Name: Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Poznaj metodę obserwacji interakcji białko-DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek, łączącą podwójne pęsety optyczne z mikroskopią fluorescencyjną. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie dynamiki wiązania białek do DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Gijsowi Wuite, Erwinowi J.G. Petermanowi i Peterowi Grossowi za pomoc w mikrofluidyce oraz Alessii Tempestini za pomoc w przygotowaniu próbki. Badania zostały sfinansowane ze środków Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (7PR/2007-2013) na podstawie umowy o grant nr 284464 oraz z włoskiego Ministerstwa Edukacji, Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro in Ricerca 2013 RBFR13V4M2, a także w ramach projektu flagowego NANOMAX.

<ol><li>Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Methods+to+Study+Protein-DNA+Interactions+in+Vitro+and+in+Living+Cells+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level.</a> International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).</li>
<li>Tinoco, I., Gonzalez, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+mechanisms%2C+one+molecule+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Biological mechanisms, one molecule at a time.</a> Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+molecular+motors+and+switches+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Micr.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level.</a> Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).</li>
<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li>
<li>Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bead+movement+by+single+kinesin+molecules+studied+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers.</a> Nature. 348, 348-352 (1990).</li>
<li>Wang, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+velocity+measured+for+single+molecules+of+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase.</a> Science. 282, 902-907 (1998).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li>
<li>Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+single+quantum+dot+labeled+EcoRV+sliding+along+DNA+manipulated+by+double+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers.</a> Biophys J. 96, 50-52 (2009).</li>
<li>Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+optical+trapping%2C+fluorescence+microscopy+and+micro-fluidics+for+single+molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+chemistry+chemical+physics+%3A+PCCP%22%5BJournal%5D)">Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).</li>
<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+and+Lasers+in+Engineering%22%5BJournal%5D)">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).</li>
<li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+RNA+polymerase-DNA+interactions+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time.</a> Biophys J. 76, 709-715 (1999).</li>
<li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+RAD51+proteins+disassembling+from+nucleoprotein+filaments+under+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension.</a> Nature. 457, 745-748 (2009).</li>
<li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiona+in+the+trap%3A+the+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+A%3A+Pure+Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157(2007).</li>
<li>Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+optical+trapping+and+single-molecule+fluorescence+spectroscopy%3A+enhanced+photobleaching+of+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores.</a> J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).</li>
<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22European+Physical+Journal+B%22%5BJournal%5D)">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).</li>
<li>Elangovan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+in+vitro+and+in+situ+study+of+kinetics+of+myosin+II+from+frog+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle.</a> J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).</li>
<li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+laser+trap%2Fflow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).</li>
<li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nat Methods. 5, 517-525 (2008).</li>
<li>Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer+opening+in+LacI-mediated+DNA+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).</li>
<li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li>
<li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+structure+of+DNA+during+overstretching+by+using+multicolor%2C+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).</li>
<li>Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA with optical tweezers.</a> Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).</li>
<li>Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+precise+algorithm+based+on+maximum+radial+symmetry+for+single+molecule+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization.</a> Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).</li>
<li>Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+accurate+particle+tracking+by+calculation+of+radial+symmetry+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers.</a> Nat Methods. 9, 724-726 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W ciągu ostatniej dekady w technikach manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania nastąpił ogromny postęp pod względem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Połączenie technik manipulacji i obrazowania leży u podstaw potężnych instrumentów, które obecnie umożliwiają kontrolę warunków mechanicznych pojedynczego polimeru biologicznego, takiego jak DNA, RNA lub filamenty cytoszkieletu, oraz jednoczesną lokalizację pojedynczych białek oddziałujących z tym samym polimerem. Szczególnie interesujące jest kontrolowani...

Techniki pojedynczej cząsteczki (SM) znacznie się rozwinęły w ciągu ostatnich trzydziestu lat, aby odpowiedzieć na potrzebę przezwyciężenia niektórych ograniczeń tradycyjnych, masowych pomiarów roztworów 1-3. Manipulacja pojedynczymi cząsteczkami biologicznymi stworzyła możliwość pomiaru właściwości mechanicznych biopolimerów4 oraz kontroli parametrów mechanicznych oddziaływań białko-białko5 i białko-DNA6,7. Z drugiej strony detekcja fluorescencji SM stanowi niezwykle wszechstronne narzędzie do badania aktywności białek in vitro i in vivo, co daje możliwość lokalizacji i śledzenia pojedynczych cząsteczek z nanometrową precyzją. Dzięki dopasowaniu funkcji rozproszenia punktowego do obrazu SM, można uzyskać lokalizację z precyzją zależną głównie od stosunku sygnału do szumu (SNR) i osiągając granicę około jednego nanometra8,9. Metodologie te znajdują potężne zastosowania w badaniach dynamiki białek motorycznych, a także procesów dyfuzji leżących u podstaw poszukiwania celu w białkach wiążących DNA. Zdolność do wyznaczania stałych dyfuzji w funkcji sekwencji DNA, czasu przebywania na celu i dokładnego pomiaru długości DNA badanej podczas jednowymiarowych zdarzeń dyfuzji stanowi potężne narzędzie do badania dynamiki interakcji białko-DNA oraz do badania mechanizmów poszukiwania określonego celu.
Niedawno, połączenie tych dwóch technik stworzyło nową generację eksperymentalnychkonfiguracji 10-14, umożliwiających jednoczesną manipulację biologicznym substratem (na przykład filamentem aktynowym lub cząsteczką DNA) oraz wykrywanie/lokalizację oddziałującego enzymu partnerskiego (na przykład miozyny lub białka wiążącego DNA). Zalety tych technik polegają głównie na możliwości wywierania mechanicznej kontroli nad uwięzionym polimerem, umożliwiając w ten sposób badanie dynamiki oddziaływań w zależności od sił lub momentów obrotowych. Metodyka pozwala również na pomiar reakcji biochemicznych z dala od powierzchni, unikając jednego z głównych ograniczeń klasycznych metod SM, tj. konieczności unieruchomienia badanych cząsteczek na powierzchni (szkiełko lub mikrosfery).
Połączenie technik dwóch pojedynczych cząsteczek wymaga pokonania kilku trudności technicznych, głównie wynikających z wymagań stabilności mechanicznej i odpowiedniego SNR (zwłaszcza gdy wymagana jest lokalizacja z precyzją nm)15. Szczególnie w przypadku sprzężenia detekcji fluorescencji SM z pęsetą optyczną niezwykle ważna jest redukcja szumów i fotowybielania powodowanego przez pułapkujące lasery na podczerwień16 oraz kontrola biochemicznych do składania kompleksów biologicznych i wykonywanie pomiarów eksperymentalnych11. W tym miejscu opisujemy metody wykonywania udanych pomiarów w konfiguracji podwójnej lokalizacji pułapkowania/fluorescencji SM. Metodologia jest zilustrowana przykładem białka represorowego laktozy (LacI) znakowanego fluorescencyjnie (za pomocą Atto532) i wykrywanego podczas wiązania się z cząsteczką DNA (uwięzioną między dwiema pęsetami optycznymi) zawierającą określone sekwencje wiążące LacI (tj. operatory). Wykazano skuteczność metody w wykrywaniu wiązania LacI z DNA i dyfuzji wzdłuż jego konturu w procesie poszukiwania celu. Metodę stosuje się do dowolnej kombinacji sekwencji DNA i białka wiążącego DNA, a także do innych układów (mikrotubul lub filamentów aktynowych i oddziałujących z nimi białek motorycznych).

<table><tbody><tr><td>Izolatory elastomerowe</td><td>Newport</td><td>Newdamp</td><td>Wybierz odpowiedni elastomer Newdamp w zależności od wagi mikroskopu i częstotliwości rezonansowych</td></tr><tr><td>Izolator optyczny</td><td>Optyka do badań</td><td>IO-3-YAG-VHP</td><td></td></tr><tr><td>Laser Nd:YAG, długość fali 1,064 nm</td><td>Spectra-Physics</td><td>Millennia IR</td><td></td></tr><tr><td>Deflektory akustyczno-optyczne (AOD)</td><td>A& A optoelektroniczne</td><td>DTS-XY 250</td><td></td></tr><tr><td>Bezpośrednie syntezatory cyfrowe</td><td>Urządzenia</td><td></td><td></td>analogowe</tr><tr><td>Detektor kwadrantowy fotodiody</td><td>OSI optoelektronika</td><td>SPOT-15-YAG</td><td></td></tr><tr><td>DIO i płyta FPGA</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-7830R</td><td></td></tr><tr><td>Lampa halogenowa</td><td>Schott</td><td>KL 1500</td> Kondensator LCD <td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA zanurzenie</td><td></td>w wodzie</tr><tr><td>532 nm laser</td><td>Coherent</td><td>Sapphire</td><td></td></tr><tr><td>CCD 200X i 2000X</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>XC-ST70 CE</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik CCD zwielokrotniony elektronem</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Stolik piezoelektryczny z dokładnością nm</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-527.2CL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny</td><td>Chroma Technologies</td><td>600/100m</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki krzemionkowe (1,54 mm)</td><td>Bangs Laboratories</td><td>SS04N/5303</td><td></td></tr><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>Octan pentylu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46022</td><td>Łatwopalna ciecz i para (Nr 1272/2008)</td></tr><tr><td>Nitroceluloza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8267-5EA</td><td>Łatwopalna substancja stała&nbsp; (nr 1272/2008)</td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>MPM Instruments Srl</td><td>M502-HBD</td><td>z 2 wyjmowanymi blokami; wstępnie podgrzany do 120 &; C</td></tr><tr><td>NanoPort montuje</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>N-333</td><td></td></tr><tr><td>Rurki z polieteroeteroketonu&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>1535</td><td></td></tr><tr><td>Domowy metalowy uchwyt do montażu zbiornika ciśnieniowego komory przepływowej wykonany z plexi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki Luer lock-tip 2,5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS 02LZ1</td><td></td></tr><tr><td>Zawory odcinające&nbsp;</td><td>Upchurch Naukowy, Inc.</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>Złączki bezkołnierzowe&nbsp;</td><td>Upchurch Naukowy, Inc.</td><td>LT-111</td><td></td></tr><tr><td>Rurki fluorowane etylenowo-propylenowe&nbsp;</td><td>Upchurch Naukowy, Inc.</td><td>1549</td><td></td></tr><tr><td>Dwa sterowane komputerowo zawory elektromagnetyczne</td><td>Clippard, Cincinnati, USA</td><td>ET-2-H-M5</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik ciśnienia</td><td>Druck LTD</td><td>PTX 1400</td><td></td></tr><tr><td>biotyna-14-dCTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>19518-018</td><td></td></tr><tr><td>Końcowa deoksynukleotydylotransferaza (TdT)</td><td>Thermoscientific</td><td>EP0161</td><td></td></tr><tr><td>ATTO532 maleimid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68499</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid (DMF)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>Ciecz palna, szkodliwa przez wchłanianie przez skórę. Działa drażniąco, teratogenowo. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280; P305; P351; P338; P311</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris-(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Redukcja L-glutationu (GSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td>Ostra toksyczność, Doustnie (kategoria 5), H303</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrana, 10&nbsp; Koncentratory spinowe odcinające kDa Merck</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki polistyrenowe powlekane streptawidyną 1,87 i mikro; m</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>Zobacz materiał SVP-15-5</td><td></td></tr></tbody></table>

połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-dna

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Artykuł opisuje połączenie pęsety optycznej i wykrywania fluorescencji pojedynczej cząsteczki w celu zbadania interakcji białko-DNA. Metoda daje możliwość badania oddziaływań zachodzących w roztworze (unikając w ten sposób problemów związanych z bliskimi powierzchniami, jak w innych metodach jednocząsteczkowych), kontrolowania wydłużania DNA i śledzenia dynamiki oddziaływań w funkcji zarówno parametrów mechanicznych, jak i sekwencji DNA. Przedstawiono metody skutecznego pułapkowania optycznego i nanometrowej lokalizacji pojedynczych cząsteczek. Przedstawiono warunki doświadczalne pozwalające na badanie oddziaływania represora laktozy (lacI), znakowanego Atto532, z cząsteczką DNA zawierającą specyficzne sekwencje docelowe (operatory) do wiązania LacI. Metoda pozwala na obserwację określonych oddziaływań u operatorów, a także jednowymiarową dyfuzję białka w trakcie procesu poszukiwania celu. Metoda ta ma szerokie zastosowanie w badaniu oddziaływań białko-DNA, ale także w silnikach molekularnych, w których pożądana jest kontrola napięcia przyłożonego do polimeru ścieżki partnerskiej (na przykład aktyny lub mikrotubul).

W udanym eksperymencie jedno (lub więcej) znakowanych białek ulega wiązaniu/odwiązaniu i/lub dyfuzji jednowymiarowej wzdłuż cząsteczki DNA (Rysunek 3A). Lokalizacja białek wzdłuż cząsteczki DNA pozwala na kwantyfikację parametrów kinetycznych w funkcji sekwencji DNA. W przypadku zastosowania warunków buforowych wywołujących dyfuzję 1D, możliwe jest śledzenie trajektorii białek i wyznaczenie, na przykład, współczynnika dyfuzji D1D.
Dokładna pozycja pojedynczego punkt...

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obserwacja dynamicznej interakcji pomiędzy pojedynczym białkiem wiążącym DNA a cząsteczką DNA. Osiąga się to poprzez połączenie w specjalnie zbudowanym mikroskopie dwóch technik jednocząsteczkowych: podwójnych pęset optycznych oraz mikroskopii fluorescencyjnej. Układ ten jest również wyposażony w oświetlenie w polu jasnym do wizualizacji oraz system nanometrowej stabilizacji próbki.W drugim kroku budowana jest wielokanałowa komora przepływowa zintegrowana z mikrosystemem przepływowym, aby umożliwić do czterech przepływów laminarnych efektywne dostarczenie i zgromadzenie wszystkich komponentów niezbędnych do eksperymentu. Następnie, w celu przeprowadzenia doświadczeń, montowany jest konstrukt pojedynczej cząsteczki. W pierwszej kolejności dwie mikrosfery pokryte tityną paskową są chwytane za pomocą podwójnej pęsety optycznej w pierwszym kanale.Następnie dwie uwięzione kuleczki są przenoszone do drugiego kanału, aby umożliwić przyłączenie matrycy DNA znakowanej biotyną na obu końcach. Obecność pojedynczej cząsteczki DNA jest sprawdzana w trzecim kanale za pomocą analizy rozciągania DNA pod wpływem siły. Na koniec konstrukt kuleczka-DNA-kuleczka, zwany hantlem DNA, jest przenoszony do kanału z białkiem, w którym znajduje się fluorescencyjnie znakowane białko represora laktozy.Uzyskano wyniki wykazujące dyfuzję i specyficzne wiązanie pojedynczych cząsteczek LAC eye na pojedynczej rozciągniętej cząsteczce DNA oraz ilościowe określenie parametrów kinetycznych ruchu LAC eye. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu do istniejących metod analizy pojedynczych cząsteczek są możliwość kontrolowania naprężenia przyłożonego do nowej cząsteczki, możliwość precyzyjnego śledzenia ruchów wiążących białek w obszarze stabilnym nanometrycznie, a także możliwość pracy w znacznej odległości od powierzchni szkiełka przedmiotowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące oddziaływań białko-DNA, zwłaszcza w zakresie mechaniki regulacji ekspresji genów, a także dynamiki dyfuzji białek wzdłuż DNA w mechanizmach poszukiwania celu.Prezentacja tej metody jest bardzo przydatna do pokazania praktycznych aspektów konstrukcji celi przepływowej, obsługi próbek oraz montażu konstruktu z koralików DNA. W niniejszym filmie w pierwszej kolejności zademonstrowano sposób sprawdzania stabilności celowania dwóch laserów pułapkujących, wykorzystując jako punkt odniesienia mikrokoraliki przytwierdzone do powierzchni szkiełka podstawowego. Szczegółowe informacje na temat projektu i konstrukcji układu pęsety optycznej znajdują się w towarzyszącym tekście protokołu.Użyj szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 by 60 milimetrów, aby rozprowadzić dwa mikrolitry kulek krzemionkowych na powierzchni szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 by 32 milimetry. Przy użyciu dwóch kawałków dwustronnej taśmy przymocuj szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 by 32 milimetry do szkiełka przedmiotowego, aby stworzyć komorę przepływową.Napełnij celę przepływową 50 mM buforem fosforanowym i uszczelnij ją smarem silikonowym. Pojedynczy koralik krzemionkowy w mikroskopii w polu jasnym przy powiększeniu około 2000x. Pole widzenia powinno wynosić około 7x5 µm, przy rozdzielczości 68x576 pikseli, tak aby obraz koralika miał średnicę około 190 pikseli. Dryfty termiczne należy kompensować za pomocą oprogramowania sprzężenia zwrotnego, które oblicza pozycję XY na podstawie centrum obrazu oraz pozycję Z na podstawie pierścieni dyfrakcyjnych i koryguje dryfty.Przesuwając stolem piezoelektrycznym z dokładnością nanometrową lub lepszą, należy pokryć centrum lewej pułapki z centrum kuleczki, a następnie zmierzyć szum pozycji oraz jego odchylenie standardowe za pomocą fotodiody kwadratowej (QDP). Powtórz pomiar dla prawej pułapki. Odchylenie standardowe szumu pozycji powinno mieścić się w granicach kilku nanometrów, aby umożliwić precyzyjną lokalizację białek wiążących DNA w celu wykonania komory przepływowej.Najpierw za pomocą wiertła z diamentową końcówką wierci się otwory o średnicy 1 mm w szkiełku przedmiotowym o wymiarach 76 × 76 × 1 mm, aby utworzyć cztery wloty i jeden wylot. Pozwoli to na uzyskanie do czterech równoległych przepływów buforu.Każda z nich zawiera jeden z różnych komponentów wymaganych do eksperymentu: kuleczki, znakowane fluorescencyjnie białko DNA oraz bufor obrazujący. Oczyść szkiełko mikroskopowe etanolem i wycentruj port z włożonym pierścieniem O oraz pierścieniem klejącym na szkiełku, otaczającym otwory dostępowe. Na tym etapie niezbędne jest noszenie rękawiczek, aby uniknąć odcisków palców, które zakłóciłyby proces klejenia.Za pomocą drugiego zacisku przytwierdź nanoporty do szkiełka przedmiotowego, a następnie umieść je w piekarniku rozgrzanym do 180 stopni Celsjusza na jedną godzinę, aby zapewnić całkowite przyleganie. W międzyczasie narysuj na kartce papieru kontur celi przepływowej. Kanał powinien mieć około trzech milimetrów szerokości i odpowiadać położeniu otworów na szkiełku przedmiotowym.Umieść rysunek na dwóch kawałkach profilu i za pomocą skalpela wykonaj ostre i ciągłe nacięcia wzdłuż narysowanego obrysu. Usuń wszelkie powstałe wypukłości i wyrzuć dolną warstwę perfum, która służy jedynie do zapewnienia czystego podłoża. Następnie umieść do góry dnem w metalowym uchwycie szkiełko przedmiotowe zawierające przymocowane nanoporty.Ostrożnie dopasuj obrys komory z parafilmu do otworów, upewniając się, że parafilm nie zasłania wlotów i wylotu pokrywy komory z czystym szkiełkiem przedmiotowym, a następnie ostrożnie usuń nadmiar parafilmu wokół komory. Umieść dwa bloki grzejne, uprzednio podgrzane do 120 °C, na górnej części celi przepływowej, aby wywrzeć na nią jednorodny nacisk. Pozostaw parafilm do stopienia na około 25 minut.Kolejnym krokiem jest przygotowanie zbiornika ciśnieniowego oraz pojemników z buforem. Zbiornik ciśnieniowy wykonany jest z pleksiglasu i pozwala na umieszczenie do sześciu pojemników z buforem. Najpierw podłącz zawory odcinające przy wylotach pojemników z buforem, aby umożliwić włączanie przepływu buforu poprzez ustawienie dźwigni zaworu w pozycji pionowej lub jego wyłączanie poprzez obrót zgodnie z ruchem wskazówek zegara.Podczas przeprowadzania eksperymentów zamocuj celę przepływową na stoliku mikroskopu. Następnie połącz zawory odcinające za pomocą rurek z polieteroeteroketonu (PEEK) oraz złączki bezkołnierzowe z wlotami komory przepływowej. Rurki PEEK mają średnicę wewnętrzną około 150 µm; jako łącznik pomiędzy rurkami PEEK a zespołami nanoportów celi przepływowej stosuje się fragment rurki z fluoretylenu propylenu o długości około 3 cm i średnicy wewnętrznej około 500 µm.Jest to niezbędne w celu zmniejszenia przepływu buforu przy wlocie do komory, aby uniknąć uszkodzenia celi przepływowej lub oderwania nanoportu od szkła. Z kolei stosowanie wyłącznie rurek o dużej średnicy wewnętrznej wymagałoby użycia dużych objętości próbek biologicznych. Należy połączyć wylot komory przepływowej z otwartą probówką Falcon pod ciśnieniem atmosferycznym.Probetka ta służy do zbierania buforu wypływającego z komory przepływowej. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać 1 mL buforu A do każdego z pojemników z buforem i przyłożyć ciśnienie 200 mbar w celu przemycia rurek łączących oraz celi przepływowej. Do tego celu można wykorzystać system kontroli ciśnienia.Na koniec należy dostosować ciśnienie powietrza w zbiorniku ciśnieniowym. Należy sprawdzić obecność pęcherzyków powietrza, które mogą zaburzyć płynność przepływu. Delikatne stuknięcie w rurkę wylotową pomoże usunąć pozostałe pęcherzyki; następnie należy obniżyć ciśnienie do 20 millibars i zweryfikować, czy wszystkie kanały i rurki są wolne od pęcherzyków powietrza oraz czy bufor przepływa z podobnymi prędkościami we wszystkich kanałach.Przygotować próbki do końcowej objętości 300 µL. W tym doświadczeniu wykorzystuje się polistyrenowe kule pokryte streptawidyną, liniowe DNA biotynilowane na obu końcach, zawierające specyficzne sekwencje docelowe dla wiązania represora laktozy oraz fluorescencyjnie znakowane białko represora laktozy. Dodać każdą z próbek do jednego z pojemników strzykawkowych w następującej kolejności: kule do pierwszego kanału, DNA do drugiego, bufor obrazujący do trzeciego oraz znakowane białko do czwartego kanału.Ustaw przepływ na 20 millibarów i otwórz zawory odcinające, aby próbki dotarły do kanału przepływowego. Można to łatwo zaobserwować w kanale z kuleczkami. Obserwując pierwszy kanał w oświetleniu w polu jasnym, włącz dwie pęsety optyczne i przechwyć po jednej kuleczce polistyrenowej w każdej pułapce.Szybko przejdź do drugiego kanału, aby uniknąć wpadania pozostałych kulek do pułapek. Należy zauważyć, że dotarcie do kanału z DNA jest łatwo zauważalne po ustaniu przepływu kulek. Używając jednego deflektora optycznego AO lub ruchu OD, przesuwaj jedną uwięzioną kulkę w przód i w tył w pobliżu drugiej kulki, aby umożliwić przyłączenie rozciągniętego w przepływie DNA pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi kulkami.Po utworzeniu hantla DNA, nieruchomy koralik zaczyna podążać za ruchem koralika, który jest aktywnie przesuwany w przód i w tył przez pułapkę. Szybko przesuń się do kanału z buforem i wyłącz przepływ buforu. Przeprowadź analizę krzywej siła-rozciąganie, aby zweryfikować obecność pojedynczej cząsteczki DNA.Osiąga się to poprzez oddzielenie od siebie dwóch kulek przy jednoczesnym pomiarze napięcia DNA. Po uzyskaniu pojedynczej hantli DNA ponownie włącz przepływ i przesuń hantlę do kanału z białkiem. Przełącz na szerokopolową mikroskopię fluorescencyjną, aby monitorować oddziaływanie znakowanego białka represora laktozy z DNA, wyłącz przepływ i rozpocznij akwizycję.Metoda ta umożliwia wykrywanie pojedynczych cząsteczek represora laktozy lub lacI oddziałujących z rozciągniętą cząsteczką DNA. Na tym reprezentatywnym wykresie pojedyncza cząsteczka lacI dyfunduje wzdłuż niespecyficznych sekwencji DNA, podczas gdy inna cząsteczka lacI jest specyficznie związana z jednym operatorem znajdującym się w centrum cząsteczki DNA. Wykres ten przedstawia położenie dwóch cząsteczek lacI wzdłuż kierunku łączącego centra dwóch pułapek.Pozycje cząsteczek w funkcji czasu określono za pomocą algorytmu centrum symetrii radialnej; tutaj przedstawiono wykres średniego kwadratu przesunięcia (MSD) w funkcji czasu dla pojedynczej cząsteczki lacI dyfundującej wzdłuż rozciągniętej cząsteczki DNA. Współczynnik dyfuzji białka można łatwo wyznaczyć z regresji liniowej danych. Połączenie technik manipulacyjnych i obrazowania stanowi potężną metodę, umożliwiającą mechaniczną kontrolę nad pojedynczym polimerem biologicznym, takim jak DNA, RNA lub filamentem cytoszkieletu, oraz jednoczesną lokalizację pojedynczych cząsteczek białek oddziałujących z samym polimerem.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że łączenie technik manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania wymaga starannego zaprojektowania układu eksperymentalnego, aby zapewnić stabilność zawieszonego polimeru na poziomie nanometrów. Z drugiej strony, odpowiednia konstrukcja sondy biologicznej jest niezbędna, aby zagwarantować przestrzenną separację między laserem pułapkującym G a sondą fluorescencyjną. Szczegóły znajdują się w towarzyszącym tekście protokołu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu montażu cząsteczki DNA pomiędzy dwoma optycznymi szybkimi uderzeniami. Montaż tej konstrukcji jest łatwiejszy przy użyciu wielokanałowej celi przepływowej, dla której zapewniliśmy szczegółowy opis. Wskazaliśmy również, jak zoptymalizować przepływ buforu i usuwać pęcherzyki powietrza, które w przeciwnym razie mogłyby negatywnie wpłynąć na przebieg eksperymentów.W protokole tekstowym łączonym znajdują się procedury znakowania DNA za pomocą bioTE, co jest niezbędne do montażu z koralikami powlekanymi streptawidyną, a także procedury znakowania białka. Na koniec przedstawiliśmy krok po kroku operacje służące do ilościowego określenia wiązania i dyfuzji pojedynczego białka represora laktozy na rozciągniętej cząsteczce DNA.

combining-single-molecule-manipulation-imaging-for-study-protein-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Łączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania dla badania interakcji białko-DNA

Opisano metodę obrazowania za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) w trybie stukowym (tapping mode) w celu wizualizacji plazmidowego DNA, białek cytoplazmatycznych oraz kompleksów DNA-białko. Metoda obejmuje alternatywne podejścia do przygotowania próbek do obrazowania AFM po przeprowadzeniu manipulacji biochemicznych. DNA zawierające specyficzne regiony oddziałujące z białkami są obserwowane w warunkach buforu zbliżonego do fizjologicznego.

Wizualizacja rekombinowanego DNA i kompleksów białkowych przy użyciu mikroskopii sił atomowych

Ten film opisuje metodę wizualizacji montażu kondensatów białek fuzyjnych na cząsteczkach DNA w określonych loci za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek. Kondensaty te powstają w wyniku oddziaływań LCD-LCD i LCD-DBD, które pozwalają na rekrutację polimerazy RNA II i zwiększoną transkrypcję genów.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w celu wizualizacji łączenia kondensatów białek fuzyjnych na zasłonach DNA

Mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM) w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych cząsteczek umożliwia bezpośrednią obserwację i kwantyfikację interakcji białko-DNA w żywych komórkach Escherichia coli.

Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji DNA-białko za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z pełnym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) przy użyciu specyficznie zmodyfikowanego substratu DNA λ i białka znakowanego kropkami kwantowymi.

Wizualizacja interakcji między białkiem znakowanym Qdot a specyficznie modyfikowanym λ DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki

Korzystając z DNA znakowanego kwantowo kropkami i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, możemy badać mechanizm reakcji endonukleaz restrykcyjnych, używając nieznakowanego białka. Ta technika jednocząsteczkowa pozwala na masowo multipleksowaną obserwację poszczególnych interakcji białko-DNA, a dane mogą być łączone w celu wygenerowania dobrze wypełnionych rozkładów czasu przebywania.

Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej

Tutaj opisujemy użycie metody obrazowania pojedynczych cząsteczek, Zasłon DNA, do badania biofizycznego mechanizmu gromadzenia się kondensatów EWS-FLI1 na DNA.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek kondensatów EWS-FLI1 składających się na DNA

Kurtyna DNA, wysokoprzepustowa technika obrazowania pojedynczych cząsteczek, stanowi platformę do wizualizacji w czasie rzeczywistym różnych interakcji białko-DNA. Niniejszy protokół wykorzystuje technikę kurtyny DNA do zbadania biologicznej roli i mechanizmu molekularnego Abo1, ATPazy AAA + zawierającej bromodomenę Schizosaccharomyces pombe.

Rozszyfrowanie molekularnego mechanizmu składania histonów za pomocą techniki kurtyny DNA

Wizualna, jednocząsteczkowa biochemia badana za pomocą komór mikroprzepływowych jest znacznie ułatwiona dzięki szklanemu cylindrowi, gazoszczelnym strzykawkom, stabilnym połączeniom rurek z komórkami przepływowymi i eliminacji pęcherzyków poprzez umieszczenie zaworów przełączających między strzykawkami a rurkami. Protokół opisuje podwójne pułapki optyczne, które umożliwiają wizualizację transakcji DNA i oddziaływań międzycząsteczkowych.

Zastosowanie podwójnej pęsety optycznej i mikrofluidyki do badań pojedynczych cząsteczek

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Zgłaszamy test hybrydowy i jednocząsteczkowy, aby bezpośrednio zobrazować i określić ilościowo ruch fluorescencyjnie znakowanej, w pełni zrekonstytuowanej helikazy Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) na liniowych cząsteczkach DNA utrzymywanych w miejscu w pułapce optycznej.

Zestaw hybrydowy i test jednocząsteczkowy do obrazowania ruchu w pełni odtworzonego CMG

Protokół ten określa procedurę wykonywania głębokiej, całkomórkowej mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej (SMLM) za pomocą obrotowego mikroskopu konfokalnego z optycznym przesunięciem fotonów, co umożliwia obrazowanie DNA-PAINT bez potrzeby stosowania niestandardowej optyki czy złożonego oświetlenia.

Obrazowanie całokomórkowe superrozdzielczości za pomocą DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów

Poznaj metodę obserwacji interakcji białko-DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek, łączącą podwójne pęsety optyczne z mikroskopią fluorescencyjną. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie dynamiki wiązania białek do DNA.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Przeglądaj więcej filmów