Name: Przeprogramowanie linii komórek pochodzących z perycytów mózgu dorosłego człowieka na neurony indukowane (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T21:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj metodę przeprogramowania perycytów mózgu na neurony indukowane przy użyciu wektorów retrowirusowych. Technika ta umożliwia bezpośrednią konwersję komórek endogennych bez konieczności transplantacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni dr Magdalenie Götz za jej wkład podczas opracowywania tego protokołu. Dziękujemy dr Mariusowi Wernigowi (Uniwersytet Stanforda) za hojne udostępnienie nam sekwencji kodowania sox2. Jesteśmy również bardzo wdzięczni dr Alexandrze Lepier za produkcję wirusa. Prace te były wspierane przez granty Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) i BMBF (01GN1009A) dla B.B., a Bawarskie Ministerstwo Nauki, Badań Naukowych i Sztuki dla M.K. i B.B. C.S. otrzymało finansowanie z dwunarodowego Wirtualnego Instytutu SYSTHER-INREMOS (niemieckie i słoweńskie federalne ministerstwa edukacji i badań naukowych) oraz DFG (SFB 824).

1. Izolacja i hodowla komórek mózgowych dorosłego człowieka
Eksperymenty z udziałem tkanek ludzkich powinny być przeprowadzane zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi regulacjami rządowymi i instytucjonalnymi dotyczącymi wykorzystania materiału ludzkiego do celów badawczych. Niniejszy protokół został opracowany zgodnie z aprobatą komisji etycznej Wydziału Medycznego LMU w Monachium i pisemną świadomą zgodą wszystkich pacjentów.
Ten protokół przygotowania kultur ludzkiej dorosłej kory mózgowej został opracowany przy użyciu próbek pacjentów obu płci cierpiących na padaczkę skroniową lub inne głęboko osadzone, nieurazowe, niezłośliwe zmiany. Tkanka pobrana z sali operacyjnej stanowiła wyłącznie kanał dostępowy do uszkodzenia mózgu i dlatego jest uważana za zdrową. Przedział wiekowy pacjentów wynosił 19-70 lat.
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę wzrostową, dodając inaktywowaną termicznie płodową surowicę cielęcą (FCS) do DMEM o wysokiej zawartości glukozy za pomocą GlutaMAX, aby uzyskać końcowe stężenie 20% FCS. Dodać 5 ml penicyliny/streptomycyny do łącznie 500 ml pożywki wzrostowej. Wykonaj ten i wszystkie kolejne kroki wymagające sterylnych warunków hodowli w odpowiednim okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Biopsję mózgu dorosłego człowieka uzyskaną na sali operacyjnej należy przechowywać w zrównoważonym roztworze soli Hanksa z pożywką CaCl2 i MgCl2 (HBSS), w tym HEPES (10 mM stężenie końcowe) na lodzie do czasu przetworzenia. Rozpocznij przetwarzanie tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>Aby rozpocząć dysocjację na pojedyncze komórki, przenieś tkankę na szalkę Petriego o średnicy 65 mm i zmiel na małe kawałki za pomocą dwóch sterylnych skalpeli jednorazowego użytku. Do trawienia enzymatycznego należy użyć 3-6 ml TrypLE w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i inkubować przez 15-30 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Dodać 1 objętość wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej w celu ułatwienia dysocjacji i delikatnie rozprowadzić roztwór zawierający kawałki tkanki w górę i w dół, najpierw używając jednorazowej pipety o pojemności 5 ml, a następnie używając szklanej pipety Pasteura aż do homogenizacji zawiesiny komórek. Zazwyczaj niektóre resztkowe fragmenty tkanki, składające się głównie z istoty białej, pozostają w zawiesinie.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 157 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej ilości podłoża wzrostowego (10 ml na niepowlekaną kolbę hodowlaną T75). Do biopsji o średnicy 5-10 mm należy użyć jednej kolby hodowlanej T75 i z niej ekstrapolować w przypadku większych próbek.</li>
	<li>Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5% O2 .</li>
	<li>Wymieniaj połowę pożywki co 3-4 dni, aż komórki osiągną zbieg. Zwykle trwa to do dwóch tygodni (określane jako przejście 0 [P0]).</li>
</ol>
2. Ekspansja in vitro i charakterystyka komórek mózgowych dorosłego człowieka
<ol>
	<li>Ekspansja in vitro:
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę hodowlaną i przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), przechowywaną w temperaturze pokojowej, przed dodaniem 3 ml TrypLE.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut, aż większość komórek się odłączy. Delikatnie postukać w kolby, aby ułatwić podnoszenie komórek; Po dodaniu 3 objętości pożywki wzrostowej, przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować w dół przy 157 x G przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Pasaż komórek w stosunku 1:3 w celu uzyskania optymalnej wydajności do nowych kolb do hodowli komórkowych T75. 
		Uwaga: Przeszliśmy te komórki aż do P5 bez żadnych oznak zmniejszonej wydajności przeprogramowywania. O ile w P0 hodowla zawiera znaczną frakcję komórek śródbłonka (ocenianą na podstawie ekspresji CD34), o tyle przy kolejnych pasażach ich liczba staje się znikoma.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Charakterystyka kultur mózgu dorosłego człowieka:
	<ol>
		<li>Immunocytochemia:
		<ol>
			<li>W celu scharakteryzowania komórek, wysiewaj ~ 60 000 komórek na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną w 500 μl świeżej pożywki wzrostowej na 24-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5% O2 .</li>
			<li>Do analizy immunocytochemicznej hodowanych ludzkich komórek mózgowych należy usunąć pożywkę i przemyć 3x 1 ml PBS.</li>
			<li>Utrwal komórki, dodając 500 μl 4% paraformaldehydu w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Przenieś szkiełka szklanej pokrywy do odpowiedniej wilgotnej komory barwienia i zablokuj 80 μl PBS zawierającej 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,5% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Dodać przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w tym samym roztworze (współczynniki rozcieńczenia znajdują się w tabeli określonych odczynników i wyposażenia) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
			Uwaga: Znaczna, ale zmienna część komórek na tym etapie hodowli jest immunoreaktywna na β receptora płytkowego czynnika wzrostu (PDGFRβ), klaster różnicowania 146 (CD146), proteoglikan siarczanu chondroityny NG2 i aktynę mięśni gładkich (SMA), tj. markery charakterystyczne dla perycytów związanych z mikronaczyniami. Tylko mniejszość (<1%) wykazuje ekspresję markerów astrogleju: kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) i S100β. Ponadto na tym etapie hodowla powinna być pozbawiona jakichkolwiek komórek wykazujących ekspresję markera neuronalnego βIII-tubuliny. Użyj wielu kombinacji przeciwciał pierwszorzędowych do wspólnego znakowania różnych markerów. Dalsze potwierdzenie ekspresji markerów glejowych, neuronalnych, śródbłonka i perycytów można uzyskać za pomocą odwrotnej transkrypcji i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (nieopisanej w tym protokole).</li>
			<li>Po inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi przemyć trzykrotnie 1 ml PBS i dodać odpowiednie przeciwciała drugorzędowe (w odpowiednich rozcieńczeniach) do roztworu barwiącego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj komórki 3x PBS. W razie potrzeby przed montażem należy zabarwić go DAPI przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Użyj środka montażowego zapobiegającego blaknięciu i przeanalizuj szkiełka nakrywkowe za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Cytometria przepływowa:
		<ol>
			<li>W celu analizy ekspresji markera powierzchniowego za pomocą cytometrii przepływowej, hoduj komórki do konfluencji w niepowlekanych kolbach do hodowli komórkowych T25 lub T75.</li>
			<li>Odłączyć komórki za pomocą TrypLE zgodnie z wcześniejszym opisem i ponownie zawiesić w roztworze barwiącym składającym się z PBS + 0,5% BSA. Na reakcję barwienia ponownie zawieś 100 000-200 000 komórek w 100 μl roztworu barwiącego. Przygotować pojedyncze reakcje barwienia dla każdego użytego przeciwciała (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, odpowiednie przeciwciała kontrolne izotypu).</li>
			<li>Dodać przeciwciała sprzężone z fluorochromem do każdego roztworu barwiącego (w celu rozcieńczenia, patrz tabela określonych odczynników i sprzętu) bezpośrednio do zawiesiny komórkowej i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut w ciemności.</li>
			<li>Przemyć komórki trzykrotnie 500 μl PBS i odwirowywać między każdym etapem płukania przy 157 x g przez 5 minut.</li>
			<li>Zawiesić osad komórkowy w 0,5-1 ml roztworu barwiącego i przenieść komórki przez sitko do komórek (70 μm) do probówek FACS. Chronić próbkę przed działaniem światła.</li>
			<li>Wiruj próbki przed umieszczeniem ich w instrumencie FACS.</li>
			<li>Aby przeanalizować żywe komórki i wykluczyć szczątki i agregaty komórek, należy zastosować bramkę dla FSC-A i SSC-A. Duplikaty komórek są specjalnie bramkowane przez FSC-A i FSC-W. Aby określić właściwe warunki bramkowania dla markerów powierzchni komórki, należy ustawić bramki z kontrolą przeciwciał dopasowanych do izotypu sprzężonych z odpowiednim fluorochromem. Następnie określ proporcję komórek związanych z przeciwciałami.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wzbogacanie komórek pochodzących z pericytów przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją
<ol>
	<li>Oczyść populację komórek perycytów (zawieszonych w pożywce wzrostowej) przed transdukcją poprzez sortowanie FACS za pomocą dyszy 70 μm. Użyj CD34-APC w połączeniu z CD140b-PE i CD146-FITC, aby wybrać perycyty. Sortuj według komórek CD34-ujemnych, CD140b i CD146-dodatnich.</li>
	<li>Zebrać posortowane komórki w pożywce wzrostowej i rozłożyć na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną na 24-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5 %O2 .</li>
	<li>Po upływie 48 godzin od sortowania zastąpić pożywkę świeżą pożywką wzrostową i przeprowadzić transdukcję zgodnie z opisem w protokole 4.</li>
</ol>
4. Transdukcja retrowirusowa komórek pochodzących z pericytów i przeprogramowanie na neurony indukowane
Uwaga: Zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi bezpieczeństwa biologicznego podczas obchodzenia się z cząstkami retrowirusowymi. W Niemczech stosowanie retrowirusów wymaga 2. poziomu bezpieczeństwa biologicznego. Informacje na temat produkcji cząstek retrowirusowych znajdują się w protokole6. Aby zapoznać się z konstruktami retrowirusowymi używanymi do przeprogramowania, zapoznaj się z Karow et al. (2012) . Retrowirusy były pseudotypowane za pomocą VSV-G (wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej – glikoproteina)5. Dla produkcji patrz Gavrilescu i wsp. 6.
<ol>
	<li>24 godziny przed transdukcją retrowirusową wysiew ~ 60 000 komórek na szkle pokrytym poli-D-lizyną szkiełka nakrywkowe w 500 μl świeżej pożywki wzrostowej na 24-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5% O2 .</li>
	<li>Następnego dnia zastąp pożywkę wzrostową 500 μl świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej i dodaj 1 μl odpowiednich skoncentrowanych supernatantów zawierających cząstki retrowirusowe (pCAG-IRES-dsred do kontroli, szczególnie podczas ustalania protokołu w laboratorium), pCAG-ascl1-IRES-dsred, pCAG-sox2-IRES-gfp.</li>
	<li>Dzień później usuń pożywkę wraz z cząsteczkami wirusa z komórek i dodaj 1 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej B27, składającej się z 49 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy z GlutaMAX i 1 ml suplementu B27 bez surowicy. Utrzymywać komórki w hodowli w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i 5%O2 przez 4-8 tygodni bez zmiany pożywki, ponieważ powtarzające się zmiany pożywki stają się szkodliwe w miarę dojrzewania iN.</li>
</ol>
5. Charakterystyka neuronów indukowanych za pomocą immunocytochemii
<ol>
	<li>W celu określenia tożsamości komórkowej transdukowanych komórek, w szczególności w celu wykazania nabycia fenotypu neuronalnego, należy przeprowadzić immunocytochemię przeciwko antygenom neuronalnym, takim jak bIII-tubulina, MAP2 i NeuN (dla przeciwciał i ich odpowiednich rozcieńczeń, patrz tabela specyficznych odczynników i sprzętu; postępuj zgodnie z tą samą procedurą, jak wskazano w 2.2.1).</li>
	<li>Aby poprawić dojrzewanie PdiN, należy hodować te komórki razem z neuronami pochodzącymi z kory mózgowej myszy E14. W tym celu należy rozciąć korę mózgową i mechanicznie oddzielić tkankę za pomocą wypolerowanej ogniowo szklanej pipety Pasteura. Dodaj 10 000-50 000 mysich neuronów do kultur komórek pochodzących z pericytów 2-3 tygodnie po transdukcji retrowirusami kodującymi sox2 i ascl1 i kontynuuj hodowlę. Transdukowane komórki można odróżnić od neuronów mysich na podstawie ich ekspresji reporterowej (GFP i dsRed), albo przez żywą epifluorescencję, albo po immunocytochemii dla GFP i dsRed.</li>
	<li>Aby ocenić tworzenie synaps na PdiN przez neurony mysie, należy przeprowadzić immunocytochemię przeciwko pęcherzykowym receptorom neuroprzekaźników, takim jak pęcherzykowy transporter glutaminianu 1 (vGluT1).</li>
	<li>Sonda transdukowała komórki pod kątem ich właściwości elektrycznych (tj. zdolności do generowania potencjałów czynnościowych) i tworzenia funkcjonalnych synaps za pomocą elektrofizjologii patch-clamp. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat procedury, patrz Heinrich et al. (2011) .</li>
</ol>

<ol><li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integration+of+dopaminergic+neurons+directly+converted+from+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts.</a> Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+water+deficit%2C+ABA%2C+and+provenances+in+Picea+asperata%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata.</a> Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Karow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+pericyte-derived+cells+of+the+adult+human+brain+into+induced+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells.</a> Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).</li>
<li>Ortega, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+adherent+cell+culture+of+the+mouse+subependymal+zone+to+study+the+behavior+of+adult+neural+stem+cells+on+a+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level.</a> Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).</li>
<li>Ladewig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+enable+highly+efficient+neuronal+conversion+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts.</a> Nat Methods. 9, 575-578 (2012).</li>
<li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77, 440-456 (2013).</li>
<li>Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+reduction+in+oxygen+tension+enhances+the+induction+of+neurons+from+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts.</a> J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463, 1035-1041 (2010).</li>
<li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Integration-free+and+Region-Specific+Neural+Progenitors+from+Primate+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts.</a> Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).</li>
<li>Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neuronal+cells%3A+how+to+make+and+define+a+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced neuronal cells: how to make and define a neuron.</a> Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).</li>
<li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476, 220-223 (2011).</li>
<li>Yoo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+conversion+of+human+fibroblasts+to+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons.</a> Nature. 476, 228-231 (2011).</li>
<li>Son, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+into+functional+spinal+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons.</a> Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).</li>
<li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+into+stably+expandable+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).</li>
<li>Yang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oligodendroglial+cells+by+direct+lineage+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion.</a> Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+reprogramming+of+fibroblasts+to+expandable%2C+myelinogenic+oligodendrocyte+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy protokół opisuje in vitro ekspansję i wzbogacanie komórek pochodzących z perycytów po izolacji z kory mózgowej dorosłego człowieka, a następnie przekształceniu w iNs przez ekspresję neurogennych czynników transkrypcyjnych Sox2 i Ascl1 za pośrednictwem retrowirusa. Taki protokół zapewnia eksperymentalny system in vitro do badania konwersji linii komórek rezydujących w mózgu w neurony, a potencjalnie także w komórki glejowe, mając na celu ostateczne przełożenie tego bezpośredniego podejścia do k...

W przeciwieństwie do przeprogramowania komórek somatycznych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), które z kolei są obdarzone mnóstwem potencjałów różnicowania, bezpośrednie przeprogramowanie ma na celu prostą konwersję jednego konkretnego typu komórki na inny. Jeśli chodzi o ich zastosowanie w kontekście modelowania chorób i potencjalnych terapii komórkowych, oba podejścia do przeprogramowywania mają określone zalety i wady. Przeprogramowanie na iPSC (i) zapewnia praktycznie nieskończone źródło komórek; (ii) pozwala na inżynierię genetyczną; (iii) obdarza niemal nieograniczonym potencjałem różnicowania. Jednak główne wady iPSC wiążą się z ryzykiem rakotwórczości niezróżnicowanych komórek (powstawanie potworniaków in vivo) oraz koniecznością hodowli ex vivo, a następnie przeszczepiania, jeśli komórki te mają być wykorzystywane w terapiach komórkowych. I odwrotnie, bezpośrednie przeprogramowanie linii jest ograniczone przez niższą wydajność pożądanych komórek, która jest bezpośrednio skorelowana z liczbą komórek docelowych w populacji wyjściowej, ale ma tę zaletę, że komórki przeprogramowane przez linię wydają się nie wykazywać ryzyka rakotwórczego po przeszczepieniu1,2; Co więcej, bezpośrednie przeprogramowanie można osiągnąć nawet in situ, tj. w narządzie, w którym komórki te byłyby wymagane, unikając w ten sposób konieczności przeszczepu.
Mając to na uwadze, nasze laboratorium badało możliwość przeprogramowania komórek rezydujących w mózgu na iNs jako nowatorskie podejście do terapii chorób neurodegeneracyjnych opartych na komórkach. Komórki rezydujące w mózgu, które mogą być potencjalnie uważane za cele komórkowe do przeprogramowania linii, obejmują różne typy makrogleju (astrocyty, komórki NG2 i oligodendrocyty), mikroglej i komórki związane z mikronaczyniami (komórki śródbłonka i perycyty). Dokładnie badaliśmy potencjał przeprogramowania in vitro astrogleju kory mózgowej myszy we wczesnym okresie postnatalnym3-5. W poszukiwaniu podobnie odpowiednich źródeł komórek do bezpośredniego przeprogramowania linii w mózgu dorosłego człowieka, natknęliśmy się na populację komórek, które można z powodzeniem przeprogramować na iN i wykazywać cechy charakterystyczne dla perycytów. Tutaj opisujemy protokół, w jaki sposób pobrać te komórki z biopsji mózgu dorosłego człowieka, aby rozszerzyć i wzbogacić te komórki in vitro, a na koniec skutecznie przeprogramować znaczną część tych rozszerzonych komórek in vitro (w zakresie 25-30%) na iNs. Przeprogramowanie można osiągnąć poprzez jednoczesną koekspresję dwóch czynników transkrypcyjnych, sox2 i ascl1, w której pośredniczy retrowirus. Stwierdzono, że te PdiN nabywają zdolność do powtarzalnego wystrzeliwania potencjału czynnościowego i służą jako cele synaptyczne dla innych neuronów, co wskazuje na ich zdolność do integracji z sieciami neuronowymi. Nasz protokół zapewnia prostą procedurę izolacji i konwersji linii perycytów mózgu dorosłego człowieka do iNs.

<table><tbody><tr><td>anty-CD140b-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558821</td><td>stosować</td></tr><tr><td>anty-CD146-FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA2141FT</td> stosować anty-CD13-FITC w <td>skali 1:100</td></tr><tr><td></td><td>AbD Serotec</td><td>MVA1270A488T</td> stosować anty-CD34-APC w <td>skali 1:100</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>anty-PDGFR</td></tr><tr><td>&beta;</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>3169S</td><td>użyj 1:200</td></tr><tr><td>anty-CD146</td><td>Abcam</td><td>Ab75769</td><td>użyj 1:400</td></tr><tr><td>anty-NG2</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td>użyj 1:400</td></tr><tr><td>anty-SMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2547</td><td>użyj 1:400</td></tr><tr><td>anty-&beta; III-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8660</td><td>zastosowanie</td></tr><tr><td>anty-MAP2 1:400 użycie anty-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4403</td><td>użycie 1:200</td></tr><tr><td>anty-GFAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3893</td><td>użycie 1:600</td></tr><tr><td>anty-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP 10-20</td><td>użycie 1:1,000</td></tr><tr><td>anty-RFP</td><td>Chromotek</td><td>5F8</td><td>użycie 1:500</td></tr><tr><td>anty-S100&beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td>użyj 1:300</td></tr><tr><td>anty-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td>użyj 1:200</td></tr><tr><td>anty-GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2052</td><td>użyj 1:500</td></tr><tr><td>anty-kalretyniny</td><td>Millipore</td><td>AB5054</td><td>użyj 1:500</td></tr><tr><td>anty-vGluT1</td><td>SYstemy SYnattyczne</td><td>135511</td><td>użyj 1:1,000</td></tr><tr><td>Kontrola izotypu IgG1 szczura FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>11-4301-81</td><td>zastosowanie 1:100</td></tr><tr><td>Kontrola izotypu IgG1 szczura PE</td><td>AbD Serotec</td><td>12-4301-81</td><td>zastosowanie 1:100</td></tr><tr><td>Kontrola izotypu IgG1 szczura APC</td><td>AbD Serotec</td><td>17-4301-81</td><td>zastosowanie 1:100</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza, GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>61965</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement bez surowicy</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>płodowej surowicy cielęcej</td><td>Invitrogen</td><td>10106-169</td><td>przeprowadzić inaktywację cieplną przez inkubację w temperaturze 56 &; C przez 30 min</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)</td><td>Invitrogen</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>PBS firmy Dulbecco bez CaCl2 i MgCl2 (D-PBS, 1x)</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna bromowodorek (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>PFA (paraformaldehyd)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-Diamidin-2-fenyloindol) dilactan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>042M4005</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Poly/ Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Rury z okrągłym dnem z polipropylenu&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowe rurki okrągłodenne z nakrętką z sitkiem komórkowym&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki</td><td>Orange Scientific</td><td>5530305</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 termosy</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2</td> termosy <td>Greiner Bio-One</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>Pipety jednorazowe 10 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>Szklany Pasteur pipety (150 mm)</td><td>Fisherbrand</td><td>FB50251</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane o średnicy 12 mm</td><td>Menzel</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgiczne skalpele jednorazowe&nbsp;</td><td>B. Braun</td><td>5518083</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Okap</td><td></td><td></td><td></td>z przepływem laminarnym</tr><tr><td>Wirówka i rotor wychylny z adapterami do probówek 15 ml i 50 ml</td><td>Hettich Lab Technology</td><td>1406</td><td></td></tr><tr><td>Sortownik komórek do cytometrii przepływowej: FACSAria l z oprogramowaniem FACSDiva&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humifikowany inkubator do hodowli komórkowych</td><td>Eppendorf Galaxy 170R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wanher wanna w 37 & stopni; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSPodcień do osłonek dolnych&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny BX61</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przeprogramowanie linii komórek pochodzących z perycytów mózgu dorosłego człowieka na neurony indukowane

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Bezpośrednie przeprogramowanie komórek nieneuronalnych na neurony indukowane (iNs) może dostarczyć wglądu w mechanizmy molekularne leżące u podstaw neurogenezy i umożliwić nowe strategie modelowania in vitro lub naprawy chorego mózgu. Zidentyfikowanie typów komórek nieneuronalnych rezydujących w mózgu, które można bezpośrednio przekształcić w iNs, może pozwolić na wprowadzenie takiego podejścia in situ, tj. w uszkodzonej tkance mózgowej. W tym miejscu opisujemy protokół opracowany w celu identyfikacji komórek pochodzących z mózgu dorosłego człowieka, które spełniają to założenie. Protokół ten obejmuje: (1) hodowlę komórek ludzkich z kory mózgowej uzyskanych z biopsji mózgu dorosłego człowieka; (2) ekspansja in vitro (wymagająca około 2-4 tygodni) i charakterystyka hodowli za pomocą immunocytochemii i cytometrii przepływowej; (3) wzbogacanie poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) przy użyciu przeciwciał anty-PDGF przeciwko receptorowi β i anty-CD146; (4) transdukcja za pośrednictwem retrowirusa z neurogennymi czynnikami transkrypcyjnymi SOX2 i ASCL1; (5) i wreszcie charakterystyka powstałych neuronów indukowanych pochodzących z perycytów (PdiN) za pomocą immunocytochemii (14 dni do 8 tygodni po transdukcji retrowirusowej). Na tym etapie iN można badać ich właściwości elektryczne za pomocą rejestracji patch-clamp. Protokół ten zapewnia wysoce powtarzalną procedurę konwersji linii in vitro perycytów rezydujących w mózgu w funkcjonalne ludzkie iNs.

Pierwszym wynikiem niniejszego protokołu po pomyślnym ustanowieniu hodowli z próbki ludzkiej kory mózgowej dorosłego człowieka jest identyfikacja składu komórkowego hodowli. Immunocytochemia w kierunku białek specyficznych dla poszczególnych typów komórek wykazuje znaczny stopień heterogeniczności pomiędzy hodowlami pochodzącymi z próbek od różnych pacjentów (Rycina 1A). Jak określono za pomocą cytometrii przepływowej, zawsze występuje istotna frakcja komórek wykazujących ekspresję PDGFRβ (średnio ~75%, ...

Celowanie w komórki rezydujące w mózgu w celu bezpośredniego przeprogramowania linii otwiera nowe perspektywy dla naprawy mózgu. Tutaj opisujemy protokół, w jaki sposób przygotować kultury wzbogacone o perycyty rezydujące w mózgu z kory mózgowej dorosłego człowieka i przekształcić je w indukowane neurony przez ekspresję czynników transkrypcyjnych Sox2 i Ascl1 za pośrednictwem retrowirusa.

Przeprogramowanie linii komórek pochodzących z perycytów mózgu dorosłego człowieka na neurony indukowane

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przekształcenie komórek pochodzących z ludzkich pasożytów mózgu w neurony indukowane. Osiąga się to poprzez izolację i hodowlę komórek pochodzenia pasożytniczego z chirurgicznych preparatów mózgu. Następnie, po ekspansji, komórki in vitro poddawane są immunoznakowaniu w kierunku markerów pasożytniczych, co umożliwia ich charakterystykę i ewentualne dalsze wzbogacenie populacji komórek.Następnie komórki pochodzące od pasożyta są transdukowane wektorami retrowirusowymi kodującymi determinanty losu neuronalnego w celu ich bezpośredniej konwersji w neurony indukowane. Uzyskane wyniki wykazują obecność neuronów indukowanych pochodzących z przeprogramowanych linii komórkowych pasożyta, co potwierdzono barwieniem immunologicznym na marker neuronalny beta three tubulin. Główną zaletą tego podejścia w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przeprogramowanie fibroblastów czy różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w neurony, jest ukierunkowanie na komórki endogenne dla mózgu, co w przyszłości może utorować drogę do bezpośredniej konwersji linii komórkowych wewnątrz mózgu bez konieczności transplantacji komórek.Poniższy protokół opra

lineage-reprogramming-pericyte-derived-cells-adult-human-brain-into

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Reprogramowanie linii komórkowych pochodzących od pericytów ludzkiego dorosłego mózgu w indukowane neurony

Pierwotne, wielopotencjalne komórki progenitorowe pochodzące z ludzkiego płodowego mózgu proliferują in vitro, zachowując zdolność do różnicowania się w neurony i astrocyty. Niniejsza praca wykazuje, że progenitorom neuralnym można indukować różnicowanie poprzez kolejne stadia linii oligodendrocytarnej za pomocą kondycjonowania wybranymi czynnikami wzrostu.

System hodowli oligodendrocytów pochodnych z komórek progenitorowych ludzkiego płodu

Ten film pokazuje bezpośrednie przeprogramowanie genetycznie zmodyfikowanych hematopoetycznych komórek progenitorowych na neuronalne komórki macierzyste. Czynniki transkrypcyjne ulegające ekspresji przez krwiotwórcze komórki progenitorowe wywołują kaskadę zdarzeń molekularnych ułatwiających ich transformację. Dalsze specyficzne pożywki są używane do selekcji i wzrostu indukowanych neuronalnych komórek macierzystych.

Bezpośrednie przeprogramowanie hematopoetycznych komórek progenitorowych w neuronalne komórki macierzyste

Ten film pokazuje proces różnicowania indukowanych komórek progenitorowych neuronów (iNPC) w neurony i astrocyty za pomocą specjalistycznych pożywek.

Różnicowanie indukowanych nerwowych komórek progenitorowych w astrocyty

Film pokazuje generowanie neuronów z dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych (aHDF). aHDF są przeprogramowywane przy użyciu wektora lentiwirusowego przenoszącego geny neuronalnych czynników transkrypcyjnych i krótkich RNA spinki do włosów (shRNA). ShRNA hamują ekspresję neuronalnego represora transkrypcyjnego, a neuronalne czynniki transkrypcyjne aktywują geny do różnicowania aHDF w neurony. Te przeprogramowane aHDF są hodowane we wczesnej i późnej pożywce konwersji neuronalnej w celu...

Generowanie neuronów poprzez przeprogramowanie ludzkich komórek fibroblastów skóry

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Obrazowanie na żywo to potężne narzędzie do badania zachowań komórkowych w czasie rzeczywistym. W tym miejscu opisujemy protokół wideomikroskopii poklatkowej pierwotnych komórek kory mózgowej, który umożliwia szczegółowe badanie faz odgrywanych podczas progresji linii od pierwotnych nerwowych komórek macierzystych do zróżnicowanych neuronów i gleju.

Obrazowanie na żywo pierwotnych komórek kory mózgowej za pomocą systemu hodowli 2D

Opisany jest solidny protokół do monitorowania populacji neuronów za pomocą wideomikroskopii poklatkowej, a następnie przetwarzania końcowego opartego na oprogramowaniu. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do identyfikacji zdarzeń biologicznych w wybranej populacji podczas eksperymentów obrazowania na żywo.

Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronalnych

Bezpośrednie przeprogramowanie neuronów generuje neurony, które utrzymują wiek początkowej komórki somatycznej. W tym miejscu opisujemy pojedynczą metodę opartą na wektorach do generowania indukowanych neuronów z fibroblastów skóry uzyskanych od dorosłych dawców ludzkich.

Proste generowanie wysokowydajnej kultury indukowanych neuronów z dorosłych fibroblastów skóry człowieka

Protokół przedstawia przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w celu wywołania nerwowych komórek macierzystych przez infekcję wirusem Sendai, różnicowanie iNSC w neurony dopaminergiczne, przeszczepianie prekursorów DA do jednostronnie uszkodzonych modeli mysich choroby Parkinsona oraz ocenę bezpieczeństwa i skuteczności prekursorów DA pochodzących z iNSC w leczeniu PD.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

Opisujemy protokół przeprogramowania fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC), a następnie ich różnicowanie w indukowane astrocyty (iAs). Metoda ta prowadzi do szybkiego i powtarzalnego generowania iNPC i iA w dużych ilościach.

Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Poznaj metodę przeprogramowania perycytów mózgu na neurony indukowane przy użyciu wektorów retrowirusowych. Technika ta umożliwia bezpośrednią konwersję komórek endogennych bez konieczności transplantacji.

Przeprogramowanie linii komórek pochodzących z perycytów mózgu dorosłego człowieka na neurony indukowane

Przeglądaj więcej filmów