Name: Prosty i szybki protokół pomiaru neutralnych lipidów w komórkach glonów za pomocą fluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Naucz się szybkiej metody pomiaru lipidów neutralnych w komórkach glonów za pomocą barwienia Nile Red i spektrofotometrii fluorescencyjnej. Protokół ten umożliwia efektywne monitorowanie procesów biotechnologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Kanadyjskiej Radzie ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych za wsparcie finansowe dla tego projektu.

1. Izolacja suchej biomasy glonów jako wzorce odczytów fluorescencji
<ol>
	<li>Usunąć objętość próbki z rosnącej kultury glonów, która dostarczy co najmniej 200 mg suchej biomasy, preferowane jest 400-600 mg.</li>
	<li>Odwirować próbkę w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 10 000 x g. Odrzucić supernatant i przemyć osad równą objętością buforu fosforanowego o tym samym pH co pożywka wzrostowa.</li>
	<li>Powtórz krok 1.2, aby uzyskać łącznie 3 etapy prania.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w wodzie dejonizowanej i przenieść do wstępnie zważonego naczynia wagowego. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze 50 °C przez 48 godzin. UWAGA: Suszenie w próżni skróci czas suszenia, a suszenie kultury w temperaturach powyżej 50 °C może utrudnić ponowne zawieszenie.</li>
	<li>Przechowuj wysuszone kultury glonów w temperaturze pokojowej do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
2. Grawimetryczna kwantyfikacja neutralnych lipidów metodą ekstrakcji heksanu (na podstawie Bligh i Dyer4)
<ol>
	<li>Odmierzyć około 50 mg suchej biomasy glonów w naczyniu wagowym. UWAGA: Masy w zakresie 40-80 mg mogą być stosowane bez utraty odtwarzalności.</li>
	<li>Przenieś biomasę do zaprawy wstępnie umytej heksanem. W razie potrzeby umyć naczynie wagowe niewielką ilością (1 ml) heksanu za pomocą pipety Pasteura w celu całkowitego przeniesienia biomasy do moździerza. UWAGA: Heksan jest substancją wysoce lotną i toksyczną. Należy się z nim obchodzić w dygestorium w odpowiedniej odzieży ochronnej.</li>
	<li>Miel biomasę glonów przez 5 minut za pomocą tłuczka. Zacznij od delikatnego mielenia i stopniowo zwiększaj intensywność. Zmiel biomasę na drobną i gładką pastę w ciągu 5 minut. Jeśli podczas przenoszenia biomasy do zaprawy używa się nadmiaru heksanu, najlepiej poczekać, aż heksan odparuje przed mieleniem.</li>
	<li>Dodaj kilka ml heksanu do moździerza i wymieszaj powstałą zawiesinę z tłuczkiem, aż się zhomogenizuje. Upewnij się, że wszystkie resztki komórek przyklejone do ścianek zaprawy zostały odbite i zawieszone w cieczy.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę masy heksanowo-komórkowej do probówki wirówkowej. UWAGA: Probówka wirówkowa musi być wykonana ze szkła lub odpowiedniego polimeru kompatybilnego z heksanem, takiego jak teflon.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 2.4 i 2.5, aż cała biomasa zostanie przeniesiona do probówki wirówkowej (3-5x).</li>
	<li>Odwirować próbkę w temperaturze 4 °C przez 20 minut przy 10 000 x g.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować supernatant do wstępnie zważonego metalowego naczynia wagowego. Przechowywać w dygestorium.</li>
	<li>Wykonaj 2. ekstrakcję heksanu, dodając 3 ml heksanu do granulki i energicznie wirując przez 1 minutę.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.7 i 2.8. W razie potrzeby należy umieścić próbki w wirówce przez 30 minut podczas drugiej ekstrakcji, aby upewnić się, że wszystkie resztki komórek całkowicie się osadzą. Określić masę oleju ekstrahowanego grawimetrycznie po całkowitym odparowaniu heksanu.</li>
</ol>
3. Fluorometryczna kwantyfikacja neutralnych lipidów przy użyciu czerwieni nilowej (zgłoszona przez de la Hoz Siegler et al.11)
UWAGA: Do odczytu fluorescencji potrzebne jest tylko 10 μl zawiesiny glonów o stężeniu 5 g/L. Ogólnie rzecz biorąc, izolacja suchej biomasy glonów z 1,5 ml bulionu hodowlanego jest więcej niż wystarczająca. Również natężenie światła lampy w spektrofotometrze może z czasem ulec pogorszeniu. Zaleca się uwzględnianie wzorców w każdym eksperymencie, aby upewnić się, że zmiany w instrumencie nie dodają niepotrzebnych błędów do pomiarów.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór czerwieni nilowej o stężeniu 10 μg/ml rozpuszczony w alkoholowym odczynniku etanolowym. Roztwór należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 30% (v/v) roztwór etanolu w wodzie dejonizowanej i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować wszystkie próbki glonów o tym samym stężeniu biomasy (zalecane jest 5 g/l) i w taki sam sposób, jak wzorce użyte w pomiarze. W tym celu należy zawiesić wstępnie wysuszone próbki w odpowiedniej ilości buforu fosforanowego (0,6 g/l dwuzasadowego fosforanu potasu, 1,4 g/l jednozasadowego fosforanu potasu) lub dostosowując stężenie rosnącej kultury glonów do 5 g/l za pomocą buforu fosforanowego po zmierzeniu zmętnienia. UWAGA: pomiary wykonywane na żywych kulturach glonów często będą miały większy błąd związany z nimi, w zależności od precyzji krzywej kalibracji zmętnienia. Ponowne zawieszenie wysuszonych próbek może wymagać użycia homogenizatora w celu pełnego rozproszenia biomasy.</li>
	<li>Dla każdej próbki wymieszać 80 μl 30% roztworu etanolu, 10 μl roztworu czerwieni nilowej i 10 μl zawiesiny glonów w jednym dołku na 96-dołkowej płytce. W celu prawidłowego uwzględnienia zmienności pomiaru fluorescencji należy wykonać 5 powtórzeń każdej próbki.</li>
	<li>Przeprowadź dwupunktową krzywą kalibracyjną z wcześniej przygotowanymi wzorcami, aby uwzględnić codzienne zmiany w przyrządzie i przygotowaniu. Przygotować wzorce do pomiaru fluorescencji, stosując tę samą procedurę, co próbki. UWAGA: Generalnie do ponownej kalibracji przyrządu wystarczą dwa punkty, trzy punkty można uruchomić w celu sprawdzenia liniowości.</li>
	<li>Wykonaj pomiary fluorescencji w spektrofotometrze z wielodołkowym czytnikiem płytek. Stwierdzono, że następujące warunki dają najbardziej spójne wyniki11:
	<ol>
		<li>Wstrząsać z prędkością 1 200 obr./min, orbita 3 mm, przez 30 sek.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 40 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Wstrząsać z prędkością 1 200 obr./min, orbita 3 mm, przez 30 sek.</li>
		<li>Zapis fluorescencji, wzbudzenia przy 530 nm, emisji przy 604 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przelicz pomiary fluorescencji na zawartość oleju, korzystając z wyników z wzorców wewnętrznych.</li>
</ol>
4. Technika mikroskopii fluorescencyjnej
UWAGA: Protokół barwienia opisany w sekcji 3 jest przeznaczony do analizy ilościowej, ale może być również przydatny do dostarczania wizualnych reprezentacji technik opartych na barwieniu w celach edukacyjnych i ilustracyjnych. Do uzyskania obrazów fluorescencji próbki potrzebny jest mikroskop optyczny z tradycyjną transmisją oraz dodatkowymi źródłami oświetlenia epifluorescencyjnego. Do barwienia czerwieni nilowej potrzebne są filtry światła wzbudzenia i emisji odpowiednio w zakresie 530 nm (zielony) i 604 nm (czerwony), a także kamera zamontowana na mikroskopie z powiązanym oprogramowaniem. Obrazy pokazane w tym badaniu (ryc. 1) zostały uzyskane przy użyciu mikroskopu jasnego pola wyposażonego w kamerę i konwerter monochromatyczny na RGB. Procedura tworzenia obrazów fluorescencji czerwieni nilowej przy użyciu tych narzędzi jest opisana poniżej:
<ol>
	<li>Przygotować próbkę kultury z czerwonym barwnikiem nilowym zgodnie z sekcją 3 protokołu. UWAGA: próbka o stężeniu 5 g/l wytwarza szkiełka o odpowiedniej gęstości komórek bez nadmiernego przepełnienia.</li>
	<li>Po wykonaniu kroku 3.6 protokołu barwienia należy przygotować szkiełko mikroskopowe z przetworzonej próbki zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi.</li>
	<li>Zaczynając od mikroskopu w trybie transmisyjnym, załaduj przygotowany szkiełko do mikroskopu i zlokalizuj komórki pod żądanym powiększeniem (obrazy pokazane w tym artykule zostały uzyskane za pomocą obiektywu 100X).</li>
	<li>Po ustawieniu ostrości przełącz mikroskop z trybu oświetlenia transmisyjnego na epifluorescencyjny. Źródło światła powinno teraz pochodzić bezpośrednio z soczewki obiektywu (można to potwierdzić wizualnie, obserwując przestrzeń między szkiełkiem a soczewką obiektywu).</li>
	<li>Włóż zielony filtr wzbudzenia do źródła światła, a czerwony filtr emisyjny do obserwacyjnej ścieżki światła; fluorescencja zabarwionych komórek powinna być teraz bezpośrednio widoczna przez okular.</li>
	<li>Przełącz tryb obserwacji mikroskopowej z okularu na zamontowaną kamerę i użyj viewoprogramowanie do przechwytywania obrazu komórek fluoryzujących. W zależności od czułości aparatu, próbka może początkowo nie pojawić się w oknie podglądu (tj. ekran będzie); Aby temu zaradzić, dostosuj czas naświetlania i wzmocnienie kamery do poziomu, w którym komórki są widoczne. Konkretne ustawienia będą się różnić w zależności od instrumentów, sprzętu i typów komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+from+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Biodiesel from microalgae.</a> Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Algal+Biofuels+Technology+Roadmap.+Energy+Efficiency+%26+Renewable+Energy%5BTitle%5D)+AND+%22U.S.+Department+of+Energy%2C+Office+of+Energy+Efficiency+and+Renewable+Energy%2C+Biomass+Program%22%5BJournal%5D)">National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy.</a> U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf">http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf</a> (2010).</li>
<li>de la Hoz Siegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+microalgal+productivity+using+an+adaptive%2C+non-linear+model+based+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy.</a> Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Hara, A., Radin, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+extraction+of+tissues+with+a+low-toxicity+solvent%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent.</a> Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+methods+used+for+microalgal+lipid-content+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Energ.+Procedia%22%5BJournal%5D)">Review of methods used for microalgal lipid-content analysis.</a> Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).</li>
<li>Pino, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+high+throughput+microscopic+assessment+of+fat+mass+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans.</a> J. Vis. Exp. (73), (2013).</li>
<li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).</li>
<li>Izard, J., Limberger, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+method+for+quantitation+of+bacterial+cell+lipids+from+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells.</a> J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+Nile+red+method+for+quantitative+measurement+of+neutral+lipids+in+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae.</a> J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).</li>
<li>de la Hoz Siegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+reliability+of+fluorescence-based+neutral+lipid+content+measurements+in+microalgal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Res%22%5BJournal%5D)">Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures.</a> Algal Res. 1, 176-184 (2012).</li>
<li>de la Jara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+determination+of+lipid+content+in+a+marine+dinoflagellate%2C+Crypthecodinium+cohnii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii.</a> J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).</li>
<li>Elsey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+microalgal+neutral+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids.</a> J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).</li>
<li>Feng, G. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+FT-IR+and+Nile+Red+methods+for+microalgal+lipid+characterization+and+biomass+composition+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination.</a> Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).</li>
<li>Guzmán, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimate+by+means+of+flow+cytometry+of+variation+in+composition+of+fatty+acids+from+Tetraselmis+suecica+in+response+to+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Aquacult.+Int%22%5BJournal%5D)">Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions.</a> Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).</li>
<li>Huang, G. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+method+for+lipid+production+in+alga+based+on+Nile+red+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomass+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence.</a> Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+the+determination+of+lipid+from+the+green+alga+Botryococcus+braunii%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii.</a> Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).</li>
<li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-lipid+content+strains+of+the+marine+microalga+Tetraselmis+suecica+for+biodiesel+production+by+flow+cytometry+and+single-cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting.</a> J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).</li>
<li>Vigeolas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+partial+characterization+of+mutants+with+elevated+lipid+content+in+Chlorella+sorokiniana+and+Scenedesmus+obliquus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus.</a> J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).</li>
<li>Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertozzini%2C+E+%22J.+Microbiol.+Meth%22">J. Microbiol. Meth</a>. 87, 17-23 (2011).</li>
<li>Kou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+lipid+content+in+the+model+organism+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii.</a> J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Glony użyte w krzywej standardowej muszą należeć do tych samych gatunków, które są hodowane w tych samych warunkach doświadczalnych, co algi mierzone. Znaczące zmiany w składzie podłoża, technice uprawy i protokole barwienia mogą wpływać na intensywność odczytu fluorescencji. Ekstrakcję heksanem (opisaną w sekcjach 1 i 2) zastosowano w celu oznaczenia neutralnej zawartości lipidów w próbkach użytych w krzywej wzorcowej. W celu dokładnych pomiarów intensywności fluorescencji wszystkie próbki muszą być analizowane przy tym...

Ze względu na ich zdolność do magazynowania ciał lipidowych w pewnych warunkach stresu, glony zyskały w ostatnich latach wiele uwagi jako potencjalne źródło paliwa odnawialnego1,2. Neutralne lipidy mogą stanowić ponad 60% suchej masy komórki w odpowiednich warunkach wzrostu3. Jednak przemysł nie ma prostego, czystego, szybkiego i niezawodnego ustandaryzowanego protokołu do ilościowego oznaczania zawartości lipidów w komórkach glonów w celu prawidłowego monitorowania wydajności bioprocesów, analizowania kultur i badań przesiewowych w poszukiwaniu nowych szczepów.
Metoda grawimetryczna Bligh-Dyera, opracowana około 50 lat temu, pozostaje jedną z najczęściej używanych technik dzisiaj4,5. Chociaż procedura ta jest prosta, niezawodna i łatwa do przeprowadzenia, jest czasochłonna, wymaga dużych objętości próbek i wykorzystuje toksyczne rozpuszczalniki. Nie jest to praktyczne w przypadku analizy wielu próbek z przebiegu fermentacji lub przesiewania w poszukiwaniu nowych szczepów bogatych w olej. Opracowano inne metody, ale zwykle wymagają one zaawansowanego sprzętu i nie zostały ustandaryzowane6.
Alternatywą, która wzbudziła duże zainteresowanie, jest plama Nilu Czerwona. Czerwień nilowa, barwnik, który preferencyjnie fluoryzuje w środowiskach niepolarnych, został użyty do identyfikacji lub ilościowego określenia ciał lipidowych w różnych organizmach, w tym nicieniach7, drożdżach8, bakteriach9 i algach10-19. Początkowe techniki z wykorzystaniem czerwieni nilowej były głównie jakościowe lub półilościowe, łącząc barwienie ze spektrofotometrią jednokuwetową lub cytometrią przepływową. Ponadto niektóre klasy glonów, takie jak zielone algi, mają grube dobytki komórkowe, które są w większości nieprzepuszczalne dla barwnika, co ograniczało zakres tej techniki10.
Ostatnie ulepszenia metody barwienia czerwienią Nilu zostały zgłoszone, aby ominąć początkowe niedociągnięcia protokołu10,11. Barwienie komórek w obecności rozpuszczalnika nośnikowego, takiego jak DMSO10 lub etanol10,11, linearyzuje zależność między zawartością oleju a absorbancją, umożliwiając wiarygodne pomiary ilościowe. Rozpuszczalnik pomaga przeniknąć przez błonę komórkową, dzięki czemu cząsteczki czerwieni nilowej mogą przez nią przejść. Ponadto zastosowanie spektrofotometru z możliwością odczytu mikropłytek umożliwia stosowanie protokołów o wysokiej przepustowości odpowiednich do analizy ilościowej.
W tym artykule szczegółowo opisujemy prostą metodę pomiaru zawartości oleju w komórkach glonów poprzez barwienie kultur czerwienią nilową w obecności etanolu, łagodnego rozpuszczalnika. W celu jak najdokładniejszego uwzględnienia szumu tła w pomiarach, przy użyciu komórek glonów o znanym składzie oleju opracowano standardową krzywą korelacji intensywności fluorescencji z zawartością oleju. Metoda jest zaadaptowana z wcześniej opublikowanych protokołów10,11. Korzystając z 96-dołkowego spektrofotometru, można przeanalizować taką samą ilość próbek w ciągu godziny, która zajęłaby kilka dni do monitorowania metodami grawimetrycznymi. Ponadto, dzięki kalibracji przy użyciu reprezentatywnych próbek pożądanych gatunków glonów, metoda ta pozwala uzyskać stosunkowo precyzyjne pomiary, które można bezpośrednio zinterpretować. Istnieje wiele protokołów przedstawiających metody barwienia glonów czerwienią nilową zoptymalizowane dla różnych szczepów i zastosowań; przedstawiony tutaj protokół został pierwotnie opracowany przez de la Hoz Siegler i wsp.11 dla Auxenochlorella protothecoides, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus i Scenedesmus obliquus, chociaż prawdopodobnie nadaje się do wielu innych gatunków i klas. Został zaprojektowany z myślą o monitorowaniu wydajności bioprocesów i działa równie dobrze w przypadku próbek wcześniej wysuszonych, jak i próbek mokrych z hodowli.

<table><tbody><tr><td>Pipety jednorazowe o</td><td></td> suchej masie <td></td> 25 ml Fisher 13-676-10K <td></td></tr><tr><td>Bulb do pipet</td><td>Fisher</td><td>13-681-51</td><td></td></tr><tr><td>40 ml Teflonowe probówki</td> wirówkowe Nalgene <td>Fisher</td><td>05-562-16A</td><td>Teflon potrzebny do</td></tr><tr><td>naczyń wagowych heksanu (polipropylen)</td><td>Fisher</td><td>2-202B</td><td></td></tr><tr><td></td> Mikrowirówka 1,5 ml <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Probówki</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sorvall</td><td>RC6plus</td><td></td></tr><tr><td>Piec do suszenia (Fisher 625D)</td><td>Fisher</td><td>13-254-2</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki do przechowywania</td><td>Fisher</td><td>0337-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka stołowa (Eppendorf 5415D)</td><td>Fisher</td><td>05-40-100</td><td></td></tr><tr><td>Kwant grawimetryczny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moździerz porcelanowy (Coorstek)</td><td>Fisher</td><td>12-961A</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek porcelanowy (Coorstek)</td><td>Fisher</td><td>12-961-5A</td><td></td></tr><tr><td>40 ml Probówki wirówkowe (FEP)</td><td>Fisher</td><td>05-562-16A</td><td>Można również używać szklanych probówek</td></tr><tr><td>Pipety szklane Pasteura</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowe naczynia wagowe</td><td>Fisher</td><td>08-732-101</td><td></td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher</td><td>H292-4</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometryczna kwantyfikacja zawartości</td><td></td><td></td><td></td>oleju</tr><tr><td>Fluorescencyjny czytnik płytek wielodołkowych</td><td>Thermo Lab Systems</td> Oprogramowanie czytnika <td>fluorescencji Fluoroskan Ascent</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Systems Thermo Lab</td><td>Systems Ascent Software 2.6</td><td></td></tr><tr><td>COSTAR 96 dołkowa płytka z okrągłym dnem</td><td>Fisher</td><td>06-443-2</td><td></td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>Sigma</td><td>N3013-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (odczynnik alkoholowy)</td><td>Fisher</td><td>AC65109-0020</td><td></td></tr><tr><td>Obrazowanie Komórki</td><td></td><td></td><td></td>fluorescencyjne</tr><tr><td>Mikroskop Leica DMRXA2 (lub równoważny)</td> Szkiełka mikroskopowe <td>Leica</td><td>DMRXA2</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe do mikroskopu</td><td>Fisher</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>Aparat</td><td>fotograficzny Qimaging</td><td>Retiga Ex</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>Qimaging</td><td>QCapture v.1.1.8</td><td></td></tr></tbody></table>

prosty i szybki protokół pomiaru neutralnych lipidów w komórkach glonów za pomocą fluorescencji

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algi są uważane za doskonałych kandydatów na odnawialne źródła paliwa ze względu na ich naturalne zdolności magazynowania lipidów. Solidne monitorowanie procesów fermentacji glonów i badania przesiewowe w poszukiwaniu nowych szczepów bogatych w olej wymaga szybkiego i niezawodnego protokołu oznaczania zawartości lipidów wewnątrzkomórkowych. Obecne praktyki opierają się w dużej mierze na metodach grawimetrycznych do oznaczania zawartości oleju, technikach opracowanych dziesiątki lat temu, które są czasochłonne i wymagają dużych objętości próbek. W tym artykule czerwień nilowa, barwnik fluorescencyjny, który został użyty do identyfikacji obecności ciał lipidowych w wielu typach organizmów, został włączony do prostego, szybkiego i niezawodnego protokołu pomiaru neutralnej zawartości lipidów w Auxenochlorella protothecoides, zielonej aldze. Metoda wykorzystuje etanol, stosunkowo łagodny rozpuszczalnik, do przepuszczalności błony komórkowej przed barwieniem oraz 96-dołkową mikropłytkę w celu zwiększenia pojemności próbki podczas pomiarów intensywności fluorescencji. Został zaprojektowany z myślą o konkretnym zastosowaniu monitorowania wydajności bioprocesów. W teście można wykorzystać wcześniej wysuszone próbki lub żywe próbki z rosnącej kultury.

Reprezentatywne komórki glonów zabarwione barwnikiem Nile Red przedstawiono na Ryc. 1. Części A i B na Ryc. 1 prezentują obrazy A. protothecoides hodowanego w nadmiarze azotu, co prowadzi do bardzo niskiej akumulacji lipidów wewnątrzkomórkowych. W częściach C i D pokazano próbki A. protothecoides hodowanego w warunkach ograniczenia azotu. Przy oświetleniu prześwietleniowym ciała lipidowe komórki można z...

Opisany jest prosty protokół do określania neutralnej zawartości lipidów w komórkach glonów za pomocą procedury barwienia czerwienią Nilu. Ta oszczędzająca czas technika stanowi alternatywę dla tradycyjnych protokołów kwantyfikacji lipidów opartych na grawimetrii. Został zaprojektowany z myślą o konkretnym zastosowaniu monitorowania wydajności bioprocesów.

Prosty i szybki protokół pomiaru neutralnych lipidów w komórkach glonów za pomocą fluorescencji

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar zawartości neutralnych lipidów w komórkach glonów przy użyciu fluorescencyjnego barwnika Nile red. Osiąga się to poprzez uprzednie zawieszenie komórek w roztworze etanolu w celu zwiększenia przepuszczalności ściany komórkowej i błony komórkowej. W drugim kroku dodaje się fluorescencyjny barwnik Nile red, który wnika do komórek i gromadzi się w obszarach niepolarnych, w tym w ciałkach neutralnych lipidów.Następnie próbki poddaje się działaniu źródła światła wzbudzenia o długości fali 530 nanometrów, co powoduje fluorescencję czerwieni nilowej zaabsorbowanej w ciałkach lipidów obojętnych przy 604 nanometrach. Wyniki uzyskuje się na masową skalę, przeprowadzając poszczególne testy w wielodołkowej płytce mikrotitracyjnej i używając spektrofotometru do szybkiego odczytu fluorescencji. Odczyty wykazują liniową zależność między zawartością lipidów obojętnych w komórkach alg a intensywnością pomiaru fluorescencji.Konwersja pomiarów fluorescencji na zawartość oleju może zostać przeprowadzona za pomocą krzywej kalibracyjnej przygotowanej z komórek o znanym składzie olejowym. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących protokołów, takich jak grawimetryczna metoda Blydire, jest możliwość szybkiego oznaczenia zawartości lipidów obojętnych przy użyciu materiałów dostępnych w większości laboratoriów. Metoda ta zapewnia natychmiastową informację zwrotną o wydajności bioprocesu podczas hodowli alg.Ponadto wysoka przepustowość zapewniana przez czytnik płytek 96-dołkowych jest idealna do badań przesiewowych i eksperymentów wieloczynnikowych. Chociaż technika ta została zoptymalizowana dla chlorella i s Desus, można ją łatwo zmodyfikować do analizy innych gatunków glonów. Aby rozpocząć, pobierz z rosnącej kultury glonów objętość próbki, która dostarczy co najmniej 200 mg suchej biomasy.Preferowane jest 400 do 600 mg. Odwiruj próbkę w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 10 000 ×g, odlej nadsącz i przemyj osad równą objętością buforu fosforanowego o tym samym pH co pożywka hodowlana.Powtórz ten proces, wykonując łącznie trzy etapy płukania. Resuspenduj osad w wodzie dejonizowanej i przenieś go do wcześniej zważonego naczynia wagowego. Pozostaw próbkę do wyschnięcia w temperaturze 50 °C przez 48 godzin.Wysuszone kultury alg można przechowywać w temperaturze pokojowej do późniejszego wykorzystania. Odważ około 50 mg suchej biomasy alg do szalki. Przenieś biomasę do moździerza, który w razie potrzeby należy uprzednio przemyć heksanem; szalkę przemyj niewielką ilością heksanu za pomocą pipety pasteryzacyjnej, aby całkowicie przenieść biomasę do moździerza.Następnie ucieraj biomasę glonów przez pięć minut za pomocą moździerza z tłuczkiem. Zacznij od delikatnego ucierania, stopniowo zwiększając intensywność. Ucieraj biomasę do uzyskania drobnej i gładkiej papki.W ciągu pięciu minut dodać do moździerza kilka mililitrów heksanu i mieszać powstałą zawiesinę tłuczkiem do uzyskania homogenicznej konsystencji. Należy upewnić się, że wszystkie resztki komórkowe przylegające do ścianek moździerza zostały oddzielone i zawieszone w cieczy. Następnie przenieść mieszaninę masy komórkowej z heksanem do odpowiedniej probówki do wirowania.Powtarzać od trzech do pięciu razy, aż cała biomasa zostanie przeniesiona do probówki do wirowania. Wirować próbkę w temperaturze 4 °C przez 20 minut przy 10 000 ×g. Po wirowaniu ostrożnie przenieść nadsącz pipetą do wcześniej zważonego metalowego naczynia wagowego, które można przechowywać w dygestorium.Przeprowadź drugą ekstrakcję heksanem, dodając 3 mL heksanu do osadu i intensywnie mieszając na vortexie. Ponownie odwiruj próbkę przez jedną minutę i przenieś nadsącz. Po całkowitym odparowaniu heksanu wyznacz masę wyekstrahowanego oleju metodą grawimetryczną.W celu ilościowego oznaczenia fluorometrycznego należy przygotować wszystkie próbki alg w tym samym stężeniu biomasy i w ten sam sposób, co wzorce użyte w pomiarze. Należy to zrobić poprzez zawieszenie uprzednio wysuszonych próbek w odpowiedniej ilości buforu fosforanowego. W razie potrzeby należy użyć homogenizatora, aby ułatwić resuspensję wysuszonych komórek alg.Dla każdej próbki wymieszaj 80 µL przygotowanego 30% roztworu etanolu, 10 µL przygotowanego roztworu czerwieni Nilowej oraz 10 µL zawiesiny alg w pojedynczej studzience płytki 96-dołkowej. Aby prawidłowo uwzględnić zmienność pomiaru fluorescencji, wykonaj pięć powtórzeń dla każdej próbki. Następnie przeprowadź dwupunktową kalibrację przy użyciu wcześniej przygotowanych wzorców.Aby uwzględnić codzienne zmienności aparatury oraz przygotowania do wykonania pomiarów fluorescencji w spektrofotometrze z czytnikiem płytek wielodołkowych, ustaw parametry wstrząsania na 1 200 RPM i orbitę 3 mm przez 30 s, a następnie inkubację w temperaturze 40 °C przez 10 min. Następnie ustaw ponowne wstrząsanie przy 1 200 RPM i orbicie 3 mm przez 30 s oraz pomiar fluorescencji przy wzbudzeniu 530 nm i emisji 604 nm. W ostatnim kroku uruchom pomiar.Przelicz pomiary fluorescencji na zawartość oleju, wykorzystując wyniki standardów wewnętrznych, aby przeprowadzić mikroskopię fluorescencyjną. Używając próbki przygotowanej z barwnikiem Nile red, sporządź preparat mikroskopowy próbki procesowej zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi. Rozpocznij od ustawienia mikroskopu w trybie transmisyjnym, umieść przygotowany preparat w mikroskopie i zlokalizuj komórki przy wybranym powiększeniu.Po ustawieniu ostrości przełącz mikroskop z trybu oświetlenia przeświecającego na tryb fluorescencji epi. Źródło światła powinno teraz znajdować się bezpośrednio w obiektywie, co można potwierdzić wizualnie, obserwując przestrzeń między preparatem a obiektywem. Wstaw zielony filtr wzbudzenia do źródła światła oraz czerwony filtr emisyjny do toru optycznego obserwacji.Fluorescencja barwionych komórek powinna być teraz bezpośrednio widoczna przez okular. Przełącz tryb obserwacji mikroskopu z okularu na zamontowaną kamerę i użyj oprogramowania do obrazowania, aby zarejestrować obraz fluorescencyjnych komórek. Konkretne ustawienia będą się różnić w zależności od instrumentów, sprzętu i typów komórek.Na obrazach przedstawiono reprezentatywne komórki alg zabarwione barwnikiem Nile red; komórki hodowane w nadmiarze azotu wykazują bardzo niską akumulację lipidów wewnątrzkomórkowych, co kontrastuje z próbkami OIDs hodowanymi w warunkach ograniczenia azotu. W oświetleniu przeświecającym ciała lipidowe komórek można zwizualizować przy uważnej inspekcji, gdzie jawią się one jako błyszczące, okrągłe struktury i stanowią większość objętości komórki. Przedstawione tutaj komórki zawierają jedynie 5% oleju w przeliczeniu na suchą masę i nie wykazują znacznego poziomu ciał lipidowych w odpowiednich warunkach oświetleniowych.Różnice w tych próbkach są powiększone. Komórki ubogie w olej pojawiają się jako fluorescencyjne pierścienie z ciemnymi ciałami, podczas gdy komórki bogate w olej wykazują jasnopomarańczowy czerwony blask w miejscach, w których nagromadziły się ciała lipidowe. Nile red fluorescencyjnie emituje światło o różnych długościach fal w zależności od obecności neutralnych lipidów, fosfolipidów zlokalizowanych w ścianie komórkowej oraz niepolarnych białek komórkowych, dlatego komórki ubogie w olej pojawiają się jako fluorescencyjne pierścienie z ciemnymi ciałami.Ta nieswoistość jest również przyczyną poziomu fluorescencji tła podczas pomiarów spektrofotometrycznych lipidów obojętnych; w zoptymalizowanych warunkach analizy możliwe jest łatwe uzyskanie krzywych kalibracyjnych z wartościami R kwadrat powyżej 0,980. Zależność między zawartością oleju w komórkach a fluorescencją staje się nieliniowa, jeśli komórki są barwione w roztworze pozbawionym rozpuszczalnika nośnika, takiego jak etanol. Przedstawione tutaj dane mają wartość R kwadrat wynoszącą 0,395 i zostały uzyskane poprzez przeprowadzenie protokołu w roztworze 0% etanolu.Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje od 15 do 20 minut. Podczas realizacji tej procedury kluczowe jest zapewnienie, aby wszystkie próbki były przygotowane przy tej samej koncentracji biomasy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre zrozumienie sposobu pomiaru zawartości neutralnych lipidów w komórkach lgal, przy użyciu zarówno tradycyjnych protokołów ekstrakcji heksanem, jak i prostszej procedury barwienia fluorescencyjnego barwnikiem NAL red.

a-simple-rapid-protocol-for-measuring-neutral-lipids-algal-cells

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Prosty i szybki protokół pomiaru neutralnych lipidów w komórkach glonów z wykorzystaniem fluorescencji

Przedstawiamy szybki test oparty na fluorescencji, który monitoruje szybkość gaszenia fluorescencji jako miarę aktywności kanałów gramicydynowych. Kanały gramicydynowe są wykorzystywane jako molekularne przetworniki siły do monitorowania zmian w właściwościach dwuwarstwy lipidowej wyczuwanych przez białka przebiegające przez dwuwarstwę.

Test fluorescencyjny oparty na gramicydynie; do oznaczania potencjału małych cząsteczek w modyfikowaniu właściwości dwuwarstwy lipidowej

Ten film demonstruje protokół wykrywania i ilościowego oznaczania neutralnych lipidów w komórkach glonów poprzez barwienie ich czerwonym barwnikiem nilowym.

Barwienie czerwienią nilową: technika wykrywania i ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych obojętnych lipidów w algach

Opisano metodę oznaczania zawartości i składu kwasów tłuszczowych w mikroalgach na podstawie mechanicznego rozbijania komórek, ekstrakcji lipidów na bazie rozpuszczalnika, transestryfikacji oraz kwantyfikacji i identyfikacji kwasów tłuszczowych za pomocą chromatografii gazowej. Wewnętrzny wzorzec tripentadekaniny służy do kompensacji ewentualnych strat podczas ekstrakcji i niepełnej transestryfikacji.

Analiza zawartości i składu kwasów tłuszczowych w mikroalgach

Użycie fluoroforów do obrazowania in vivo może być znacznie ograniczone przez opsonizację, szybki klirens, niską czułość wykrywania i cytotoksyczne działanie na gospodarza. Enkapsulacja fluoroforów w liposomach poprzez hydratację i ekstruzję filmu prowadzi do wygaszania i ochrony fluorescencji, co umożliwia obrazowanie in vivo o wysokiej czułości wykrywania.

Wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo

Opisujemy test oparty na fluorescencji do pomiaru mieszania fosfolipidów w dużych liposomach jednowarstwowych odtworzonych za pomocą opsyny.

Test fluorescencyjny aktywności scramblazy fosfolipidowej

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania wskaźnika kropelek lipidów (indeksu LD) w celu zbadania dynamiki triacylogliceroli w komórkach hodowanych w eksperymentach wysokoprzepustowych. Test wskaźnika LD jest łatwą i niezawodną metodą, która wykorzystuje BODIPY 493/503. Ten test nie wymaga jednorazowej ekstrakcji lipidów ani analizy mikroskopowej.

Oznaczanie indeksu lipidowego metodą odzyskiwania ciekłej fluorescencji w patogenie grzybowym Ustilago maydis

Tutaj prezentujemy protokół budowy fotobioreaktorów z bąbelkowymi kolumnami na skalę laboratoryjną i wykorzystania ich do hodowli mikroalg. Dostarcza również metody określania tempa wzrostu kultury i neutralnej zawartości lipidów.

Hodowla zielonych mikroalg w fotobioreaktorach z kolumnami bąbelkowymi i test na obecność obojętnych lipidów

Ten protokół opisuje wytwarzanie liposomów oraz sposób, w jaki można je unieruchomić na powierzchni i zobrazować indywidualnie w masowy równoległy sposób za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pozwala to na ilościowe określenie wielkości i niejednorodności składu między pojedynczymi liposomami populacji.

Ilościowy test pojedynczego liposomu oparty na mikroskopii fluorescencyjnej do wykrywania niejednorodności składu między poszczególnymi liposomami

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania fluorescencyjnego, która wykorzystuje klasę wrażliwych na pH fluoroforów lipidowych do monitorowania transportu błony lipidowej podczas egzocytozy komórkowej i cyklu endocytozy.

Pomiar obrotu lipidów w błonie za pomocą wrażliwego na pH fluorescencyjnego analogu lipidowego ND6

Obecny protokół opisuje krok po kroku obrazowanie autofluorescencyjne i ocenę zmian fikobiliproteinowych u czerwonych alg na podstawie analizy spektralnej. Jest to bezznacznikowa i nieniszcząca metoda oceny adaptacji komórkowej do ekstremalnych siedlisk, gdy dostępny jest tylko rzadki materiał, a komórki rosną powoli lub wcale w warunkach laboratoryjnych.

Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny fizjologii czerwonych alg

Naucz się szybkiej metody pomiaru lipidów neutralnych w komórkach glonów za pomocą barwienia Nile Red i spektrofotometrii fluorescencyjnej. Protokół ten umożliwia efektywne monitorowanie procesów biotechnologicznych.

Prosty i szybki protokół pomiaru neutralnych lipidów w komórkach glonów za pomocą fluorescencji

Przeglądaj więcej filmów