Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obserwacja dynamicznej interakcji pomiędzy pojedynczym białkiem wiążącym DNA a cząsteczką DNA. Osiąga się to poprzez połączenie w specjalnie zbudowanym mikroskopie dwóch technik jednocząsteczkowych: podwójnych pęset optycznych oraz mikroskopii fluorescencyjnej. Układ ten jest również wyposażony w oświetlenie w polu jasnym do wizualizacji oraz system nanometrowej stabilizacji próbki.

W drugim kroku budowana jest wielokanałowa komora przepływowa zintegrowana z mikrosystemem przepływowym, aby umożliwić do czterech przepływów laminarnych efektywne dostarczenie i zgromadzenie wszystkich komponentów niezbędnych do eksperymentu. Następnie, w celu przeprowadzenia doświadczeń, montowany jest konstrukt pojedynczej cząsteczki. W pierwszej kolejności dwie mikrosfery pokryte tityną paskową są chwytane za pomocą podwójnej pęsety optycznej w pierwszym kanale.

Następnie dwie uwięzione kuleczki są przenoszone do drugiego kanału, aby umożliwić przyłączenie matrycy DNA znakowanej biotyną na obu końcach. Obecność pojedynczej cząsteczki DNA jest sprawdzana w trzecim kanale za pomocą analizy rozciągania DNA pod wpływem siły. Na koniec konstrukt kuleczka-DNA-kuleczka, zwany hantlem DNA, jest przenoszony do kanału z białkiem, w którym znajduje się fluorescencyjnie znakowane białko represora laktozy.

Uzyskano wyniki wykazujące dyfuzję i specyficzne wiązanie pojedynczych cząsteczek LAC eye na pojedynczej rozciągniętej cząsteczce DNA oraz ilościowe określenie parametrów kinetycznych ruchu LAC eye. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu do istniejących metod analizy pojedynczych cząsteczek są możliwość kontrolowania naprężenia przyłożonego do nowej cząsteczki, możliwość precyzyjnego śledzenia ruchów wiążących białek w obszarze stabilnym nanometrycznie, a także możliwość pracy w znacznej odległości od powierzchni szkiełka przedmiotowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące oddziaływań białko-DNA, zwłaszcza w zakresie mechaniki regulacji ekspresji genów, a także dynamiki dyfuzji białek wzdłuż DNA w mechanizmach poszukiwania celu.

Prezentacja tej metody jest bardzo przydatna do pokazania praktycznych aspektów konstrukcji celi przepływowej, obsługi próbek oraz montażu konstruktu z koralików DNA. W niniejszym filmie w pierwszej kolejności zademonstrowano sposób sprawdzania stabilności celowania dwóch laserów pułapkujących, wykorzystując jako punkt odniesienia mikrokoraliki przytwierdzone do powierzchni szkiełka podstawowego. Szczegółowe informacje na temat projektu i konstrukcji układu pęsety optycznej znajdują się w towarzyszącym tekście protokołu.

Użyj szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 by 60 milimetrów, aby rozprowadzić dwa mikrolitry kulek krzemionkowych na powierzchni szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 by 32 milimetry. Przy użyciu dwóch kawałków dwustronnej taśmy przymocuj szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 by 32 milimetry do szkiełka przedmiotowego, aby stworzyć komorę przepływową.

Napełnij celę przepływową 50 mM buforem fosforanowym i uszczelnij ją smarem silikonowym. Pojedynczy koralik krzemionkowy w mikroskopii w polu jasnym przy powiększeniu około 2000x. Pole widzenia powinno wynosić około 7x5 µm, przy rozdzielczości 68x576 pikseli, tak aby obraz koralika miał średnicę około 190 pikseli. Dryfty termiczne należy kompensować za pomocą oprogramowania sprzężenia zwrotnego, które oblicza pozycję XY na podstawie centrum obrazu oraz pozycję Z na podstawie pierścieni dyfrakcyjnych i koryguje dryfty.

Przesuwając stolem piezoelektrycznym z dokładnością nanometrową lub lepszą, należy pokryć centrum lewej pułapki z centrum kuleczki, a następnie zmierzyć szum pozycji oraz jego odchylenie standardowe za pomocą fotodiody kwadratowej (QDP). Powtórz pomiar dla prawej pułapki. Odchylenie standardowe szumu pozycji powinno mieścić się w granicach kilku nanometrów, aby umożliwić precyzyjną lokalizację białek wiążących DNA w celu wykonania komory przepływowej.

Najpierw za pomocą wiertła z diamentową końcówką wierci się otwory o średnicy 1 mm w szkiełku przedmiotowym o wymiarach 76 × 76 × 1 mm, aby utworzyć cztery wloty i jeden wylot. Pozwoli to na uzyskanie do czterech równoległych przepływów buforu.

Każda z nich zawiera jeden z różnych komponentów wymaganych do eksperymentu: kuleczki, znakowane fluorescencyjnie białko DNA oraz bufor obrazujący. Oczyść szkiełko mikroskopowe etanolem i wycentruj port z włożonym pierścieniem O oraz pierścieniem klejącym na szkiełku, otaczającym otwory dostępowe. Na tym etapie niezbędne jest noszenie rękawiczek, aby uniknąć odcisków palców, które zakłóciłyby proces klejenia.

Za pomocą drugiego zacisku przytwierdź nanoporty do szkiełka przedmiotowego, a następnie umieść je w piekarniku rozgrzanym do 180 stopni Celsjusza na jedną godzinę, aby zapewnić całkowite przyleganie. W międzyczasie narysuj na kartce papieru kontur celi przepływowej. Kanał powinien mieć około trzech milimetrów szerokości i odpowiadać położeniu otworów na szkiełku przedmiotowym.

Umieść rysunek na dwóch kawałkach profilu i za pomocą skalpela wykonaj ostre i ciągłe nacięcia wzdłuż narysowanego obrysu. Usuń wszelkie powstałe wypukłości i wyrzuć dolną warstwę perfum, która służy jedynie do zapewnienia czystego podłoża. Następnie umieść do góry dnem w metalowym uchwycie szkiełko przedmiotowe zawierające przymocowane nanoporty.

Ostrożnie dopasuj obrys komory z parafilmu do otworów, upewniając się, że parafilm nie zasłania wlotów i wylotu pokrywy komory z czystym szkiełkiem przedmiotowym, a następnie ostrożnie usuń nadmiar parafilmu wokół komory. Umieść dwa bloki grzejne, uprzednio podgrzane do 120 °C, na górnej części celi przepływowej, aby wywrzeć na nią jednorodny nacisk. Pozostaw parafilm do stopienia na około 25 minut.

Kolejnym krokiem jest przygotowanie zbiornika ciśnieniowego oraz pojemników z buforem. Zbiornik ciśnieniowy wykonany jest z pleksiglasu i pozwala na umieszczenie do sześciu pojemników z buforem. Najpierw podłącz zawory odcinające przy wylotach pojemników z buforem, aby umożliwić włączanie przepływu buforu poprzez ustawienie dźwigni zaworu w pozycji pionowej lub jego wyłączanie poprzez obrót zgodnie z ruchem wskazówek zegara.

Podczas przeprowadzania eksperymentów zamocuj celę przepływową na stoliku mikroskopu. Następnie połącz zawory odcinające za pomocą rurek z polieteroeteroketonu (PEEK) oraz złączki bezkołnierzowe z wlotami komory przepływowej. Rurki PEEK mają średnicę wewnętrzną około 150 µm; jako łącznik pomiędzy rurkami PEEK a zespołami nanoportów celi przepływowej stosuje się fragment rurki z fluoretylenu propylenu o długości około 3 cm i średnicy wewnętrznej około 500 µm.

Jest to niezbędne w celu zmniejszenia przepływu buforu przy wlocie do komory, aby uniknąć uszkodzenia celi przepływowej lub oderwania nanoportu od szkła. Z kolei stosowanie wyłącznie rurek o dużej średnicy wewnętrznej wymagałoby użycia dużych objętości próbek biologicznych. Należy połączyć wylot komory przepływowej z otwartą probówką Falcon pod ciśnieniem atmosferycznym.

Probetka ta służy do zbierania buforu wypływającego z komory przepływowej. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać 1 mL buforu A do każdego z pojemników z buforem i przyłożyć ciśnienie 200 mbar w celu przemycia rurek łączących oraz celi przepływowej. Do tego celu można wykorzystać system kontroli ciśnienia.

Na koniec należy dostosować ciśnienie powietrza w zbiorniku ciśnieniowym. Należy sprawdzić obecność pęcherzyków powietrza, które mogą zaburzyć płynność przepływu. Delikatne stuknięcie w rurkę wylotową pomoże usunąć pozostałe pęcherzyki; następnie należy obniżyć ciśnienie do 20 millibars i zweryfikować, czy wszystkie kanały i rurki są wolne od pęcherzyków powietrza oraz czy bufor przepływa z podobnymi prędkościami we wszystkich kanałach.

Przygotować próbki do końcowej objętości 300 µL. W tym doświadczeniu wykorzystuje się polistyrenowe kule pokryte streptawidyną, liniowe DNA biotynilowane na obu końcach, zawierające specyficzne sekwencje docelowe dla wiązania represora laktozy oraz fluorescencyjnie znakowane białko represora laktozy. Dodać każdą z próbek do jednego z pojemników strzykawkowych w następującej kolejności: kule do pierwszego kanału, DNA do drugiego, bufor obrazujący do trzeciego oraz znakowane białko do czwartego kanału.

Ustaw przepływ na 20 millibarów i otwórz zawory odcinające, aby próbki dotarły do kanału przepływowego. Można to łatwo zaobserwować w kanale z kuleczkami. Obserwując pierwszy kanał w oświetleniu w polu jasnym, włącz dwie pęsety optyczne i przechwyć po jednej kuleczce polistyrenowej w każdej pułapce.

Szybko przejdź do drugiego kanału, aby uniknąć wpadania pozostałych kulek do pułapek. Należy zauważyć, że dotarcie do kanału z DNA jest łatwo zauważalne po ustaniu przepływu kulek. Używając jednego deflektora optycznego AO lub ruchu OD, przesuwaj jedną uwięzioną kulkę w przód i w tył w pobliżu drugiej kulki, aby umożliwić przyłączenie rozciągniętego w przepływie DNA pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi kulkami.

Po utworzeniu hantla DNA, nieruchomy koralik zaczyna podążać za ruchem koralika, który jest aktywnie przesuwany w przód i w tył przez pułapkę. Szybko przesuń się do kanału z buforem i wyłącz przepływ buforu. Przeprowadź analizę krzywej siła-rozciąganie, aby zweryfikować obecność pojedynczej cząsteczki DNA.

Osiąga się to poprzez oddzielenie od siebie dwóch kulek przy jednoczesnym pomiarze napięcia DNA. Po uzyskaniu pojedynczej hantli DNA ponownie włącz przepływ i przesuń hantlę do kanału z białkiem. Przełącz na szerokopolową mikroskopię fluorescencyjną, aby monitorować oddziaływanie znakowanego białka represora laktozy z DNA, wyłącz przepływ i rozpocznij akwizycję.

Metoda ta umożliwia wykrywanie pojedynczych cząsteczek represora laktozy lub lacI oddziałujących z rozciągniętą cząsteczką DNA. Na tym reprezentatywnym wykresie pojedyncza cząsteczka lacI dyfunduje wzdłuż niespecyficznych sekwencji DNA, podczas gdy inna cząsteczka lacI jest specyficznie związana z jednym operatorem znajdującym się w centrum cząsteczki DNA. Wykres ten przedstawia położenie dwóch cząsteczek lacI wzdłuż kierunku łączącego centra dwóch pułapek.

Pozycje cząsteczek w funkcji czasu określono za pomocą algorytmu centrum symetrii radialnej; tutaj przedstawiono wykres średniego kwadratu przesunięcia (MSD) w funkcji czasu dla pojedynczej cząsteczki lacI dyfundującej wzdłuż rozciągniętej cząsteczki DNA. Współczynnik dyfuzji białka można łatwo wyznaczyć z regresji liniowej danych. Połączenie technik manipulacyjnych i obrazowania stanowi potężną metodę, umożliwiającą mechaniczną kontrolę nad pojedynczym polimerem biologicznym, takim jak DNA, RNA lub filamentem cytoszkieletu, oraz jednoczesną lokalizację pojedynczych cząsteczek białek oddziałujących z samym polimerem.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że łączenie technik manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania wymaga starannego zaprojektowania układu eksperymentalnego, aby zapewnić stabilność zawieszonego polimeru na poziomie nanometrów. Z drugiej strony, odpowiednia konstrukcja sondy biologicznej jest niezbędna, aby zagwarantować przestrzenną separację między laserem pułapkującym G a sondą fluorescencyjną. Szczegóły znajdują się w towarzyszącym tekście protokołu.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu montażu cząsteczki DNA pomiędzy dwoma optycznymi szybkimi uderzeniami. Montaż tej konstrukcji jest łatwiejszy przy użyciu wielokanałowej celi przepływowej, dla której zapewniliśmy szczegółowy opis. Wskazaliśmy również, jak zoptymalizować przepływ buforu i usuwać pęcherzyki powietrza, które w przeciwnym razie mogłyby negatywnie wpłynąć na przebieg eksperymentów.

W protokole tekstowym łączonym znajdują się procedury znakowania DNA za pomocą bioTE, co jest niezbędne do montażu z koralikami powlekanymi streptawidyną, a także procedury znakowania białka. Na koniec przedstawiliśmy krok po kroku operacje służące do ilościowego określenia wiązania i dyfuzji pojedynczego białka represora laktozy na rozciągniętej cząsteczce DNA.