Pełny model ubytku skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo
28 sierpnia 2014
Unaczynienie jest kluczem do skutecznego podejścia do inżynierii tkankowej. W związku z tym potrzebne są niezawodne technologie do oceny rozwoju sieci naczyniowych w konstruktach tkankowych. Tutaj przedstawiamy prostą i opłacalną metodę wizualizacji i ilościowego określania unaczynienia in vivo.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja naczyń krwionośnych w konstruktach inżynierii tkankowej. Osiąga się to poprzez stworzenie standaryzowanego pełnego defektu skóry na grzbietach myszy. Następnie próbka materiału inżynierii tkankowej jest wszczepiana do ubytku skóry.
Następnie, pod koniec czasu obserwacji, materiał jest wszczepiany i umieszczany w urządzeniu do oświetlania trans. Na koniec zdjęcia sieci naczyniowej w wysokiej rozdzielczości są uzyskiwane za pomocą standardowego aparatu cyfrowego. Ostatecznie sieć zbiorników jest analizowana poprzez cyfrową segmentację i kwantyfikację za pomocą oprogramowania narzędziowego Vest egg.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia, tomografia komputerowa czy rezonans magnetyczny, jest to, że pozwala na efektywną wizualizację i kwantyfikację procesów naczyniowych w biomateriałach, skupiając wszystkie nowe funkcjonalne naczynia. Metoda ta może zapewnić wgląd w unaczynienie materiałów zastępczych skóry. Może być również stosowany do innych organizmów modelowych lub do badania unaczynienia w innych narządach.
Na początek użyj 12-milimetrowych stempli biopsyjnych, aby wygenerować próbki rusztowań, takich jak bydlęce, materiały zastępcze skóry na bazie kolagenu wytnij okrągłe kawałki siatki tetynowej o średnicy 14 milimetrów do umieszczenia pod każdym rusztowaniem. Po znieczuleniu myszy sprawdzenie głębokości znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi i usunięcie sierści z tyłu zgodnie z protokołem tekstowym. Umieść zwierzę w pozycji leżącej i użyj stałego pisaka z cienką końcówką, aby zaznaczyć linię środkową grzbietu myszy.
Określ obszar cięcia, który nie jest zbyt daleko, aby uniemożliwić zwierzęciu usunięcie rusztowania. Za pomocą 10-milimetrowego stempla biopsyjnego utwórz okrągłe obustronne ubytki, ostrożnie dociskając stempel do skóry. Aby wyznaczyć obszar wycięcia za pomocą kleszczy, delikatnie zdejmij zaznaczoną skórę i użyj nożyczek chirurgicznych, aby naciąć wzdłuż zaznaczonego okręgu.
Jeśli wystąpi krwawienie, użyj sterylnej gazy, aby ostrożnie ścisnąć obszar, aby zrobić miejsce na siatkę Titanic. Rozszerz separację skóry i leżącej pod nią tkanki na granicy rany i dodatkowe dwa do czterech milimetrów. Umieścić siatkę w ubytku bezpośrednio na łożysku rany i pod krawędziami rany.
Następnie umieść rusztowania bezpośrednio nad siatką. Użyj czterech do sześciu pojedynczych węzłów, aby zszyć rusztowanie, tak aby sąsiednie krawędzie rany pozostawiały krawędzie lekko nad rusztowaniem. Następnie zszyj przezroczysty opatrunek na ranę nad ubytkami, aby chronić rusztowanie, a jednocześnie umożliwić monitorowanie obszaru rany.
Oceniaj, oceniaj ogólny stan zwierzęcia codziennie, monitorując aktywność motoryczną, masę ciała, oznaki bólu, tolerancję na opatrunk i samookaleczenie. Należy również monitorować obszar rany pod kątem krwawienia, miejscowych i ogólnoustrojowych objawów zakażenia oraz umiejscowienia opatrunku. Po eutanazji zwierzęcia w pożądanym punkcie czasowym.
Zgodnie z protokołem tekstowym użyj trwałego markera, aby oznaczyć miejsce wycięcia, w którym znajdują się rusztowania. Za pomocą nożyczek lub skalpela naciąć skórę wzdłuż zaznaczonych linii przez wycięcie, oderwij całą skórę, w tym rusztowania i siatkę od tkanki znajdującej się pod spodem, umieść tkankę rozciągniętą do góry nogami na szalce Petriego. Aby zobrazować próbkę, umieść ją nad urządzeniem do oświetlenia trans.
W trybie makro zrób zdjęcia całych rusztowań i obszarów normalnej skóry o jednakowej wielkości i zapisz obrazy w formacie TIFF do dalszej analizy cyfrowej. Po pobraniu oprogramowania ves EQ tool otwórz obraz i wybierz interesujący Cię obszar do analizy, naciskając Backspace. Następnie naciśnij odwróć.
Aby zobrazować sieć naczyniową w kolorze białym, wybierz obraz filtra poprawy naczyń krwionośnych, histerezy progującej transformację cylindra i oblicz wzmocnienie naczyń we wszystkich poprzednich krokach. Przewiń, aby powiększyć lub pomniejszyć obraz. Podziel mapę statku na segmenty, wybierając pierwszy próg lub pokrycie statku, tak aby każdy piksel, który nawet w niewielkim stopniu przypomina statek, został oznaczony jako statek.
Naciśnij przycisk Oblicz. Aby wyświetlić podgląd zaznaczenia, wybierz drugi próg lub pokrycie tła, tak aby tylko te piksele, które są szczególnie podobne do naczyń, były oznaczone jako naczynia. Aby obliczyć długość naczyń i całkowitą powierzchnię przez nie pokrytą, kliknij na obraz, statystyki obrazu i binarne statystyki obrazu.
Długość naczynia najlepiej oszacować poprzez wstępne rozrzedzenie sieci naczyniowej do szerokości jednego piksela. W tym celu przejdź do filtrów morfologicznych obrazu i szkieletyzacji przed obliczeniami. Stosunek powierzchni statku do długości statku daje wartość dla wielkości statku w obszarze zainteresowania.
W razie potrzeby wyeliminuj artefakty, wybierając tylko interesujące Cię naczynia. Klikając pod trybem zaznaczania, naciśnij Backspace, aby skopiować wybrane naczynia do nowego obrazu. Na koniec przeanalizuj natywny obszar skóry pod tymi samymi parametrami, co rusztowanie, przypisując wartość 100% do tkanki natywnej i odnieś rusztowanie do tej wartości.
Na przykład, jeśli procent białych pikseli wynosi 30% w normalnej tkance i 15% w rusztowaniu, oznacza to 50% unaczynienia całkowitej powierzchni rusztowania. Należy pamiętać, że wartości odpowiadają całemu obszarowi obrazu. Dlatego konieczne jest skorygowanie go do obszaru wybranego regionu, jak pokazano tutaj.
Dwa tygodnie po implantacji tkanki oświetlenie trans umożliwiło wyraźną wizualizację struktur naczyniowych o szerokości do 30 mikrometrów w całej próbce tkanki, która obejmowała zarówno tkankę natywną, jak i wszczepione rusztowania. Wykorzystując segmentację cyfrową do analizy poziomu unaczynienia tkanek eksplantowanych wynoszącego 62,28 plus minus 8,6% zaobserwowano w rusztowaniu w porównaniu ze skórą natywną. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o stworzeniu powtarzalnych pełnych defektów skóry i niezawodnym przymocowaniu biomateriału do rany.
Po tej procedurze rozszerzoną tkankę można wykorzystać do dalszej analizy, takiej jak histologia lub ekspresja RNA i białka.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę wizualizacji i kwantyfikacji unaczynienia w konstruktach inżynierii tkankowej. Dzięki wykorzystaniu ustandaryzowanego modelu defektu skóry u myszy można skutecznie przeanalizować sieć naczyniową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Biologia naczyniowa
- Obrazowanie in vivo
Wstęp
- Unaczynienie jest kluczowe dla sukcesu inżynierii tkankowej.
- Konieczne są niezawodne technologie do oceny sieci naczyniowych.
- Obecne metody mogą charakteryzować się niską opłacalnością i stopniem skomplikowania.
- Celem niniejszego badania jest wypełnienie tych luk.
Cel badania
- Wizualizacja naczyń krwionośnych w konstruktach inżynierii tkankowej.
- Opracowanie kosztowo efektywnej metody analizy sieci naczyniowej.
- Pogłębienie zrozumienia procesów unaczynienia w inżynierii tkankowej.
Zastosowane metody
- Utworzenie zestandaryzowanego pełnowarstwowego ubytku skóry u myszy.
- Implantacja materiału inżynierii tkankowej w miejsce ubytku.
- Zastosowanie urządzenia do oświetlenia prześwitowego w celu obrazowania.
- Fotografia sieci naczyniowej w wysokiej rozdzielczości.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja naczyń krwionośnych w konstruktach.
- Ilościowe określenie sieci naczyniowej przy użyciu segmentacji cyfrowej.
- Wykorzystanie oprogramowania Vest egg tool do analizy.
- Wykazanie skuteczności i efektywności kosztowej opisanej metody.
Wnioski
- Metoda ta stanowi niezawodny sposób oceny unaczynienia.
- Może ona zostać zastosowana w różnych badaniach z zakresu inżynierii tkankowej.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym podejściu w celu uzyskania lepszych wyników.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodna kwantyfikacja unaczynienia w biomateriałach stanowi krytyczny punkt zwrotny w rozwoju konstruktów inżynierii tkankowej w kierunku walidacji translacyjnej i przedklinicznej. Ten model całkowitego defektu skóry umożliwia bezpośrednią, wysokorozdzielczą wizualizację oraz cyfrową kwantyfikację neowaskularyzacji, co zwiększa pewność predykcyjną w ocenie wydajności rusztowań. Podejście to usprawnia wczesną redukcję ryzyka oraz selekcję kandydackich biomateriałów przeznaczonych do zastosowań w medycynie regeneracyjnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią weryfikację hipotez dotyczących unaczynienia w rusztowaniach inżynieryjnych.
- Wspiera funkcjonalną walidację modyfikacji proangiogennych lub włączonych cząsteczek bioaktywnych.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez ilościową ocenę wrastania naczyń in vivo.
- Zapewnia porównawcze kontrole wewnętrzne dzięki obustronnemu modelowi rany, co zmniejsza zmienność międzyosobniczą.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne warunki testów in vivo do oceny biomateriałów.
- Generuje wyniki ilościowe dzięki cyfrowej segmentacji i wskaźnikom pokrycia naczyń.
- Umożliwia wysokorozdzielcze przesiewanie wielu formulacji rusztowań lub strategii bioaktywacji.
- Pozwala na ponowne wykorzystanie platformy do iteracyjnej optymalizacji właściwości unaczynienia.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami regeneracji tkanek i medycyny regeneracyjnej istotnymi dla przebiegu chorób.
- Zapewnia ciągłość od etapu oceny rusztowań w fazie odkryć po przedkliniczną walidację integracji naczyniowej.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu, skorygowane o ryzyko, w oparciu o ilościowe punkty odniesienia unaczynienia.
- Umożliwia przeprowadzenie analizy końcowej, takiej jak badania histologiczne lub profilowanie molekularne wyeksplantowanej tkanki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten stanowi pomost między wczesną fazą odkryć a oceną przedkliniczną, zapewniając standaryzowany schemat postępowania w celu oceny unaczynienia biomateriałów in vivo.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących potencjału angiogennego i zaangażowania szlaków sygnałowych w konstrukcjach inżynieryjnych.
- Przesiewanie: Umożliwia powtarzalne, ilościowe porównywanie wariantów rusztowań oraz metod bioaktywacji.
- Analityka: Dostarcza wskaźników długości, powierzchni i stopnia pokrycia naczyń za pomocą cyfrowej analizy obrazu, co pozwala na podejmowanie decyzji w oparciu o rzetelne dane.
- Badania translacyjne: Ułatwia dostosowanie do punktów końcowych medycyny regeneracyjnej oraz przedklinicznych wymagań dotyczących integracji tkanek.
- Wykorzystanie przedsiębiorstwa: Tworzy skalowalną i kosztowo efektywną platformę testową do ciągłej oceny potoku biomateriałów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie unaczynienia rusztowania i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ocenę in vivo, poprawia powtarzalność i wspiera skalowalne badania przesiewowe.
- Wartość strategiczna: Stanowi podstawę do podejmowania decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań oraz optymalizuje alokację zasobów poprzez kwantyfikację kluczowych punktów końcowych biologii.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na biomateriały do dalszego rozwoju z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu chirurgii małych zwierząt oraz leczenia ran.
- Niezbędny jest dostęp do obrazowania przezświetleniowego i oprogramowania do analizy cyfrowej (np. narzędzia Vest egg tool).
- W celu zapewnienia powtarzalności wymagana jest standaryzacja protokołów chirurgicznych i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Metoda jest adaptowalna do różnych typów rusztowań i potencjalnie do innych układów organów po wprowadzeniu modyfikacji protokołu.
- Ograniczenia obejmują konieczność starannego minimalizowania artefaktów oraz korekty obszaru zainteresowania podczas analizy.
