Izolacja małych niekodujących RNA z ludzkiej surowicy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie wysokiej jakości RNA z próbek surowicy, przy zastosowaniu zoptymalizowanej wersji powszechnego protokołu RTLS z odczynnikiem MRC. Cel ten osiąga się poprzez wstępne rozcieńczenie surowicy w stosunku jeden do pięciu wodą wolną od nukleaz, aby zmniejszyć zanieczyszczenie białkami.

Drugim krokiem jest wprowadzenie probówek typu phase lock o pojemności dwóch mililitrów do pierwszego etapu wirowania. Pozwala to na uwięzienie większości zanieczyszczeń, takich jak fenol i białka, w fazie organicznej. Następnie trzecim i ostatnim krokiem optymalizacji jest krótkie wirowanie przy 12 000 g, które usuwa wszelkie pozostałe zanieczyszczenia z granulatu RNA przed przemywaniem etanolem.

Ostatnim krokiem jest połączenie dwóch zmodyfikowanych preparatów RNA od tego samego pacjenta, jeśli wymagana jest wyższa całkowita wydajność RNA. Ostatecznie, stosując tę zmodyfikowaną metodę, która wykorzystuje probówkę z blokadą fazową do wychwytywania głównych zanieczyszczeń oraz wprowadza krótkie wirowanie (flash spin) po rozpuszczeniu surowicy w wodzie wolnej od nukleaz, wykazujemy, że możliwe jest zmaksymalizowanie odzysku małych niekodujących RNA podczas izolacji RNA z surowicy.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowy protokół izolacji RNA metodą triolu, jest możliwość maksymalizacji wydajności uzyskiwania RNA z surowicy dzięki prostym modyfikacjom. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ małe RNA występują w surowicy w niskich ilościach. Zoptymalizowana metoda oraz wizualizacja tych etapów poprawią odzysk tych cząsteczek RNA i pomogą nowicjuszom w skutecznej izolacji.

Aby rozpocząć, rozmrozić na lodzie wcześniej przygotowaną zamrożoną próbkę surowicy, a następnie przenieść 400 µL świeżo rozmrożonej surowicy do opisanej probówki do mikrocentryfugi. Następnie rozcieńczyć surowicę za pomocą 100 µL wody wolnej od RNazy i dodać 50 µL proteinazy K o stężeniu 1 mg/mL. Potem inkubować rozcieńczoną surowicę w temperaturze 37 °C przez 20 minut, aby zapewnić odpowiednią trawienie białek i całkowite rozpuszczenie w 1,5 mL TRI reagent RTLS oraz 100 µL 4-bromonalolu.

Krótko odwróć probówkę z homogenatem i wykonaj wielokrotne pipetowanie przez pięć sekund. Następnie przenieś mieszaninę do opisanej probówki typu heavy phase lock o pojemności dwóch mililitrów. Wirowarkuj homogenat przy 12 000 GS przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie ostrożnie przelej 1 ml otrzymanego roztworu wodnego do nowej probówki typu DNA low bind. Faza organiczna oraz interfaza powinny pozostać uwięzione pod białym żelem probówki phase lock. Do roztworu wodnego dodaj 5 µL glikogenu oraz 500 µL 100% izopropanolu.

Wymieszaj roztwór przez odwracanie i inkubuj go przez noc w temperaturze -20 °C. Po nocnej inkubacji odwiruj próbkę przez 20 minut przy 12 000 g w wirówce schłodzonej do 4 °C. Następnie odlej przejrzysty supernatant i wykonaj krótkie wirowanie (flash spin) przez dwie minuty przy 16 000 g w wirówce schłodzonej do 4 °C.

Za pomocą pipety ostrożnie usuń przejrzysty roztwór otaczający pellet. Następnie przemyj pellet jednym mililitrem 70% etanolu i odwiruj próbkę przy 10 000 g przez 10 minut. Aby zwizualizować pellet, przechyl probówkę na ciemnym tle i zlej roztwór płuczący.

Powtórz płukanie. W kolejnym kroku resuspendujemy osad w 10 µL wody wolnej od RNA.

Upewnij się, że pellet jest całkowicie rozpuszczony, podgrzewając próbkę w temperaturze 55 °C przez pięć minut. W tym czasie mieszaj próbkę, wielokrotnie pipetując ją w celu uzyskania większej całkowitej puli RNA, przygotowując dwie preparacje RNA od tego samego pacjenta. Ilościowo określ resuspenderowane RNA, używając spektrometru UV.

Spektrofotometrem i ocenić jakość RNA za pomocą bioanalizatora 2100. Następnie przechowywać połączone próbki RNA w temperaturze -80 °C do późniejszych zastosowań. Profile spektrofotometryczne RNA z ludzkiej surowicy wykazują zwiększoną wydajność izolacji RNA dzięki dodaniu kilku etapów do tradycyjnej metody Chomczyńskiego.

Typowy profil UV RNA wyizolowanego z ludzkiej surowicy kontrastuje z profilami uzyskanymi dzięki zastosowaniu kroków optymalizacyjnych, w tym dodaniu glikogenu i dodatkowego wirowania; połączenie tych metod prowadzi do redukcji zanieczyszczeń i zwiększenia całkowitej wydajności RNA. Czystość próbki RNA została dodatkowo zwiększona dzięki zastosowaniu żelu blokującego fazy, który wyłapuje fenol i białka. Ponadto zwiększenie objętości surowicy ma znaczący wpływ na wydajność RNA.

W celu dalszej analizy jakości próbki wykonano analizę bioanalizatorem. Pojedynczy pik przy około 21 nukleotydach reprezentuje frakcję mikroRNA. Zgodnie z procedurą przeprowadzono profilowanie macierzy oraz reakcję qPCR. Profil macierzy trzech próbek z raka głowy i szyi oraz jednej próbki normalnej S wykazuje ekspresję mikroRNA, przeanalizowaną za pomocą klasteryzacji hierarchicznej i przedstawioną w formie mapy ciepła, na której widoczna jest nadekspresja i obniżona ekspresja mikroRNA.

Wygenerowano następujące krzywe amplifikacji QPCR dla specyficznych mikroRNA. Dane te posłużyły następnie do wykreślenia surowych wartości CT dla surowicy prawidłowej. Po opanowaniu techniki można ją stosować u dowolnej liczby pacjentów, uzyskując wysokiej jakości RNA, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak odkrywanie i walidacja biomarkerów, można zastosować inne metody, np. ilościowy PCR lub sekwencjonowanie nowej generacji.