Oznaczanie spontanicznej aktywności lokomotorycznej u Drosophila melanogaster

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie spontanicznej aktywności lokomotorycznej muszek owocowych. Osiąga się to poprzez pierwsze zbieranie i starzenie eksperymentalnych much. Drugim krokiem jest zainstalowanie monitorów populacji w inkubatorze z kontrolowaną temperaturą i pobranie odpowiedniego oprogramowania.

Następnie muchy są przenoszone do szklanych plików, a następnie umieszczane w monitorach populacji, w których uruchamiane są monitory aktywności. Ostatnim krokiem jest analiza danych. Ostatecznie monitory populacji służą do wykazania różnic w spontanicznej aktywności fizycznej much.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ujemna oś geograficzna, jest to, że pozwala ona na proste, wiarygodne i obiektywne ciągłe rejestrowanie spontanicznej aktywności fizycznej wielu populacji much. Ta metoda może pomóc nam określić, jak różne manipulacje wpływają na muchy. Spontaniczna aktywność fizyczna demonstrująca procedurę będzie Suzanne Kowski, asystentka laboratoryjna z laboratorium Aby rozpocząć przygotowywanie jedzenia zgodnie z krokami wymienionymi w dołączonym protokole tekstowym i pozostawienie go do ostygnięcia przy ciągłym mieszaniu na gorącym talerzu.

Porcję porcji pięciu mililitrów pokarmu do każdej wąskiej szklanej fiolki, upewniając się, że ilość pokarmu znajduje się poniżej najniższego pierścienia populacji. Monitoruj, gdy żywność ostygnie do temperatury pokojowej. Przykryj fiolki zatyczkami z gąbki i utrzymuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do dwóch tygodni.

Przed użyciem rozgrzać fiolki do temperatury pokojowej. Następnie uprawa Canton S leci w plastikowych fiolkach ze standardowym pokarmem laboratoryjnym. Przechowywać fiolki w wilgotnej komorze o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 25 stopni Celsjusza w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym.

Usuń dorosłe muchy z fiolek rano. Następnie oddziel nowo zamknięte muchy według płci na podkładce z dwutlenku węgla w ciągu ośmiu godzin po welo, aby upewnić się, że samice much są dziewicami. Przygotuj 10 fiolek z muchami rodzicielskimi, umieszczając od pięciu do 10 dni dziewiczych samców i samic

Muchy w standardowej fiolce z jedzeniem z kilkoma ziarnami drożdży. Trzymaj muchy w inkubatorze w temperaturze 25 stopni Celsjusza z 12-godzinnym cyklem jasno-ciemnym przez dwa dni. Podawaj muchy do nowej plastikowej fiolki co drugi dzień i trzymaj fiolki z powstałymi jajami w inkubatorze w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Następnie usuń i wyrzuć muchy, które zamknął pierwszego dnia i zwróć fiolki do inkubatora, aby zebrać bardziej zsynchronizowaną populację much drugiego dnia. Następnie na podkładce z dwutlenkiem węgla szybko zbierz 25 samców i 25 samic much w fiolce metalową łyżką w ciągu 24 godzin. Zapisać dzień ELO na fiolce.

Zbierz co najmniej pięć fiolek Replicate każda. Dla grup eksperymentalnych i kontrolnych. Przechowywać fiolki w komorach środowiskowych o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 25 stopni Celsjusza w 12-godzinnym cyklu światła i ciemności.

Podawać muchy do nowej plastikowej fiolki co drugi dzień przez 10 dni. Za pomocą lejka monitoruje populację w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze. Następnie podłącz każdy monitor za pomocą czterożyłowego telefonicznego do zasilacza lub PSIU za pomocą pięciokierunkowego rozgałęźnika.

Następnie podłącz telefoniczny do zasilacza PSIU. Podłącz zasilacz PSIU do gniazdka elektrycznego o napięciu od 100 do 240 V i podłącz złącze wyjściowe zasilacza do jednego z pasujących gniazd PSIU. Następnie pobierz oprogramowanie USB używane przez PSIU do syntezy łącza danych między programem komputerowym a PSIU i monitorami aktywności.

Uruchom program. Następnie w preferencjach. Wybierz port szeregowy PSIU dla komputerów Macintosh.

Następnie wybierz interwał odczytu. Następnie wybierz monitory według ich unikalnego numeru producenta. Wybierz zakres monitorów, który odpowiada numerom nadanym monitorom.

Upewnij się, że wszystkie monitory są prawidłowo podłączone, szukając zielonego światła. Czerwone światło oznacza, że połączenie zostało utracone. skrzynka wskazuje, że system jest wyłączony lub że połączenie USB nie zostało prawidłowo wykonane.

Oddziel samce i samice much w tym samym wieku. Na podkładce z dwutlenkiem węgla umieść 10 samców i 10 samic much w oddzielnej temperaturze pokojowej. Szkło vi.

Użyj co najmniej trzech fiolek dla każdej linii doświadczalnej i kontrolnej, a dla każdej płci much, trzymaj fiolki na bokach, dopóki muchy nie odzyskają sił z dwutlenku węgla, aby upewnić się, że nie utkną w pokarmie. Pozostaw je na dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby zregenerowały się po tlenku węgla. Następnie umieścić fiolki wewnątrz populacji.

Monitory umieszczone w inkubatorach. Muchy należy przekazać po trzech lub czterech dniach do nowych fiolek, aby uniknąć wysuszenia żywności. Pod koniec eksperymentu zeskanuj dane, aby wyeliminować zduplikowane odczyty i upewnić się, że nagrania są kompletne.

Korzystając ze skanowania plików 110 x, wybierz interwał zbierania danych i odrzuć dane zebrane w ciągu pierwszych 24 godzin w wybranym przedziale czasu. Program wyśle aktualną łączną liczbę dla każdego monitora do komputera i rozpocznie liczenie od nowa. Następnie wybierz nazwę eksperymentu i skopiuj pliki z folderu danych komputera, aby zapisać dane.

Analizę danych należy rozpocząć od starannego skopiowania danych zebranych w plikach tekstowych do kolumn arkuszy kalkulacyjnych Excel. Następnie oblicz całkowitą aktywność w żądanym okresie czasu dla każdego monitora, która reprezentuje sumę aktywności zebranej na trzech różnych wysokościach wiązek podczerwieni. Na koniec określ średnią aktywność lokomotoryczną i odchylenie standardowe między trzema monitorami, które reprezentują trzy kontrpróby biologiczne, za pomocą dwustronnego testu T-studenta.

Spontaniczna aktywność lokomotoryczna u muszki zależy od płci muchy i cyklu jasno-ciemnego. Jak pokazuje ten wykres średniej aktywności samców i samic much, strzałka oznacza przejście od światła do ciemności. Tam, gdzie obserwuje się spadek aktywności, całkowita aktywność 20-dniowych samców much wzrasta, gdy muchom podaje się połowę standardowego pokarmu na diecie niskokalorycznej w porównaniu ze zmniejszoną aktywnością much na diecie wysokokalorycznej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić spontaniczną aktywność fizyczną drosophila. Ta metoda jest pomocna w określeniu, w jaki sposób różne manipulacje genetyczne lub środowiskowe wpływają na aktywność much.