
<li>Jordan, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+methods+for+oropharyngeal+cancer+HPV+status+determination+in+US+cooperative+group+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).</li>
<li>Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHammond%2C+ME+%22Arch.+Pathol.+Lab.+Med%22">Arch. Pathol. Lab. Med</a>. 134 (7), 48-72 (2010).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są zatrudnieni i posiadają akcje w Advanced Cell Diagnostics, Inc.

Test RNAscope HPV umożliwił bezpośrednią wizualizację mRNA E6/E7 in situ w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi związanym z HPV. Test RNAscope jest w pełni kompatybilny z rutynowo utrwaloną tkanką nowotworową i zachowuje morfologię tkanki dla korelacji histopatologicznych (ryc. 2). Kluczową zaletą testu RNAscope w porównaniu z konwencjonalnymi metodami CISH jest to, że specyficznie wzmacnia sygnały hybrydyzacji (rysunki 2B i 2E) bez wzmacniania szumu tła (ryc. 2C i 2F).
W praktyce procedura testu RNAscope HPV może zostać zakończona w ciągu 8 godzin lub wygodnie rozłożona na dwa dni. Test RNAscope HPV został wykorzystany do określenia statusu HPV w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi12-16, wykazując 97% czułość i 93% swoistość przy użyciu qRT-PCR jako metody referencyjnej16. Konwencjonalny chromogenny ISH dla HR-HPV DNA jest wysoce specyficzny, ale ma czułość ~80%12. Barwienie immunohistochemiczne (IHC) dla komórkowego markera zastępczego p16 wykazuje doskonałą czułość, ale może generować fałszywie dodatnie wyniki15,18, szczególnie w nieustno-gardłowych nowotworach głowy i szyi15. Obecna metoda qRT-PCR "złotego standardu" do wykrywania mRNA HPV E6/E7 wymaga świeżo zamrożonej tkanki w celu uzyskania optymalnych wyników i jest technicznie złożona, co ogranicza jej zastosowanie wyłącznie do laboratorium badawczego. Ponadto wymaga ekstrakcji RNA, co uniemożliwia skorelowanie ekspresji mRNA HR-HPV E6/E7 z histopatologią.
Istnieje kilka krytycznych czynników decydujących o powodzeniu testu RNAscope. Po pierwsze, aby uzyskać najlepsze wyniki, tkanki należy utrwalić w świeżej 10% neutralnie buforowanej formalinie w temperaturze pokojowej przez 16-32 godziny zgodnie z wytycznymi ASCO/CAP19. Po drugie, piec HybEZ jest wysoce zalecany, ponieważ umożliwia optymalną kontrolę temperatury i wilgotności na etapie hybrydyzacji sondy i wzmocnienia sygnału. Po trzecie, ważne jest, aby usunąć nadmiar resztkowych przed każdym krokiem, ale nadal nie dopuścić do wyschnięcia części tkanki podczas któregokolwiek z tych etapów.
Opisana tutaj ręczna procedura RNAscope została w pełni zautomatyzowana w komercyjnym systemie automatycznego barwieniaszkiełek 10. Powinno to znacznie ułatwić standaryzację warunków testowych i zaoszczędzić cenną pracę ręczną w laboratoriach patologii klinicznej. Ponadto opracowano dedykowane oprogramowanie do analizy obrazu10 w celu automatycznej identyfikacji komórek i sygnałów barwienia na zdigitalizowanym szkiełku, co powinno pomóc w wyeliminowaniu subiektywności i poprawie odtwarzalności w punktacji.
Podsumowując, test RNAscope HPV wykrywa obecność transkryptów mRNA HR-HPV E6/E7 in situ w tkankach FFPE. Ma przepływ pracy, który jest znany z laboratoriów patologii klinicznej, umożliwiając bezpośrednią wizualizację tych elementów w sekcjach tkanek. Stanowi idealną platformę do badania próbek tkanek (FFPE) i może być łatwo zaadoptowany przez laboratoria patologii diagnostycznej.

Zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego wysokiego ryzyka (HR-HPV) stanowi około 5% wszystkich nowotworów na świecie1. Częstość występowania raka jamy ustnej i gardła związanego z HPV wzrosła w ciągu ostatnich dziesięcioleci, zwłaszcza wśród mężczyzn. Rak płaskonabłonkowy jamy ustnej i gardła (OPSCC) HPV-dodatni prawdopodobnie będzie stanowił większość wszystkich nowotworów głowy i szyi w Stanach Zjednoczonych w ciągu najbliższych 20 lat2. Rak płaskonabłonkowy jamy ustnej i gardła wywołany przez HPV wiąże się z korzystnym przeżyciem, a status guza HPV jest silnym i niezależnym czynnikiem prognostycznym dla przeżycia3.
Dowody na transkrypcyjną aktywację onkogenów wirusa E6 i E7 są uważane za złoty standard dla obecności klinicznie istotnego HPV4. Jednak wykrywanie mRNA E6/E7 ze świeżej tkanki nowotworowej za pomocą techniki RT-PCR nie jest praktyczne w rutynowej praktyce klinicznej i zostało ograniczone do laboratoriów badawczych. Niedawno opracowaliśmy nowatorską technologię RNA ISH o nazwie RNAscope, która umożliwia multipleksową detekcję w pojedynczych komórkach z czułością pojedynczej cząsteczki RNA w próbkach tkanek zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE)5-10. Przedstawiliśmy trzy linie dowodowe dotyczące wykrywania pojedynczych cząsteczek5. Po pierwsze, konstrukcja sondy RNAscope i system wzmacniania sygnału umożliwiły wykrywanie pojedynczych kopii genomowego DNA HER2 w liniach komórkowych HeLa i SK-BR-3. Po drugie, w porównaniu z sygnałami genomowego DNA HER2, rozkład intensywności fluorescencji kropek sygnałowych mRNA HER2 w komórkach HeLa był zgodny z jedną cząsteczką na kropkę. Po trzecie, liczba kropek sygnałowych mRNA HER2 na komórkę była ściśle zgodna z liczbą kopii mRNA HER2 oszacowaną za pomocą testu ilościowego opartego na roztworze, co dodatkowo wspiera wykrywanie pojedynczych cząsteczek. Co więcej, barwienie przeciwstawne jąder za pomocą DAPI w mikroskopii fluorescencyjnej lub hematoksyliny w mikroskopii jasnego pola umożliwia wizualizację pojedynczych jąder, co z kolei umożliwia wykrywanie i kwantyfikację celów RNA na podstawie pojedynczej komórki10. Możliwość analizy ekspresji genów in situ w rutynowych próbkach klinicznych sprawia, że RNAscope jest obiecującą platformą do diagnostyki patologii, zwłaszcza tych testów opartych na sekcjach tkanek FFPE10,11. Opracowaliśmy test HPV oparty na RNAscope do wykrywania mRNA E6/E7 siedmiu genotypów HPV wysokiego ryzyka (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 i 58) przy użyciu puli sond specyficznych dla genotypu. Nasze ostatnie badania w OPSCC wykazały, że test RNAscope HPV jest bardzo czuły i specyficzny w określaniu statusu HPV w tkankach FFPE12-17, a także informuje o rokowaniu w OPSCC12,16.
Zasada działania technologii RNAscope została wcześniej opisana5. W tym miejscu opisujemy pełny protokół testu RNAscope i demonstrujemy jego zastosowanie w wykrywaniu HR-HPV w skrawkach tkanki nowotworowej FFPE.

<table><tbody><tr><td>SuperFrost Plus Prowadnice</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ Piekarnik, taca i stojak</td><td>Zaawansowana diagnostyka komórek</td><td>310011, 310012, 310014</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników FFPE RNAscope 2.0 - Brown</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310035</td><td></td></tr><tr><td>Sonda RNAscope HPV-HR7 do zaawansowanej diagnostyki komórek HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 i 58, E6/E7 mRNA</td><td></td><td>312351</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrofobowy długopis barierowy</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>ALREAGAL</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Gill's Hematoxylin I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>HXGHE1LT</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amoniaku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320145-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Szklana osłona 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-F</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Piec</td><td></td> suszący Fisher Scientific 11-300-49SHP <td></td></tr><tr><td></td> Zdolny do utrzymywania temperatury na poziomie 60&plusmn;<td></td><td></td><td> 1 &stopnie; C</td></tr><tr><td>Łaźnia</td><td></td><td></td> wodna <td>Zdolna do utrzymywania temperatury na poziomie 40 i plusmn; 1 &stopnie; Z</td></tr></tbody></table>

rnascope do wykrywania in situ transkrypcyjnie aktywnego wirusa brodawczaka ludzkiego w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

'Złotym standardem' w wykrywaniu onkogennych HPV jest wykazanie aktywnego transkrypcyjnie wirusa HPV wysokiego ryzyka w tkance nowotworowej. Jednak wykrycie mRNA E6/E7 za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) wymaga ekstrakcji RNA, która niszczy tkankę nowotworową w kontekście krytycznym dla korelacji morfologicznej i jest trudna do przyjęcia w rutynowej praktyce klinicznej. Nasza niedawno opracowana technologia hybrydyzacji RNA in situ, RNAscope, umożliwia bezpośrednią wizualizację RNA w tkance utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie (FFPE) z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością pojedynczej komórki, co umożliwia bardzo czułą i specyficzną analizę in situ dowolnego biomarkera RNA w rutynowych próbkach klinicznych. Test RNAscope HPV został zaprojektowany do wykrywania mRNA E6/E7 siedmiu genotypów HPV wysokiego ryzyka (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 i 58) przy użyciu puli sond specyficznych dla genotypu. Wykazał doskonałą czułość i swoistość w porównaniu z obecnym "złotym standardem" metody wykrywania mRNA E6/E7 za pomocą qRT-PCR. Status HPV określany za pomocą RNAscope jest silnie prognostyczny dla wyniku klinicznego u pacjentów z rakiem jamy ustnej i gardła.

Procedura analizy RNAscope HPV
Test RNAscope charakteryzuje się bardzo usprawnionym schematem pracy, który jest podobny do IHC (Rysunek 1). Składa się on z czterech głównych etapów: przygotowania wstępnego, hybrydyzacji, amplifikacji sygnału i detekcji. Wykorzystuje on unikalną strategię projektowania sond, która zapewnia wysoką wierność amplifikacji sygnału5. W teście RNAscope HPV siedem zestawów sond HR-HPV jest łączonych w puli, a wszystkie są rozpoznawane przez ten sam system amplifikacji sygnału sprzężony z peroksydazą chrzanową (HRP). Specyficzne sygnały hybrydyzacji są wykrywane jako brązowe osady powstałe w wyniku chromogenicznej reakcji katalizowanej przez HRP z użyciem DAB jako substratu, co można łatwo zwizualizować za pomocą standardowej mikroskopii w polu jasnym.
Reprezentatywne barwienie w celu wykrycia HPV
Rycina 2 przedstawia przykładowe obrazy z barwionych przekrojów FFPE z nowotworu płaskonabłonkowego głowy i szyi. W przypadku HPV-dodatnim (Rycina 2A) sondy HR-HPV wykryły silne sygnały punktowe specyficznie w komórkach nowotworowych. Sonda UBC wykryła liczne punktowe sygnały cytoplazmatyczne zarówno w komórkach nowotworowych, jak i w komórkach zrębu (Rycina 2B). Sonda dla bakteryjnego genu dapB wykazała czyste tło (Rycina 2C). W przypadku HPV-ujemnym zarówno sonda HR-HPV, jak i sonda dapB nie wykryły żadnych sygnałów (Ryciny 2D oraz 2F), podczas gdy silne sygnały wykryto przy użyciu sondy UBC (Rycina 2E). W tym badaniu UBC służy jako kontrola pozytywna do oceny jakości RNA w tkance, a dapB jako kontrola negatywna dla sygnałów tła. Ocena stanu HPV polega na zbadaniu wszystkich trzech preparatów dla każdego przypadku. Poziom barwienia na preparacie kontroli negatywnej (dapB) służy jako punkt odcięcia: pozytywność HPV definiuje obecność punktowego barwienia cytoplazmatycznego i/lub jądrowego, które przekraczało poziom sygnału na preparacie dapB.
<img alt="Schemat RNAscope: deparafinizacja, wstępne traktowanie, hybrydyzacja sond, amplifikacja sygnału." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat analizy RNAscope. Ilustracja przebiegu analizy RNAscope. Analiza RNAscope składa się z 4 głównych etapów: wstępnego traktowania, hybrydyzacji sond docelowych, amplifikacji sygnału oraz detekcji sygnału. Cała procedura analizy może zostać ukończona w ciągu 8 hr. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Analiza histologiczna, przekroje tkankowe, wyniki immunobarwienia dla markerów HPV, UBC, dapB." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przykładowe obrazy preparatów barwionych metodą RNAscope. Przekroje FFPE barwione sondami przeciwko HR-HPV, UBC (kontrola pozytywna) i dapB (kontrola negatywna) z dwóch przypadków HNSCC. A-C. Przypadek HPV-dodatni. A, ekspresja mRNA HR-HPV E6/E7 w komórkach nowotworowych. Wstawka, powiększenie 40X ukazujące punktowe sygnały. B i C) sąsiednie przekroje tkankowe wykazujące odpowiednio pozytywne barwienie UBC (B) oraz negatywne barwienie dla dapB (C). D-F) Przypadek HPV-ujemny. D) brak barwienia dla mRNA HPV E6/E7, podobnie jak w negatywnej kontroli dapB (F). E) pozytywne barwienie UBC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>

Obecność HPV wysokiego ryzyka w tkance nowotworowej głowy i szyi wiąże się z korzystnymi wynikami. Niedawno opracowana technika hybrydyzacji RNA in situ zwana RNAscope umożliwia bezpośrednią wizualizację mRNA HPV E6/E7 w skrawkach tkanek FFPE.

RNAscope do wykrywania in situ transkrypcyjnie aktywnego wirusa brodawczaka ludzkiego w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zademonstrowanie czułego i swoistego wykrywania mRNA E6 i E7 HPV wysokiego ryzyka w komórkach nowotworowych w rakach głowy i szyi przy użyciu nowej techniki hybrydyzacji in situ RNA o nazwie RNAscope. Osiąga się to poprzez wstępne potraktowanie próbek tkanek na szkiełkach ciepłem oraz proteazą w celu permeabilizacji komórek, co umożliwia dostęp sondy. W drugim kroku szkiełka inkubuje się z koktajlem sond HPV celującym w siedem typów HPV wysokiego ryzyka, który hybrydyzuje z mRNA E6 i E7.Następnie należy wzmocnić sygnały hybrydyzacji poprzez sekwencyjną hybrydyzację z przedwzmacniaczem, wzmacniaczem oraz sondą znakującą sprzężoną z HRP. Sygnał jest następnie wykrywany za pomocą chromogenu i wizualizowany pod standardowym mikroskopem światłym; uzyskane wyniki wykazują sygnały mRNA HPV 6 E7 w postaci punktowych brązowych osadów w guzach HPV-dodatnich, natomiast nie występują one w guzach HPV-ujemnych. Test RNAscope wykorzystuje nowatorską i zastrzeżoną strategię projektowania sond w celu zapewnienia skutecznej hybrydyzacji.Umożliwia ona wizualizację pojedynczych cząsteczek oraz kwantyfikację celu. Technologia ta otwiera przed badaczami w dziedzinie poszukiwania biomarkerów i opracowywania diagnostyki możliwość identyfikacji i walidacji wszelkich biomarkerów RNA odkrytych w badaniach RACE lub sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS). Większość naukowców z doświadczeniem w IHC lub ISH może szybko opanować tę metodę.Teraz zaprezentuję cały schemat postępowania, podkreślając kluczowe etapy, aby pomóc Państwu opanować tę technikę. Próbki tkanek przeznaczonych do analizy za pomocą tej metody hybrydyzacji in situ RNA są utrwalone w formalinie. Przekroje zatopione w parafinie o grubości 5 ± 1 µm zostały naniesione na szkiełka jedną godzinę przed rozpoczęciem analizy.Wypiecz preparaty w suchym piekarniku w temperaturze 60°C. W międzyczasie przygotuj piecyk do hybrydyzacji. Ustaw temperaturę na 40°C i umieść papier nawilżający w tacy do kontroli wilgotności.Dodać 50 milliliters wody destylowanej do papieru nawilżającego, aby całkowicie go zmoczyć. Włożyć zakrytą tackę do inkubatora w celu wstępnego ogrzania przez co najmniej 30 minutes przed użyciem. Przygotować 700 milliliters roztworu pretreat two o stężeniu one x poprzez rozcieńczenie 10 x pretreatment solution w wodzie destylowanej.Podgrzać roztwór one x pretreat two do wrzenia i utrzymywać temperaturę między 100 a 104 °C, zapobiegając jednoczesnemu wykipieniu. Przygotować trzy litry buforu one x wash poprzez rozcieńczenie wstępnie podgrzanego buforu 50 x wash w wodzie destylowanej pod dygestorium.Przygotować ksyleny, 70% etanol oraz 100% etanol do finalizacji deparafinacji i odwodnienia. Przygotować 50% roztwór barwiący hematyną oraz 0,01% wodę amoniakalną lub odczynnik niebieszczący do etapu po barwieniu. Podgrzać sondy docelowe do 40 °C przez 10 minut.Doprowadzić wszystkie odczynniki z zestawu detekcyjnego RTU, z wyjątkiem chromogenu DAB brązowego A i brązowego B, do temperatury pokojowej. Aby rozpocząć ten test, odparafinować wypieczone przekroje tkanek w ksylenole dwukrotnie przez pięć minut za każdym razem, często wstrząsając probówkami. Odwodnić w 100% etanolu dwukrotnie po trzy minuty, często wstrząsając.Suszyć na powietrzu przez pięć minut, a następnie narysować barierę hydrofobową wokół skrawka tkanki za pomocą pisaka do barier hydrofobowych. Rozpocząć wstępne przygotowanie skrawków tkanki, inkubując je w roztworze pretreat one przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pozwoli to na zablokowanie endogennej aktywności peroksydazy.Przepłukać wodą destylowaną. Następnie odzyskać RNA, inkubując skrawki tkanki przez 15 minut w roztworze wstępnego przygotowania dwa, utrzymywanym w temperaturze wrzenia; po 15 minutach przepłukać dwukrotnie wodą destylowaną w celu strawienia białek. Potraktować skrawki tkanki roztworem wstępnego przygotowania trzy i inkubować w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 40 °C przez 30 minut.Po zakończeniu 30-minutowej inkubacji należy dwukrotnie wypłukać skrawki tkanek wodą destylowaną. Kolejnym krokiem jest hybrydyzacja sond celowych przy użyciu puli sond wykrywających mRNA E6 i E7 siedmiu genotypów HPV wysokiego ryzyka: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 i 58. Sonda HPV, sonda ubikwityny C oraz sonda genu bakteryjnego DAP B powinny zostać naniesione oddzielnie na trzy sąsiednie skrawki tkanek.Po upływie dwugodzinnej inkubacji przeprowadzić hybrydyzację w temperaturze 40°C w inkubatorze przez dwie godziny. Przeznzmyć skrawki tkanek dwukrotnie w buforze płuczącym przez dwie minuty każdego razu w temperaturze pokojowej w celu wzmocnienia sygnału. Rozpocząć od inkubacji skrawków tkanek z przedwzmacniaczem AMP one przez 30 minut w temperaturze 40°C w inkubatorze do hybrydyzacji.Przemyć dwukrotnie w buforze płuczącym przez dwie minuty za każdym razem w temperaturze pokojowej. Kolejne etapy wzmacniania sygnału obejmują inkubację skrawków tkanek z następującymi odczynnikami w temperaturze 40 °C przez wskazany czas, z dwukrotnym płukaniem w buforze płuczącym w temperaturze pokojowej. Po każdej inkubacji zastosować AMP two background reducer przez 15 minut.Inkubuj z AMP three amplifier przez 30 minut oraz z AMP four labeled probe przez 15 minut. Następnie, po dwukrotnym płukaniu w buforze do płukania, inkubuj skrawki tkanek z amp five przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie z amp six przez 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym ponownie wykonaj dwa płukania w buforze do płukania. W celu detekcji sygnału przygotuj mieszaninę DAB w stosunku jeden do jednego, mieszając równe objętości brown A i brown B. Nałóż roztwór na slajdy i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Przepłukać dwukrotnie w wodzie destylowanej. Przebarwić przekroje tkanek roztworem hematoksyliny 50% przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie płukać wodą destylowaną, aż preparaty będą przejrzyste, a tkanki pozostaną fioletowe. Zanurzyć preparaty pięciokrotnie w 0,01% wodzie amoniakalnej, a następnie pięciokrotnie w wodzie destylowanej. Odwodnić przekroje tkanek, inkubując je po dwie minuty w kolejno: 70% etanolu, 100% etanolu i ponownie w 100% etanolu, a na koniec w ksylenie przez pięć minut.Na koniec zamocuj okładki szkiełek za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu. Poniżej przedstawiono przykładowe obrazy z barwionych przekrojów utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie z raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. W przypadku dodatnim pod kątem HPV sondy HR HPV wykryły silne sygnały punktowe specyficznie w komórkach nowotworowych. Jest to wyraźnie widoczne na powiększeniu 40x wstawce.Pozytywna sonda kontrolna UBC wykryła liczne punktowe sygnały cytoplazmatyczne zarówno w komórkach nowotworowych, jak i w komórkach zrębowych. Podczas gdy negatywna sonda kontrolna DAP B wykazała czyste tło w przypadku negatywnym pod kątem HPV, ani sonda HR HPV, ani sonda DAP B nie wykryły sygnałów, natomiast sonda UBC wykryła silne sygnały. Ocena stanu zakażenia HPV polega na zbadaniu wszystkich trzech preparatów dla każdego przypadku.Poziom barwienia na slajdzie kontrolnym negatywnym DAP B służy jako punkt odcięcia; dodatni wynik w kierunku HPV definiuje się jako obecność punktowego barwienia cytoplazmatycznego i/lub jądrowego przekraczającego sygnał na slajdzie DAP B. Analizę RNAscope można ukończyć w ciągu ośmiu godzin, jeśli zostanie ona przeprowadzona prawidłowo. Kluczowe jest dodanie wystarczającej ilości roztworu, aby pokryć cały obszar tkanki na każdym etapie.Ważne jest również usunięcie resztek buforu poprzez delikatne potrząsanie preparatami pomiędzy poszczególnymi etapami, przy jednoczesnym zachowaniu białego koloru slajdów. Technologia rescope może być zastosowana do detekcji praktycznie wszelkich biomarkerów RNA w dowolnej komórce lub tkance dowolnego gatunku.

rnascope-for-situ-detection-transcriptionally-active-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

RNAscope do wykrywania in situ transkrypcjonnie aktywnego ludzkiego papillomawirusa w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi

Charakterystyka epitopów limfocytów T patogenów wywołujących infekcje miejscowe, takich jak wirus brodawczaka ludzkiego, stanowi wyzwanie ze względu na ograniczoną liczbę krążących limfocytów T. Opisano metodę, w której rzadkie limfocyty T zostały wyizolowane i scharakteryzowane, zaczynając od bardzo małej liczby komórek.

Wykorzystanie testu Enzyme-linked Immunospot (ELISpot) dla interferonu $\gamma$ do charakterystyki nowych epitopów limfocytów T wirusa papilomawirusa ludzkiego

Ten film opisuje strategię sekwencyjnej hybrydyzacji, która polega na hybrydyzacji sond mRNA do określonego docelowego mRNA. Po hybrydyzacji sondy przeprowadza się wzmocnienie sygnału w celu zwiększenia rozdzielczości poprzez zmniejszenie stosunku sygnału do szumu podczas RNA-CISH próbek histologicznych.

Hybrydyzacja sondy i wzmocnienie sygnału w hybrydyzacji RNA in situ: technika wykrywania określonych sekwencji RNA w skrawkach tkanek

Ten film przedstawia protokół wykrywania sygnału podczas chromogenicznej hybrydyzacji RNA in situ. Technika ta może być stosowana do wizualnego diagnozowania aktywnej infekcji onkogennej w nienaruszonej próbce tkanki.

Wykrywanie sygnału RNA CISH: technika wykrywania sygnałów chromogennych podczas hybrydyzacji RNA in situ w nienaruszonych próbkach tkanek

Identyfikacja ekspresji poszczególnych loci HERV w oparciu o mikromacierze: zastosowanie do odkrywania biomarkerów w raku prostaty

Wieloparametrowa immunohistochemia fluorescencyjna może być wykorzystana do oceny liczby, względnego rozmieszczenia i lokalizacji populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza. Niniejszy manuskrypt opisuje zastosowanie tej techniki do analizy subpopulacji komórek T w raku jamy ustnej i gardła.

Czterokolorowa immunohistochemia fluorescencyjna subpopulacji komórek T w archiwalnych próbkach ludzkiego raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i gardła utrwalonego w formalinie, zatopionych w parafinie

Geny homeobox są genami regulatorowymi często związanymi z nowotworami u dorosłych organizmów. Zbadaliśmy ich porównawczą ekspresję za pomocą analizy immunohistochemicznej i PCR w czasie rzeczywistym, w prawidłowych i zapalnych błonach śluzowych nosa oraz w nowotworach zatok przynosowych, aby wykorzystać je jako możliwe cele diagnostyczne i terapeutyczne.

Identyfikacja OTX1 i OTX2 jako dwóch możliwych markerów molekularnych raka zatok przynosowych i nerwiaków zarodkowych węchu

Prezentowany tutaj jest protokół lokalizacji guzków płuc za pomocą znakowania barwnikiem za pomocą elektromagnetycznie nawigowanego dostępu za pomocą igły przezklatkowej. Opisana tutaj technika może być realizowana w okresie okołooperacyjnym w celu optymalizacji lokalizacji guzka i udanej resekcji podczas wykonywania minimalnie inwazyjnej chirurgii klatki piersiowej.

Nawigacja elektromagnetyczna Lokalizacja guzka przezklatkowego w minimalnie inwazyjnej chirurgii klatki piersiowej

Tutaj prezentujemy powtarzalną metodę tworzenia ortotopowego mysiego modelu raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Guzy wykazują klinicznie istotne cechy histopatologiczne choroby, w tym martwicę, słabe różnicowanie, przerzuty węzłowe i naciek immunologiczny. U myszy z guzem rozwijają klinicznie istotne objawy, w tym dysfagię, przemieszczenie szczęki i utratę wagi.

Dośluzówkowa inokulacja komórek raka płaskonabłonkowego u myszy w celu profilowania immunologicznego guza i oceny odpowiedzi na leczenie

Chromogeniczna hybrydyzacja in situ RNA wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) jest uważana za jeden ze złotych standardów wykrywania aktywnego zakażenia wirusem brodawczaka ludzkiego w obrębie nowotworów. Pozwala na wizualizację ekspresji mRNA HPV E6-E7 wraz z lokalizacją i półilościową oceną jego sygnału.

Chromogenna hybrydyzacja in situ jako narzędzie do diagnostyki raka głowy i szyi związanego z HPV

Spinki i pętle RNA mogą funkcjonować jako startery do odwrotnej transkrypcji (RT) w przypadku braku starterów specyficznych dla sekwencji, zakłócając badanie nakładających się na siebie transkryptów antysensownych. Opracowaliśmy technikę zdolną do identyfikacji swoistego dla nici RNA i wykorzystaliśmy ją do badania białka antysensownego HIV-1 ASP.

Wykrywanie transkryptów RNA białka antysensownego (ASP) ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) u pacjentów za pomocą RT-PCR swoistego dla nici

Poznaj technikę RNAscope do wykrywania mRNA wirusa HPV E6/E7 w nowotworach głowy i szyi. Metoda umożliwia wizualizację pojedynczych cząsteczek RNA w tkankach utrwalonych formaliną.

RNAscope do wykrywania in situ transkrypcyjnie aktywnego wirusa brodawczaka ludzkiego w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi

Przeglądaj więcej filmów