Name: Pełny model ubytku skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji naczyń krwionośnych w konstruktach inżynierii tkankowej przy użyciu mysiego modelu ubytku skóry. Technika ta umożliwia analizę unaczynienia biomateriałów in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Szablon regeneracji skóry Integra został udostępniony przez Integra LifeSciences Corporation. Źródła finansowania prac: Prace te zostały częściowo sfinansowane przez CIRM-BMBF Early Translational II Award oraz FONDAP Center for Genome Regulation (nr 15090007) dla JTE.

1. Przygotowanie rusztowań
<ol>
	<li>Wygeneruj próbki rusztowań za pomocą stempli biopsyjnych 12 mm.</li>
	<li>Aby wprowadzić bioaktywne cząsteczki lub komórki do rusztowania, należy osuszyć rusztowania, delikatnie ściskając je sterylną gazą. Następnie należy ponownie nawodnić rusztowania, dodając 160 μl roztworu zawierającego interesujące nas bioaktywne cząsteczki lub komórki. Dokładnie sprawdź powodzenie bioaktywacji komórek za pomocą testów metabolicznych, takich jak testy MTT.</li>
	<li>W razie potrzeby utrwalić związki lub komórki, które mają być badane, wewnątrz rusztowania, dostarczając je, na przykład w roztworze fibryny i trombiny lub hydrożelu, ponownie poprzez ponowne uwodnienie, jak opisano w kroku 1.2. 
	UWAGA: Ten krok może być pomocny, gdy związki lub komórki nie przyczepiają się mechanicznie do materiału. Można również kontrolować dynamikę uwalniania związków.</li>
	<li>Przygotuj tytanizowane siatki, które zostaną umieszczone pod każdym rusztowaniem w każdym doświadczeniu i grupie kontrolnej, wycinając okrągłe kawałki o średnicy około 14 mm. 
	UWAGA: Tytanizowana siatka działa jak fizyczna granica wymagana do odgraniczenia zregenerowanej tkanki od łożyska rany.</li>
</ol>
2. Zwierzęta
<ol>
	<li>Przed wdrożeniem przedstawionego modelu należy zapoznać się z odpowiednimi przepisami dotyczącymi ochrony zwierząt i uzyskać pozwolenie od władz lokalnych. W tej pracy wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone na myszach, zgodnie z obowiązującą niemiecką ustawą o dobrostanie zwierząt i zatwierdzoną przez rząd powiatowy Górnej Bawarii (Regierung von Oberbayern).</li>
	<li>Starannie wybierz zwierzę i szczep. Chociaż model został stworzony dla myszy, można go przełożyć na inne pospolite zwierzęta, takie jak szczury, króliki czy świnie.</li>
	<li>W przypadku pracy ze zwierzętami futerkowymi należy ogolić grzbiet zwierząt przed założeniem rusztowań. 
	UWAGA: W tej pracy wykorzystuje się myszy w wieku od 6 do 8 tygodni o masie ciała od 20 g do 25 g, jednak można również użyć różnych grup wiekowych i masy ciała.</li>
</ol>
3. Znieczulenie
<ol>
	<li>Operację należy przeprowadzić w sterylnych warunkach. W celu utrzymania prawidłowej temperatury ciała zwierzęcia należy stosować matę rozgrzewającą.</li>
	<li>Przed podaniem znieczulenia wziewnego zwierzęta otrzymują buprenorfinę w dawce 0,05-0,1 mg/kg masy ciała, podskórnie co 8 godzin.</li>
	<li>Umieścić zwierzę w znieczuleniu wziewnym (izofluran) lub zastosować równoważne standardowe procedury. Potwierdź znieczulenie, delikatnie ściskając palce u nóg zwierzęcia lub przez uszczypnięcie skóry.</li>
	<li>Aby zapobiec wytrzeszczom, na początku operacji należy wstrzyknąć podskórnie 0,5 ml roztworu soli fizjologicznej.</li>
</ol>
4. Wycięcie skóry
<ol>
	<li>Umieść zwierzę w pozycji leżącej i zaznacz linię środkową grzbietu myszy stałym pisakiem z cienką końcówką (Rysunek 1A).</li>
	<li>Określ obszar wycięcia. Umieść defekty w obszarze pokazanym na rysunku 1C. Należy pamiętać, że jeśli ubytki są umieszczone zbyt doogonowo, zwierzęta są bardziej skłonne do zdejmowania opatrunków i rusztowań.</li>
	<li>Utworzyć okrągłe obustronne ubytki za pomocą stempla do biopsji o średnicy 10 mm (ryc. 1B). Stempel powinien być ostrożnie dociśnięty do skóry i nie może być używany do całkowitego przecięcia skóry, ale do wyznaczenia obszaru wycięcia (ryc. 1C i 1E).</li>
	<li>Delikatnie zdejmij zaznaczoną skórę kleszczami i naciąć wzdłuż zaznaczonego okręgu za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych (ryc. 1F). W przypadku krwawienia ostrożnie ściskać jałową gazą. Szczegółowy opis wycięcia przedstawiono na rysunku 1. 
	UWAGA: Wada jest tworzona za pomocą mniejszego stempla niż ten do generowania rusztowań, aby skompensować powiększenie ubytku ze względu na elastyczność skóry.</li>
</ol>
5. Implantacja rusztowania
<ol>
	<li>Aby zrobić miejsce na tytanizowaną siatkę, należy rozszerzyć separację skóry i leżącej pod nią tkanki na brzegach rany o 2-4 mm (ryc. 2A).</li>
	<li>Umieść tytanizowaną siatkę w ubytku bezpośrednio na łożysku rany i pod krawędziami rany (rysunki 2A i B).</li>
	<li>Umieść rusztowania bezpośrednio nad siatką.</li>
	<li>Zszyj rusztowania z sąsiednimi krawędziami rany za pomocą 4 do 6 pojedynczych węzłów, pozostawiając krawędzie nieco nad rusztowaniem (ryc. 2C). 
	UWAGA: Unikaj stosowania szwów biodegradowalnych.</li>
	<li>Zszyj przezroczysty opatrunek na ranę nad ubytkami, aby chronić rusztowanie, umożliwiając jednocześnie monitorowanie obszaru rany (ryc. 2D).</li>
</ol>
6. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Trzymaj jedną mysz na klatkę, aby uniknąć wzajemnej manipulacji opatrunkiem i rusztowaniami.</li>
	<li>Oceniaj ogólny stan zwierzęcia na co dzień, obserwując aktywność ruchową, masę ciała, oznaki bólu, tolerancję na opatrunek i samookaleczenie. Należy również monitorować obszar rany pod kątem krwawienia, miejscowych i ogólnoustrojowych objawów zakażenia oraz umiejscowienie opatrunku.</li>
	<li>W celu zminimalizowania bólu zwierzęcia należy wstrzykiwać buprenorfinę codziennie w dawce 0,05-0,1 mg/kg masy ciała lub równoważne leki przeciwbólowe.</li>
	<li>Jeśli mysz usunie lub uszkodzi opatrunek na ranę, wymień go lub ponownie załóż w znieczuleniu.</li>
</ol>
7. Eutanazja i eksplantacja rusztowania
<ol>
	<li>W pożądanych punktach czasowych należy uśmiercać zwierzęta przez przedawkowanie pentobarbitalu (150 mg/kg).</li>
	<li>Zaznacz miejsce wycięcia skóry trwałym markerem, który powinien obejmować rusztowania i jak największą część skóry pleców myszy (ryc. 3A).</li>
	<li>Naciąć skórę wzdłuż zaznaczonych linii nożyczkami lub skalpelem. Odłącz całą skórę, w tym rusztowania i tytanizowaną siatkę, od leżącej pod spodem tkanki poprzez przygotowanie (ryc. 3B).</li>
	<li>Umieść eksplantowaną tkankę rozciągniętą na szalce Petriego (ryc. 3C i D)</li>
</ol>
8. Wizualizacja i kwantyfikacja sieci naczyniowej
<ol>
	<li>Tłumaczenie:
	<ol>
		<li>Ustaw urządzenie transiluminacyjne, montując szalkę Petriego nad silnym źródłem białego światła (standardowa żarówka o mocy 100 W).</li>
		<li>Zamocuj kamerę cyfrową nad transiluminatorem, aby uzyskać obrazy cyfrowe.</li>
		<li>Umieścić próbki do góry nogami na szalce Petriego nad urządzeniem do transoświetlenia.</li>
		<li>Rób zdjęcia całych rusztowań w trybie makro, a także obszarów normalnej skóry o jednakowej wielkości. Przechowuj obrazy w formacie TIFF do dalszej analizy cyfrowej.</li>
		<li>Zachowaj tkankę do dalszej analizy biochemicznej lub histologicznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cyfrowa segmentacja i kwantyfikacja:
	<ol>
		<li>Pobierz i zainstaluj oprogramowanie VesSeg-Tool, które można pobrać bezpłatnie pod adresem: <a href="http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255">http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255.</a></li>
		<li>Otwórz zdjęcie za pomocą oprogramowania VesSeg-Tool.</li>
		<li>Wybierz obszar obrazu pokryty rusztowaniem do analizy cyfrowej (Image→Select).</li>
		<li>Aby zwiększyć kontrast naczyń krwionośnych, użyj opcji "Progowanie histerezy" (Obraz→Filtr wzmacniający naczynia→Progowanie histerezy→Transformacja Top-Hat→Oblicz wzmocnienie naczynia).</li>
		<li>Kontynuuj segmentację mapy naczyń (Obraz→Filtr poprawy naczyń krwionośnych→Progowanie histerezy→Granice progu). Wybierz pierwszy próg ("Pokrycie naczynia"), aby każdy piksel, który nawet w najmniejszym stopniu przypomina statek, został oznaczony jako statek. Wybierz drugi próg ("Pokrycie tła"), aby tylko te piksele, które są szczególnie podobne do naczyń, były oznaczone jako naczynia.</li>
		<li>Sprawdź ręcznie propozycję automatycznej segmentacji, aby dodać nieprzechwycone naczynia i wyeliminować typowe struktury fałszywie dodatnie, które zwykle są długimi i cienkimi strukturami przypominającymi naczynia, takimi jak włosy lub szwy.</li>
		<li>Oblicz długość naczyń i całkowitą powierzchnię pokrytą przez statki (Image→Image statistics→Binary image statistics). 
		UWAGA: W celu obliczenia długości statków, statki na wynikowej mapie statków są pocieniane do linii o szerokości jednego piksela20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizuj natywny obszar skóry przy tych samych parametrach, co rusztowania, przypisując wartość 100% do tkanki natywnej i odnieś rusztowanie do tej wartości. Na przykład, jeśli procent białych pikseli wynosi 60% w normalnej tkance i 30% w rusztowaniu, oznaczałoby to 50% unaczynienia rusztowania. Uwaga: Pokrycie białych naczyń jest przypisane do obszaru kwadratu wokół rusztowania. Dostosuj liczbę pokrycia białymi pikselami, biorąc pod uwagę, że obszar okręgu jest znacznie mniejszy (π x R2) niż kwadrat (4 x R2).</li>
</ol>

<ol><li>Rahaman, M. N., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+composite+tissue+constructs+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based composite tissue constructs for regenerative medicine.</a> Biotechnology and Bioengineering. 91 (3), 261-284 (2005).</li>
<li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nature Biotechnology. 23, 47-55 (2005).</li>
<li>Machens, H. G., Berger, A. C., Mailaender, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioartificial+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Bioartificial skin.</a> Cells Tissues Organs. 167, 88-94 (2000).</li>
<li>Priya, S. G., Jungvid, H., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+tissue+engineering+for+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Skin tissue engineering for tissue repair and regeneration.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 105-118 (2008).</li>
<li>Papavasiliou, G., Cheng, M. H., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+vascularization+of+polymer+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Strategies for vascularization of polymer scaffolds.</a> Journal of Investigative Medicine. 58 (7), 838-844 (2010).</li>
<li>Laschke, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+tissue+engineering%3A+breathing+life+into+constructed+tissue+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in tissue engineering: breathing life into constructed tissue substitutes.</a> Tissue Engineering. 12, 2093-2104 (2006).</li>
<li>Zhong, S. P., Zhang, Y. Z., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+scaffolds+for+skin+wound+healing+and+dermal+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Tissue scaffolds for skin wound healing and dermal reconstruction.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (5), 510-525 (2010).</li>
<li>Liu, G., Zhang, Y., Liu, B., Sun, J., Li, W., Cui, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+regeneration+in+a+canine+cranial+model+using+allogeneic+adipose+derived+stem+cells+and+coral+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bone regeneration in a canine cranial model using allogeneic adipose derived stem cells and coral scaffold.</a> Biomaterials. 34 (11), 2655-2664 (2013).</li>
<li>Hansson, A., Di Francesco, T., Falson, F., Rousselle, P., Jordan, O., Borchard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+evaluation+of+nanoparticles+for+directed+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Preparation and evaluation of nanoparticles for directed tissue engineering.</a> International Journal of Pharmaceutics. 439 (1-2), 73-80 (2012).</li>
<li>Sarkar, S. D., Farrugia, B. L., Dargaville, T. R., Dhara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan-collagen+scaffolds+with+nano%2Fmicrofibrous+architecture+for+skin+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Chitosan-collagen scaffolds with nano/microfibrous architecture for skin tissue engineering.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 18, (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+knitted+mesh-reinforced+collagen-chitosan+hybrid+scaffold+in+the+one-step+repair+of+full-thickness+skin+defects+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The roles of knitted mesh-reinforced collagen-chitosan hybrid scaffold in the one-step repair of full-thickness skin defects in rats.</a> Acta Biomaterials. 9 (8), 7822-7832 (2013).</li>
<li>Rizzi, S. C., Upton, Z., Bott, K., Dargaville, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+dermal+wound+healing%3A+biomedical+device+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Medical+Devices%22%5BJournal%5D)">Recent advances in dermal wound healing: biomedical device approaches.</a> Expert Review of Medical Devices. 1, 143-154 (2010).</li>
<li>des Rieux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+systems+delivering+VEGF+to+promote+angiogenesis+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">3D systems delivering VEGF to promote angiogenesis for tissue engineering.</a> Journal of Controlled Release. 150, 272-278 (2011).</li>
<li>Reckhenrich, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactivation+of+dermal+scaffolds+with+a+non-viral+copolymer-protected+gene+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bioactivation of dermal scaffolds with a non-viral copolymer-protected gene vector.</a> Biomaterials. 32, 1996-2003 (2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Key+Regulatory+Roles+of+the+PI3K%2FAkt+Signaling+Pathway+in+the+Functionalities+of+Mesenchymal+Stem+Cells+and+Applications+in+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">The Key Regulatory Roles of the PI3K/Akt Signaling Pathway in the Functionalities of Mesenchymal Stem Cells and Applications in Tissue Regeneration.</a> Tissue Engineering Part B Rev. 19, 516-528 (2013).</li>
<li>Fedorovich, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelial+progenitor+cells+in+prevascularized+bone+tissue+engineering%3A+development+of+heterogenous+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">The role of endothelial progenitor cells in prevascularized bone tissue engineering: development of heterogenous constructs.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2355-2367 (2010).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenesis+and+angiogenesis+of+tissue-engineered+bone+constructed+by+prevascularized+%CE%B2-tricalcium+phosphate+scaffold+and+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Osteogenesis and angiogenesis of tissue-engineered bone constructed by prevascularized β-tricalcium phosphate scaffold and mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 36, 9452-9461 (2010).</li>
<li>Cuadra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+results+of+burned+hands+treated+with+Integra%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plastic%2C+Reconstructive+%26+Aesthetic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Functional results of burned hands treated with Integra.</a> Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (2), 228-234 (2012).</li>
<li>Wilcke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF%28165%29+and+bFGF+protein-based+therapy+in+a+slow+release+system+to+improve+angiogenesis+in+a+bioartificial+dermal+substitute+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">VEGF(165) and bFGF protein-based therapy in a slow release system to improve angiogenesis in a bioartificial dermal substitute in vitro and in vivo.</a> Langenbecks Arch Surg. 392 (3), 305-314 (2007).</li>
<li>Condurache, A., Aach, T., Grzybowsky, S., Machens, H. G. Vessel segmentation and analysis in laboratory skin transplant micro-angiograms. Proceedings of the Eighteenth IEEE Symposium on Computer-Based Medical Systems. , 21-26 (2005).</li>
<li>Danner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+human+sweat+gland-derived+stem+cells+for+enhancing+vascularization+during+dermal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The use of human sweat gland-derived stem cells for enhancing vascularization during dermal regeneration.</a> Journal of Investigative Dermatology. 132 (6), 1707-1716 (2012).</li>
<li>Shaterian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+Time+Analysis+of+the+Kinetics+of+Angiogenesis+and+Vascular+Permeability+in+an+Animal+Model+of+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Real Time Analysis of the Kinetics of Angiogenesis and Vascular Permeability in an Animal Model of Wound Healing.</a> Burns. 35 (6), 811-817 (2009).</li>
<li>McDonald, D. M., Choyke, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+angiogenesis%3A+from+microscope+to+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic.</a> Nature Medicine. 9 (6), 713-725 (2003).</li>
<li>Bergeron, L., Tang, M., Morris, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+vascular+injection+techniques+for+the+study+of+perforator+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">A review of vascular injection techniques for the study of perforator flaps.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 117, 2050-2057 (2006).</li>
<li>Schlatter, P., König, M. F., Karlsson, L. M., Burri, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+study+of+intussusceptive+capillary+growth+in+the+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+of+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative study of intussusceptive capillary growth in the chorioallantoic membrane (CAM) of the chicken embryo.</a> Microvascular Research. 54 (1), 65-73 (1997).</li>
<li>Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+skinfold+chamber+technique+for+intravital+microscopy+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice.</a> American Journal of Pathology. 143 (4), 1055-1062 (1993).</li>
<li>Menger, M. D., Jäger, S., Walter, P., Hammersen, F., Messmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+studies+on+the+microvasculature+of+transplanted+islets+of+Langerhans+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+microcirculation%2C+clinical+and+experimental%22%5BJournal%5D)">A novel technique for studies on the microvasculature of transplanted islets of Langerhans in vivo.</a> International journal of microcirculation, clinical and experimental. 9 (1), 103-117 (1990).</li>
<li>Laschke, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroids+of+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+are+potent+initiators+of+blood+vessel+formation+in+porous+polyurethane+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroids of adipose-derived mesenchymal stem cells are potent initiators of blood vessel formation in porous polyurethane scaffolds.</a> Acta Biomaterials. 9 (6), 6876-6884 (2013).</li>
<li>Egaña, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+mesenchymal+cells+to+improve+vascularization+in+a+mouse+model+for+scaffold-based+dermal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Use of human mesenchymal cells to improve vascularization in a mouse model for scaffold-based dermal regeneration.</a> Tissue Eng Part A. 15 (5), 1191-1200 (2009).</li>
<li>Condurache, A., Aach, T. Vessel segmentation in angiograms using hysteresis thresholding. Proceedings of the Ninth IAPR Conference on Machine Vision Applications. , 269-272 (2005).</li>
<li>Egaña, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+method+to+visualize+and+quantify+vascular+networks+in+native+and+tissue+engineered+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Archives+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Ex vivo method to visualize and quantify vascular networks in native and tissue engineered skin.</a> Langenbecks Archives of Surgery. 394, 349-356 (2009).</li>
</ol>

Oświadczenie o konflikcie interesów:
Wszyscy autorzy: Brak
Ujawnianie informacji finansowych:
Żaden z autorów nie ma interesu finansowego w żadnym z produktów, urządzeń lub leków wymienionych w tym manuskrypcie.

Istnieje potrzeba opracowania skutecznych metod poprawy perfuzji krwi w konstruktach inżynierii tkankowej, co wymaga opracowania nowych, niezawodnych metod badania procesów unaczyniania w biomateriałach. Powszechne metody unaczynienia rusztowania ex vivo obejmują użycie mikroskopii, która zapewnia narzędzie o wysokiej rozdzielczości. Jednak w większości przypadków metoda ta ogranicza się do analizy małych obszarów tkanek i jest zwykle kosztowna i czasochłonna. Co więcej, często obejmuje skomplikowane metody etyk...

W ostatnich dziesięcioleciach inżynieria tkankowa otworzyła nową opcję terapeutyczną polegającą na zastąpieniu defektów tkanek własnymi komórkami organizmu1. Aby wspomóc fizjologiczny proces regeneracji tkanek, rusztowania są projektowane jako struktura biodegradowalna, która zapewnia scenariusz, w którym komórki z łożyska rany mogą rosnąć i przywracać ubytek2,3.
Niedostateczne unaczynienie jest uważane za główną przeszkodę, która powstrzymuje kliniczny przełom w tworzeniu rusztowań biosztucznych4. Wraz z wrastaniem komórek wzrasta zapotrzebowanie na składniki odżywcze i tlen, a unaczynienie materiału staje się niezbędne. Niewystarczające lub opóźnione unaczynienie może zatem prowadzić do centralnej martwicy produktów inżynierii tkankowej5. Ponadto naczynia krwionośne dostarczają kompetentne komórki odpornościowe i usuwają pozostałości metaboliczne w obszarze regeneracji. Wysokie wskaźniki zakażeń i niska regeneracja to tylko niektóre z konsekwencji niedostatecznej perfuzji krwi obserwowanej w inżynierii tkankowej, której celem jest zapobieżenie poprzez zwiększenie unaczynienia rusztowań6,7.
Kilka strategii, które mają na celu poprawę unaczynienia, skupia się na kluczowej roli samego biomateriału i mikrostrukturze rusztowania. Prowadzone są intensywne prace badawcze mające na celu opracowanie nowych podejść do przenoszenia procesu gojenia z naprawy na regenerację, a tym samym (re)generacji tkanki o właściwościach fizjologicznych najbardziej zbliżonych do tej, która ma zostać odtworzona8,9. Biomateriały, które badano i oceniano pod kątem ich potencjału regeneracyjnego, obejmowały kolagen, fibrynę, chitozan i alginian10,11. Te biomateriały mogą być wykorzystywane i łączone jako szkielet do budowy nowych rusztowań przy użyciu różnych strategii, takich jak decelularyzacja tkanek, samoorganizacja, szybkie prototypowanie i elektroprzędzenie12. W celu zwiększenia własnych zdolności regeneracyjnych organizmu, rusztowania mogą być bioaktywowane. Wykazano, że włączenie rekombinowanych angiogennych czynników wzrostu13 lub wektorów genowych kodujących takie czynniki14 poprawia unaczynienie rusztowania. Powszechnie wykazano, że stosowanie komórek macierzystych jest obiecującą strategią poprawy unaczynienia, w której najwięcej uwagi poświęcono mezenchymalnym komórkom zrębu i komórkom progenitorowym śródbłonka15,16. Inne podejścia polegają na budowie konstrukcji, które zawierają prefabrykowane sieci naczyń krwionośnych przed przeszczepem17. Pomimo intensywnych wysiłków w zakresie projektowania rusztowań i ich bioaktywacji, żadna strategia nie poprawiła unaczynienia na klinicznie istotnym poziomie i, z wyjątkiem wymiany skóry w przypadku masywnych oparzeń, przełożenie materiałów bioinżynieryjnych na rutynę kliniczną odbywa się tylko zwahaniem18.
Jednym z powodów, dla których unaczynienie sztucznych konstrukcji tkankowych jest nadal nierozwiązanym problemem, jest trudność w ocenie sukcesu nowych technologii w podejściu in vivo. Chociaż eksperymenty in vitro mogą dostarczyć ważnych informacji na temat potencjału unaczynienia rusztowań, potrzebne są odpowiednie modele zwierzęce do zbadania kluczowych parametrów, takich jak biokompatybilność materiału, bezpieczeństwo i skuteczność leczenia oraz, co szczególnie ważne, unaczynienie konstruktu tkankowego. Dlatego niezbędne są niezawodne narzędzia do wizualizacji i ilościowego określania sieci naczyń krwionośnych in vivo.
W tym badaniu prezentujemy prostą i niezawodną metodę, która pozwala na wizualizację i kwantyfikację sieci naczyniowej wewnątrz eksplantowanych rusztowań. Metoda ta opiera się na transiluminacji tkankowej i segmentacji cyfrowej. Ponieważ metoda ta jest nieinwazyjna, pozwala na dalsze analizy molekularne i histologiczne materiału docelowego.

<table><tbody><tr><td>Ethilon P-3 13 mm 3/8 okrąg 5-0</td><td>Ethicon, Norderstedt, Niemcy</td><td>698G</td><td>Ethilon poliamid-6 precyzyjny szew do cięcia punktowego odwróconego</td></tr><tr><td>Stemple do biopsji (10 mm)</td><td>Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA</td><td>P1050</td><td></td></tr><tr><td>Stemple do biopsji (12 mm)</td><td>Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA</td><td>P1250</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy&nbsp;</td><td>Ricoh, Hannover, Niemcy</td><td>Cx1</td><td></td></tr><tr><td>Gazin Mullkompresse&nbsp;</td><td>Lohmann und Rauscher, Neuwied, Niemcy</td><td>13622</td><td>Sterylna gaza (10 cm x 10 cm)</td></tr><tr><td>Dwuwarstwowe rusztowanie na bazie kolagenu (8' x 10')</td><td>Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA</td><td>88101</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran, ciekły gaz do znieczulenia wziewnego&nbsp;</td><td>Baxter, Unterschleissheim, Niemcy</td><td>100196040</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital, 16 g / 100 ml</td><td>Fa. Merial, Hallbergmoos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuri Nu/Nu Myszy nade, CrLNU-Foxn1nu</td><td>Charles River, Sulzfeld, Niemcy</td><td>Kod szczepu 088</td><td>Atymiczne nagie myszy w wieku od 6 do 8 tygodni i o masie ciała od 20 do 25 g&nbsp;</td></tr><tr><td>Buprenorfina (0,3 mg/ml)</td><td>Essex Pharma GmbH, Monachium, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siatka tytanizowana (15 cm x 15 cm), ekstralekcyjna</td><td>PFM Medical AG, K&ouml; ln, Niemcy</td><td>6000029</td><td></td></tr><tr><td>Tissucol Duo S Immuno 2 ml</td><td>Baxter Germany GmbH, Unterschlei&szlig; heim, Niemcy</td><td>B1332020110614</td><td>Roztwór fibrynowo-trombinowy&nbsp;</td></tr><tr><td>Przezroczysta serweta samoprzylepna (30,5 cm x 26 cm)</td><td>KCI Medical Products, Wimborne Dorset, Wielka Brytania</td><td>M6275009/10</td><td></td></tr></tbody></table>

pełny model ubytku skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Niedostateczne unaczynienie jest uważane za jeden z głównych czynników ograniczających sukces kliniczny konstruktów inżynierii tkankowej. Aby ocenić nowe strategie, które mają na celu poprawę unaczynienia, potrzebne są wiarygodne metody, które uwidocznią wrastanie nowych naczyń krwionośnych w biosztuczne rusztowania i określą ilościowo wyniki. W ciągu ostatnich kilku lat nasza grupa wprowadziła pełny model defektu skóry, który umożliwia bezpośrednią wizualizację naczyń krwionośnych za pomocą transilluminacji oraz daje możliwość kwantyfikacji poprzez cyfrową segmentację. W tym modelu chirurgicznie tworzy się pełne defekty skóry w grzbiecie myszy i zastępuje je badanym materiałem. Cząsteczki lub komórki, które są przedmiotem zainteresowania, mogą być również włączone do takich materiałów w celu zbadania ich potencjalnego wpływu. Po wybranym przez siebie czasie obserwacji, materiały są eksplantowane do oceny. Rany obustronne dają możliwość dokonywania wewnętrznych porównań, które minimalizują artefakty między osobnikami, a także zmniejszania liczby zwierząt potrzebnych do badania. W porównaniu z innymi podejściami, nasza metoda oferuje prostą, wiarygodną i opłacalną analizę. Wdrożyliśmy ten model jako rutynowe narzędzie do wykonywania badań przesiewowych w wysokiej rozdzielczości podczas testowania unaczynienia różnych biomateriałów i podejść do bioaktywacji.

U myszy można stworzyć wiarygodny obustronny pełnowarstwowy defekt skóry (Rysunek 1), w którym skórę można zastąpić badanym biomateriałem (Rysunek 2). W tym przypadku nie zaobserwowano poważnych powikłań w trakcie ani po zabiegu operacyjnym, ani makroskopowych oznak infekcji czy reakcji na ciało obce. W rzadkich przypadkach rusztowanie zostaje utracone, gdy mysz je usunie. Nigdy nie zaobserwowano kurczenia się rany (Rysunek 3). Transluminacja tkanek pozwoliła na wyraźną ...

Unaczynienie jest kluczem do skutecznego podejścia do inżynierii tkankowej. W związku z tym potrzebne są niezawodne technologie do oceny rozwoju sieci naczyniowych w konstruktach tkankowych. Tutaj przedstawiamy prostą i opłacalną metodę wizualizacji i ilościowego określania unaczynienia in vivo.

Pełny model ubytku skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja naczyń krwionośnych w konstruktach inżynierii tkankowej. Cel ten osiąga się poprzez stworzenie standaryzowanego pełnowarstwowego ubytku skóry na grzbietach myszy. Następnie w ubytek skórny implantuje się próbkę materiału inżynierii tkankowej.Następnie, po zakończeniu czasu obserwacji, materiał jest implantowany i umieszczany w urządzeniu do transiluminacji. Na koniec, przy użyciu standardowej kamery cyfrowej, wykonuje się wysokorozdzielcze zdjęcia sieci naczyniowej. Ostatecznie sieć naczyń jest analizowana poprzez segmentację cyfrową i kwantyfikację z wykorzystaniem oprogramowania Vessel egg tool.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia, tomografia komputerowa czy rezonans magnetyczny, jest możliwość efektywnego czasowo i przyczynowo wizualizowania oraz ilościowego określania procesów naczyniowych w biomateriałach, z uwzględnieniem wszystkich nowych naczyń funkcjonalnych. Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat unaczynienia materiałów zastępczych skóry. Można ją również zastosować w odniesieniu do innych organizmów modelowych lub do badania unaczynienia w innych narządach.Na począt

a-full-skin-defect-model-to-evaluate-vascularization-biomaterials

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Model defektu pełnej skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo

Przedstawiamy metodę immunohistochemii całego preparatu oraz konfokalnej mikroskopii skaningowej z wielokrotnym znakowaniem w celu analizy tworzenia złożonej sieci naczyniowej w skórze kończyny zarodka myszy.

Analiza immunohistochemiczna całego preparatu dla naczyń krwionośnych skóry kończyny zarodkowej: model systemowy do badania morfogenezy rozgałęzień naczyniowych w zarodku

Celem tego protokołu jest stworzenie trójwymiarowego odpowiednika skóry o pełnej grubości, który przypomina naturalną skórę. Dzięki specjalnie skonstruowanemu zautomatyzowanemu urządzeniu do nawijania można generować precyzyjne i powtarzalne rany przy zachowaniu bezpłodności.

Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Do tej pory, grube ubytki tkanek są zazwyczaj rekonstruowane za pomocą autologicznych płatów tkankowych lub tkanek zmodyfikowanych. W niniejszym protokole przedstawiamy nową metodę inżynierii unaczynionego płata tkankowego z autologiczną szypułką, która ma służyć jako substytut płatów autologicznych.

Zaprojektowana unaczyniona płat mięśniowa

To jest wytyczne do konstruowania in vivo unaczynionej tkanki za pomocą mikrochirurgicznej pętli tętniczo-żylnej lub przepływowej konfiguracji szypułki wewnątrz komory inżynierii tkankowej. Powstałe unaczynione tkanki mogą być wykorzystane do regeneracji narządów i wymiany ubytków tkanek, a także do testowania leków i modelowania chorób.

Inżynieria tkankowa poprzez wewnętrzne unaczynienie w komorze inżynierii tkankowej in vivo

Opisujemy mikrochirurgiczne podejście do generowania pętli tętniczo-żylnej (AV) jako model do analizy unaczynienia in vivo w izolowanym i dobrze scharakteryzowanym środowisku. Model ten jest nie tylko przydatny do badania angiogenezy, ale jest również optymalnie przystosowany do inżynierii osiowo unaczynionych i przeszczepialnych tkanek.

Pętla tętniczo-żylna (AV) w małym modelu zwierzęcym do badania angiogenezy i inżynierii tkanek unaczynionych

Ten film demonstruje model do badania rozwoju przerostu mięśniowo-wewnętrznego, po operacji wstawiania żył u szczurów.

Model wstawiania żył: odpowiedni model do badania drożności przeszczepu bypassów

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

Tutaj opisane są dwa modele gojenia ran u myszy, jeden przeznaczony do oceny reakcji na gojenie się ran komórkowych i cytokinowych, a drugi do ilościowego określania szybkości zamykania ran. Metody te mogą być stosowane w złożonych modelach chorób, takich jak cukrzyca, w celu określenia mechanizmów różnych aspektów złego gojenia się ran.

Ocena ostrego gojenia się ran za pomocą grzbietowej podskórnej implantacji gąbki z polialkoholu winylowego i wycinających raki skóry ogona.

Przedstawiamy szczegółowy protokół generowania mysiego modelu ksenoprzeszczepu malformacji żylnej. Model ten opiera się na podskórnym wstrzyknięciu komórek śródbłonka pochodzących od pacjenta zawierających hiperaktywujące mutacje genu TIE2 i/lub PIK3CA. Zmiany ksenoprzeszczepowe ściśle odwzorowują cechy histopatologiczne tkanki pacjenta z VM.

Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta w przypadku malformacji żylnej

Celem tego protokołu jest opisanie generacji i analizy objętościowej unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry przy użyciu dostępnych i prostych technik dla długoterminowej hodowli. W miarę możliwości opisano uzasadnienie kroków, aby umożliwić badaczom dostosowanie ich do ich potrzeb badawczych.

Generacja samoorganizujących się unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry

Protokół ten opisuje technikę chirurgiczną pobierania ludzkiego modelu płata perforatora opartego na głębokim dolnym szypułku tętnicy nadbrzuszkowej, przeznaczonego do badań eksperymentalnych.

Eksperymentalny ludzki model płatów DIEP do badania strategii zachowania dla naczyniowych allograftów kompozytowych i płatów wolnych

Poznaj metodę wizualizacji naczyń krwionośnych w konstruktach inżynierii tkankowej przy użyciu mysiego modelu ubytku skóry. Technika ta umożliwia analizę unaczynienia biomateriałów in vivo.

Pełny model ubytku skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo

Przeglądaj więcej filmów