Badanie interakcji białko-białko w żywych komórkach za pomocą transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego
26 maja 2014
Interakcje między białkami są fundamentalne dla wszystkich procesów komórkowych. Korzystając z transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego, można monitorować interakcję między parą białek w żywych komórkach i w czasie rzeczywistym. Ponadto można ocenić skutki potencjalnie patogennych mutacji.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obserwacja interakcji między dwoma białkami a żywymi hodowanymi komórkami. Osiąga się to poprzez subklonowanie CDNA dla dwóch interesujących białek do plazmidów zawierających sekwencję powlekającą lucyferazy lub żółtego białka fluorescencyjnego, w skrócie YFP w celu stworzenia wektorów do ekspresji białka w komórkach ssaków. W drugim etapie plazmidy są transfekowane do hodowanych komórek, co prowadzi do ekspresji białek fuzyjnych YFP i lucyferazy.
Następnie substrat lucyferazy jest dodawany do komórek w celu zainicjowania emisji światła z lucyferazy. Uzyskano wyniki, które wskazują na interakcję między dwoma białkami fuzyjnymi w oparciu o transfer energii z LUCIFERAZY do YFP. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wytrącanie COun, jest to, że umożliwia ona obserwację interakcji białek w żywych komórkach.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie genomiki funkcjonalnej poprzez określenie, czy mutacja znaleziona u pacjenta wpływa na interakcje białek białkowych. Pierwszym krokiem procedury będzie RAB tric, doktorant z mojego laboratorium, aby rozpocząć tworzenie plazmidów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Oszacuj ich stężenie na podstawie absorbancji przy 260 nanometrach.
Określ masę cząsteczkową każdego plazmidu, mnożąc liczbę par zasad przez 650.Daltony. Użyj stężenia i masy cząsteczkowej, aby obliczyć stężenie molowe każdego preparatu plazmidowego. Rozcieńczyć preparaty plazmidowego DNA do stężenia 36 nano molowców.
Będą to zapasy robocze, które zostaną wykorzystane do przygotowania mieszanek DNA. Do transfekcji. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest ustawienie mieszanek DNA Aby zapewnić sukces, tworzymy arkusze kalkulacyjne, aby wstępnie obliczyć prawidłową ilość każdego składnika i dokładamy wszelkich starań.
Podczas ustawiania mieszanek DN. Przygotuj pierwszą kontrolną mieszankę DNA zawierającą 1800 nanogramów plazmidu wypełniającego w końcowej objętości 20 mikrolitrów wody. Następnie ustaw drugą kontrolowaną mieszankę DNA, przygotowując pięć mikrolitrów konstruktu kontrolnego P look.
Dodaj plazmid wypełniający, aby uzyskać całkowitą masę DNA do 1800 nanogramów. Dodaj wodę, aby doprowadzić końcową objętość do 20 mikrolitrów. Przygotuj trzecią kontrolną mieszankę DNA zawierającą pięć mikrolitrów konstruktu kontrolnego P i pięć mikrolitrów konstruktu kontrolnego PYFP.
Dodaj plazmid wypełniający i wodę jak poprzednio. Na koniec należy ustawić czwartą kontrolną mieszankę DNA zawierającą pięć mikrolitrów konstruktu kontroli pozytywnej. Ponownie dodaj wypełniacz, plazmid i wodę w ten sam sposób.
Następnie przygotuj mieszaniny 3D NA, aby przetestować homodimeryzację białka będącego przedmiotem zainteresowania x. Dla każdej mieszanki DNA połącz pięć mikrolitrów odpowiedniego konstruktu o wyglądzie P i pięć mikrolitrów konstruktu PYFP, dodając plazmid wypełniający i wodę. Następnie przygotuj mieszanki DNA, aby przetestować interakcję między parą interesujących białek X i Y. Dla każdej mieszanki DNA połącz pięć mikrolitrów odpowiedniego konstruktu P i pięć mikrolitrów konstruktu PYFP wraz z plazmidem wypełniającym i zbieraniem wody sub confluent hec 2 9 3 komórki z kolby o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych rozcieńczyć 10% wszystkich komórek w 13 mililitrach pożywki hodowlanej.
Następnie dozować 130 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki białej, przezroczystej, 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej przed hodowlą komórek przez 24 godziny. Następnie oblicz liczbę studzienek do transfekcji, mnożąc liczbę mieszanek DNA przez trzy. Przygotować mieszankę wzorcową zawierającą 6,3 mikrolitra temperatury pokojowej, pożywki wolnej od surowicy i 0,18 mikrolitra odczynnika do transfekcji na studzienkę zmieszaną przez wirowanie przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Następnie dozuj 20 mikrolitrów odczynnika do transfekcji bez surowicy do wymaganej liczby probówek. Dodaj dwa mikrolitry odpowiedniej mieszanki DNA do każdej probówki, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Na koniec transfekuj trzy dołki każdą mieszanką transfekcyjną.
Dozowanie 6,5 mikrolitra mieszanki transfekcyjnej na dołek przed hodowlą komórek przez kolejne 36 do 48 godzin. Do pomiaru sygnału BRET. Najpierw rozpuść substrat lucyferazy z żywych komórek w 34 miligramach na mililitr w DMSO przez wirowanie.
Rozcieńczyć odtworzony substrat lucyferazy z żywych komórek w temperaturze od jednego do 1000 w podłożu rozcieńczającym substrat podgrzanym do 37 stopni Celsjusza. Pozostawić do wymieszania 50 mikrolitrów pożywki rozcieńczającej substrat na wir studzienki. Może powstać osad, ale nie będzie zakłócał testu.
Odessać pożywkę hodowlaną z płytki 96-dołkowej, dozować 50 mikrolitrów rozcieńczonego substratu lucyferazy z żywych komórek do każdej studzienki po hodowli komórek przez co najmniej dwie godziny. Zdjąć pokrywkę z płytki 96-dołkowej i inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej wewnątrz luminometru. Mierz emisję z LUCIFERAZY i YFP po jednym dołku na raz zgodnie ze szczegółami w protokole tekstowym, integruj sygnały emisyjne przez 10 sekund.
Członkowie rodziny represorów transkrypcyjnych Fox P odgrywają rolę w rozwoju mózgu. Mutacje są związane z zaburzeniami mowy i spektrum autyzmu. Wiadomo, że FOX P two tworzy homodimery w celu walidacji testu Bretta w celu wykrycia Foxa.
Komórki P dwóch homodimerów transfekowano konstruktami do ekspresji lucyferazy jako dawcy lub YFP jako akceptora połączonego z Fox P dwa lub sygnałem lokalizacji jądrowej. Ukierunkowane jądrowo białka LUCIFERAZY i YFP służą jako kontrola ujemna jako kontrola pozytywna do wykrywania Bretta. Komórki sygnałowe zostały również transfekowane konstruktem do ekspresji białka fuzyjnego lucyferazy YFP.
Wzrost sygnału BRET pokazuje, że test Bret jest skuteczny w wykrywaniu dwóch homodimerów Fox P obrazy mikroskopii fluorescencyjnej komórek transfekowanych YFP połączonym z sygnałem lokalizacji jądrowej lub z YFP połączonym z FOX P dwa są pokazane tutaj. Specyfikę oddziaływania wykazano poprzez wprowadzenie mutacji do FOX P 2, o której wiadomo, że zaburza dimeryzację. Gdy lucyferazy Fox P dwie delta E 400 i YFP Fox B dwa białka fuzyjne ulegały jednoczesnej ekspresji.
Zaobserwowano zmniejszenie sygnału oddechowego w porównaniu z sytuacją, gdy Fox B dwa i YFP Fox B dwa były jednocześnie wyrażane. Ta redukcja sygnału nie była spowodowana zmianą subkomórkowej lokalizacji zmutowanego białka w celu oceny skuteczności testu Bret w wykrywaniu typowych interakcji, przetestowano interakcję Fox P dwa z Fox P jeden, zaobserwowano sygnał Bretta w obu możliwych konfiguracjach testu. Ponadto przetestowano przydatność testu Bretta lub wykrywania interakcji Fox P two z białkami innymi niż FOX P, badając interakcję z CT BP one, korepresorem transkrypcji i znanym partnerem interakcji Fox P dwa.
Interakcja Fox P two CT BP one została wykryta w teście Bretta, gdy Fox P 2 był białkiem fuzyjnym dawcy, a CT P jeden był akceptorem, ale nie w odwrotnej konfiguracji. Interakcję między FOX P two i CT P one zaobserwowano, mimo że tylko niewielka część CT BP one była zlokalizowana w jądrze, co podkreśla czułość tego testu. Wreszcie, test Bret został wykorzystany do zbadania wpływu patogennych mutacji w Fox P two na interakcje białek białkowych.
Doniesiono, że dwie mutacje punktowe w Fox P two powodują rzadkie zaburzenie dziedziczone autosomalnie dominująco wpływające na mowę i język. Zdolność zmutowanych białek do dimeryzacji z lisem typu dzikiego P 2 oceniono za pomocą testu BRET. Mutacja R 3 28 X, ale nie R 5 53 H, zakłóca dimeryzację wyników przy użyciu dzikiego typu Fox B dwa jako dawcy i zmutowanego Foxa B dwóch.
Jak pokazano akceptanta, te same wyniki zaobserwowano dla odwrotnej konfiguracji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować test chleba do monitorowania interakcji białek białkowych. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki do zbadania interakcji białko-białko w żywych komórkach.
Po tej procedurze można wykonać dodatkowe techniki w celu oznaczenia aktywności białka będącego przedmiotem zainteresowania w celu oceny funkcjonalnych konsekwencji zaobserwowanej interakcji białka białkowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na obserwacji oddziaływań między dwoma białkami w żywych hodowlach komórkowych z wykorzystaniem transferu energii rezonansowej bioluminescencji (BRET). Technika ta umożliwia monitorowanie oddziaływań białkowych w czasie rzeczywistym oraz ocenę wpływu mutacji patogennych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Interakcje białkowe
- Obrazowanie żywych komórek
Wprowadzenie
- Interakcje białkowe mają kluczowe znaczenie dla procesów komórkowych.
- Tradycyjne metody badania tych interakcji posiadają pewne ograniczenia.
- BRET zapewnia nowoczesne podejście umożliwiające obserwację interakcji w czasie rzeczywistym.
- Technika ta może również pomóc w ocenie wpływu mutacji na funkcję białek.
Cel badania
- Obserwacja oddziaływań między dwoma konkretnymi białkami.
- Wykorzystanie metody BRET do monitorowania w czasie rzeczywistym w żywych komórkach.
- Ocena wpływu potencjalnie patogennych mutacji na te oddziaływania.
Zastosowane metody
- Subklonowanie cDNA białek do plazmidów.
- Transfekcja plazmidów do hodowlanych komórek ssaków.
- Ekspresja białek fuzyjnych YFP i lucyferazy.
- Dodanie substratu lucyferazy w celu zainicjowania emisji światła.
Główne wyniki
- Skuteczna ekspresja białek fuzyjnych YFP i lucyferazy w żywych komórkach.
- Obserwacja transferu energii wskazująca na oddziaływania białko-białko.
- Wykazanie zalet metody BRET w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Wgląd w wpływ mutacji na oddziaływania białek.
Wnioski
- BRET jest skuteczną metodą badania oddziaływań białkowych w żywych komórkach.
- Technika ta może dostarczyć cennych informacji na temat dynamiki oddziaływań białkowych.
- Ma ona potencjalne zastosowania w zrozumieniu wpływu mutacji na procesy komórkowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bioluminescencyjny Transfer Energii Rezonansowej (BRET) umożliwia ilościowe monitorowanie oddziaływań białko-białko w czasie rzeczywistym w żywych komórkach, zapewniając czuły i istotny fizjologicznie odczyt służący do walidacji celu terapeutycznego. Podejście to wspiera wczesne etapy odkrywania leków poprzez potwierdzanie słabych, przejściowych lub zależnych od środowiska oddziaływań, które mogą zostać pominięte w testach punktu końcowego, co zwiększa pewność prognostyczną hipotez terapeutycznych. Dzięki wykrywaniu zaburzeń oddziaływań wywołanych przez mutacje patogenne, BRET pomaga w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) podczas przedklinicznego wyboru celu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Potwierdza domniemane oddziaływania białko-białko zidentyfikowane metodą dwuhybrydową drożdżową lub spektrometrią mas w kontekście żywych komórek.
- Wartość naukowa: Wykrywa słabe lub przejściowe oddziaływania wrażliwe na natywne środowisko biochemiczne, co zwiększa pewność dotyczącą celu.
- Wartość operacyjna: Wymaga minimalnego nakładu czasu pracy i niewielkiej liczby odczynników, co umożliwia wysokoprzepustową analizę sieci oddziaływań.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe stosunki BRET, które odzwierciedlają siłę i bliskość oddziaływania, co wspiera standaryzację testu.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z formatem płytek 96-dołkowych i odczytami z luminometru ułatwia skalowalność w badaniach przesiewowych związków lub mutantów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia kinetyczną ocenę dynamiki oddziaływań w czasie, co pozwala na zastosowanie formatów przesiewowych z rozdzielczością czasową.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ocenia wpływ mutacji pochodzących od pacjentów na oddziaływania białkowe, łącząc odkrycia genetyczne z konsekwencjami funkcjonalnymi.
- Wartość naukowa: Mapuje domeny oddziaływania i ocenia efekty modyfikacji potranslacyjnych, wspierając analizę struktura-funkcja.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje ten sam system żywych komórek na etapach odkrywania i przedklinicznych, zapewniając ciągłość translacyjną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda BRET wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od oceny zaangażowania celu po optymalizację związku wiodącego, w którym dane dotyczące oddziaływań służą do ustalania priorytetów i prowadzenia dalszych badań nad mechanizmami.
- Biologia odkrywcza: Testuje hipotezy terapeutyczne poprzez walidację oddziaływań białek w żywych komórkach, co ogranicza liczbę wyników fałszywie dodatnich charakterystycznych dla systemów sztucznych.
- Przesiewanie: Generuje powtarzalne, ilościowe odczyty umożliwiające porównanie białek typu dzikiego i zmutowanych lub efektów związków chemicznych na siłę oddziaływania.
- Analityka: Emituje odrębne sygnały donora i akceptora, które mogą być przeliczane na stosunek (ratiometria) w celu normalizacji zmienności ekspresji, co zwiększa wiarygodność danych.
- Badania translacyjne: Ocenia, czy mutacje związane z chorobą zaburzają kluczowe oddziaływania, zapewniając walidację funkcjonalną celów genetycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do przesiewania oddziaływań w wielu celach, co redukuje nakład pracy związany z ponowną optymalizacją testów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez wykrywanie oddziaływań w fizjologicznie istotnym środowisku żywych komórek.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiar oddziaływań dzięki spójnemu dodawaniu substratu i integracji z luminometrem, co redukuje zmienność między poszczególnymi studzienkami.
- Wartość strategiczna: Wspiera wczesne decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez potwierdzenie lub odrzucenie hipotez dotyczących oddziaływań przed poniesieniem znaczących nakładów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o trwałość oddziaływań i wrażliwość na mutacje.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu klonowania molekularnego w celu wytworzenia konstruktów fuzyjnych lucyferazy i YFP.
- Metoda jest uzależniona od dostępu do luminometru w celu sekwencyjnego pomiaru emisji donora i akceptora.
- Konieczna jest optymalizacja stosunków ekspresji, aby uniknąć nasycenia donora lub akceptora, co może zniekształcić sygnały BRET.
- Wymagane są kontrole niespecyficznego transferu energii, w tym nieoddziałujące pary fuzyjne oraz mutanty lokalizacji subkomórkowej.
- Ograniczeniem jest wymóg bliskiego sąsiedztwa (<10 nm) między donorem a akceptorem, co może nie odzwierciedlać wszystkich istotnych biologicznie oddziaływań.
