Izolacja małych niekodujących RNA z ludzkiej surowicy
19 czerwca 2014
Ten protokół opisuje metodę ekstrakcji małych RNA z ludzkiej surowicy. Zastosowaliśmy tę metodę do wyizolowania mikroRNA z surowicy nowotworowej do zastosowania w macierzach DNA, a także w ilościowym PCR singleplex. W protokole wykorzystuje się odczynniki tiocyjanianu fenolu i guanidyny z modyfikacjami w celu uzyskania wysokiej jakości RNA.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie wysokiej jakości RNA z próbek surowicy. Korzystając z naszej zoptymalizowanej wersji popularnego protokołu MRC odczynnika RTLS. Osiąga się to poprzez uprzednie rozcieńczenie surowicy w stosunku od jednego do pięciu wodą wolną od nukleaz w celu zmniejszenia zanieczyszczenia białkami.
Drugim krokiem jest wprowadzenie dwóch mililitrowych probówek z blokadą fazową do pierwszego etapu wirowania. W ten sposób większość zanieczyszczeń, takich jak fenol i białka, zostaje uwięziona w fazie organicznej. Kolejnym trzecim i ostatnim krokiem optymalizacji jest wirowanie błyskawiczne przy 12 000 serów, które usuwa wszelkie pozostałości zanieczyszczeń z osadu RNA przed płukaniem etanolem.
Ostatnim krokiem jest połączenie dwóch zmodyfikowanych preparatów RNA od tego samego pacjenta, jeśli wymagana jest wyższa całkowita wydajność RNA. Ostatecznie, dzięki zastosowaniu tej zmodyfikowanej metody, która rozpuszcza surowicę w wodzie wolnej od nukleaz, wykorzystuje rurkę blokującą fazę do wychwytywania głównych zanieczyszczeń i wprowadza spin błyskawiczny. Pokazujemy, że możliwe jest maksymalne odzyskanie małych niepowlekających RNA z izolacji RNA z surowicy.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak standardowy protokół izolacji triolowego RNA, jest to, że dzięki prostym modyfikacjom możemy zmaksymalizować wydajność RNA z surowicy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ małe RNA znajdują się w małych ilościach w surowicy. Zoptymalizowana metoda i wizualizacja tych kroków poprawi odzyskiwanie tych RNA i poprowadzi nowicjuszy do udanej końcówki izolacyjnej.
Aby rozpocząć rozmrażanie wcześniej przygotowanej zamrożonej próbki surowicy na lodzie, należy przenieść 400 mikrolitrów świeżo rozmrożonej surowicy do oznakowanej mikroprobówki wirówkowej. Następnie rozcieńczyć surowicę 100 mikrolitrami wody wolnej od R nasy i dodać 50 mikrolitrów proteinazy K w stężeniu jednego miligrama na mililitr. Następnie inkubować rozcieńczoną surowicę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby umożliwić odpowiednie trawienie białka, aby zapewnić całkowitą rozpuszczalność w 1,5 mililitra triodczynnika RTLS i 100 mikrolitrach czterech anoli promocyjnych.
Na krótko odwrócić homogenat i powtarzać pipetowanie przez pięć sekund. Następnie przenieś mieszaninę do oznakowanej dwumililitrowej ciężkiej rurki z zamkiem fazowym. Wirować homogenat w temperaturze 12 000 GS przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie ostrożnie zdekantować jeden mililitr powstałego roztworu wodnego do świeżej probówki o niskim wiązaniu DNA. Substancja organiczna i granica faz powinny być uwięzione pod białym żelem rurki z węzłem fazowym. Następnie do roztworu wodnego dodaj pięć mikrolitrów glikogenu i 500 mikrolitrów 100% izopropanolu.
Wymieszaj roztwór przez odwrócenie i inkubuj go przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po całonocnej inkubacji odwirować próbkę przez 20 minut w temperaturze 12 000 GS w wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć klarowny supernatant i wykonuj wirowanie błyskawiczne przez dwie minuty w temperaturze 16 000 GS w wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Za pomocą pipety ostrożnie usunąć klarowny roztwór otaczający osad. Następnie przemyj osad jednym mililitrem 70% etanolu i odwiruj próbkę w temperaturze 10 000 GS przez 10 minut. Aby uwidocznić osad, przechyl rurkę przed ciemne tło i usuń roztwór myjący.
Powtórz pranie. Zrób krok naprzód. Zawiesiliśmy granulat w 10 mikrolitrach wody wolnej od RNA.
Upewnij się, że osad jest całkowicie rozpuszczony, podgrzewając próbkę w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez pięć minut. W tym czasie należy wymieszać próbkę z wielokrotnym pipetowaniem w celu uzyskania wyższej całkowitej puli RNA, dwóch preparatów RNA od tego samego pacjenta. Określ ilościowo ponownie zawieszony RNA za pomocą
spektrofotometru UV i oceń jakość RNA za pomocą bioanalizatora 2100. Następnie przechowuj zebrane próbki RNA w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w dalszych zastosowaniach. Profile fotometryczne widm RNA z ludzkiej surowicy wykazują poprawę wydajności RNA dzięki dodaniu kilku etapów do tradycyjnego podejścia kumpla Chomsky'ego.
Typowy profil UV RNA wyizolowanego z ludzkiej surowicy kontrastuje z tymi wykorzystującymi etapy optymalizacji, w tym dodanie glikogenu i dodatkowego spinu, a każde z tych narzędzi połączone skutkuje redukcją zanieczyszczeń i zwiększoną całkowitą wydajnością RNA. Czystość próbki RNA została dodatkowo zwiększona dzięki zastosowaniu żelu z synchronizacją fazową, który zatrzymuje fenol i białka. Dodatkowo zwiększenie objętości surowicy ma znaczący wpływ na wydajność RNA.
Wykonano ślad bioanalizatora w celu dalszej analizy jakości próbki. Pojedynczy kolec przy około 21 nukleotydach reprezentuje profilowanie macierzy frakcji mikro RNA i QPCR przeprowadzono po procedurze. Ten profil matrycowy trzech nowotworów głowy i szyi oraz jednego normalnego S pokazuje ekspresję mikroRNA, analizowany przy użyciu hierarchicznego grupowania i przedstawiony jako mapa cieplna, na której można zobaczyć regulację w górę i w dół mikroRNA.
Następnie wygenerowano krzywe amplifikacji QPCR dla określonych mikroRNA. Dane te zostały następnie wykorzystane do wykreślenia surowych wartości CT dla normalnej surowicy Po opanowaniu technika ta może być wykonywana na dowolnej liczbie pacjentów wytwarzających wysokiej jakości RNA w dzisiejszym maksimum, jeśli zostanie wykonana prawidłowo Po zabiegu. Inne metody, takie jak ilościowy PCR lub sekwencjonowanie nowej generacji, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak odkrywanie i walidacja biomarkerów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę ekstrakcji wysokiej jakości małych RNA z próbek surowicy ludzkiej. Zoptymalizowana procedura ma na celu izolację mikroRNA do zastosowań takich jak macierze DNA oraz ilościowa PCR.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Ekstrakcja RNA
Wstęp
- Małe RNA odgrywają kluczową rolę w regulacji genów.
- Izolacja wysokiej jakości RNA jest niezbędna dla dokładności dalszych zastosowań.
- Próbki surowicy mogą stanowić wyzwanie ze względu na zanieczyszczenia białkowe.
- Zoptymalizowane protokoły są niezbędne w celu zwiększenia wydajności i czystości RNA.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody izolacji małych RNA z surowicy.
- Poprawa jakości RNA do zastosowań badawczych.
- Dostarczenie protokołu minimalizującego ryzyko kontaminacji.
Zastosowane metody
- Rozcieńczenie surowicy wodą wolną od nukleaz w celu zmniejszenia zanieczyszczenia białkami.
- Zastosowanie probówek z fazową blokadą (phase lock tubes) podczas wirowania w celu oddzielenia zanieczyszczeń.
- Szybkie wirowanie (flash centrifugation) w celu usunięcia resztkowych zanieczyszczeń z osadów RNA.
- Przemywanie etanolem w celu oczyszczenia RNA.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia skuteczną izolację wysokiej jakości małych RNA.
- Zminimalizowane zanieczyszczenia przekładają się na lepszą integralność RNA.
- Wyizolowane microRNA mogą być efektywnie wykorzystywane w różnych testach.
- Wykazano możliwość zastosowania w badaniach nad nowotworami.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia niezawodne podejście do izolacji RNA z surowicy.
- Wysoka jakość RNA jest niezbędna dla uzyskania wiarygodnych wyników eksperymentalnych.
- Protokół można dostosować do różnych potrzeb badawczych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolowanie wysokiej jakości małych niekodujących RNA z ludzkiej surowicy umożliwia odkrywanie biomarkerów oraz walidację celów w onkologii i innych obszarach chorobowych. Metoda ta rozwiązuje problem niskiej wydajności RNA oraz zanieczyszczeń w surowicy, zwiększając pewność prognostyczną w badaniach biomarkerów we wczesnych stadiach. Dzięki zastosowaniu minimalnej objętości próbki i standardowych odczynników laboratoryjnych, protokół ten wspiera skalowalne i powtarzalne przepływy pracy w rurociągach badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wzorców ekspresji mikroRNA jako potencjalnych biomarkerów lub celów terapeutycznych w szlakach chorobowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia niezawodną metodę pozyskiwania wystarczającej ilości RNA z ograniczonych objętości surowicy do późniejszej walidacji funkcjonalnej.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na otrzymanie wysokiej czystości RNA nadającego się do zastosowań w mikromacierzach i qPCR, co zapewnia dokładną detekcję zmian w ekspresji małych RNA.
- Wartość operacyjna: Redukuje zmienność spowodowaną przez zanieczyszczenia, takie jak fenol i białka, poprawiając powtarzalność analiz między różnymi seriami i laboratoriami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera ciągłość procesu od odkrywania biomarkerów w surowicy do walidacji przedklinicznej z wykorzystaniem modeli istotnych dla danej choroby.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podejmowanie decyzji w oparciu o analizę ryzyka poprzez dostarczenie mierzalnych, wysokiej jakości danych o RNA do priorytetyzacji celów.
Integracja rurociągów i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w początkowy etap procesu odkrywania leków, wspierając identyfikację punktów uchwycenia opartą na hipotezach oraz opracowywanie testów analitycznych przed optymalizacją związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia weryfikację hipotez poprzez umożliwienie odzyskania małych cząsteczek RNA o niskiej zawartości z surowicy do profilowania ekspresji.
- Przesiewanie: Pozwala na uzyskanie standaryzowanych ilości RNA, co zwiększa powtarzalność i czułość w platformach przesiewowych opartych na mikromacierzach i qPCR.
- Analityka: Pozwala na uzyskanie mierzalnych ilości RNA oraz parametrów jakościowych (np. widm UV, zapisów z bioanalizatora), co umożliwia obiektywne porównanie integralności próbek i stopnia zaangażowania celu.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki dotyczące biomarkerów w surowicy z badaniami nad mechanizmami poprzez dostarczenie RNA odpowiedniego do testów funkcjonalnych w systemach modelowych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Wykorzystuje powszechnie dostępne odczynniki i sprzęt, co pozwala na adaptację metody w różnych zespołach i ośrodkach bez konieczności posiadania specjalistycznej infrastruktury.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez redukcję fałszywych sygnałów wynikających z degradacji RNA lub zanieczyszczeń.
- Wartość operacyjna: Poprawia wydajność i powtarzalność dzięki uproszczeniu etapów, takich jak zastosowanie żelu do blokowania faz (phase lock gel) oraz szybkie wirowanie.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji go/no-go w programach biomarkerów poprzez dostarczanie wiarygodnych danych z klinicznie dostępnych typów próbek.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia wcześniejszą identyfikację celów o wysokim potencjale, ograniczając inwestycje w kandydatów o niskim stopniu pewności.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga podstawowej wiedzy z zakresu biologii molekularnej w obszarze obchodzenia się z RNA oraz technik wirowania.
- Zależna od standardowego wyposażenia laboratoryjnego, w tym mikrocentryfug, probówek do separacji faz oraz spektrofotometrów.
- Wymaga ustandaryzowanych procedur operacyjnych w celu zapewnienia spójności etapów rozcieńczania, inkubacji i przemywania przez różnych użytkowników.
- Może wymagać optymalizacji podczas adaptacji do innych płynów ustrojowych lub typów tkanek ze względu na zróżnicowane profile zanieczyszczeń.
- Ograniczona przez naturalnie niskie stężenie całkowitego RNA w surowicy, co w przypadku niskiej wydajności wymaga starannego łączenia próbek.
