Name: Izolacja małych niekodujących RNA z ludzkiej surowicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Naucz się izolować małe niekodujące RNA z ludzkiej surowicy. Zoptymalizowana metoda z wykorzystaniem rurek phase lock i wirowania flash maksymalizuje wydajność i czystość RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Samantha Khoury i Pamela Ajuyah są wspierane przez Australian Postgraduate Award. Chcielibyśmy również podziękować Translational Cancer Research Network, Lowy Cancer Research Centre, University of New South Wales oraz Northern Translational Cancer Research Unit za dodatkowe wsparcie dla Samanthy Khoury.

Uwaga: Próbki ludzkiej surowicy od zdrowych pacjentów lub pacjentów z rakiem zostały uzyskane za świadomą zgodą zgodnie z zatwierdzonymi ludzkimi protokołami etycznymi z Royal Prince Alfred Hospital Sydney (numer protokołu X10-0016 i HREC/10/RPAH/24) oraz University of Technology w Sydney. Próbki surowicy pobrano od pacjentów przed operacją z różnych szpitali w Sydney i umieszczono w magazynie w temperaturze -80 °C.
1. Izolacja małego RNA z surowicy 
Całkowite RNA zostało przygotowane z ludzkiej surowicy przy użyciu zmodyfikowanej wersji protokołu Tri-Reagent RT LS.
<ol>
	<li>Rozmrozić zamrożoną próbkę surowicy na lodzie, a następnie przenieść 400 μl świeżo rozmrożonej surowicy do znakowanej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Rozcieńczyć surowicę 100 μlH2Owolnego od RNaz i dodać proteinazę K w stężeniu 1 mg/ml.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut, aby umożliwić trawienie białek przez proteinazę K.</li>
	<li>Aby zapewnić całkowitą rozpuszczalność, dodaj 1,5-krotność objętości Tri-Reagent RT LS i 100 μl 4-bromoanizolu.</li>
	<li>Na krótko odwrócić homogenat, wykonywać powtarzalne pipetowanie przez 5 sekund i przenieść do oznakowanej probówki o pojemności 2 ml z ciężkim zamkiem fazowym.</li>
	<li>Wirować homogenat w temperaturze 12 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie zdekantować co najmniej 1 ml otrzymanego roztworu wodnego do świeżej probówki Lobind DNA. Substancja organiczna i interfaza powinny być uwięzione pod białym żelem rurki Phase Lock.</li>
	<li>Dodać 5,0 μl glikogenu (5 mg/ml) i 500 μl 100% izopropanolu do roztworu wodnego, wymieszać przez inwersję i inkubować O/N w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Po inkubacji O/N odwirować próbkę przez 20 minut pod ciśnieniem 12 000 × g w wirówce o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić klarowny supernatant i wirować przez 2 minuty pod ciśnieniem 16 000 × g w wirówce o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć klarowny roztwór otaczający osad za pomocą pipety.</li>
	<li>Przemyć granulat 1 ml 70% etanolu i odwirować przy 10 000 × g przez 10 minut. Zdekantować roztwór płuczący i powtórzyć etap mycia.</li>
</ol>
2. Ponowne zawieszenie RNA do roztworu
<ol>
	<li>Zawiesić osad w 10 μl H2O wolnego od RNaz, upewniając się, że osad jest całkowicie rozpuszczony. Aby upewnić się, że RNA jest całkowicie rozpuszczone, próbkę można podgrzać do 55 °C przez 5 minut. W tym czasie wymieszać próbkę, wielokrotnie pipetując. Aby uzyskać wyższą całkowitą wydajność RNA, połącz dwa preparaty RNA od tego samego pacjenta.</li>
	<li>Określ ilościowo ponownie zawieszony RNA za pomocą spektrofotometru UV-Vis i oceń jakość RNA za pomocą bioanalizatora 2100. Zbiorcze próbki RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w dalszych zastosowaniach.</li>
</ol>

<ol><li>Babu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+extraction+efficiency+of+small+RNAs+with+the+Agilent+2100+Bioanalyzer+and+the+Small+RNA+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Application+Note%22%5BJournal%5D)">Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit.</a> Agilent Application Note. , (2010).</li>
<li>Tran, N., Hutvagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+the+regulation+of+the+maturation+of+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs.</a> Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).</li>
<li>Chim, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+placental+microRNAs+in+maternal+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma.</a> Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).</li>
<li>Lodes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+cancer+with+serum+miRNAs+on+an+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microRNAs+in+serum%3A+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li>
<li>Burgos, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+extracellular+miRNA+in+human+cerebrospinal+fluid+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing.</a> RNA. 19, 712-722 (2013).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+miRNA+processing+and+expression+in+pleomorphic+adenomas+of+the+salivary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland.</a> Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).</li>
<li>Kirschner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemolysis+during+sample+preparation+alters+microRNA+content+of+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Murphy, N. R., Hellwig, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+nucleic+acid+organic+extraction+through+use+of+a+unique+gel+barrier+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material.</a> Biotechniques. 21, 934-936 (1996).</li>
<li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).</li>
<li>Ichikawa, M., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Combination+of+Extraction+Reagent+and+DNA+Microarray+That+Allows+for+the+Detection+of+Global+MiRNA+Profiles+from+Serum%2FPlasma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma.</a> Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).</li>
<li>Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+preparations+from+individual+monogenean+Gyrodactylus+salaris-a+comparison+of+six+commercially+available+totalRNA+extraction+kits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits.</a> BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).</li>
<li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).</li>
<li>McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Methods+for+miRNA+Extraction+from+Plasma+and+Quantitative+Recovery+of+RNA+from+Cerebrospinal+Fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid.</a> Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).</li>
<li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).</li>
</ol>

Nie ma nic do ujawnienia.

Populacja mikroRNA stanowi około 0,4-0,5% całkowitego RNA znajdującego się w surowicy. Ponadto w surowicy ludzkiej znajduje się również wysoka zawartość białka. Aby poprawić RNA i zmniejszyć zanieczyszczenie zarówno białkami, jak i fenolami, zmodyfikowaliśmy tradycyjne podejście Chomczynskiego9 , dodając kilka kroków.
Całkowite RNA wyizolowano z surowicy przy użyciu standardowego Tri-Reagent RT-LS (Centrum Badań Molekularnych), jednak metoda ta przeprowadzona w naszym laboratorium d...

W ostatnich latach coraz częściej dąży się do odkrycia nowych biomarkerów do wczesnego wykrywania chorób ludzkich. Wiele uwagi poświęcono wykorzystaniu małych RNA, takich jak mikroRNA2 (miRNA lub miR) jako potencjalnych markerów. Te małe RNA znajdują się w płynach ustrojowych, takich jak surowica, a badania wykazały, że są odporne na degradację i są stabilne w różnych warunkach środowiskowych3. Biorąc pod uwagę te cechy, surowica lub krążące miRNA są idealnym biomarkerem 4,5. Obecnie istnieją dwa główne podejścia do izolacji małego RNA z płynów biologicznych. Pierwsze podejście wykorzystuje technologię opartą na kolumnach do wiązania i elucji małych RNA6, podczas gdy drugie podejście wykorzystuje długotrwały protokół z odczynnikami tiocyjanianu fenolu i guanidyny7. Opracowaliśmy prosty, skuteczny, pozbawiony kolumn protokół izolowania małych RNA z ludzkiej surowicy. Wyizolowane RNA nadaje się do natychmiastowego wykorzystania w dalszych zastosowaniach, w tym w macierzach oligonukleotydowych DNA i sekwencjonowaniu RNA.
Ten protokół został opracowany, ponieważ napotkaliśmy kilka problemów podczas korzystania z metod opartych na fenolu do izolowania RNA z surowicy. Tradycyjne podejście Chomczyńskiego jest często stosowane w większości laboratoriów z szeregiem odczynników dostępnych u większości komercyjnych dostawców. Jednak biorąc pod uwagę ich powszechne stosowanie, nie opracowano rygorystycznych wytycznych dotyczących konsekwentnego wytwarzania wysokiej jakości RNA z płynów ustrojowych, w szczególności krwi lub surowicy.
Częste problemy związane z izolacją RNA z surowicy obejmują niską wydajność RNA i zanieczyszczenie odczynnikami używanymi podczas izolacji, szczególnie fenolem. Nasze podejście eliminuje te zanieczyszczenia fenolowe, aby zapewnić wysokiej jakości RNA do dalszych analiz, takich jak ilościowy PCR (qPCR) i sekwencjonowanie RNA. Przeprowadziliśmy dalsze testy tego RNA na macierzach miRNA.

<table><tbody><tr><td>Tri-Reagent RT LS</td><td>Molecular Research Center, USA</td><td>TR 118</td><td></td></tr><tr><td>Wolne od RNaz H2O</td><td>GIBCO Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Finnzymes, Finlandia</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Rurka z blokadą ciężkiej fazy</td><td>5PRIME</td><td>2302830</td><td>pojemność 2 ml</td></tr><tr><td>Probówka DNA Lobind</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.078</td><td>1.5 ml pojemność</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Invitrogen, USA</td><td>10814-010</td><td>5 mg / ml</td></tr><tr><td>Izopropanol klasy RNA</td><td>Sigma Aldrich, USA</td><td>I9516</td><td>100%</td></tr> <tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>John Morris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr> Etanol <tr><td>klasy RNA</td><td>Sigma Aldrich, USA</td><td>E7023</td><td>70%</td></tr><tr><td>Bioanalizator Agilent 2100</td><td>Agilent, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja małych niekodujących rna z ludzkiej surowicy

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Analiza RNA i jego ekspresji jest powszechną cechą w wielu laboratoriach. Istotne jest pojawienie się małych RNA, takich jak mikroRNA, które znajdują się w komórkach ssaków. Te małe RNA są silnymi regulatorami genów kontrolującymi ważne szlaki, takie jak wzrost, rozwój i śmierć, a duże zainteresowanie skierowano na ich ekspresję w płynach ustrojowych. Wynika to z ich rozregulowania w chorobach człowieka, takich jak rak, i ich potencjalnego zastosowania jako biomarkerów w surowicy. Problematyczna może być jednak analiza ekspresji miRNA w surowicy. W większości przypadków ilość surowicy jest ograniczona, a surowica zawiera niewielkie ilości całkowitego RNA, z czego małe RNA stanowią tylko 0,4-0,5%1. W związku z tym wyizolowanie wystarczającej ilości wysokiej jakości RNA z surowicy jest obecnie głównym wyzwaniem dla naukowców. W tym dokumencie technicznym przedstawiamy metodę, która wykorzystuje tylko 400 μl ludzkiej surowicy do uzyskania wystarczającej ilości RNA do macierzy DNA lub analizy qPCR. Zaletą tej metody jest jej prostota i możliwość uzyskania wysokiej jakości RNA. Nie wymaga specjalistycznych kolumn do oczyszczania małych RNA i wykorzystuje ogólne odczynniki i sprzęt, które można znaleźć w zwykłych laboratoriach. Nasza metoda wykorzystuje żel Phase Lock w celu wyeliminowania zanieczyszczenia fenolem, jednocześnie uzyskując wysokiej jakości RNA. Wprowadzamy również dodatkowy krok, aby jeszcze bardziej usunąć wszystkie zanieczyszczenia na etapie izolacji. Protokół ten jest bardzo skuteczny w izolowaniu wydajności całkowitego RNA do 100 ng/μl z surowicy, ale może być również dostosowany do innych tkanek biologicznych.

Rysunek 1 przedstawia typowe widmo UV/Vis RNA wyizolowanego z surowicy. Na podstawie tego profilu odnotowano zanieczyszczenie białkami przy 280 nm, a także zanieczyszczenia fenolem i substancjami organicznymi odpowiednio przy 270 nm i 230 nm. Przy 260 nm odnotowano również obecność pozostałości tiocyjanianu guanidyny. Aby zmniejszyć ilość zanieczyszczeń, wprowadzono szereg kroków optymalizacyjnych do standardowej procedury Tri-Reagent RT-LS. Dodano 5 mg/ml glikogenu w celu zwiększenia całkowitej wydajnoś...

Ten protokół opisuje metodę ekstrakcji małych RNA z ludzkiej surowicy. Zastosowaliśmy tę metodę do wyizolowania mikroRNA z surowicy nowotworowej do zastosowania w macierzach DNA, a także w ilościowym PCR singleplex. W protokole wykorzystuje się odczynniki tiocyjanianu fenolu i guanidyny z modyfikacjami w celu uzyskania wysokiej jakości RNA.

Izolacja małych niekodujących RNA z ludzkiej surowicy

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie wysokiej jakości RNA z próbek surowicy, przy zastosowaniu zoptymalizowanej wersji powszechnego protokołu RTLS z odczynnikiem MRC. Cel ten osiąga się poprzez wstępne rozcieńczenie surowicy w stosunku jeden do pięciu wodą wolną od nukleaz, aby zmniejszyć zanieczyszczenie białkami.Drugim krokiem jest wprowadzenie probówek typu phase lock o pojemności dwóch mililitrów do pierwszego etapu wirowania. Pozwala to na uwięzienie większości zanieczyszczeń, takich jak fenol i białka, w fazie organicznej. Następnie trzecim i ostatnim krokiem optymalizacji jest krótkie wirowanie przy 12 000 g, które usuwa wszelkie pozostałe zanieczyszczenia z granulatu RNA przed przemywaniem etanolem.Ostatnim krokiem jest połączenie dwóch zmodyfikowanych preparatów RNA od tego samego pacjenta, jeśli wymagana jest wyższa całkowita wydajność RNA. Ostatecznie, stosując tę zmodyfikowaną metodę, która wykorzystuje probówkę z blokadą fazową do wychwytywania głównych zanieczyszczeń oraz wprowadza krótkie wirowanie (flash spin) po rozpuszczeniu surowicy w wodzie wolnej od nukleaz, wykazujemy, że możliwe jest zmaksymalizowanie odzysku małych niekodujących RNA podczas izolacji RNA z surowicy.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowy protokół izolacji RNA metodą triolu, jest możliwość maksymalizacji wydajności uzyskiwania RNA z surowicy dzięki prostym modyfikacjom. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ małe RNA występują w surowicy w niskich ilościach. Zoptymalizowana metoda oraz wizualizacja tych etapów poprawią odzysk tych cząsteczek RNA i pomogą nowicjuszom w skutecznej izolacji.Aby rozpocząć, rozmrozić na lodzie wcześniej przygotowaną zamrożoną próbkę surowicy, a następnie przenieść 400 µL świeżo rozmrożonej surowicy do opisanej probówki do mikrocentryfugi. Następnie rozcieńczyć surowicę za pomocą 100 µL wody wolnej od RNazy i dodać 50 µL proteinazy K o stężeniu 1 mg/mL. Potem inkubować rozcieńczoną surowicę w temperaturze 37 °C przez 20 minut, aby zapewnić odpowiednią trawienie białek i całkowite rozpuszczenie w 1,5 mL TRI reagent RTLS oraz 100 µL 4-bromonalolu.Krótko odwróć probówkę z homogenatem i wykonaj wielokrotne pipetowanie przez pięć sekund. Następnie przenieś mieszaninę do opisanej probówki typu heavy phase lock o pojemności dwóch mililitrów. Wirowarkuj homogenat przy 12 000 GS przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie ostrożnie przelej 1 ml otrzymanego roztworu wodnego do nowej probówki typu DNA low bind. Faza organiczna oraz interfaza powinny pozostać uwięzione pod białym żelem probówki phase lock. Do roztworu wodnego dodaj 5 µL glikogenu oraz 500 µL 100% izopropanolu.Wymieszaj roztwór przez odwracanie i inkubuj go przez noc w temperaturze -20 °C. Po nocnej inkubacji odwiruj próbkę przez 20 minut przy 12 000 g w wirówce schłodzonej do 4 °C. Następnie odlej przejrzysty supernatant i wykonaj krótkie wirowanie (flash spin) przez dwie minuty przy 16 000 g w wirówce schłodzonej do 4 °C.Za pomocą pipety ostrożnie usuń przejrzysty roztwór otaczający pellet. Następnie przemyj pellet jednym mililitrem 70% etanolu i odwiruj próbkę przy 10 000 g przez 10 minut. Aby zwizualizować pellet, przechyl probówkę na ciemnym tle i zlej roztwór płuczący.Powtórz płukanie. W kolejnym kroku resuspendujemy osad w 10 µL wody wolnej od RNA.Upewnij się, że pellet jest całkowicie rozpuszczony, podgrzewając próbkę w temperaturze 55 °C przez pięć minut. W tym czasie mieszaj próbkę, wielokrotnie pipetując ją w celu uzyskania większej całkowitej puli RNA, przygotowując dwie preparacje RNA od tego samego pacjenta. Ilościowo określ resuspenderowane RNA, używając spektrometru UV.Spektrofotometrem i ocenić jakość RNA za pomocą bioanalizatora 2100. Następnie przechowywać połączone próbki RNA w temperaturze -80 °C do późniejszych zastosowań. Profile spektrofotometryczne RNA z ludzkiej surowicy wykazują zwiększoną wydajność izolacji RNA dzięki dodaniu kilku etapów do tradycyjnej metody Chomczyńskiego.Typowy profil UV RNA wyizolowanego z ludzkiej surowicy kontrastuje z profilami uzyskanymi dzięki zastosowaniu kroków optymalizacyjnych, w tym dodaniu glikogenu i dodatkowego wirowania; połączenie tych metod prowadzi do redukcji zanieczyszczeń i zwiększenia całkowitej wydajności RNA. Czystość próbki RNA została dodatkowo zwiększona dzięki zastosowaniu żelu blokującego fazy, który wyłapuje fenol i białka. Ponadto zwiększenie objętości surowicy ma znaczący wpływ na wydajność RNA.W celu dalszej analizy jakości próbki wykonano analizę bioanalizatorem. Pojedynczy pik przy około 21 nukleotydach reprezentuje frakcję mikroRNA. Zgodnie z procedurą przeprowadzono profilowanie macierzy oraz reakcję qPCR. Profil macierzy trzech próbek z raka głowy i szyi oraz jednej próbki normalnej S wykazuje ekspresję mikroRNA, przeanalizowaną za pomocą klasteryzacji hierarchicznej i przedstawioną w formie mapy ciepła, na której widoczna jest nadekspresja i obniżona ekspresja mikroRNA.Wygenerowano następujące krzywe amplifikacji QPCR dla specyficznych mikroRNA. Dane te posłużyły następnie do wykreślenia surowych wartości CT dla surowicy prawidłowej. Po opanowaniu techniki można ją stosować u dowolnej liczby pacjentów, uzyskując wysokiej jakości RNA, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak odkrywanie i walidacja biomarkerów, można zastosować inne metody, np. ilościowy PCR lub sekwencjonowanie nowej generacji.

isolation-of-small-noncoding-rnas-from-human-serum

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja małych niekodujących RNA z ludzkiego surowicy krwi

Niniejsza praca przedstawia metody izolacji, oczyszczania i detekcji egzosomów, a także techniki analizy ich zawartości molekularnej. Metody te można dostosować do izolacji egzosomów zarówno z pożywek hodowli komórkowych, jak i z płynów biologicznych; poza analizą zawartości molekularnej mogą one być również przydatne w badaniach funkcjonalnych.

Izolacja i charakterystyka egzosomów zawierających RNA

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Ten protokół opisuje izolację i kwantyfikację małych RNA lipoprotein o dużej gęstości.

Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Ten protokół pokazuje, jak oczyszczać zewnątrzkomórkowe mikroRNA z pożywek do hodowli komórkowych w celu budowy małych bibliotek RNA i sekwencjonowania nowej generacji. Opisano różne punkty kontrolne kontroli jakości, aby umożliwić czytelnikom zrozumienie, czego można się spodziewać podczas pracy z próbkami o niskim poziomie wejściowym, takimi jak exRNA.

Izolowanie, sekwencjonowanie i analiza zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy krok po kroku strategię izolowania małych RNA, wzbogacania mikroRNA i przygotowywania próbek do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Następnie opisujemy, jak przetwarzać odczyty sekwencji i dopasowywać je do mikroRNA za pomocą narzędzi open source.

Kompletny potok do izolowania i sekwencjonowania mikroRNA oraz analizowania ich przy użyciu narzędzi open source

Koliste RNA (circRNA) to niekodujące RNA, które mogą odgrywać rolę w regulacji transkrypcji i pośredniczeniu w interakcjach między białkami. Po dokonaniu oceny różnych parametrów budowy bibliotek sekwencjonowania circRNA, opracowano protokół wykorzystujący przygotowanie biblioteki nici całkowitego RNA ze wstępną obróbką RNazy R i przedstawiono go tutaj.

Identyfikacja kolistych RNA za pomocą sekwencjonowania RNA

Ten protokół izoluje wysokiej jakości całkowite RNA z próbek kału zwierząt i ludzi. Komercyjny zestaw do izolacji miRNA jest używany ze znaczną adaptacją do izolowania czystego RNA ze zoptymalizowaną ilością i jakością. Izolaty RNA są dobre dla większości dalszych testów RNA, takich jak sekwencjonowanie, mikromacierz i RT-PCR.

Izolacja kałowego (mikro) RNA

Obecny protokół opisuje izolację mikroRNA z gruczołów ślinowych kleszczy i oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Jest to uniwersalna procedura, która łączy w sobie powszechnie używane odczynniki i materiały eksploatacyjne. Metoda pozwala również na użycie niewielkiej liczby kleszczy, co skutkuje wysokiej jakości mikroRNA, które można łatwo zsekwencjonować.

Izolacja mikroRNA z kultur gruczołów ślinowych ex vivo kleszczy i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Naucz się izolować małe niekodujące RNA z ludzkiej surowicy. Zoptymalizowana metoda z wykorzystaniem rurek phase lock i wirowania flash maksymalizuje wydajność i czystość RNA.

Izolacja małych niekodujących RNA z ludzkiej surowicy

Przeglądaj więcej filmów