Produkcja skoncentrowanych, mikropęcherzykowych emulsji tlenowych na bazie lipidów metodą homogenizacji przy wysokim ścinaniu i stężeniu seryjnym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie dużej objętości samomontujących się, lipidowych mikropęcherzyków tlenu (OMS) do dożylnego podawania tlenu. Jest to realizowane przy użyciu homogenizatora o wysokich siłach ścinających oraz szczelnego zbiornika w celu produkcji i seryjnego zagęszczania OMS. Drugim krokiem jest wykorzystanie zmodyfikowanych strzykawek do ekstruzji emulsji LOM zawierającej 70% objętościowo tlenu.

Następnie emulsję zagęszcza się poprzez wirowanie, aby uzyskać piankę tlenową o objętościowej zawartości tlenu wynoszącej 90%. Ostatnim krokiem jest kontrola jakości polegająca na obliczeniu objętościowego procentu tlenu oraz ocenie rozkładu wielkości cząstek z wykorzystaniem technologii rozpraszania światła. W rezultacie homogenizacja wysokoprężna pozwala uzyskać dwa litry OMS zawierającego 90% tlenu objętościowo.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami wytwarzania, takimi jak sonikacja i amalgamacja, jest to, że homogenizacja pozwala na produkcję samomontujących się mikropęcherzyków w ilościach rzędu litrów, co jest objętością niezbędną do badań nad terapeutycznym dostarczaniem tlenu u dużych zwierząt. Jednym z zastosowań tej techniki jest leczenie pacjentów z ciężką hypoksemią, ponieważ wypełnione gazowym tlenem mikropęcherzyki przenoszą tlen do deoksyhemoglobiny w ciągu kilku sekund i przenoszą trzykrotnie większą zawartość tlenu niż krew Visual. Demonstracja tej metody jest istotna ze względu na głębokość głowicy homogenizatora.

Utrzymanie środowiska czysto utleniającego oraz odróżnienie skoncentrowanego LMS od fazy wodnej może być trudne do oszacowania. System do produkcji lipidowych mikropęcherzyków tlenu lub OMS składa się ze zbiornika magazynującego i zagęszczającego (HCT) wyposażonego w mieszałkę jednostopniową, liniowego homogenizatora wysokociśnieniowego, pompy rolkowej do przemieszczania cieczy między HCT a homogenizatorem oraz wymiennika ciepła.

Aby rozpocząć konfigurację systemu, umieść wysterylizowany szklany zbiornik o szerokim wlewie i pojemności czterech litrów, wyposażony w dwa porty dolne i trzy porty boczne, pod mieszadłem jednostopniowym. Jeden z portów dolnych (port nr 1 HCT) podłącz do sterylnego przezroczystego wężyka o średnicy wewnętrznej 3/8 cala i długości około 10 cali, wyposażonego na końcówce w trójdrożny kurek do pobierania skoncentrowanej emulsji. Następnie drugi port dolny (port nr 2) podłącz do sterylnego wężyka o średnicy wewnętrznej 3/8 cala i długości około 36 cali. Przewieź ten wężyk przez pompę perystaltyczną.

Wlot homogenizatora wysokoprzepływowego jest wyposażony w trójnik z dwoma portami. Podłącz cewkę z portu numer dwa przez pompę perkystaltyczną do bocznego portu trójnika. Drugi port podłącz do butli z tlenem, korzystając z przepływomierza tlenu o niskim przepływie.

Podłącz port wylotowy homogenizatora wysokoprzepływowego do portu wlotowego przelotowego wymiennika ciepła utrzymywanego w temperaturze 4 °C. Podłącz port wylotowy wymiennika ciepła do portu powrotnego HCT, tworząc system w obiegu zamkniętym. Podłącz butlę z tlenem za pomocą przepływomierza do portu numer cztery HCT.

Na koniec podłącz monitor składu gazów, otwarty do atmosfery, do górnego portu HCT. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść 20 gramów GMP one two DYS steer oil, SN glycerol three PHOSPHOCHOLINE lub DSPC oraz 10 gramów cholesterolu w podstawie HCT. Dodaj jeden litr plasma light A do HCT i mieszaj ręcznie przez jedną minutę, włączając jak najwięcej lipidów w fazę wodną.

Zanurz jednostopniowy mieszalnik w fazie wodnej, upewniając się, że cała głowica mieszalnika jest przykryta fazą wodną. Aby zapobiec zanieczyszczeniu przestrzeni nad cieczą powietrzem z otoczenia, należy użyć gumowych uszczelek lub taśmy, aby zapewnić szczelność gazową górnej części HCT i upewnić się, że żadne boczne porty nie są otwarte. Włącz źródło gazu podłączone do portu numer cztery i poczekaj, aż frakcja tlenu w przestrzeni nad cieczą HCT przekroczy 95%. Za pomocą jednostopniowego mieszalnika mieszaj emulsję prekursorową przez pięć minut. Przy 5,000 RPM otrzymana mieszanina powinna mieć bladobiały kolor i nie zawierać widocznych grudek lipidów.

Po zmieszaniu niewykorzystana mieszanina lipidowo-wodna może być przechowywana w temperaturze 4°C do 30 dni przed użyciem. Należy zapowietrzyć cały system zamkniętego obiegu za pomocą emulsji prekursorowej, uruchamiając pompę perystaltyczną z przepływem 1,3 litra na minutę (LPM). Po zapowietrzeniu systemu należy pozostawić pompę włączoną przy 1,3 LPM, aby rozpocząć wytwarzanie LO.

Ustaw liniowy homogenizator wysokoprzepływowy na 7 500 RPM. Następnie niezwłocznie uruchom przepływ tlenu do wlotowej części homogenizatora z prędkością 0,5 LPM. Pozostaw jednostopniowy mieszadło w HCT włączone przy 3 500 RPM.

Oms tworzą się na styku łopatek wirnika i sit emulsyjnych w homogenizatorze przepływowym. W ciągu pierwszych kilku minut ciecz powinna stać się widocznie bardziej lepka. Uruchom system na 15 minut, a następnie wyłącz homogenizator o wysokim ścinaniu oraz dopływ tlenu do niego.

Działanie to ogranicza separację faz i zapewnia względną jednorodność produktu w obrębie HCT. Należy zauważyć, że objętość emulsji wypełnionej gazem powinna zwiększyć się około dwu- do trzykrotnie podczas fazy seryjnej koncentracji. Strzykawki Luer-Lock o pojemności 140 ml, służące do zbierania wytworzonego OMS, zostały wcześniej zmodyfikowane poprzez nabranie do strzykawki 100 ml powietrza, a następnie odcięcie nadmiaru tłoka i obudowy strzykawki powyżej oznaczenia 140 ml.

Do kurka odcinającego przymocowanego do portu podstawowego nr 1 naczynia zbiorczego podłącz sterylną zmodyfikowaną strzykawkę. Używając pęsety ząbkowanej, obniż tłok i pobierz 100 ml płynu, a następnie szczelnie zamknij strzykawkę zaślepką. Powtarzaj czynność do momentu usunięcia całego płynu. Wirowarką w chłodni odwiruj strzykawki z końcem zamkniętym skierowanym w dół przy 225 ×g przez 10 minut. Po wirowaniu widoczne będą trzy warstwy materiału; usuń i odrzuć dolną warstwę nadmiarowej, mętnej fazy wodnej.

Druga warstwa jest jasnobiała i zawiera skoncentrowane oms. Przenieś skoncentrowaną pianę do nieprzepuszczalnej dla gazów strzykawki szklanej, używając trójdrożnego zaworu, aby zapobiec zanieczyszczeniu gazami z otoczenia. Usuń ostatnią warstwę, która zawiera wolny tlen pochodzący z pękniętych oms.

Jakość piany można ocenić, obliczając stężenie gazu w następujący sposób. Piana wysokiej jakości osiągnie stężenie gazu większe lub równe 90% objętości; jako drugą kontrolę jakości wielkość mikropęcherzyków określa się metodą optycznego rozpraszania światła, aby sprawdzić, czy rozmiar cząsteczek mieści się w oczekiwanym zakresie. Należy zauważyć, że zmiana czasu homogenizacji lub składu formulacji może wpłynąć na rozmiar pęcherzyków; szklane strzykawki zawierające stężone oms należy szczelnie zamknąć.

Przy zastosowaniu złączek typu Luer-Lock strzykawki można przechowywać w temperaturze 22°C, 4°C lub -20°C. Niższe temperatury mogą zapewnić zwiększoną stabilność okresu trwałości. Stosując ten protokół, do 2 L stężonego OMS można przygotować w ciągu 90 minut.

Wizualizacja 10 µL próbki OMS za pomocą mikroskopii świetlnej wykazała obecność sferycznych OMS oraz względną ilość resztek lipidowych. Gdy tę samą próbkę OMS oceniono za pomocą rozpraszania światła, średnica cząstek wynosiła 2,624 ± 0,332 µm. Ponad 90% OMS miało średnicę poniżej 10 µm, a populacja była polydyspersyjna.

Lepkość emulsji była silnie zależna od frakcji gazu, a tym samym od stężenia mikropęcherzyków. Alikwoty emulsji LOM o objętości 2 ml przy zawartości gazu 60, 70 i 90% obj. badano za pomocą pomiaru przepływu w stanie ustalonym z wykorzystaniem płyt równoległych o średnicy 40 mm.

Przy zmianie naprężenia od 0,1 do 1000 past gass OMS zawierających 60% objętości gazu, geometria wykazała profil radiologiczny podobny do ludzkiej krwi. Zawartość tlenu w OMS badano poprzez dodawanie różnych objętości tlenu zawartego w 60% objętości OMS do alikwotów odgazowanej krwi ludzkiej o znanym deficycie tlenu. Zależność między objętością tlenu dodanego w OMS a objętościowym wzrostem zawartości tlenu we krwi wynosiła 1,053 plus lub minus 0,03025.

Sugeruje to, że przetestowane OMS zawierały niemal 100% tlenu, wykazywały niewielką liczbę uwięzionych pęcherzyków gazu i skutecznie przekazywały cały ładunek tlenu do ludzkiej krwi in vitro. Po opanowaniu ta technika może być wykorzystana do wytworzenia dwóch litrów LMS w 90 minut, pod warunkiem że zostanie przeprowadzona prawidłowo i wydajnie. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o stałej kontroli wizualnej gromadzonego OMS oraz o przeprowadzeniu kontroli jakości po skoncentrowaniu piany LOM. Po zastosowaniu tej procedury produkcyjnej OMS mogą być wykorzystywane do wielkoskalowych wlewów dożylnych i dostarczania gazów terapeutycznych.