RNAscope do wykrywania in situ transkrypcyjnie aktywnego wirusa brodawczaka ludzkiego w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zademonstrowanie czułego i swoistego wykrywania mRNA E6 i E7 HPV wysokiego ryzyka w komórkach nowotworowych w rakach głowy i szyi przy użyciu nowej techniki hybrydyzacji in situ RNA o nazwie RNAscope. Osiąga się to poprzez wstępne potraktowanie próbek tkanek na szkiełkach ciepłem oraz proteazą w celu permeabilizacji komórek, co umożliwia dostęp sondy. W drugim kroku szkiełka inkubuje się z koktajlem sond HPV celującym w siedem typów HPV wysokiego ryzyka, który hybrydyzuje z mRNA E6 i E7.

Następnie należy wzmocnić sygnały hybrydyzacji poprzez sekwencyjną hybrydyzację z przedwzmacniaczem, wzmacniaczem oraz sondą znakującą sprzężoną z HRP. Sygnał jest następnie wykrywany za pomocą chromogenu i wizualizowany pod standardowym mikroskopem światłym; uzyskane wyniki wykazują sygnały mRNA HPV 6 E7 w postaci punktowych brązowych osadów w guzach HPV-dodatnich, natomiast nie występują one w guzach HPV-ujemnych. Test RNAscope wykorzystuje nowatorską i zastrzeżoną strategię projektowania sond w celu zapewnienia skutecznej hybrydyzacji.

Umożliwia ona wizualizację pojedynczych cząsteczek oraz kwantyfikację celu. Technologia ta otwiera przed badaczami w dziedzinie poszukiwania biomarkerów i opracowywania diagnostyki możliwość identyfikacji i walidacji wszelkich biomarkerów RNA odkrytych w badaniach RACE lub sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS). Większość naukowców z doświadczeniem w IHC lub ISH może szybko opanować tę metodę.

Teraz zaprezentuję cały schemat postępowania, podkreślając kluczowe etapy, aby pomóc Państwu opanować tę technikę. Próbki tkanek przeznaczonych do analizy za pomocą tej metody hybrydyzacji in situ RNA są utrwalone w formalinie. Przekroje zatopione w parafinie o grubości 5 ± 1 µm zostały naniesione na szkiełka jedną godzinę przed rozpoczęciem analizy.

Wypiecz preparaty w suchym piekarniku w temperaturze 60°C. W międzyczasie przygotuj piecyk do hybrydyzacji. Ustaw temperaturę na 40°C i umieść papier nawilżający w tacy do kontroli wilgotności.

Dodać 50 milliliters wody destylowanej do papieru nawilżającego, aby całkowicie go zmoczyć. Włożyć zakrytą tackę do inkubatora w celu wstępnego ogrzania przez co najmniej 30 minutes przed użyciem. Przygotować 700 milliliters roztworu pretreat two o stężeniu one x poprzez rozcieńczenie 10 x pretreatment solution w wodzie destylowanej.

Podgrzać roztwór one x pretreat two do wrzenia i utrzymywać temperaturę między 100 a 104 °C, zapobiegając jednoczesnemu wykipieniu. Przygotować trzy litry buforu one x wash poprzez rozcieńczenie wstępnie podgrzanego buforu 50 x wash w wodzie destylowanej pod dygestorium.

Przygotować ksyleny, 70% etanol oraz 100% etanol do finalizacji deparafinacji i odwodnienia. Przygotować 50% roztwór barwiący hematyną oraz 0,01% wodę amoniakalną lub odczynnik niebieszczący do etapu po barwieniu. Podgrzać sondy docelowe do 40 °C przez 10 minut.

Doprowadzić wszystkie odczynniki z zestawu detekcyjnego RTU, z wyjątkiem chromogenu DAB brązowego A i brązowego B, do temperatury pokojowej. Aby rozpocząć ten test, odparafinować wypieczone przekroje tkanek w ksylenole dwukrotnie przez pięć minut za każdym razem, często wstrząsając probówkami. Odwodnić w 100% etanolu dwukrotnie po trzy minuty, często wstrząsając.

Suszyć na powietrzu przez pięć minut, a następnie narysować barierę hydrofobową wokół skrawka tkanki za pomocą pisaka do barier hydrofobowych. Rozpocząć wstępne przygotowanie skrawków tkanki, inkubując je w roztworze pretreat one przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pozwoli to na zablokowanie endogennej aktywności peroksydazy.

Przepłukać wodą destylowaną. Następnie odzyskać RNA, inkubując skrawki tkanki przez 15 minut w roztworze wstępnego przygotowania dwa, utrzymywanym w temperaturze wrzenia; po 15 minutach przepłukać dwukrotnie wodą destylowaną w celu strawienia białek. Potraktować skrawki tkanki roztworem wstępnego przygotowania trzy i inkubować w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 40 °C przez 30 minut.

Po zakończeniu 30-minutowej inkubacji należy dwukrotnie wypłukać skrawki tkanek wodą destylowaną. Kolejnym krokiem jest hybrydyzacja sond celowych przy użyciu puli sond wykrywających mRNA E6 i E7 siedmiu genotypów HPV wysokiego ryzyka: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 i 58. Sonda HPV, sonda ubikwityny C oraz sonda genu bakteryjnego DAP B powinny zostać naniesione oddzielnie na trzy sąsiednie skrawki tkanek.

Po upływie dwugodzinnej inkubacji przeprowadzić hybrydyzację w temperaturze 40°C w inkubatorze przez dwie godziny. Przeznzmyć skrawki tkanek dwukrotnie w buforze płuczącym przez dwie minuty każdego razu w temperaturze pokojowej w celu wzmocnienia sygnału. Rozpocząć od inkubacji skrawków tkanek z przedwzmacniaczem AMP one przez 30 minut w temperaturze 40°C w inkubatorze do hybrydyzacji.

Przemyć dwukrotnie w buforze płuczącym przez dwie minuty za każdym razem w temperaturze pokojowej. Kolejne etapy wzmacniania sygnału obejmują inkubację skrawków tkanek z następującymi odczynnikami w temperaturze 40 °C przez wskazany czas, z dwukrotnym płukaniem w buforze płuczącym w temperaturze pokojowej. Po każdej inkubacji zastosować AMP two background reducer przez 15 minut.

Inkubuj z AMP three amplifier przez 30 minut oraz z AMP four labeled probe przez 15 minut. Następnie, po dwukrotnym płukaniu w buforze do płukania, inkubuj skrawki tkanek z amp five przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie z amp six przez 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym ponownie wykonaj dwa płukania w buforze do płukania. W celu detekcji sygnału przygotuj mieszaninę DAB w stosunku jeden do jednego, mieszając równe objętości brown A i brown B. Nałóż roztwór na slajdy i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Przepłukać dwukrotnie w wodzie destylowanej. Przebarwić przekroje tkanek roztworem hematoksyliny 50% przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie płukać wodą destylowaną, aż preparaty będą przejrzyste, a tkanki pozostaną fioletowe. Zanurzyć preparaty pięciokrotnie w 0,01% wodzie amoniakalnej, a następnie pięciokrotnie w wodzie destylowanej. Odwodnić przekroje tkanek, inkubując je po dwie minuty w kolejno: 70% etanolu, 100% etanolu i ponownie w 100% etanolu, a na koniec w ksylenie przez pięć minut.

Na koniec zamocuj okładki szkiełek za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu. Poniżej przedstawiono przykładowe obrazy z barwionych przekrojów utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie z raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. W przypadku dodatnim pod kątem HPV sondy HR HPV wykryły silne sygnały punktowe specyficznie w komórkach nowotworowych. Jest to wyraźnie widoczne na powiększeniu 40x wstawce.

Pozytywna sonda kontrolna UBC wykryła liczne punktowe sygnały cytoplazmatyczne zarówno w komórkach nowotworowych, jak i w komórkach zrębowych. Podczas gdy negatywna sonda kontrolna DAP B wykazała czyste tło w przypadku negatywnym pod kątem HPV, ani sonda HR HPV, ani sonda DAP B nie wykryły sygnałów, natomiast sonda UBC wykryła silne sygnały. Ocena stanu zakażenia HPV polega na zbadaniu wszystkich trzech preparatów dla każdego przypadku.

Poziom barwienia na slajdzie kontrolnym negatywnym DAP B służy jako punkt odcięcia; dodatni wynik w kierunku HPV definiuje się jako obecność punktowego barwienia cytoplazmatycznego i/lub jądrowego przekraczającego sygnał na slajdzie DAP B. Analizę RNAscope można ukończyć w ciągu ośmiu godzin, jeśli zostanie ona przeprowadzona prawidłowo. Kluczowe jest dodanie wystarczającej ilości roztworu, aby pokryć cały obszar tkanki na każdym etapie.

Ważne jest również usunięcie resztek buforu poprzez delikatne potrząsanie preparatami pomiędzy poszczególnymi etapami, przy jednoczesnym zachowaniu białego koloru slajdów. Technologia rescope może być zastosowana do detekcji praktycznie wszelkich biomarkerów RNA w dowolnej komórce lub tkance dowolnego gatunku.