Prosty i szybki protokół pomiaru neutralnych lipidów w komórkach glonów za pomocą fluorescencji

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar neutralnej zawartości lipidów w komórkach glonów przy użyciu barwnika fluorescencyjnego czerwieni nilowej. Osiąga się to poprzez najpierw zawieszenie komórek w roztworze etanolu, aby przepuszczalność ściany komórkowej i błony komórkowej. W drugim etapie dodaje się czerwony barwnik fluorescencyjny Nilu, który dostaje się do komórek i gromadzi się w niepolarnych obszarach komórki, w tym w obojętnych ciałach lipidowych.

Następnie próbki są wystawiane na działanie wzbudzającego źródła światła o długości 530 nanometrów, co powoduje, że czerwień nilowa wchłonięta przez obojętne ciała lipidowe fluoryzuje przy 604 nanometrach. Wyniki uzyskuje się w skali masowej poprzez przeprowadzenie poszczególnych testów w mikrostudzience wielostudzienkowej i użycie spektrofotometru do uzyskania szybkich odczytów fluorescencji. Odczyty pokazują liniową zależność między neutralną zawartością lipidów w komórkach lgal a intensywnością pomiaru fluorescencji.

Konwersję pomiarów fluorescencji na zawartość oleju można osiągnąć za pomocą krzywej kalibracyjnej przygotowanej z ogniw o znanym składzie oleju. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi protokołami, takimi jak metoda grawimetryczna Bly dire, jest to, że pozwala ona na szybkie określenie neutralnej zawartości lipidów przy użyciu materiałów dostępnych dla większości laboratoriów. Metoda ta zapewnia natychmiastową informację zwrotną na temat wydajności bioprocesu podczas uprawy glonów.

Ponadto wysoka przepustowość zapewniana przez 96-dołkowy czytnik płytek jest idealna do badań przesiewowych i eksperymentów czynnikowych. Chociaż technika ta została zoptymalizowana pod kątem chlorelli i Desus, można ją łatwo zmodyfikować do analizy innych gatunków lgal. Porządku. Na początek usuń objętość próbki z rosnącej kultury glonów, która dostarczy co najmniej 200 miligramów suchej biomasy.

Preferowane jest 400 do 600 miligramów. Odwirować próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut 10 000 razy. G, odrzucić supernatant i przemyć osad równą objętością buforu fosforanowego o tym samym pH co pożywka wzrostowa.

Powtórz ten proces, w sumie trzy etapy prania. Zawiesić osad w wodzie dejonizowanej i przenieść do wstępnie zważonego naczynia wagowego. Pozostaw próbkę do wyschnięcia w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Suszone kultury glonów można przechowywać w temperaturze pokojowej do wykorzystania w przyszłości. Odmierz około 50 miligramów suchej biomasy glonów w naczyniu serwatkowym. W razie potrzeby przenieść biomasę do moździerza wstępnie umytego heksanem, umyć naczynie serwatkowe niewielką ilością heksanu za pomocą poprzedniej pipety, aby całkowicie przenieść biomasę do zaprawy kolejowej.

Następnie zmiel biomasę glonów przez pięć minut za pomocą tłuczka. Zacznij od delikatnego mielenia i stopniowo zwiększaj intensywność. Zmiel biomasę na drobną i gładką pastę.

W ciągu pięciu minut dodaj kilka mililitrów heksanu do moździerza i wymieszaj powstałą gnojowicę z tłuczkiem, aż się zhomogenizuje. Upewnij się, że wszystkie resztki komórek przyklejone do ścianek zaprawy zostały odbite i zawieszone w cieczy. Następnie przenieś mieszaninę masy komórkowej heksanu do kompatybilnej probówki wirówkowej.

Powtórz trzy do pięciu razy, aż cała biomasa zostanie przeniesiona do probówki wirówkowej. Odwirować próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut po 10 000 razy. G. Po odwirowaniu ostrożnie odpipetować supernatant do wstępnie zważonego metalowego naczynia, które można przechowywać w dygestorium.

Wykonaj drugą ekstrakcję heksanu, dodając trzy mililitry heksanu do granulki i energicznie wirując. Przez jedną minutę powtarzać odwirowywanie i przenoszenie supernatantu. Określić masę oleju ekstrahowanego grawimetrycznie po całkowitym odparowaniu heksanu.

Do oznaczania ilościowego fluorometrycznego należy przygotować wszystkie próbki glonów o tym samym stężeniu biomasy i w taki sam sposób, jak wzorce użyte w pomiarze. W tym celu należy zawiesić wstępnie wysuszone próbki w odpowiedniej ilości buforu fosforanowego. W razie potrzeby należy użyć homogenizatora, aby ułatwić zawiesinę rezolucji wysuszonych komórek lgal

Do każdej próbki należy wymieszać 80 mikrolitrów przygotowanego 30% roztworu etanolu, 10 mikrolitrów przygotowanego roztworu czerwieni nilowej i 10 mikrolitrów zawiesiny glonów w jednym dołku na 96-dołkowej płytce. Aby właściwie uwzględnić zmienność pomiaru fluorescencji, należy wykonać pięć powtórzeń każdej próbki. Następnie należy przeprowadzić dwupunktową krzywą kalibracyjną z przygotowanymi wcześniej wzorcami.

Aby uwzględnić codzienne zmiany w instrumencie i przygotować się do wykonywania pomiarów fluorescencji w spektrofotometrze z wielodołkowym czytnikiem płytek, ustaw parametry tak, aby wstrząsały z prędkością 1200 obr./min i krążyły po trzech milimetrach przez 30 sekund, a następnie inkubowały w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 10 minut. Kolejne wstrząsy z prędkością 1200 obr./min i orbita o długości trzech milimetrów przez 30 sekund, a następnie zarejestrowanie fluorescencji ze wzbudzeniem na długości 530 nanometrów i emisją na poziomie 604 nanometrów. Następnie rozpocznij bieg jako ostatni krok.

Przelicz pomiary fluorescencji na zawartość oleju, korzystając z wyników z wzorców wewnętrznych, aby wykonać mikroskopię fluorescencyjną. Użyć próbki przygotowanej z czerwonym barwnikiem Nilu do przygotowania szkiełka mikroskopowego próbki procesowej zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi. Zaczynając od mikroskopu w trybie transmisyjnym, załaduj przygotowane szkiełko do mikroskopu i umieść komórki w żądanym powiększeniu.

Po ustawieniu ostrości przełącz mikroskop z trybu oświetlenia transmisyjnego na epi fluorescencyjny. Źródło światła powinno teraz pochodzić bezpośrednio z soczewki obiektywu, co można potwierdzić wizualnie, obserwując przestrzeń między szkiełkiem a soczewką obiektywu. Włóż zielony filtr wzbudzenia do źródła światła, a czerwony filtr emisyjny do obserwacyjnej ścieżki światła.

Fluorescencja barwionych komórek powinna być teraz bezpośrednio widoczna przez okular. Przełącz tryb obserwacji mikroskopowej z okularu na zamontowaną kamerę i użyj viewoprogramowanie do przechwytywania obrazu komórek fluoryzujących. Konkretne ustawienia będą się różnić w zależności od instrumentów, sprzętu i typów komórek.

Reprezentatywnym komórkom glonów wybarwionym czerwonym barwnikiem nilowym pokazano obrazy pro hodowanego w nadmiarze azotu, co prowadzi do bardzo niskiej wewnątrzkomórkowej akumulacji lipidów, które są pokazane w przeciwieństwie do próbek OID hodowanych pod ograniczeniem azotu. W oświetleniu transmisyjnym ciała lipidowe komórek można uwidocznić po dokładnym przyjrzeniu się, gdzie pojawiają się jako błyszczące okrągłe struktury i stanowią większość objętości komórki. Pokazane tutaj komórki mają tylko 5% oleju w suchej masie i nie zawierają znacznych poziomów ciał lipidowych, gdy są w odpowiednich warunkach oświetleniowych.

Różnice w tych próbkach są powiększone. Chude komórki olejowe wyglądają jak fluorescencyjne pierścienie z ciemnymi ciałami, podczas gdy komórki bogate w olej wykazują jasnopomarańczowo-czerwoną poświatę w miejscach, w których nagromadziły się ciała lipidowe. Czerwień nilowa będzie fluoryzować na różnych długościach fal w zależności od obecności obojętnych lipidów, fosfolipidów znajdujących się na ścianie komórkowej i niepolarnych białek komórkowych, dlatego chude komórki olejowe wyglądają jak fluorescencyjne pierścienie z ciemnymi ciałami.

Ta niespecyficzność jest również tym, co powoduje poziom fluorescencji tła podczas pomiarów spektrofotometrem obojętnych lipidów w zoptymalizowanych warunkach testu, krzywe kalibracyjne z wartościami R kwadrat większymi niż 0,980 są łatwo osiągalne. Zależność między zawartością oleju komórkowego a fluorescencją staje się nieliniowa, jeśli komórki są barwione w roztworze, w którym brakuje rozpuszczalnika nośnikowego, takiego jak etanol. Przedstawione tutaj dane mają kwadrat R równy 0,395 i zostały uzyskane poprzez przeprowadzenie protokołu w 0% roztworze etanolu.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 15 do 20 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy upewnić się, że wszystkie próbki są przygotowane w tym samym stężeniu biomasy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć neutralną zawartość lipidów w komórkach lgal przy użyciu zarówno tradycyjnych protokołów ekstrakcji heksanu, jak i prostszej procedury barwienia czerwoną fluorescencją NAL.