Oznaczanie spontanicznej aktywności lokomotorycznej u Drosophila melanogaster
10 kwietnia 2014
Drosophila melanogaster są przydatne w badaniu manipulacji genetycznych lub środowiskowych, które wpływają na zachowania takie jak spontaniczna aktywność lokomotoryczna. Tutaj opisujemy protokół, który wykorzystuje monitory z wiązkami podczerwieni i oprogramowanie do analizy danych do ilościowego określania spontanicznej aktywności lokomotorycznej.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie spontanicznej aktywności lokomotorycznej muszek owocówek. Jest to realizowane poprzez wstępne zebranie i starzenie muszek doświadczalnych. Drugim krokiem jest przygotowanie monitorów populacji w inkubatorze z kontrolą temperatury oraz pobranie odpowiedniego oprogramowania.
Następnie muchy przenosi się do szklanych fiolek, a potem umieszcza w monitorach populacji, w których uruchamia się monitory aktywności. Ostatnim krokiem jest analiza danych. W końcowym rozrachunku monitory populacji służą do wykazania różnic w spontanicznej aktywności fizycznej much.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak negative geo axis, jest to, że pozwala ona na proste, niezawodne i obiektywne ciągłe rejestrowanie spontanicznej aktywności fizycznej wielu populacji much. Metoda ta może pomóc w określeniu, w jaki sposób różne manipulacje wpływają na muchy. Procedurę wykazującą spontaniczną aktywność fizyczną przeprowadzi Suzanne Kowski, asystentka laboratoryjna. Aby rozpocząć, należy przygotować pożywkę zgodnie z krokami opisanymi w towarzyszącym protokole tekstowym i pozostawić ją do ostygnięcia przy ciągłym mieszaniu na płycie grzewczej.
Do każdej wąskiej szklanej fiolki odlej pięć mililitrów pożywki, upewniając się, że ilość pożywki znajduje się poniżej najniższego pierścienia populacji. Monitoruj proces po ostygnięciu pożywki do temperatury pokojowej. Zamknij fiolki korkami z gąbki i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza przez maksymalnie dwa tygodnie.
Przed użyciem ogrzać fiolki do temperatury pokojowej. Następnie hodować muchy Canton S w plastikowych fiolkach na standardowej pożywce laboratoryjnej. Fiolki przechowywać w komorze z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością w 25°C, przy 12-godzinnym cyklu światło-ciemność.
Rano usuń dorosłe muchy z fiolek. Następnie, w ciągu ośmiu godzin od wylo hatchingu, oddziel nowo wyklute muchy według płci na podkładce z dwutlenkiem węgla, aby upewnić się, że samice są dziewicze. Przygotuj 10 fiolek z muchami rodzicielskimi, umieszczając w nich dziewicze samce i samice w wieku od pięciu do 10 dni.
Muchy w standardowej fiolce z pożywką z kilkoma ziarnami drożdży. Przechowywać muchy w inkubatorze w temperaturze 25 °C w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność przez dwa dni. Przenosić muchy do nowej plastikowej fiolki co drugi dzień, a fiolki z powstałymi jajami przechowywać w inkubatorze w temperaturze 25 °C.
Następnie należy usunąć i zutylizować muchy, które wykluły się pierwszego dnia, a fiolki umieścić ponownie w inkubatorze, aby drugiego dnia zebrać bardziej zsynchronizowaną populację much. Następnie, korzystając z podkładki z dwutlenkiem węgla, szybko zebrać metalową łyżką po 25 samców i 25 samic do każdej fiolki w ciągu 24 godzin. Na fiolce należy zapisać dzień ELO.
Przygotuj co najmniej pięć probówek powtórzeń dla każdej z grup: doświadczalnej i kontrolnej. Przechowuj probówki w komorach środowiskowych z kontrolowaną temperaturą 25 °C, przy 12-godzinnym cyklu światła i ciemności.
Przez 10 dni co drugi dzień przenosić muchy do nowej plastikowej fiolki. Używając lejka, umieścić monitory populacji w inkubatorze z kontrolą temperatury. Następnie połączyć każdy monitor za pomocą czteryzylowego kabla telefonicznego z jednostką interfejsu zasilania (PSIU) poprzez rozdzielacz pięciokierunkowy.
Następnie podłącz kabel telefoniczny do PSIU. Podłącz PSIU do gniazdka zasilania o napięciu od 100 do 240 V, a złącze wyjściowe zasilacza wsuń do jednego z gniazd sprzęgających PSIU. Następnie pobierz oprogramowanie USB używane przez PSIU w celu utworzenia łącza danych między programem komputerowym a PSIU i monitorami aktywności.
Uruchom program. Następnie w preferencjach wybierz port szeregowy PSIU dla Macintosh.
Następnie należy wybrać odstęp między odczytami. W kolejnym kroku wybierz monitory na podstawie ich unikalnych numerów producenta. Wybierz zakres monitorów odpowiadający numerom przypisanym do monitorów.
Upewnij się, że wszystkie monitory są prawidłowo podłączone, sprawdzając, czy świeci się zielona kontrolka. Czerwone światło oznacza utratę połączenia. Czarna ramka wskazuje, że system jest wyłączony lub że połączenie USB nie zostało prawidłowo ustanowione.
Oddziel od siebie muchy płci męskiej i żeńskiej w tym samym wieku. Używając podkładki z dwutlenkiem węgla, umieść 10 samców i 10 samic w oddzielnych szklanych fiolkach w temperaturze pokojowej.
Użyć co najmniej trzech fiolek dla każdej linii eksperymentalnej i kontrolnej oraz dla każdej płci much; fiolki należy trzymać w pozycji poziomej, dopóki muchy nie dojdą do siebie po działaniu dwutlenku węgla, aby zapobiec ich ugrzęźnięciu w pożywce. Pozostawić je na dwie godziny w temperaturze pokojowej w celu regeneracji po działaniu tlenku węgla. Następnie umieścić fiolki w populacji.
Monitory przechowywane w inkubatorach. Po trzech lub czterech dniach przenieść muchy do nowych fiolek, aby zapobiec wysychaniu pożywki. Na koniec eksperymentu przeskanować dane, aby usunąć powtórzone odczyty i upewnić się, że zapisy są kompletne.
Korzystając z funkcji skanowania plików 110 x, wybierz przedział zbierania danych i odrzuć dane zebrane w ciągu pierwszych 24 godzin w wybranym okresie czasu. Program prześle aktualną całkowitą liczbę dla każdego monitora do komputera i rozpocznie ponowne zliczanie od zera. Następnie wybierz nazwę eksperymentu i skopiuj pliki z folderu danych komputera, aby zapisać dane.
Analizę danych należy rozpocząć od starannego skopiowania danych zebranych w plikach tekstowych do kolumn arkuszy kalkulacyjnych Excel. Następnie oblicz całkowitą aktywność w żądanym okresie czasu dla każdego monitora, co stanowi sumę aktywności zarejestrowanej na trzech różnych wysokościach wiązek podczerwieni. Na koniec wyznacz średnią aktywność lokomocyjną oraz odchylenie standardowe pomiędzy trzema monitorami reprezentującymi trzy powtórzenia biologiczne, wykorzystując dwustronny test t Studenta.
Spontaniczna aktywność lokomotoryczna u drosophila zależy od płci muchy oraz od cyklu światło-ciemność. Jak pokazano na tym wykresie średniej aktywności much samców i samic, strzałka oznacza przejście z fazy światła do fazy ciemności. W miejscu, gdzie widoczny jest spadek aktywności, całkowita aktywność 20-dniowych much samców wzrasta, gdy muchy otrzymują połowę standardowej ilości pokarmu w ramach diety niskokalorycznej, w porównaniu do obniżonej aktywności much na diecie wysokokalorycznej.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat sposobu określania spontanicznej aktywności fizycznej drosofil. Metoda ta jest pomocna w ustaleniu, w jaki sposób różne manipulacje genetyczne lub środowiskowe wpływają na aktywność much.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę ilościowego pomiaru spontanicznej aktywności lokomocyjnej u Drosophila melanogaster. Dzięki zastosowaniu monitorów wiązki podczerwonej oraz oprogramowania do analizy danych, badacze mogą skutecznie mierzyć aktywność fizyczną muszek owocówek w kontrolowanych warunkach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia behawioralna
- Genetyka
Wstęp
- Drosophila melanogaster służy jako organizm modelowy do badania zachowań.
- Zrozumienie aktywności lokomocyjnej może dostarczyć wiedzy na temat wpływów genetycznych i środowiskowych.
- Technologia monitorowania w podczerwieni umożliwia precyzyjne śledzenie aktywności.
- Analiza danych jest kluczowa dla interpretacji wzorców lokomocyjnych.
Cel badania
- Ilościowe określenie spontanicznej aktywności lokomotorycznej u muszek owocówek.
- Ocena wpływu czynników genetycznych i środowiskowych na zachowanie.
- Przedstawienie standaryzowanego protokołu dla badaczy w tej dziedzinie.
Zastosowane Metody
- Zbieranie i starzenie eksperymentalnych Drosophila melanogaster.
- Konfiguracja monitorów populacji w inkubatorze z kontrolowaną temperaturą.
- Przenoszenie much do szklanych fiolek w celu monitorowania.
- Uruchamianie monitorów aktywności i analiza zebranych danych.
Główne wyniki
- Monitory populacyjne skutecznie ilościowo określają różnice w aktywności lokomocyjnej.
- Analiza danych pozwala na uzyskanie informacji na temat poziomów spontanicznej aktywności fizycznej.
- Wyniki mogą być pomocne w przyszłych badaniach nad zachowaniem i genetyką.
- Protokół jest powtarzalny i możliwy do zastosowania w różnych konfiguracjach eksperymentalnych.
Wnioski
- Ta metoda zapewnia niezawodne podejście do badania aktywności lokomotorycznej muszek owocówek.
- Zrozumienie tych zachowań może poszerzyć wiedzę na temat interakcji genetycznych i środowiskowych.
- Protokół ten można dostosować do różnych potrzeb badawczych w dziedzinie neuronauki i biologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kwantyfikacja spontanicznej aktywności lokomocyjnej u Drosophila melanogaster zapewnia skalowalny i obiektywny odczyt służący do oceny wpływu czynników genetycznych i środowiskowych na zachowanie, co wspiera wczesną walidację celów w badaniach nad neuronauką i chorobami metabolicznymi. Metoda ta umożliwia redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie wyników fenotypowych z modulacją szlaków, oferując pewność prognostyczną w procesach identyfikacji wiodących związków. Jej powtarzalność oraz możliwość ciągłego monitorowania pozycjonują ją jako translacyjną platformę biomarkerów dla walidacji modeli przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar spontanicznej aktywności fizycznej jako funkcjonalnego wskaźnika integralności szlaków neuronalnych i metabolicznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera redukcję ryzyka biologicznego dzięki obiektywnej, ciągłej kwantyfikacji zachowań lokomotorycznych w różnych warunkach genetycznych i środowiskowych.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów z portfolio poprzez identyfikację związków lub manipulacji genetycznych, które znacząco zmieniają wzorce aktywności, co wskazuje na oddziaływanie na cel terapeutyczny.
Przesiewy i rozwój testów
- Gotowość testu: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych badań przesiewowych poprzez ustalenie bazowych profili aktywności lokomotorycznej w kontrolowanych warunkach.
- Powtarzalność: Dostarcza zestandaryzowane, ilościowe wyniki za pomocą monitorowania wiązkami podczerwieni, co umożliwia niezawodną ocenę związków w powtórzeniach.
- Skalowalność: Wspiera równoległe monitorowanie wielu fiolek w celu wysokoprzepustowej oceny interwencji farmakologicznych lub genetycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Modeluje stany chorobowe u ludzi poprzez ocenę zmian w lokomocji w manipulacjach genetycznych naśladujących zaburzenia neurologiczne lub metaboliczne.
- Ciągłość translacyjna: Łączy fenotypy behawioralne z fazy odkryć z walidacją przedkliniczną dzięki spójnym, mierzalnym wskaźnikom aktywności.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Dostarcza informacji dla kryteriów postępu poprzez korelację zmian aktywności z modulacją celu, co zmniejsza liczbę wyników fałszywie dodatnich w optymalizacji wiodących związków.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć – od testowania hipotez dotyczących celu, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną – dostarczając punktu końcowego behawioralnego, który łączy wgląd mechanistyczny z wynikiem fenotypowym.
- Biologia odkryć: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i walidację celów poprzez kwantyfikację wpływu zmian genetycznych lub indukowanych lekami na spontaniczną aktywność lokomotoryczną.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację i powtarzalność testów dzięki ciągłemu, wieloparametrowemu śledzeniu aktywności w populacjach muszek.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennych zależnych (całkowita aktywność, odchylenie standardowe), które pozwalają na statystyczne porównanie warunków doświadczalnych przy użyciu analizy testem t.
- Badania translacyjne: Wspiera rozwój biomarkerów poprzez powiązanie zmian w aktywności lokomotorycznej z podstawowymi zaburzeniami genetycznymi lub metabolicznymi istotnymi dla ludzkich modeli chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma do przesiewania behawioralnego, którą można zastosować w wielu projektach z zakresu neuronauki, metabolizmu i badań nad starzeniem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki bezpośredniemu pomiarowi spontanicznej aktywności fizycznej jako punktu odniesienia dla fenotypu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki skalibrowanemu monitorowaniu w podczerwieni oraz zdefiniowanym przepływom analizy danych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając wczesnych, mierzalnych danych behawioralnych, co zmniejsza odsetek niepowodzeń biologicznych na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację z uwzględnieniem ryzyka poprzez identyfikację interwencji wywołujących istotne i powtarzalne efekty w zakresie aktywności lokomocyjnej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie hodowli Drosophila, przygotowania testów behawioralnych oraz systemów monitorowania w podczerwieni.
- Zależność od monitorów populacji, interfejsu PSIU, inkubatorów z kontrolą temperatury oraz oprogramowania do akwizycji danych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów starzenia się much, rozdzielania płci oraz przygotowywania fiolek pomiędzy zespołami.
- Uwzględnia kwestie adaptacyjne dla różnych teł genetycznych, warunków dietetycznych i terapii farmakologicznych.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak wysychanie pożywki w czasie oraz konieczność okresowego przenoszenia much do nowych fiolek w celu zachowania spójności danych.
