Name: Oczyszczanie białka transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy ulegającego ekspresji w Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania białka CFTR w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Technika ta umożliwia uzyskanie miligramowych ilości czynnego białka błonowego kluczowego dla badań nad mukowiscydozą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana przez Amerykańską Fundację Mukowiscydozy (CFF) poprzez jej Konsorcjum CFTR 3D Structure. TR był finansowany przez brytyjskie stypendium CF Trust, a NC przez brytyjskie stypendium BBSRC. Dziękujemy naszym kolegom z konsorcjum CFF CFTR 3D Structure za ich pomoc i porady oraz za projektowanie zoptymalizowanej pod kątem kodonów sekwencji CFTR kurczaka i znaczników oczyszczania.

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Aby przygotować 100-krotny zapas koktajlu inhibitorów proteazy (PI), rozpuść 96 mg AEBSF, 3,5 mg chymostatyny, 10 mg E64, 16,5 mg leupeptyny, 16,5 mg pepstatyny, 348 mg PMSF i 4 mg bestatyny w 20 ml DMSO. Przygotować 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Aby przygotować 100-krotny zapas benzamidyny, rozpuść 720 mg w 20 ml ultraczystej wody (ddH2O) i przechowuj w 1 ml porcji w temperaturze -20 °C. Ta ilość wystarcza na jedno oczyszczenie. We wszystkich stosuje się zapasy PI i benzamidyny w rozcieńczeniu 1:100.</li>
	<li>Przygotować "mPIB" (0,3 M Tris pH 8, 0,3 M sacharozy, 2 mM DTT) i "CFTR" (50 mM Tris pH 8, 20% (v/v) glicerolu, 1 mM DTT) i schłodzić do temperatury 4 °C. Przed użyciem należy dodać 1:100 koktajlu inhibitorów proteazy i 1:100 benzamidyny w zależności od objętości mPIB użytej do ponownego wytworzenia osadu komórkowego (np. użyć 3,5 ml PI i 3,5 ml benzamidyny w łącznej objętości 350 ml mPIB).</li>
	<li>Przygotować do solubilizacji. Bufor solubilizacyjny lizofosfatydyloglicerol-14 (LPG) (50 mM Tris pH 8, 10% (v/v) glicerol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, inhibitory proteazy (PI) i 4% (w/v) LPG) i bufor solubilizacyjny dodecylmaltozydu (DDM) (50 mM Tris pH 8, 20% (v/v) glicerol, 1 M NaCl, 1 mM DTT, inhibitory proteazy, 4% (w/v) DDM). Bufor może być sonikowany w kąpieli sonikatora (35 W, 40 kHz), aby pomóc w rozproszeniu detergentu, ale należy unikać wirowania mieszaniny, ponieważ tworzy to pęcherzyki. Przed użyciem schłodzić do 4 °C.</li>
	<li>Bufor oczyszczający CFTR do oczyszczania LPG to 50 mM Tris, 10% (v/v) glicerol, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (w/v) LPG-14 i inhibitory proteazy. Przygotować 350 ml tego buforu i 150 ml tego samego buforu plus 1 M imidazol. Dostosować pH obu do 8.</li>
	<li>Bufor do oczyszczania w DDM składa się z 50 mM Tris pH 8, 20% (v/v) glicerolu, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (w/v) DDM. Przygotować 350 ml tego buforu i 150 ml tego samego buforu plus 1 M imidazol. Dostosować pH obu do 8.</li>
	<li>Dla buforu do chromatografii żelowej (GPC) zawierającego LPG należy przygotować 50 mM Tris pH 8, 10% (v/v) glicerolu, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,05% (w/v) LPG-14. Dla GPC przy użyciu DDM przygotuj bufor 50 mM Tris pH 8, 20% (v/v) glicerolu, 1 M NaCl, 1 mM DTT, 0,1% (w/v) DDM. Wszystkie i ddH2O użyte w kolumnie GPC powinny być przefiltrowane (filtr 0,2 μm) i odgazowane przed użyciem.</li>
	<li>Bufor do próbek SDS-PAGE (2x stężenie robocze): 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 5% (v/v) glicerol, 5 mM EDTA, 0,02% (w/v) błękit bromofenolowy. Przygotować 700 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem dodać 200 μl 20% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 100 μl świeżej 0,5 M DTT. Inkubować przez co najmniej 10 minut z próbką w temperaturze pokojowej przed załadowaniem na żel. Nie podgrzewać; spowoduje to denaturację zwykłej praktyki rolniczej i może spowodować agregację CFTR.</li>
	<li>Aby wytworzyć zapasy lipidów do rozpuszczenia, należy rozpuścić mieszaninę lipidów E. coli i cholesterolu w stosunku 4:1 (m/m) w chloroformie i metanolu (2:1 v/v) i wysuszyć w szklanej fiolce pod gazemN2 przez 2 godziny, aby utworzyć film lipidowy. Dodać bufor GPC (bez NaCl) do stężenia lipidów 40 mg/ml i zastosować wielokrotne wirowanie i sonikację (35 W, 40 kHz) w celu wyjaśnienia roztworu.</li>
	<li>Do testu ATPazy należy przygotować 100-krotne zapasy inhibitorów ATPazy, rozpuszczając SCH28080 do 1 mM w DMSO, NaSCN do 1 M w ddH2O i oligomycynę do 2,5 mM w 100% (v / v) etanolu. Przechowywać w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C. Przygotować 100 ml buforu ATPazy z 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NH4Cl, 5 mMMgSO4 i 0,02% (w/v) NaN3. Można go przechowywać w temperaturze pokojowej i wykorzystywać do kilku testów. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować zapas ATP o pojemności 5 mM i przechowywać go na lodzie. (Uwaga: Użyj Na2ATP, aby zapobiec nadmiernemu sygnałowi tła z fosforanu w teście). Przygotować roztwór zatrzymujący SDS (12% (w/v) SDS w ddH2O).</li>
	<li>Do wykrywania szyflet należy przygotować bufor A (3% (w/v) askorbinian, 0,5% (w/v) molibdenian amonu, 0,5 M HCl) bezpośrednio przed użyciem i bufor B (2% (w/v) cytrynian sodu, 2% (w/v) metaarsenin sodu, 2% (v/v) kwas octowy).</li>
</ol>
2. Izolacja mikrosomów drożdży
<ol>
	<li>S. cerevisiae wykazujące ekspresję CFTR kurczaka są hodowane zgodnie z opisem w O'Ryan i in. (2012)14. Materiał z fermentacji o objętości 20 l należy przechowywać w dwóch porcjach w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
	<li>Szybko rozmrozić jedną porcję komórek i ponownie zawiesić w 3 ml schłodzonego mPIB na gram komórek.</li>
	<li>Rozbij komórki w młynie perełkowym za pomocą szklanych kulek o średnicy 425-600 μm. Użyj pięciu 1-minutowych okresów rozerwania komórek, oddzielonych 1-minutowymi okresami odpoczynku. (Okresy odpoczynku są niezbędne, aby zapewnić, że ogniwa nie zostaną nagrzane podczas zakłóceń).</li>
	<li>Monitorować rozbijanie komórek przez odwirowanie 1 ml próbki lizatu komórkowego z młyna perełkowego. Wirówka (12 000 x g, 4 °C, 5 min) w wirówce stołowej. Rozcieńczyć supernatant do 1:50 za pomocą mPIB w kuwecie i zmierzyć A380. Jeśli A380 > 0,1 lub przestał rosnąć pomimo kilku powtarzających się cykli uderzania koralikami, przejdź do następnego kroku. Jeśli nie, powtórz 2.3-2.4.</li>
	<li>Odwirować całkowity lizat komórkowy (12 000 x g, 4 °C, 20 min). Zachować supernatant. Odrzucić osad (zawierający nieuszkodzone komórki i mitochondria), ale jeśli istnieją jakiekolwiek wątpliwości co do skuteczności rozbijania komórek (patrz ppkt 2.4), należy również zachować osad.</li>
	<li>Odwirować supernatant z poprzedniego etapu (200 000 x g, 4 °C, 1,5 godz.). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane błony mikrosomalne w buforze CFTR. Jeżeli mikrosomy są przeznaczone do oczyszczania za pomocą DDM, należy uzupełnić bufor CFTR o 1 M NaCl.</li>
	<li>Powtórzyć odwirowanie zawieszonej frakcji membranowej (100 000 x g, 4 °C, 1 godz.) i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić granulowane mikrosomy w minimalnej objętości buforu CFTR (końcowa objętość 5-15 ml, całkowite białko mikrosomalne 70-200 mg). Test Bradforda może być stosowany do określenia całkowitego stężenia białek mikrosomalnych25. Ponadto należy zmierzyć widmo emisji fluorescencji membran (wzbudzenie = 485 nm, emisja = 500-600 nm) i powinno mieć wyraźny pik fluorescencji GFP (maksimum przy 512 nm). CFTR można wykryć specyficznie na żelu SDS-PAGE, zeskanowanym w warunkach fluorescencji GFP (ryc. 1).</li>
	<li>Zawiesiny mikrosomów należy błyskawicznie zamrozić, zanurzając je w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C lub przejść do kroku 3.</li>
</ol>
3. Solubilizacja mikrosomów
<ol>
	<li>W przypadku zamrożenia mikrosomy należy rozmrozić bezpośrednio przed użyciem w łaźni wodnej o temperaturze 10 °C.</li>
	<li>W celu rozpuszczania błon należy rozcieńczyć mikrosomy równą objętością odpowiedniego buforu do rozpuszczania (etap 1.3), aby uzyskać końcowe stężenie detergentu 2% (w/v) i stężenie białka mikrosomalnego 5 mg/ml. Inkubować tę mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z mieszaniem (rotator probówkowy). Zachowaj 200 μl do analizy.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę (100 000 x g, 4 °C, 45 min). Usunąć sklarowany sklarat zawierający rozpuszczone białka błonowe, przepuścić go przez filtr strzykawkowy 0,45 μm i przechowywać na lodzie. Zmierzyć fluorescencję supernatantu (jak w kroku 2.8).</li>
	<li>Zawiesić frakcję nierozpuszczalną w 1% (w/v) roztworze SDS do objętości równej frakcji rozpuszczalnej. Zmierzyć fluorescencję w tej frakcji i zachować podwielokrotność 50 μl do analizy SDS-PAGE.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie CFTR z powinowactwem do niklu
<ol>
	<li>Połączyć szeregowo dwie kolumny sefarozy niklu o pojemności 5 ml. Przemyć 20% (v/v) etanolem o objętości 2 litrów (CV), a następnie 2 CV ddH2O, a następnie przepłukać kolumnę 2 CV buforu do rozpuszczania (etap 1.4-1.5), zawierającego 1 M imidazol. Powtórzyć z 2 CV buforu solubilizacyjnego pozbawionego imidazolu.</li>
	<li>Dodać imidazol do końcowego stężenia 5 mM do rozpuszczonego materiału (krok 2.8) i ręcznie załadować materiał do kolumny lub do pętli próbki, jeśli używa się automatycznego urządzenia do chromatografii cieczowej.</li>
	<li>Załadować rozpuszczony materiał na kolumnę z natężeniem przepływu 0,5 ml/min i przemyć 2 CV buforu pozbawionego imidazolu przy tym samym natężeniu przepływu w celu usunięcia niezwiązanego materiału. Zbierz frakcje w 50 ml probówkach Falcon.</li>
	<li>Do pierwszego przemywania należy użyć 3 CV buforu oczyszczającego z 40 mM imidazolem o natężeniu przepływu 1 ml/min. Zebrać 2 ml frakcji.</li>
	<li>Do drugiego płukania należy użyć 3 CV buforu oczyszczającego ze 100 mM imidazolem. Zebrać 2 ml frakcji.</li>
	<li>Eluować CFTR z kolumny HisTrap za pomocą 3 CV buforu oczyszczającego z 400 mM imidazolem. Zebrać 2 ml frakcji.</li>
	<li>Monitorować fluorescencję we frakcjach eluowanych (krok 2.8).</li>
	<li>Zachowaj podwielokrotności ułamków pików do analizy SDS-PAGE. Pozostałe próbki frakcji pikowej należy błyskawicznie zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C lub przejść do następnego etapu oczyszczania.</li>
</ol>
5. Chromatografia żelowa (GPC) Oczyszczanie CFTR
<ol>
	<li>Zrównoważyć kolumnę (Superose 6 10/300 GL) z buforem 1.2 CV ddH2O, a następnie buforem GPC 1.2 CV.</li>
	<li>W kroku 5.1 należy skoncentrować oczyszczone frakcje o powinowactwie do niklu o najwyższej fluorescencji GFP za pomocą filtra odśrodkowego o mocy 100 000 MWCO w temperaturze 4 °C. W przypadku oczyszczania w DDM należy unikać zagęszczania próbki powyżej stężenia białka 0,3 mg/ml białka, ponieważ spowoduje to znaczną utratę próbki. Wyjąć retentat z koncentratora i odwirować przy 100 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania granulek dużych cząstek.</li>
	<li>Wstrzyknąć tę próbkę do kolumny i eluować za pomocą gradientu izokratycznego buforu 1,2 CV GPC. Zebrać frakcje o pojemności 0,5 ml.</li>
	<li>Zmierzyć fluorescencję GFP jak w sekcji 2.8 w celu zidentyfikowania frakcji zawierających CFTR. Zachowaj niewielką objętość (np. 50 μl) każdego z nich do analizy za pomocą SDS-PAGE.</li>
	<li>Frakcje zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
6. Rekonstrukcja CFTR
<ol>
	<li>Dodać lipidy (etap 1.8) do oczyszczonego CFTR w stosunku lipidów do białka 100:1 (w/w) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Podobnie ustaw kontrolę tylko lipidów, zastępując oczyszczone białko tą samą objętością buforu GPC.</li>
	<li>Usuń detergent z mieszaniny białkowo-lipidowej za pomocą hydrofobowych kulek adsorbcyjnych. Umyj kulki adsorbentu w 5 CV ddH2O, 5 CV 70% (v/v) etanolu, 5 CV ddH2O i 5 CV buforze GPC bez detergentu. Dodać 200 mg przemytych kulek adsorbentu na ml oczyszczonego białka i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie mieszając.</li>
	<li>Pobrać próbkę rozpuszczoną z kulek adsorpcyjnych do świeżej probówki za pomocą cienkiej końcówki do pipety.</li>
</ol>
7. Pomiar aktywności ATPazy
<ol>
	<li>Określ szybkość aktywności ATPazy specyficznej dla CFTR za pomocą zmodyfikowanego testu Chifflet26,27 w formacie płytki 96-dołkowej. Z roztworem podstawowym fosforanu sodu (0,65 mM) przygotować 0-20 nmol fosforanu w końcowej objętości 50 μl jako wzorce. Użyj mieszaniny 1:1 buforu CFTR i buforu ATPazy, aby rozcieńczyć zapas fosforanów.</li>
	<li>Inkubować zarówno rozpuszczony CFTR, jak i liposomy ślepej próby z inhibitorami ATPazy w skali 1:100 (v/v) (krok 1.9) na lodzie przez 10 minut. Użyć co najmniej 5 μg odtworzonego CFTR.</li>
	<li>Dodać ATP (etap 1.9) do końcowego stężenia 2 mM i inkubować w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę. Zatrzymać reakcję przez dodanie 40 μl 10% (w/v) SDS (krok 1.9) do każdego dołka (łącznie z wzorcami).</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu A (krok 1.10) i inkubować przez 10 minut. Dodać 100 μl buforu B (1.10) do każdej studzienki i zmierzyć absorbancję przy długości fali 800 nm w 96-dołkowym spektrofotometrze UV/Vis kompatybilnym z płytką.</li>
	<li>Przeliczyć absorbancję przy 800 nm na ilość uwolnionego fosforanu, używając wzorców fosforanowych. Oblicz szybkość hydrolizy ATP po odjęciu sygnału tła (studnie tylko liposomowe).</li>
	<li>W przypadku nieodtworzonego CFTR postępuj zgodnie z tym samym protokołem, używając bufora CFTR do odczytów tła.</li>
</ol>

<ol><li>Aleksandrov, A. A., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+%28ABCC7%29+is+a+hydrolyzable-ligand-gated+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CFTR (ABCC7) is a hydrolyzable-ligand-gated channel.</a> Pflugers Arch. 453, 693-702 (2007).</li>
<li>Dodge, J. A., Lewis, P. A., Stanton, M., Wilsher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+mortality+and+survival+in+the+UK%3A+1947-2003%5BTitle%5D)+AND+%22EUR+RESPIR+J%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis mortality and survival in the UK: 1947-2003.</a> EUR RESPIR J. 29, 522-526 (2007).</li>
<li>O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis.</a> Lancet. 373, 1891-1904 (2009).</li>
<li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene%3A+chromosome+walking+and+jumping%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245, 1059-1065 (1989).</li>
<li>Kariya, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+CFTR+in+the+elevation+of+glutathione+levels+in+the+lung+by+oral+glutathione+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">A role for CFTR in the elevation of glutathione levels in the lung by oral glutathione administration.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, (2007).</li>
<li>Gould, N. S., Min, E., Martin, R. J., Day, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+is+the+primary+known+apical+glutathione+transporter+involved+in+cigarette+smoke-induced+adaptive+responses+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">CFTR is the primary known apical glutathione transporter involved in cigarette smoke-induced adaptive responses in the lung.</a> Free Radic Biol Med. 52, 1201-1206 (2012).</li>
<li>Childers, M., Eckel, G., Himmel, A., Caldwell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+cystic+fibrosis+pathology%3A+lack+of+transport+of+glutathione+and+its+thiocyanate+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">A new model of cystic fibrosis pathology: lack of transport of glutathione and its thiocyanate conjugates.</a> Med Hypotheses. 68, 101-112 (2007).</li>
<li>Cole, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+a+transporter+gene+in+a+multidrug-resistant+human+lung+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line.</a> Science. 258, 1650-1654 (1992).</li>
<li>Conseil, G., Deeley, R. G., Cole, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphisms+of+MRP1+%28ABCC1%29+and+related+ATP-dependent+drug+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Polymorphisms of MRP1 (ABCC1) and related ATP-dependent drug transporters.</a> Pharmacogenet Genomics. 15, 523-533 (2005).</li>
<li>Ketchum, C. J., Rajendrakumar, G. V., Maloney, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+adenosinetriphosphatase+and+transport+activities+of+purified+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of the adenosinetriphosphatase and transport activities of purified cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 43, 1045-1053 (2004).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (Pt 1), 17-21 (1997).</li>
<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279, 39051-39057 (2004).</li>
<li>O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Oldham, M. L., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapshots+of+the+maltose+transporter+during+ATP+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 15152-15156 (2011).</li>
<li>Pinkett, H. W., Lee, A. T., Lum, P., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inward-facing+conformation+of+a+putative+metal-chelate-type+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter.</a> Science. 315, 373-377 (2007).</li>
<li>Dawson, R. J. P., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+bacterial+multidrug+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a bacterial multidrug ABC transporter.</a> Nature. 443, 180-185 (2006).</li>
<li>Gerber, S., Comellas-Bigler, M., Goetz, B. A., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+trans-inhibition+in+a+molybdate%2Ftungstate+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of trans-inhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter.</a> Science. 321, 246-250 (2008).</li>
<li>Ward, A., Reyes, C. L., Yu, J., Roth, C. B., Chang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexibility+in+the+ABC+transporter+MsbA%3A+Alternating+access+with+a+twist%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 19005-19010 (2007).</li>
<li>Kadaba, N. S., Kaiser, J. T., Johnson, E., Lee, A., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-affinity+E.+coli+methionine+ABC+transporter%3A+structure+and+allosteric+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation.</a> Science. 321, 250-253 (2008).</li>
<li>Aller, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+P-Glycoprotein+Reveals+a+Molecular+Basis+for+Poly-Specific+Drug+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of P-Glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly-Specific Drug Binding.</a> Science. 323, 1718-1722 (2009).</li>
<li>Koehler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophospholipid+micelles+sustain+the+stability+and+catalytic+activity+of+diacylglycerol+kinase+in+the+absence+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lysophospholipid micelles sustain the stability and catalytic activity of diacylglycerol kinase in the absence of lipids.</a> Biochemistry. 49, 7089-7099 (2010).</li>
<li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+functional+characterization%2C+and+NMR+studies+of+human+KCNE1%2C+a+voltage-gated+potassium+channel+accessory+subunit+associated+with+deafness+and+long+QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltage-gated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome.</a> Biochemistry. 46, 11459-11472 (2007).</li>
<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+determination+of+inorganic+phosphate+in+the+presence+of+labile+organic+phosphate+and+high+concentrations+of+protein%3A+Application+to+lens+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases.</a> Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).</li>
<li>Rothnie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+cholesterol+in+maintenance+of+P-glycoprotein+activity+and+its+membrane+perturbing+influence%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence.</a> Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych sprzecznych interesów w odniesieniu do tej pracy.

Wcześniej opisaliśmy metodę nadekspresji mysiego CFTR14. Od czasu opublikowania tego protokołu wyraziliśmy i oczyściliśmy kilka różnych ortologów CFTR przy użyciu tego samego systemu. Wszystkie testowane do tej pory ortologi dobrze oczyściły się w detergencie LPG, podczas gdy oczyszczanie DDM wykazało większą zmienność między różnymi ortologami (dane nie pokazane). Ta elastyczność ilustruje siłę podejścia drożdżowego: możliwe jest przesiewanie wielu konstruktów ze względną szybkością, aby wybrać jeden do określonego celu.
Mycie mikrosomów drożdży buforem zawierającym 1 M NaCl przed solubilizacją DDM daje czystszy preparat mikrosomowy i redukuje zanieczyszczenia na późniejszych etapach. Ten krok nie jest potrzebny w protokole LPG, ponieważ końcowa próbka CFTR ma czystość >90% bez mycia mikrosomamicznego. Ponadto oczyszczanie w DDM wymaga kilku zmian w do rozpuszczania i oczyszczania, a mianowicie dodania dodatkowego glicerolu i soli. Razem te dodatki znacznie zwiększyły wiązanie białka rozpuszczonego przez DDM z kolumną.
Metodyka oczyszczania DDM wymaga udoskonaleń, w szczególności w zakresie usuwania głównego zanieczyszczenia o masie 40 kDa, które, oceniając za pomocą spektrometrii mas, jest spowodowane przez podjednostkę rybosomalną L3 drożdży, która wydaje się mieć nieodłączne powinowactwo do żywicy niklowej. W białku L3 nie ma oczywistej sekwencji polyHis, ale badanie jej struktury 3D po związaniu z rybosomem (PDB = 1FFK) pokazuje, że sfałdowana podjednostka L3 ma potencjalny klaster polyHis. To, że ta opaska jest mniej problematyczna w materiale oczyszczonym LPG, może wynikać z ostrzejszego detergentu LPG.
Chociaż oczyszczanie w DDM wydaje się być gorsze niż w LPG, łagodniejsze detergenty, takie jak DDM, mogą być bardziej kompatybilne z analizami funkcjonalnymi i strukturalnymi i były już stosowane w kilku krystalograficznych badaniach rentgenowskich białek błonowych15-21. Ponadto nasze wyniki wskazują, że stosowanie LPG prowadzi do utraty funkcji ATPazy w CFTR w porównaniu z oczyszczaniem w DDM. W związku z tym zalecamy protokół oczyszczania oparty na LPG do wytwarzania CFTR, w którym czystość ma kluczowe znaczenie, na przykład w zastosowaniach takich jak charakterystyka modyfikacji potranslacyjnych lub w wytwarzaniu przeciwciał, wybrany byłby protokół oparty na LPG. Z drugiej strony w zastosowaniach, w których niezbędna jest aktywność i w pełni natywny stan białka, zaproponowalibyśmy protokół oparty na DDM jako lepszą opcję.
Podsumowując, protokół ten opisuje powtarzalną metodę izolacji CFTR w obojuczniczojonowym detergencie LPG-14 lub niejonowym detergencie DDM. W związku z tym wskazuje na większy zakres warunków oczyszczania CFTR niż wcześniej zgłaszano10-13. Ponadto za pomocą tych procedur można uzyskać miligramowe ilości oczyszczonego CFTR w połączeniu z systemem wzrostu drożdży o dużej objętości, takim jak fermentor o pojemności 20 litrów, oraz systemem zbierania komórek o dużej wydajności, takim jak wirnik wolnoobrotowy o pojemności 6 litrów. Otrzymany CFTR posiada rozszczepialny znacznik GFP, który umożliwia łatwe monitorowanie białka w różnych testach biochemicznych i biofizycznych.
Odczynnik opisany w tym manuskrypcie (plazmid zawierający CFTR kurczaka lub zamrożone komórki drożdży) można uzyskać za pośrednictwem Fundacji Mukowiscydozy (USA).

Mukowiscydoza (CF) jest najczęstszą chorobą genetyczną w Europie i Ameryce Północnej, z częstością występowania około 1 na 2,500 żywych urodzeń. Mukowiscydoza występuje, gdy mutacje w białku transbłonowego regulatora przewodnictwa (CFTR) mukowiscydozy powodują utratę jego funkcji w błonie komórkowej komórek nabłonkowych1. Najpoważniejszą konsekwencją tej wady jest nieodwracalne uszkodzenie płuc, które skraca oczekiwaną długość życia chorych do <40 lat2,3.
CFTR to transporter kasetowy wiążący ATP (ABC), który ewoluował, aby stać się kanałem jonowym1,4. Pomimo dość zmienionej funkcji w błonie komórkowej komórek, nadal zachowuje znaczną homologię sekwencji z innymi transporterami ABC. Co ciekawe, wyspecjalizowane części CFTR (tj. jego region regulatorowy oraz jego końce N i C) nie mają znaczącego podobieństwa sekwencji z innymi transporterami ABC metazoan, stąd nie ma wskazówek co do pochodzenia tych sekwencji w CFTR. Na podstawie swojej pierwotnej struktury, CFTR jest klasyfikowany jako członek rodziny C rodziny transporterów ABC, Nie ma jednak mocnych dowodów na szczątkowe powiązanie funkcjonalne z tą podrodziną. Istnieją pewne doniesienia o aktywności transportu glutationu dla CFTR5-7, co byłoby zgodne z rolami innych członków rodziny C8,9, chociaż inne doniesienia sugerują, że zredukowany glutation może hamować aktywność ATPazy CFTR, zamiast wykazywać stymulację wywołaną przez substrat, która charakteryzuje transportery ABC10. Pomiar przewodnictwa jonów jest wystarczająco czuły, aby umożliwić badanie aktywności kanałowej pojedynczych cząsteczek CFTR1 i właściwości kanału CFTR były monitorowane w funkcji czasu, temperatury, stężenia ATP, potencjału błonowego i stanu fosforylacji, a także w obecności wielu małocząsteczkowych inhibitorów, wzmacniaczy i modyfikatorów. Badania te znacznie poszerzyły również naszą wiedzę na temat funkcjonowania transporterów ABC. Niemniej jednak ekspresja CFTR w znacznych ilościach i jego późniejsze oczyszczanie okazało się szczególnie trudne, a sukces ograniczył się do kilku laboratoriów10-13.
Potrzeba opracowania bardziej skutecznych leków jest paląca, jednak proces ten został utrudniony przez brak oczyszczonego CFTR do badań przesiewowych małych cząsteczek. Rozwiązanie problemu ekspresji i oczyszczania CFTR umożliwiłoby wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków mające na celu skorygowanie pierwotnej wady mukowiscydozy, a także otworzyłoby drogę do badań strukturalnych o wysokiej rozdzielczości w celu uzyskania informacji na temat racjonalnego projektowania leków. Co więcej, nawet stosunkowo podstawowe cechy biochemiczne białka, takie jak jego funkcjonalny stan oligomeryczny, oddziałujące białka i aktywność ATPazy, pozostają słabo scharakteryzowane. Wcześniej opisywaliśmy protokół ekspresji na dużą skalę mysiego CFTR znakowanego GFP i His u S. cerevisiae14, a teraz dalej opisujemy protokoły oczyszczania CFTR. Użyliśmy tych metod do oczyszczenia pięciu ortologów CFTR i jako przykład przedstawiliśmy dane dotyczące oczyszczania CFTR kurczaka. Wybór detergentów do solubilizacji i oczyszczania jest krytycznym krokiem w oczyszczaniu każdego białka błonowego. Po przeprowadzeniu badań przesiewowych pod kątem rozpuszczalności CFTR w kilku detergentach, wybraliśmy dwa kontrastujące detergenty do stosowania w oczyszczaniu. Dodecyl-β-D-maltozyd (DDM) jest niejonowym detergentem, który jest szeroko stosowany zarówno do badań strukturalnych, jak i funkcjonalnych białek błonowych15-21. Jonowy detergent 1-tetradekanoilo-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (LPG-14) jest wysoce wydajny w solubilizacji CFTR i był wcześniej stosowany do oczyszczania funkcjonalnych białek błonowych10,22,23, w tym do oczyszczania CFTR z S. cerevisiae24.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; m Filtr strzykawkowy&nbsp;</td><td>Koncentrator odśrodkowy Sartorius</td><td>FC121</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO (membrana PES)</td><td>Vivaspin</td><td>VS0641</td><td></td></tr> 2 <tr><td>ml probówki do mikrofug</td><td>Sarstedt</td><td>72.695</td><td></td></tr><tr><td>40Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td><a href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901">337901</a></td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterylne probówki Falcon</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa adenozynotrifosforanu (Na2ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>System chromatografii cieczowej</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek aminoetylobenzenesulfonylu (AEBSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8456</td><td></td></tr><tr><td>Zakłócacz komórek do bicia kulkami szklanymi</td><td>BioSpec</td><td>1107900</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa&nbsp;</td>Wirówka stołowa <td>HERMLE</td><td>Z300</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofuga stołowa&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-100-511</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek benzamidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>434760</td><td></td></tr><tr><td>Kulki hydrofobowe SM-2 Adsorbent</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>357000</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania żelu</td><td>BioRad</td><td>170-808</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Chymostatin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>E. coli całkowity ekstrakt lipidowy</td><td>Avanti lipids</td><td>100500</td><td></td></tr><tr><td>Epoksysukcynylo-leucyloamido-butan (E-64)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Kulki szklane, kwasowe myte</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>65017</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP kolumny (5 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-05</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Coomassie Stain</td><td>Novexin</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka JA-17</td><td>Beckman Coulter</td><td>369691</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Merck</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>Lizofosfatydyloglicerol-14 (LPG)</td><td>Avanti lipidy</td><td>858120</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik żelowy System SDS-PAGE</td><td>BioRad</td><td>165-8006</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-D-maltopyranozyd (DDM)</td><td>Affymetrix</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>Wstępnie barwione wzorce białkowe</td><td>Fermentas</td><td>SM1811</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny odsalające (Sephadex G-25)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4265</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>SCH28080</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4443</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>Tiocyjanian sodu (NaSCN)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>251410</td><td></td></tr><tr><td>Filtracja żelowa Kolumna 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówek</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik Vortex</td><td>Star Labs</td><td>N2400-0001</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowa łaźnia wodna</td><td>Ultrawave</td><td>F0002202</td><td></td></tr><tr><td>Wielomodowy czytnik płytek</td><td>BioTek</td><td>BTH1MF</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie białka transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy ulegającego ekspresji w saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defekty w białku CFTR (transmembrane conductance regulator) mukowiscydozy powodują mukowiscydozę (CF), chorobę dziedziczoną autosomalnie recesywnie, która obecnie ogranicza średnią długość życia chorych do <40 lat. Opracowanie nowych cząsteczek leków w celu przywrócenia aktywności CFTR jest ważnym celem w leczeniu mukowiscydozy, a wyizolowanie funkcjonalnie aktywnego CFTR jest użytecznym krokiem w kierunku osiągnięcia tego celu.
Opisujemy dwie metody oczyszczania CFTR z eukariotycznego heterologicznego systemu ekspresji, S. cerevisiae. Podobnie jak systemy prokariotyczne, S. cerevisiae może być szybko hodowany w laboratorium przy niskich kosztach, ale może również transportować i modyfikować potranslacyjnie duże białka błonowe. Wybór detergentów do solubilizacji i oczyszczania jest krytycznym krokiem w oczyszczaniu każdego białka błonowego. Po przeprowadzeniu badań przesiewowych pod kątem rozpuszczalności CFTR w kilku detergentach, wybraliśmy dwa kontrastujące detergenty do stosowania w oczyszczaniu, które pozwalają na dostosowanie końcowego preparatu CFTR do planowanych następnie eksperymentów.
W tej metodzie zapewniamy porównanie oczyszczania CFTR w dodecylo-β-D-maltozydzie (DDM) i 1-tetradekanoilo-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (LPG-14). Białko oczyszczone w DDM tą metodą wykazuje aktywność ATPazy w testach funkcjonalnych. Białko oczyszczone w LPG-14 wykazuje wysoką czystość i wydajność, może być wykorzystywane do badania modyfikacji potranslacyjnych i może być wykorzystywane do metod strukturalnych, takich jak rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami i mikroskopia elektronowa. Wykazuje jednak znacznie niższą aktywność ATPazy.

Opisany powyżej protokół stanowi wydajny sposób izolacji mikrosomów wzbogaconych w CFTR, przy niemal całkowitym odzysku CFTR podczas rozbijania komórek i przygotowania surowych mikrosomów (Rysunek 1). Można również skutecznie zastosować inne metody rozbijania komórek. Wykorzystywaliśmy prasę francuską oraz inne urządzenia wysokociśnieniowe/kawitacyjne (również w połączeniu z uderzaniem w cel rubinowy) z jednakową wydajnością. Ze względu na wygodę i niskie koszty początkowe sprzętu, za najlepszą uznajemy metodę homogenizacji za pomocą kulek (bead-beating).
Zastosowanie LPG do solubilizacji i oczyszczania CFTR pozwoliło na uzyskanie 80 μg białka/L hodowli przy czystości &gt;90% (Rycina 2). Wysoka wydajność wynikała z efektywnej solubilizacji CFTR przez LPG (porównać Rycynę 2b, ścieżki 2 i 4). Ponadto, wydajne i silne wiązanie z kolumną skutkowało minimalną utratą CFTR we frakcji nieprzypisanej oraz brakiem CFTR we frakcjach płukania (Rycina 2, ścieżki 3, 5 i 6). Eluowane białko miało czystość &gt;90%, oszacowaną na podstawie żeli SDS-PAGE barwionych Coomassie oraz przy użyciu densytometrii prążków CFTR i zanieczyszczeń. Chromatografia żelowa (GPC) oddzieliła oczyszczone za pomocą LPG białko CFTR od zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej (Rycina 4, panel dolny).
Protokół oczyszczania CFTR z wykorzystaniem DDM zapewnia czystość na poziomie około 60% i wydajność wynoszącą w przybliżeniu 50 μg/L (Rysunek 3). Mikroskopia elektronowa (EM) frakcji barwionych negatywnie z GPC, wymytych przy objętości około 10 ml (Rysunek 4), wykazała, że CFTR oczyszczony za pomocą DDM zawiera agregaty o średnicy 20-30 nm oraz mniejsze cząstki o średnicy 10 nm (dane niepokazane). Możliwe jest, że małe agregaty mogą odwracalnie asocjować i dysocjować, ponieważ ultrafiltracja z filtrem o progu odcięcia 1 MDa nie usunęła agregatów wykrywalnych w EM. Materiał oczyszczony za pomocą LPG nie adsorbował się do siatki poddanej wyładowaniom żarowym, dlatego zbadano go metodą cryo-EM frakcji niebarwionych. Wykazało to bardzo jednorodną populację cząstek o stosunkowo niewielkim rozmiarze (średnica 6-8 nm, dane niepokazane).
Na koniec zmierzono aktywność ATPase oczyszczonych białek (Rysunek 5). Jako przedstawiciel rodziny białek ABC, CFTR posiada dwie domeny wiążące nukleotydy (NBD), zdolne do wiązania i/lub hydrolizy ATP. Dane wskazują, że oczyszczone białko nie było zdolne do hydrolizy ATP w stanie solubilizowanym przez LPG i wykazywało słabą aktywność ATPase w obecności DDM (Rysunek 5, niezabarwione słupki). Po dodaniu lipidów i usunięciu detergentu aktywność ATPase była 4-krotnie wyższa w przypadku próbek oczyszczonych w DDM (13 nmol ATP/min/mg białka). Dodanie lipidów i usunięcie LPG w podobny sposób przywróciło aktywność CFTR izolowanego przy użyciu LPG, jednak z końcową szybkością (1,5 nmol ATP/min/mg białka) niższą niż w przypadku materiału oczyszczonego i rekonstytuowanego w DDM.
<img alt="Żel elektroforetyczny pokazujący rozdział białek przy różnych prędkościach wirowania; strzałka wskazuje prążek." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Monitoring poziomów kurzego CFTR w lizacie komórkowym (CL), supernatantach (S) i osadach (P) podczas różnych etapów wirowania stosowanych do izolacji i przemywania mikrosomów. Żele SDS-PAGE wizualizowano za pomocą fluorescencji w żelu znacznika GFP. Supernatant po rozbiciu komórek i wirowaniu przy 14,000 x g zawiera praktycznie cały CFTR (w tym produkty degradacji). Ultrawirowanie przy 200,000 x g powoduje osadzanie całego pełnowymiarowego CFTR, pozostawiając niektóre fragmenty w supernatancie. Ultrawirowanie przy 100,000 x g mikrosomów przemytych solą powoduje osadzenie prawie całego CFTR przy jednoczesnym usunięciu kolejnych fragmentów.
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej SDS-PAGE wykazujący prążki białkowe; markery masy cząsteczkowej po lewej stronie." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Oczyszczanie kurczego białka CFTR w LPG za pomocą chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali. Frakcje analizowano za pomocą SDS-PAGE z późniejszym barwieniem Coomassie (panel górny) oraz detekcją fluorescencyjną znacznika GFP (panel dolny). Ścieżki: (1) Mikrosomy. (2) Mikrosomy solubilizowane w LPG. (3) Materiał nie związany. (4) Materiał nierozpuszczalny. (5) i (6) Płukania 40 i 100 mM imidazolem. (7) Materiał elowany 400 mM imidazolem.
<img alt="Żel do elektroforezy SDS-PAGE przedstawiający wyniki rozdziału białek, zawiera ścieżki elucji i płukania." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Oczyszczanie kurczego CFTR w DDM za pomocą chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali. Frakcje analizowano metodą SDS-PAGE, a następnie barwiono błękitem Coomassie. Panel po lewej stronie przedstawia frakcje przed elucją. Na panelu po prawej stronie pokazano kilka kolejnych frakcji elucji, gdzie CFTR wskazano strzałką. Późniejsze frakcje są wzbogacone o zanieczyszczenie o masie 40 kDa, które zostało zidentyfikowane za pomocą spektrometrii mas jako białko rybosomalne L3.
<img alt="Wyniki chromatografii wykluczania i elektroforezy żelowej; piki absorbancji UV białka." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Oczyszczanie kurzego białka CFTR za pomocą chromatografii żelowej. CFTR oczyszczone metodą chromatografii powinowactwa do Ni skoncentrowano i nałożono na kolumnę GPC. Nałożono na siebie profile elucji CFTR (panel górny) oczyszczonego w buforze zawierającym LPG-14 (linia ciągła) lub DDM (linia przerywana). SDS-PAGE (panel dolny) wykazało, że CFTR eluował w zakresie od 8 do 11 ml.
<img alt="Wykres słupkowy aktywności ATPase; porównanie DDM, DDM+lipid, LPG, LPG+lipid; analiza aktywności enzymu." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Aktywność ATPase oczyszczonych frakcji CFTR z kurczaka. Białko oczyszczone w DDM lub LPG poddano analizie przy użyciu zmodyfikowanego testu Chiffleta26 w obecności koktajlu inhibitorów ATPase w celu wyeliminowania aktywności tła ATPase typu F, P i V (słupki niezamalowane). Szybkość hydrolizy ATP zmierzono również po usunięciu detergentu i dodaniu lipidów (słupki zamalowane). Wykres przedstawia średnią i odchylenie standardowe (n=3). Różnice między wartościami średnimi dla aktywności ATPase w obecności i przy braku lipidów, a także różnica między aktywnością w DDM i LPG są istotne przy p&lt;0,05.

Heterologiczna ekspresja i oczyszczanie transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) są znaczącymi wyzwaniami i czynnikami ograniczającymi rozwój terapii lekowych mukowiscydozy. Protokół ten opisuje dwie metody izolacji miligramowych ilości CFTR odpowiednie do badań funkcjonalnych i strukturalnych.

Oczyszczanie białka transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy ulegającego ekspresji w Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie dużych ilości funkcjonalnego białka regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie, zwanego białkiem CFTR. Osiąga się to najpierw poprzez heterologiczną nadekspresję białka CFTR z kurczaka w komórkach Charmy visi. Drugim krokiem jest rozbicie komórek drożdży i wyizolowanie zgromadzonej frakcji mikrosomalnej.Następnie CFTR zostaje solubilizowany i oczyszczony. Ostatnim krokiem jest pomiar szybkości hydrolizy TP przez oczyszczone białko w celu oceny, czy pozostaje ono funkcjonalne. Ostatecznie, nadekspresja w s visi umożliwia produkcję wysokiej czystości, funkcjonalnie kompetentnego CFTR w ilościach liczonych w miligramach.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ekspresja w liniach komórkowych ssaków, jest fakt, że drożdże są łatwe, szybkie i tanie w hodowli laboratoryjnej. Metodę tę można wykorzystać do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie mukowiscydozy, ponieważ oczyszczone białko może służyć do badania interakcji między lekami będącymi obecnie w fazie opracowania a białkiem CFTR lub nawet do poszukiwania nowych leków. Metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat oczyszczania CFTR i może być również zastosowana do innych białek błonowych, które są trudne do ekspresji i oczyszczenia.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ białko CFTR ulega szybkiej degradacji przez enzymy proteolityczne w drożdżach i ma tendencję do agregacji w roztworze. W niniejszym protokole białko CFTR z kurczaka zostanie oczyszczone z wcześniej zamrożonych komórek S SEI. Procedury hodowli i zbierania komórek S SEI wykazujących ekspresję CFTR zostały przedstawione w poprzednim artykule JoVE.Mikrosomy izoluje się z komórek drożdży zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie, a następnie resuspensuje w minimalnej objętości buforu CFTR, mieszczącą się w przedziale od 5 do 15 ml. Do oznaczenia całkowitej ilości białek mikrosomalnych można zastosować test Bradforda; ilość ta powinna wynosić od 70 do 200 mg, a widmo emisji fluorescencji membran powinno wykazywać wyraźny pik fluorescencji GFP. W procesie solubilizacji i oczyszczania CFTR zostaną użyte dwa przeciwstawne detergenty: niejonowy detergent DDMA oraz jonowy detergent LPG 14.Zgodnie z protokołem opisanym w manuskrypcie, należy wcześniej przygotować odpowiednie bufory do solubilizacji błon. Rozcieńczyć mikrosomy równą objętością odpowiedniego buforu do solubilizacji, aby uzyskać końcowe stężenie detergentu 2% oraz stężenie białka mikrosomalnego 5 mg/mL. Inkubować tę mieszaninę przez jedną godzinę w temperaturze 4°C przy ciągłym mieszaniu.Po jednej godzinie odwiruj mieszaninę w wirówce przy 100 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 45 minut. Odlej i zachowaj supernatant zawierający rozpuszczone białka błonowe.Resuspender frakcję nierozpuszczalną w 1% roztworze SDS do objętości równej objętości frakcji rozpuszczalnej. Zmierzyć fluorescencję w tej frakcji i zachować 50 µL do analizy metodą SDS-PAGE. Aby rozpocząć procedurę oczyszczania CFTR za pomocą chromatografii powinowactwa do niklu, połączyć szeregowo kolumny z niklowymi kuleczkami o pojemności 5 ml, a następnie przemyć je dwiema objętościami kolumny (CV) 20% etanolu, a następnie dwiema CV destylowanej wody dejonizowanej. Po tym przemyć dwiema CV buforu solubilizującego zawierającego 1 M MiaSole, a następnie dwiema CV buforu solubilizującego bez dodatku midsole.Dodaj MiaSole do rozpuszczonego materiału do uzyskania końcowego stężenia 5 mM, a następnie wprowadź materiał do pętli próbnej automatycznego urządzenia do chromatografii cieczowej po dwóch przemyciach buforem pozbawionym ole. Aby usunąć niezwiązanym materiał, przemyj kolumnę 3 CV buforu do oczyszczania z 40 mM ole przy szybkości przepływu 1 ml/min. Zbierz tę frakcję do probówki o pojemności 50 ml.Do drugiego płukania należy użyć trzech CV buforu do oczyszczania z 100 mM imidazolu. Należy zbierać frakcje o objętości 2 ml do płytki 96-dołkowej. Eluuj CFTR z kolumny z pułapką His przez trzy CV buforu do oczyszczania z 400 mM imidazolu. Zbieraj frakcje o objętości 2 ml do płytki 96-dołkowej, monitorując fluorescencję w eluowanych frakcjach; zachowaj alikwoty frakcji szczytowych.Do analizy za pomocą elektroforezy SDS-PAGE wykorzystane zostaną pozostałe próbki frakcji szczytowych w kolejnym kroku oczyszczania. Procedurę należy rozpocząć od równoważenia kolumny za pomocą 1,2 CV destylowanej wody dejonizowanej, a następnie 1,2 CV buforu do chromatografii żelowej lub buforu GPC podczas równoważenia kolumny. Frakcje oczyszczone metodą powinowactwa do niklu o najwyższej fluorescencji GFP należy zagęścić, używając wirówki z filtrem odcinającym cząsteczki o masie powyżej 100 000 kilodalton w temperaturze czterech stopni Celsjusza.W przypadku oczyszczania w DDM należy unikać zagęszczania próbki powyżej stężenia białka 0,3 mg/ml, ponieważ spowoduje to znaczną utratę próbki. Przenieś RENATE z koncentratorów do probówek do wirowania i wiruj przy 100 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, aby osadzić duże cząsteczki. Wstrzyknij tę próbkę na wyrównaną kolumnę i eluuj izokratycznym gradientem 1,2 CV buforu GPC.Zbieraj frakcje o objętości 0,5 mililitra. Pomiarem fluorescencji GFP zidentyfikuj frakcje zawierające CFTR. Zachowaj niewielką objętość każdej z nich do analizy metodą SDS-PAGE w celu potwierdzenia rekonstytucji CFTR.Dodaj lipidy do oczyszczonego CFTR. Zastosuj stosunek lipidów do białka wynoszący 100:1. W analogiczny sposób przygotuj kontrolę zawierającą wyłącznie lipidy.Zastąpienie oczyszczonego białka taką samą objętością buforu GPC. Inkubuj obie próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Następnie usuń detergent z mieszaniny białkowo-lipidowej, używając hydrofobowych kulek absorbujących.Należy użyć 200 miligramów uprzednio przemytych kulek adsorbentu na mililitr oczyszczonego białka i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc z łagodnym mieszaniem. Następnego dnia próbkę rekonstytuowaną z kulek adsorbentu należy zebrać do nowej probówki, używając końcówki pipety o cienkim końcu. Aktywność specyficzna APAs rekonstytuowanego CFTR jest mierzona przy użyciu zmodyfikowanego testu Chile w formacie płyty 96-dołkowej. Jako standardy należy zastosować od 0 do 20 nanomoli fosforanu sodu rozcieńczonego w mieszaninie buforu CFTR i buforu APAs w stosunku jeden do jednego. Zarówno rekonstytuowany CFTR, jak i liposomy kontrolne należy inkubować z inhibitorami APAs w stężeniach od 1 do 100 na lodzie przez 10 minut.Użyj co najmniej 5 µg zrekonstytuowanego CFTR. Przenieś próbki na płytkę 96-dołkową i dodaj TP do stężenia końcowego 2 mM; inkubuj w temperaturze 25 °C przez jedną godzinę. Po upływie godziny zatrzymaj reakcję, dodając 40 µL 10% SDS do każdego dołka.Następnie do każdej studzienki należy dodać 100 µL buforu A i inkubować przez 10 minut. Potem do każdej studzienki dodaje się 100 µL buforu B i mierzy absorbancję przy długości fali 800 nm za pomocą spektrofotometru UV-vis kompatybilnego z płytką 96-dołkową. Dane o absorbancji należy przenieść do nowej tabeli.Przelicz absorbancję przy 800 nanometrach na ilość uwolnionego fosforanu, korzystając ze wzorców fosforanu, a następnie oblicz szybkość hydrolizy TP zgodnie z przedstawionymi krokami. Protokół zaprezentowany w tym filmie jest wydajną metodą izolacji mikrosomów wzbogaconych w CFTR, zapewniającą niemal całkowity odzysk CFTR podczas rozbijania komórek i przygotowania surowych mikrosomów. Ten obraz żelu SDS-PAGE przedstawia poziomy CFTR z kurczaka, monitorowane za pomocą fluorescencji Ingel znacznika GFP podczas różnych etapów wirowania wykorzystywanych do izolacji i przemywania mikrosomów.CL oznacza lizat komórkowy, S oznacza nadosady, a P oznacza osady. Nadosad po rozbiciu komórek i wirowaniu przy 14 000 ×g zawiera praktycznie cały CFTR, w tym produkty degradacji; ultrawirowanie przy 200 000 ×g powoduje osadzenie całego CFTR o pełnej długości, pozostawiając niektóre fragmenty w nadosadzie; ultrawirowanie przy 100 000 ×g powoduje osadzenie mikrosomów przemytych solą.Prawie cały CFTR wraz z dodatkowym usunięciem niektórych fragmentów, oczyszczanie kurzaciego CFTR w LPG 14 za pomocą chromatografii powinowactwa do jonów metali unieruchomionych pozwoliło uzyskać 80 mikrogramów białka na litr hodowli przy czystości przekraczającej 90%. Górny panel przedstawia frakcje analizowane za pomocą elektroforezy SDS-PAGE, a następnie barwione kumasą. Dolny panel przedstawia te same frakcje wykryte za pomocą fluorescencji znacznika GFP.Wysoka wydajność była wynikiem efektywnej solubilizacji CFTR przez LPG 14, co potwierdza porównanie ścieżki drugiej, w której naniesiono mikrosomy solubilizowane LPG, ze ścieżką czwartą, zawierającą materiał nierozpuszczalny. Ponadto efektywne i silne wiązanie z kolumną spowodowało minimalną utratę CFTR w frakcji nie związanej, przedstawionej w ścieżce trzeciej, oraz brak CFTR we frakcjach płukania, reprezentowanych przez ścieżki piątą i szóstą. Eluowane białko charakteryzowało się czystością powyżej 90%, oszacowaną na podstawie żeli SDS-PAGE barwionych kumasy oraz poprzez densytometrię pasm CFTR i zanieczyszczeń.Oczyszczanie kurczego białka CFTR. Zastosowanie DDM oraz chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali pozwoliło na uzyskanie około 50 µg białka na litr hodowli o czystości około 60%. Rysunek przedstawia frakcje analizowane za pomocą elektroforezy SDS-PAGE z późniejszym barwieniem kumasyjaną; po lewej stronie znajdują się frakcje sprzed elucji, a po prawej kilka kolejnych frakcji EEU.CFTR jest wskazany później strzałką. Frakcje są wzbogacone w zanieczyszczenie o masie 40 kilodaltonów, które zidentyfikowano za pomocą spektrometrii mas jako białko rybosomalne L3. Kurczakowy CFTR, oczyszczony przy użyciu LPG 14 lub DDM metodą chromatografii powinowactwa do jonów metali immobilizowanych, został poddany dalszemu oczyszczaniu za pomocą chromatografii żelowej.Profil elucji dla CFTR oczyszczonego w buforze zawierającym LPG 14 przedstawiono linią ciągłą. Natomiast profil dla CFTR oczyszczonego w buforze zawierającym DDM przedstawiono linią przerywaną; elektroforeza SDS-PAGE wykazała, że oczyszczony za pomocą LPG CFTR, wskazany strzałką pomiędzy ósmym a jedenastym mililitrem, został również oddzielony w chromatografii żelowej od zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej. Na koniec zmierzono aktywność APA oczyszczonych białek.Wyniki wskazują, że oczyszczone białko nie było w stanie hydrolizować ATP w stanie solubilizacji przez LPG i wykazywało słabą aktywność APAs w obecności DDM po dodaniu lipidów i usunięciu detergentu. Aktywność APAs była czterokrotnie wyższa dla próbek oczyszczonych w DDM (13 MATP na minutę na miligram białka). Dodanie lipidów i usunięcie LPG w podobny sposób przywróciło aktywność CFTR izolowanemu za pomocą LPG, lecz z końcową niższą szybkością niż w przypadku materiału oczyszczonego i zrekonstytuowanego w DDM (1,5 MLEs A TP na minutę na miligram białka) po opanowaniu metody.Technikę tę można przeprowadzić w ciągu dwóch dni, jeśli jest ona wykonywana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby próbki przez cały czas po wykonaniu procedury przechowywać w lodzie. Do odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące struktury i stabilności białka można wykorzystać inne metody, takie jak analiza stabilności termicznej, mikroskopia elektronowa oraz małokątne rozpraszanie promieni rentgenowskich.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak ekspresować i oczyszczać duże ilości białka CFTR.

purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance-regulator

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oczyszczanie białka regulatora przewodnictwa przez błonę komórkową zmutowanego w mukowiscydozie wyrażanego w Saccharomyces cerevisiae

Próby ekspresji regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR) w Saccharomyces cerevisiae przynosiły dotychczas stosunkowo niskie ilości białka. Niniejszy protokół oraz powiązane z nim odczynniki dystrybuowane przez Cystic Fibrosis Foundation powinny umożliwić przygotowanie miligramowych ilości tego „trudnego” eukariotycznego białka błonowego.

Ekspresja i oczyszczanie białka regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie w Saccharomyces cerevisiae

Wykazano, że regulator przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR), będący nabłonkowym kanałem chlorkowym, oddziałuje z różnymi białkami i reguluje istotne procesy komórkowe; wśród nich dobrze udokumentowano oddziaływania pośredniczone przez motyw PDZ białka CFTR. Niniejszy protokół opisuje opracowane przez nas metody składania kompleksu sygnalizacyjnego makromolekularnego CFTR zależnego od domeny PDZ in vitro.

In vitro analiza makromolekularnych kompleksów sygnałowych CFTR zależnych od domen PDZ

Opisana tutaj jest szybka i skuteczna procedura funkcjonalnego odtwarzania oczyszczonego dzikiego i zmutowanego białka CFTR, które zachowuje aktywność tego kanału chlorkowego, który jest wadliwy w mukowiscydozie. Wypływ jodku z odtworzonych proteoliposomów, w którym pośredniczy CFTR, umożliwia badanie aktywności kanałów i wpływu małych cząsteczek.

Pomiary funkcjonalnej rekonstytucji i aktywności kanałowej oczyszczonego białka CFTR typu dzikiego i zmutowanego

Interakcje białek są sercem funkcji komórki. Do ich scharakteryzowania powszechnie stosuje się techniki kalorymetryczne i spektroskopowe. Tutaj opisujemy anizotropię fluorescencji jako narzędzie do badania interakcji między białkiem zmutowanym w zespole Shwachmana-Diamonda (SBDS) a GTPazą podobną do czynnika elongacji 1 (EFL1).

Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Analizy biochemiczne i strukturalne glikozylowanych białek wymagają stosunkowo dużej ilości jednorodnych próbek. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę chemiczną specyficznej dla miejsca glikozylacji rekombinowanych białek oczyszczonych z bakterii poprzez celowanie w reaktywne tiole Cys.

Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca

Tutaj opisujemy metodę generowania trójwymiarowych kultur sferoidalnych ludzkich komórek nabłonka nosa. Sferoidy są następnie stymulowane do napędzania wydzielania jonów i płynów zależnych od cyscydozy Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), określając ilościowo zmianę wielkości sferoidalnego światła jako wskaźnik zastępczy dla funkcji CFTR.

Generowanie sferoid ludzkich komórek nabłonka nosa do zindywidualizowanego badania transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Tutaj prezentujemy protokół do ekspresji, solubilizacji i oczyszczania kilku eukariotycznych transporterów boranu o homologii do rodziny transporterów SLC4 za pomocą drożdży. Opisujemy również chemiczny test sieciowania w celu oceny oczyszczonych białek homomerycznych pod kątem składania multimerycznego. Protokoły te można dostosować do innych trudnych białek błonowych.

Ekspresja, solubilizacja i oczyszczanie eukariotycznych transporterów boranu

Ten artykuł opisuje protokół cytometrii przepływowej oparty na FRET, który pozwala określić ilościowo samoorganizację białek zarówno w komórkach S. cerevisiae, jak i HEK293T.

Wykrywanie i charakterystyka samoorganizacji białek in vivo za pomocą cytometrii przepływowej

Kotranslacyjna insercja do wstępnie uformowanych nanodysków umożliwia badanie bezkomórkowych syntetyzowanych białek błonowych w określonych środowiskach lipidowych bez kontaktu z detergentami. Protokół ten opisuje przygotowanie podstawowych komponentów systemu oraz parametry krytyczne dla poprawy wydajności odciągania i jakości próbki.

Kotranslacyjna insercja białek błonowych do wstępnie uformowanych nanodysków

Ten artykuł przedstawia protokół izolacji błony plazmatycznej na małą skalę w celu scharakteryzowania białka Cdr1 Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), którego nadekspresja występuje w Saccharomyces cerevisiae. Podwójny znacznik c-końcowy mGFPHis z rozszczepialnym proteazą z łącznikiem 16 reszt między Cdr1 a znacznikiem został zaprojektowany w celu ułatwienia oczyszczania i przesiewania detergentem Cdr1.

Preparat błony plazmatycznej na małą skalę do analizy Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania białka CFTR w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Technika ta umożliwia uzyskanie miligramowych ilości czynnego białka błonowego kluczowego dla badań nad mukowiscydozą.

Oczyszczanie białka transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy ulegającego ekspresji w Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów