Name: Obrazowanie konfokalne ograniczonych mieszanin koloidalno-polimerowych w stanie spoczynku i przepływu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Poznaj mikroskopię konfokalną do badania zachowania fazowego i właściwości transportowych atrakcyjnych zawiesin koloidalnych w warunkach ograniczenia geometrycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez University of Houston New Faculty Grant, grant zalążkowy od Texas Center for Superconductivity oraz American Chemical Society Petroleum Research Fund (52537-DNI).

1. Przygotowanie mieszanin koloidalno-polimerowych
Uwaga: Ten protokół wykorzystuje cząsteczki poli(metakrylanu metylu) (PMMA), sterycznie stabilizowane za pomocą poli(kwasu 12-hydroksystearynowego) i znakowane barwnikiem fluorescencyjnym (takim jak czerwień nilowa, rodamina B lub fluoresceina), które zostały zsyntetyzowane według standardowej receptury52.
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę bromku cykloheksylu (CXB) i dekahydronaftalenu (DHN) w proporcji 3:1 jako rozpuszczalnik podstawowy. Mieszanina ta prawie odpowiada gęstości i współczynnikowi załamania cząstek. Dodać do rozpuszczalnika sól organiczną, chlorek tetrabutyloamoniowy (TBAC)46, o stężeniu 1,5 mM, aby częściowo przesiać ładunki na cząstkach.</li>
	<li>Aby precyzyjnie określić gęstość cząstek, należy przygotować zawiesinę o przybliżonym ułamku objętościowym cząstek Φ = 0,10 w rozpuszczalniku CXB:DHN. Odwirować zawiesinę o sile 800 x g przez 75 minut i dodawać kroplami CXB lub DHN, aby poprawić dopasowanie wyporności. W tych eksperymentach zmierzono gęstość cząstek PMMA na ρ = 1,223 g/ml.</li>
	<li>Przygotować skoncentrowaną zawiesinę cząstek PMMA (tutaj Φ = 0,40) w mieszaninie rozpuszczalnika CXB:DHN.</li>
	<li>Przygotować stężony roztwór polistyrenu liniowego (PS) w mieszaninie rozpuszczalników CXB:DHN. Tutaj przygotowuje się roztwór PS o masie cząsteczkowej Mw ≈ 3 000 000 (promień bezwładności rg = 15 nm) o stężeniu cp ≈ 50 mg/ml.</li>
	<li>Wymieszać mieszaniny podstawowe cząstek, polimerów i rozpuszczalników o odpowiedniej masie, aby sformułować zawiesiny o pożądanych stężeniach cząstek i polimerów. 
	Uwaga: Tutaj zawiesiny cząstek monorozproszonych przygotowuje się przy stałym ułamku objętościowym koloidu Φ = 0,15 i zmiennym stężeniu polimeru w objętości swobodnej53 cp = 0–25 mg/ml, a zawiesiny dwurozproszone zawierające cząstki koloidalne o dwóch wielkościach, z których każda ma odrębny znacznik fluorescencyjny, przygotowuje się przy ustalonym całkowitym ułamku objętościowym koloidu Φ = 0,15, stosunek ułamka objętościowego małych cząstek r = 0,50, a stężenie polimeru w wolnej objętości 5 lub 25 mg/ml.</li>
	<li>Po przygotowaniu każdej zawiesiny dodawać kroplami CXB lub DHN i odwirowywać próbki o stężeniu 800 x g przez co najmniej 75 minut, aby potwierdzić, że cząstki i skupiska w zawiesinie pozostają dopasowane pod względem wyporności.</li>
	<li>Równowaga wszystkich próbek przez co najmniej 24 godziny przed eksperymentami obrazowymi.</li>
</ol>
2. Eksperymenty z próbkami w stanie spoczynku: zachowanie fazowe
<ol>
	<li>Aby określić zachowanie fazy masowej, należy wykonać prostokątne komory ze szklanych szkiełek nakrywkowych (rysunek 1a). W przypadku mieszanin koloidalno-polimerowych w tym badaniu, komory o grubości h = 1 mm (ustawionej przez grubość szkiełka mikroskopowego) dają zachowanie masowe.</li>
	<li>Aby uzyskać dostęp do wielu powłok w jednym eksperymencie mikroskopowym, należy wytworzyć cienkie komory w kształcie klina, używając pojedynczego szkiełka nakrywkowego jako przekładki na jednym klinie (ryc. 1b). Kąt otwarcia komory wynosi <0,5°, dzięki czemu w jednym polu widzenia ściany są prawie równoległe. Reprezentatywna komora umożliwia dostęp do grubości uwięzienia od h = 6 do >100 μm.</li>
	<li>Zbuduj komory na podstawie szkiełka nakrywkowego do obrazowania pod mikroskopem odwróconym i uszczelnij żywicą epoksydową utwardzaną promieniami UV, która nie rozpuszcza się w mieszaninie rozpuszczalników CXB-DHN.</li>
	<li>Próbki obrazowe za pomocą mikroskopu konfokalnego. Protokół ten demonstruje obrazowanie za pomocą konfokalnego skaningu liniowego podłączonego do odwróconego mikroskopu wyposażonego w 100-krotną soczewkę olejową o aperturze numerycznej NA = 1,40.</li>
	<li>Wzbudzić barwniki za pomocą źródła laserowego. Tutaj długości fal λ = 491 lub 561 nm są używane do wzbudzania odpowiednio barwników fluoresceiny i rodaminy/czerwieni nilowej.</li>
	<li>W systemie skanowania punktowego wygeneruj obraz, szybko skanując punkt ogniskowy w poprzek próbki (w płaszczyźnie x-y) za pomocą oprogramowania konfokalnego. Dwuwymiarowy obraz o wymiarach 512 x 512 pikseli, obejmujący około 50 μm x 50 μm, można uzyskać w 1/32 sekundy. Popraw jakość obrazu, uśredniając wiele obrazów lub wydłużając czas akwizycji.</li>
	<li>Zlokalizuj dno komory (z = 0), na przykład skupiając się na cząstkach przyklejonych do jej dna. W tej konfiguracji wysokość (z) wzrasta wraz ze wzrostem ostrości w komorze.</li>
	<li>Jako przykład scharakteryzuj wpływ uwięzienia na dynamikę cząstek, uzyskując dwuwymiarowe szeregi czasowe obrazów (w płaszczyźnie x-y) w środkowej płaszczyźnie komory. W typowym eksperymencie uzyskuje się 500 obrazów o wymiarach 512 x 512 pikseli z szybkością 1 klatki/s (odstęp czasu ∆t = 1 sekunda).</li>
	<li>Jako drugi przykład, scharakteryzuj trójwymiarową strukturę cząstek, uzyskując trójwymiarową serię obrazów (x,y,z). W typowym eksperymencie dwuwymiarowe obrazy (512 pikseli x 512 pikseli) są uzyskiwane w wielu pozycjach z w komorze, ze stałym odstępem ∆z = 0,2 μm między kolejnymi obrazami ustawionymi przez piezo. Stos objętościowy o grubości h = 30 μm zawiera zatem 151 obrazów.</li>
	<li>Lokalizuj i śledź cząstki w czasie w 2D lub 3D za pomocą oprogramowania do śledzenia cząstek napisanego w IDL23,54-56, MATLAB57,58, LabView59 lub Python60. Algorytmy te zazwyczaj pozwalają na rozdzielenie środków cząstek w zakresie 40–50 nm. Pomyślne śledzenie cząstek wymaga, aby cząstki poruszały się mniej niż odstępy między cząstkami między kolejnymi klatkami.</li>
	<li>Na podstawie pozycji cząstek oblicz wskaźniki strukturalne i dynamiczne. Trzy wygodne metryki pokazane tutaj to funkcja korelacji par 3D g(r)61, przemieszczenie średniokwadratowe 2-D (MSD)58,62 oraz samodzielna część 2-D funkcji korelacji van Hove'a G s(x,t)58. Te dwie ostatnie metryki można również obliczyć w 3D.</li>
</ol>
3. Eksperymenty przepływowe: Właściwości przepływu
<ol>
	<li>Wykonaj prostą komorę przepływową za pomocą szklanej mikrokapilary o kwadratowym przekroju (100 μm x 100 μm), która jest przymocowana do rurki teflonowej. Użyj szklanych szkiełek nakrywkowych, aby podeprzeć kapilarnę i zapewnić sztywność mechaniczną, jak pokazano na schemacie na rysunku 7.</li>
	<li>Załaduj mieszaninę koloidowo-polimerową do szklanej strzykawki. Podłączyć strzykawkę do pompy strzykawkowej lub pneumatycznego systemu dozowania płynu.</li>
	<li>Zamontuj konfigurację komory przepływowej na mikroskopie odwróconym. Utrzymuj strzykawkę, komorę przepływową i wylot na tej samej wysokości, aby zminimalizować wpływ grawitacji na profil przepływu.</li>
	<li>Kontrolować natężenie przepływu zawiesiny przez komorę przepływową za pomocą objętościowego natężenia przepływu (dla pompy strzykawkowej) lub zastosowanego ciśnienia (dla komory ciśnieniowej). Średnia prędkość zawiesiny w mikrokanaliku zależy również od składu zawiesiny. Typowe wartości maksymalnej prędkości w kwadratowym mikrokanale mierzone w tym miejscu to 200–2 000 μm/s.</li>
	<li>Podczas przepływu uzyskaj konfokalne szeregi czasowe 2D z dużą liczbą klatek na sekundę. W tym przypadku 500 obrazów o wymiarach 512 pikseli x 512 pikseli jest rejestrowanych z prędkością 32 klatek/s (odstęp czasowy Δt = 1/32 s) na różnych wysokościach nad dnem mikrokanału (z = 0 μm) w zakresie od z = 5–50 μm. Każdy obraz obejmuje mniej więcej połowę wymiaru bocznego (y) mikrokanału, jak pokazano we wstawce do rysunku 7. Jeśli cząsteczki wydają się eliptyczne, zwiększ liczbę klatek na sekundę akwizycji.</li>
	<li>Podobnie jak w eksperymentach w stanie spoczynku, zlokalizuj cząstki w 2D za pomocą standardowych algorytmów lokalizacji i śledzenia cząstek w IDL lub MATLAB. W przypadku powolnych przepływów, w których cząstki poruszają się mniej niż średnia odległość między cząstkami między ramkami, należy użyć algorytmów śledzenia, aby uzyskać trajektorie.</li>
	<li>Użyj korelacji obrazu, aby obliczyć profile prędkości dla szybkich przepływów.
	<ol>
		<li>Podziel obraz na obrazy poziome o stałej wysokości (y) wzdłuż kierunku przepływu (x). Dla dwóch obrazów sekwencyjnych I1 (x,y) i I2 (x,y) przesuń ten ostatni obraz o współczynnik Δx, a następnie oblicz kowariancję krzyżową między I1 (x,y) i I2 (x+Δx,y).</li>
		<li>Zidentyfikuj pozycję piku histogramu wartości Δx, które maksymalizują kowariancję krzyżową między każdą parą obrazów, aby uzyskać średnią prędkość adwekcji w każdym położeniu bocznym y. Jeśli ten rozkład nie jest silnie szczytowy, uzyskuj obrazy z większą liczbą klatek na sekundę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zawiesiny koloidalne są szeroko badane jako modele zachowania w fazie zamkniętej, ponieważ cząstki koloidalne o rozmiarach mikronów wykazują znacznie wolniejszą dynamikę niż atomy i cząsteczki, a zatem mogą być łatwo obrazowane i śledzone wczasie10. W przypadku tych podstawowych badań zrozumienie wpływu przyciągania międzycząsteczkowego na zachowanie w fazie zamkniętej daje możliwość zbadania zjawisk takich jak kondensacja kapilarna i parowanie21,22,67. Ponadto zamknięte atrakcyjne zawieszenia pojaw...

Ten artykuł demonstruje (a) obrazowanie konfokalne spoczynkowych i przepływających ograniczonych mieszanin koloidowo-polimerowych w dwóch i trzech wymiarach oraz (b) śledzenie cząstek i analizy korelacji wynikowych obrazów w celu uzyskania ilościowych informacji na temat zachowania fazy i właściwości przepływu.
Zawiesiny koloidalne z atrakcyjnymi interakcjami międzycząsteczkowymi pojawiają się wszędzie w zastosowaniach technologicznych jako materiały do montażukierowanego 1-3, dostarczania leków4, ulepszonego odzyskiwania węglowodorów5-7 i magazynowania energii8. Wspólną cechą tych zastosowań jest to, że cząstki muszą przepływać przez drobne geometrie, takie jak dysze, głowice drukujące, mikrokanały lub porowate media, i/lub być formowane w cienkie warstwy lub pręty. Techniki stosowane do badania struktury koloidów o rozmiarach mikronowych w ograniczonych geometriach, w tym mikroskopia elektronowa17,18, mikroskopia rentgenowska19 i mikroskopia dyfrakcji laserowej20, mogą być wykorzystywane do pomiaru struktury i dynamiki cząstek w mikroskali. Techniki te nie pozwalają jednak na dostęp do trajektorii poszczególnych cząstek, na podstawie których można obliczyć metryki strukturalne i dynamiczne w celu bezpośredniego porównania z symulacjami numerycznymi21,22.
Mikroskopia konfokalna to odmiana mikroskopii fluorescencyjnej, która umożliwia obrazowanie cienkich odcinków próbki fluorescencyjnej. W przypadku nauki o koloidach10 technika ta jest szczególnie przydatna do obrazowania głęboko w gęstych zawiesinach lub w trzech wymiarach. Algorytmy śledzenia cząstek23 zastosowane do dwu- lub trójwymiarowych szeregów czasowych mikrofotografii konfokalnych pozwalają na wyznaczenie trajektorii wszystkich widocznych cząstek. W rezultacie, połączenie mikroskopii konfokalnej i śledzenia cząstek zostało zastosowane do badania zachowania fazowego, struktury i dynamiki zawiesin koloidalnych, w tym uporządkowanych kryształów24-27 i nieuporządkowanych szkieł28-31 i żeli32-35.
Inne algorytmy analizy obrazu mogą być stosowane do pomiaru dynamiki cząstek z szeregów czasowych mikrofotografii konfokalnych. Na przykład dyfuzyjną dynamikę cząstek można badać, analizując fluktuacje intensywności w czasie za pomocą konfokalnej różnicowej mikroskopii dynamicznej36. Gdy przemieszczenia cząstek są większe niż odstępy między cząstkami, do pomiaru profili prędkości prędkości cząstek można zastosować korelację obrazu37 opartą na prędkości obrazu cząstek38-40. Połączenie algorytmów śledzenia i korelacji pozwoliło na pomiar dynamiki koloidalnej w układach podlegających powolnemu i szybkiemu przepływowi11-16,41-45.
Używamy mieszanin koloidowo-polimerowych jako modeli dla atrakcyjnych zawiesin koloidalnych9. W tych mieszaninach zakres i siła przyciągającego potencjału międzycząsteczkowego są kontrolowane poprzez stosunek promienia bezwładności polimeru do promienia cząstek, a stężenie polimeru i odpychanie elektrostatyczne jest kontrolowane przez dodanie monowartościowej soli organicznej46. Ponieważ oddziaływania międzycząsteczkowe mogą być dokładnie dostrojone, krzepnięcie tych mieszanin zostało szeroko zbadane za pomocą mikroskopii konfokalnej 34,47-51.
Tutaj demonstrujemy obrazowanie konfokalne i analizę obrazu37 spoczynkowych i przepływowych mieszanin koloid-polimer, w których frakcja objętościowa koloidu jest utrzymywana na stałym poziomie Φ = 0,15, które badają wpływ uwięzienia na zachowanie fazowe i właściwości przepływu tych mieszanin. Techniki te mają szerokie zastosowanie w układach cząstek stałych, które mają dopasowany współczynnik załamania światła i w których cząstki i/lub rozpuszczalnik mogą być znakowane barwnikiem fluorescencyjnym.

<table><tbody><tr><td>Bromek cykloheksylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>135194</td><td>Numer CAS&nbsp; 108-85-0, Waga molekularna = 163,06, Stosowany w rozpuszczalniku</td></tr><tr><td>magazynowym Decahydronapthalene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D251</td><td>Numer CAS 91-17-8, Masa cząsteczkowa = 138,25, Stosowany w rozpuszczalniku magazynowym</td></tr><tr><td>Nil Red</td><td>Sigma Aldrich</td><td>72485</td><td>Barwnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Fluoresceina 5(6)-izotiocyjanian</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3651</td><td>Barwnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Rodamina B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83689</td><td>Barwnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Dynamiczne rozpraszanie światła&nbsp;</td><td>Brookhaven Instruments</td><td>Sprzęt BI-APD</td><td>DLS używany do pomiaru wielkości cząstek</td></tr><tr><td>Polistyren&nbsp;</td><td>Varian/Agilent</td><td>PL20138-23</td><td>Polistyren (polimer) do indukowania przyciągania zubożenia</td></tr><tr><td>Tetrabutyl (chlorek amonu) (TBAC)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>86870</td><td>sól monowartościowa</td></tr><tr><td>Klej UV</td><td>Norland Klej</td><td>NOA 68T</td><td>Numer katalogowy 68T01 (klej utwardzany promieniami UV)</td></tr> <tr><td>VT Eye</td><td>Visitech</td><td>VT Skaner</td><td>konfokalny</td></tr><tr><td>do oczu VT Infinity</td><td>Visitech</td><td>VT Skaner</td><td>konfokalny</td>nieskończoności</tr><tr><td>Mikroskop&nbsp;</td><td>Wirówka mikroskopu odwróconego</td> <td>Leica</td><td>DMI3000B</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall ST 16</td><td>1-5,000 obr./min</td></tr><tr><td>Rurki teflonowe</td><td>małe części</td><td>SLTT 26-72</td><td>Rurka ścienna Zeus PTFE Sublite 26 AWG 0,016 "ID x 0,003" Ścienna</td></tr> żywica <tr><td>epoksydowa</td><td>Devcon</td><td>DA051</td> 5 min Strzykawka <td>epoksydowa</td></tr><tr><td></td><td>Micromate/Cadence</td><td>5004</td><td>szklana strzykawka z metalowym luerem Końcówka zamka</td></tr><tr><td>Końcówki strzykawek&nbsp;</td>Precyzyjne końcówki <td>Nordson</td><td>7018462</td><td>32 GA&nbsp;</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa&nbsp;</td><td>System pomp New Era Inc.</td><td>NE1002X</td><td>Programowalna pompa mikroprzepływowa (syringepump.com)</td></tr><tr><td>Waga wagowa</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB204-S</td><td>0,0001-220 g</td></tr><tr><td>Cząstki PMMA</td><td>syntetyzowane</td><td></td><td>cząstki koloidalne z poli(metakrylanu metylu)</td></tr></tbody></table>

obrazowanie konfokalne ograniczonych mieszanin koloidalno-polimerowych w stanie spoczynku i przepływu

Confocal Imaging of Confined Quiescent and Flowing Colloid-polymer Mixtures

Zachowanie zamkniętych zawiesin koloidalnych z atrakcyjnymi interakcjami międzycząsteczkowymi jest kluczowe dla racjonalnego projektowania materiałów do bezpośredniego montażu1-3, dostarczania leków4, ulepszonego odzysku węglowodorów5-7 i płynnych elektrod do magazynowania energii8. Zawiesiny zawierające koloidy fluorescencyjne i polimery nieadsorpcyjne są atrakcyjnymi układami modelowymi, ponieważ stosunek promienia bezwładności polimeru do promienia cząstek i stężenie polimeru kontrolują odpowiednio zakres i siłę przyciągania międzycząsteczkowego. Dostrajając właściwości polimeru i udział objętościowy koloidów, można uzyskać płyny koloidalne, płyny klastrów, żele, kryształy i szkła9. Mikroskopia konfokalna, wariant mikroskopii fluorescencyjnej, pozwala na zobrazowanie optycznie przezroczystej i fluorescencyjnej próbki z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową w trzech wymiarach. W tej technice mały otwór lub szczelina blokuje emitowane światło fluorescencyjne z obszarów próbki, które znajdują się poza objętością ogniskową układu optycznego mikroskopu. W rezultacie obrazowany jest tylko cienki wycinek próbki w płaszczyźnie ogniskowej. Technika ta jest szczególnie dobrze przystosowana do badania struktury i dynamiki gęstych zawiesin koloidalnych w skali pojedynczych cząstek: cząstki są wystarczająco duże, aby można je było rozdzielić za pomocą światła widzialnego i dyfundować wystarczająco wolno, aby można je było uchwycić z typowymi prędkościami skanowania komercyjnych systemów konfokalnych10. Ulepszenia w szybkości skanowania i algorytmach analizy umożliwiły również ilościowe obrazowanie konfokalne przepływających zawiesin11-16,37. W tym artykule demonstrujemy eksperymenty z mikroskopią konfokalną w celu zbadania zachowania fazy zamkniętej i właściwości przepływu mieszanin koloidowo-polimerowych. W pierwszej kolejności przygotowujemy mieszaniny koloidalno-polimerowe, które są dopasowane pod względem gęstości i współczynnika załamania światła. Następnie przedstawiamy standardowy protokół obrazowania spoczynkowych gęstych mieszanin koloid-polimer w różnym zamknięciu w cienkich komórkach w kształcie klina. Na koniec demonstrujemy protokół obrazowania mieszanin koloidowo-polimerowych podczas przepływu mikrokanałowego.

Aby zademonstrować obrazowanie konfokalne i śledzenie cząstek, zbadaliśmy wpływ ograniczenia przestrzennego na zachowanie fazowe mieszanin koloid-polimer63-65. W tych eksperymentach średnica koloidu wynosiła 2a = 0.865 μm. Ułamk objętościowy koloidu ustalono na poziomie Φ = 0.15, a stężenie polimeru cp zmieniano w zakresie od 0 do 23.6 mg/ml. Reprezentatywne obrazy konfokalne przedstawiono na Rysunku 263, w lewej kolumnie. Na podstawie pozycji cząstek uz...

Mikroskopia konfokalna służy do obrazowania spoczynkowych i przepływających mieszanin koloidowo-polimerowych, które są badane jako układy modelowe dla atrakcyjnych zawiesin. Algorytmy analizy obrazu służą do obliczania wskaźników strukturalnych i dynamicznych dla cząstek koloidalnych, które mierzą zmiany spowodowane ograniczeniem geometrycznym.

Obrazowanie konfokalne ograniczonych mieszanin koloidalno-polimerowych w stanie spoczynku i przepływu

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie zmian w zachowaniu fazy ograniczonej oraz właściwościach transportowych atrakcyjnych zawiesin koloidalnych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej. Osiągnięto to poprzez opracowanie mieszanin koloid-polimer służących do modelowania atrakcyjnych zawiesin koloidalnych. Mieszaniny te są obrazowane i ograniczane w cienkich komorach klinowych, aby wykazać, w jaki sposób ograniczenie przestrzenne modyfikuje dynamikę struktury i zachowanie fazowe tych mieszanin.Następnie obrazuje się mieszaniny podczas ich przepływu przez mikrokanały, aby określić wpływ siły przyciągania między koloidami na właściwości transportu ograniczonego mieszanin. Zautomatyzowana analiza obrazu i algorytmy śledzenia cząstek mogą wykazać, w jaki sposób uwięzienie w stanie spoczynku prowadzi do zestalenia i korelacji obrazu. Algorytmy mogą wykazać, jak zwiększenie siły przyciągania prowadzi do coraz bardziej nienewtonowskiego charakteru przepływu.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak mikroskopia elektronowa i dynamiczne rozpraszanie światła, jest to, że umożliwia ona bezpośredni dostęp do trajektorii pojedynczych cząstek, z których można obliczyć parametry dynamiczne i strukturalne do bezpośredniego porównania z symulacjami. Ta standardowa metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu fizyki miękkiej materii skondensowanej, takie jak sposób, w jaki zawiesiny samoorganizują się w obecności oddziaływań międzycząsteczkowych lub w jaki sposób stałe zawiesiny lekkie ulegają odkształceniu pod wpływem przyłożonej siły lub naprężenia. Do niniejszego protokołu przygotowano cząstki PMMA znakowane barwnikiem; standardowe procedury przygotowania opisano w powiązanym materiale referencyjnym w protokole tekstowym.Przygotować mieszaninę w stosunku wagowym 3:1 rozdrobnionego heanu w deco hydro nataline lean, następnie dodać tetra butyl ammonium oraz sól organiczną do stężenia 1,5 millimolar. Rozpuszczalnik dopasowuje współczynnik załamania światła do cząstek i częściowo ekranuje ich ładunek, aby precyzyjnie określić gęstość cząstek. Zawiesić cząstki w stężeniu 0,1 volume by volume w przygotowanym rozpuszczalniku, a następnie wirować zawiesinę przy 800 G przez 75 minut.Należy sprawdzić, czy cząstki nie osiadają po wirowaniu. Następnie, aby zapobiec sedymentacji cząstek, należy dodawać kroplami rozpuszczalnik podstawowy, aż gęstość rozpuszczalnika zrówna się z gęstością cząstek. W kolejnym kroku należy przygotować 40% zawiesinę cząstek PMMA w przygotowanej mieszaninie rozpuszczalników.Należy również przygotować liniowy polistyren w mieszaninie rozpuszczalników w wysokim stężeniu. Na przykład 50 mg/mL, wyliczonym na podstawie masy cząsteczkowej i promienia żyracji polistyrenu. Zastosowanie skoncentrowanej zawiesiny cząstek PMMA oraz roztworu polistyrenu pozwala na otrzymanie zawiesin o pożądanym stężeniu cząstek i polimerów.W tym przypadku zawiesina zawiera 15% objętościowo cząsteczek PMMA, a stężenie polimeru wynosi od 0 do 25 mg/mL, uzyskane poprzez rozproszenie zawiesin dwóch rodzajów cząsteczek PMMA o różnych rozmiarach i różnych znacznikach w równych objętościach. Frakcje można również mieszać z roztworem polimeru. Po wymieszaniu każdej zawiesiny należy je odwirować, a następnie dodawać rozpuszczalnik kroplami, aby gęstość rozpuszczalnika ściśle odpowiadała gęstości cząsteczek.Na koniec wyrównaj wszystkie próbki, umieszczając szczelnie zamknięte naczynia w mieszalniku typu Tumblr na co najmniej 24 godziny przed obrazowaniem. Rozpocznij od przygotowania komór prostokątnych z szkiełek podstawkowych. Grubość szkiełka przedmiotowego wynosi tutaj 1 mm, co determinuje grubość komory umożliwiającą zachowanie właściwości objętościowych przez mieszaniny polimerów z pierścieniami.Jeśli wymagana jest komora o zmiennej wysokości, należy wykonać cienkie komory w kształcie klina, używając pojedynczego szkiełka zakryjącego umieszczonego na klinie. Kąt otwarcia komory wynosi mniej niż 0,5 stopnia, a grubość komory wzrasta od 6 µm do 1 mm. Taka konfiguracja pozwala na ciągłą zmianę grubości ograniczenia; komory należy wykonać tak, aby można było je umieścić na mikroskopie odwróconym, a następnie uszczelnić utwardzalną promieniami UV żywicą epoksydową, odporną na stosowaną mieszaninę rozpuszczalników w używanym mikroskopie.Oto liniowa skanująca głowica konfokalna przymocowana do mikroskopu odwróconego z obiektywem imersyjnym olejowym 100 x. Przy aperturze numerycznej 1,4 należy zastosować odpowiednie długości fal do wzbudzenia barwników i wykonać obrazy o rozmiarze 50 µm kwadrat przy rozdzielczości 512 pikseli kwadrat. Należy rozpocząć od czasu ekspozycji 1/32 sekundy, a następnie dostosować go w zależności od jakości obrazu.Następnie zlokalizuj dno komory, do którego przylgną cząsteczki. Potem przesuń ostrość na środek komory. Teraz wykonaj około 500 obrazów w tempie jednej klatki na sekundę w płaszczyźnie środkowej do analizy 2D.Następnie, w celu przeprowadzenia analizy 3D, w każdym eksperymencie obrazowania towarzyszącym wykonaj zdjęcia serii Z (Z stack) z odstępami 0,2 micron nad obszarem 30 microns. Kluczowe jest zoptymalizowanie warunków obrazowania w celu uzyskania obrazów o wysokim kontraście. Przeanalizuj obrazy przy użyciu oprogramowania do śledzenia cząstek.Należy zastosować algorytm umożliwiający rozdzielczość cząsteczek na poziomie 40 lub 50 nanometrów. Śledzenie cząsteczek jest możliwe tylko wtedy, gdy przemieszczają się one na odległość mniejszą niż odstępy między cząsteczkami w kolejnych klatkach. Do oceny struktury i dynamiki cząsteczek należy wykorzystać następujące wskaźniki.Trójwymiarowa funkcja korelacji par, dwu- lub trójwymiarowe średniokwadratowe przemieszczenie oraz dwu- lub trójwymiarowa część własna funkcji korelacji Van Hove'a. Do tego eksperymentu należy wykonać prostą celę przepływową z kwadratowej kapilary szklanej o szerokości 100 mikronów. Należy dołączyć rurki teflonowe i użyć szklanych lamellek w celu zapewnienia stabilności konstrukcji.Następnie należy pobrać badaną mieszaninę koloidów i polimerów do szklanej strzykawki i podłączyć ją do systemu dozującego, na przykład do pompy. Teraz należy zamontować cały układ do mikroskopu odwróconego, zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji. Komora przepływowa strzykawki oraz wylot powinny znajdować się w pozycji jak najbardziej poziomej.Ustaw szybkość przepływu zgodnie z właściwościami mieszaniny koloidów i polimeru. Podczas przepływu przez kapilary kwadratowe stosowano szybkości od 200 do 2000 mikronów na sekundę. Pozyskaj obrazy 2D, zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji, w różnych odległościach od dna kanału, od 5 do 50 mikronów.Jeśli cząstki wydają się eliptyczne, należy zwiększyć częstotliwość próbkowania klatek podczas akwizycji. Do analizy przepływu należy wykorzystać oprogramowanie do śledzenia oraz środowisko IDL lub MATLAB. Uzyskanie rozdzielczości subpikselowej w śledzeniu cząstek wymaga precyzyjnego dostrojenia parametrów śledzenia, aby uzyskane OID nie były obciążone w określonym kierunku.Podczas powolnego przepływu, gdy cząstki przemieszczają się na odległość mniejszą niż dystans międzycząsteczkowy pomiędzy klatkami, trajektorie można uzyskać za pomocą procedur śledzenia stosowanych w szybszym przepływie. Do obliczenia prędkości należy wykorzystać korelację obrazów.Podziel każdy obraz na pasy poziome w kierunku przepływu. W przypadku obrazów sekwencyjnych przesuń drugi obraz tak, aby odpowiadał pierwszemu, a następnie wykorzystaj odległość przesunięcia do obliczenia prędkości pomiędzy parami obrazów lub dla każdego podziału obrazów oryginalnych. Sporządź histogram wszystkich obliczonych wartości przesunięcia.Jeśli wartości nie wykazują wyraźnych maksimów, należy powtórzyć eksperyment przy zastosowaniu wyższej częstotliwości klatek. Cząsteczki PMMA o średnicy 0,865 microns zawieszono w stężeniu 15% objętościowo w roztworze zawierającym 23,6 milligrams polimeru na mililitr mieszaniny rozpuszczalników. Do oceny obrazów wykorzystano parametry strukturalne i dynamiczne, w tym funkcję korelacji par oraz średni kwadrat przemieszczenia.Zmiana zawiesiny może zmienić strukturę i dynamikę zawiesin ograniczonych. Na przykład, sformułowano zawiesinę rozproszoną z cząstkami o rozmiarach 1,48 µm i 0,73 µm, w której cząstki zajmowały 15% objętości przy zmniejszaniu grubości ograniczenia. Wywołano fazę żelu koloidalnego o charakterze ciała stałego, zawierającą oba typy cząstek, przy czym średni kwadrat przemieszczenia dużych cząstek malał wraz ze wzrostem ograniczenia układu.Zgodnie z przepływem krzepnięcia, porównano właściwości cząstek słabo przyciągających się i silnie przyciągających się. Stężenie polimeru wahało się od 5 mg/mL do 25 mg/mL. W zawiesinach, zawiesina słabo przyciągająca wykazywała profil gęstości, który silnie zmieniał się w zależności od położenia w kanale.Przy przepływie 10 µL/h profil gęstości silnie atrakcyjnej zawiesiny był niemal stały w całym kanale w tych samych warunkach. Podobnie odnotowano różnice w profilach prędkości tych zawiesin. Cząstki słabo atrakcyjne wykazywały prędkość zbliżoną do przewidywań dla płynu newtonowskiego, podczas gdy prędkość cząstek silnie atrakcyjnych nieznacznie odbiegała od przewidywań dla płynu newtonowskiego, zwłaszcza w pobliżu bocznej ścianki kanału, gdzie Y wynosi zero.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystać mikroskopię konfokalną do badania zachowania fazowego i właściwości płynnych zawiesin koloidalnych zgodnie z opisaną procedurą. Na podstawie pozycji cząstek można obliczyć inne parametry, takie jak rozmiary klastrów i wymiary fraktalne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, w jaki sposób ograniczenie przestrzenne modyfikuje kształt zagregowanych klastrów.

confocal-imaging-confined-quiescent-flowing-colloid-polymer

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Konfokalne obrazowywanie ograniczonych, niespokojnych i przepływających mieszanin koloid-polimer

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

W niniejszej pracy wyjaśniamy sposób wykonania i zastosowania mikropłynnego mieszalnika zdolnego do mieszania dwóch roztworów w czasie ~8 μs. Demonstrujemy również wykorzystanie tych mieszalników w detekcji spektroskopowej z użyciem fluorescencji UV oraz fluorescencyjnego transferu energii w rezonansie (FRET).

Miksery mikrofluidyczne do badania fałdowania białek

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Biofilmy mają złożone interakcje z otaczającym je środowiskiem. Aby kompleksowo zbadać interakcje biofilm - środowisko, przedstawiamy tutaj szereg metod tworzenia heterogenicznego środowiska chemicznego do rozwoju biofilmu, ilościowego określania lokalnej prędkości przepływu oraz analizy transportu masowego w koloniach biofilmu i wokół nich.

Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Polimeryzacja wytrącająca bez mieszania zapewnia szybkie, powtarzalne podejście do prototypowania syntezy wrażliwych na bodźce mikrożeli poli(N-izopropyloakrylamidowych) o wąskim rozkładzie rozmiarów. W tej syntezie protokołu demonstruje się charakterystykę rozpraszania światła i śledzenie fluorescencji pojedynczych cząstek tych mikrożeli w mikroskopii szerokokątnej.

Kontrolowana synteza i śledzenie fluorescencji wysoce jednorodnych mikrożeli poli(N-izopropyloakrylamidowych)

Ten protokół opisuje syntezę i formułowanie wstrzykiwalnych, supramolekularnych biomateriałów hydrożelowych polimerowo-nanocząsteczkowych (PNP). Przedstawiono zastosowania tych materiałów do dostarczania leków, stabilizacji biofarmaceutycznej oraz enkapsulacji i dostarczania komórek.

Supramolekularne hydrożele polimerowo-nanocząsteczkowe do wstrzykiwań do zastosowań w dostarczaniu komórek i leków

Proponowana technika zapewni nowatorskie, wydajne, oszczędne i nieinwazyjne podejście do obrazowania przepływu płynów przez upakowane złoże proszkowe, co zapewni wysoką rozdzielczość przestrzenną i czasową.

Oszczędna technika obrazowania przepływu kapilarnego przez trójwymiarowe polimerowe proszki drukarskie

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Ten protokół szczegółowo opisuje projekt i wykonanie urządzenia mikroprzepływowego odpowiedniego do badania mechaniki polimerów mikrotubul. Synteza technik mikrowytwarzania, zautomatyzowanej kontroli przepływu i modelowania obliczeniowego umożliwia stworzenie elastycznego systemu idealnie nadającego się do sondowania cytoszkieletu komórkowego in vitro.

Opracowanie opartego na mikrofluidyce podejścia do badania mechaniki polimerów mikrotubul

Poznaj mikroskopię konfokalną do badania zachowania fazowego i właściwości transportowych atrakcyjnych zawiesin koloidalnych w warunkach ograniczenia geometrycznego.

Obrazowanie konfokalne ograniczonych mieszanin koloidalno-polimerowych w stanie spoczynku i przepływu

Przeglądaj więcej filmów