Name: Produkcja skoncentrowanych, mikropęcherzykowych emulsji tlenowych na bazie lipidów metodą homogenizacji przy wysokim ścinaniu i stężeniu seryjnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Poznaj metodę produkcji mikropęcherzyków tlenowych na bazie lipidów z wykorzystaniem homogenizacji przy wysokim ścinaniu i stężenia seryjnego. Technika ta umożliwia wytworzenie dwóch litrów emulsji z 90% zawartością tlenu do zastosowań wewnątrzżylnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie: U.S. Army Medical Research & Materiel Command (USAMRMC) i zarządzane przez Centrum Badań nad Telemedycyną i Zaawansowanymi Technologiami. Shunxi Ji przyczynił się do modyfikacji strzykawek zgodnie z opisem tutaj.

1. Konfiguracja systemu
System składa się ze zbiornika zatrzymującego i zagęszczającego (HCT) wyposażonego w jednostopniowy mieszalnik, wbudowanego homogenizatora wysokiego ścinania, pompy rolkowej do przemieszczania płynu między HCT a homogenizatorem oraz wymiennika ciepła (Rysunek 1).
<ol>
	<li>Umieść wysterylizowane szklane naczynie o pojemności 4 litrów z szerokim otworem, wyposażone w 2 porty podstawowe i 3 porty boczne, pod jednostopniowym mikserem. Opuść głowicę mieszalnika do wylotu naczynia i upewnij się, że jest gazoszczelne za pomocą gumowych uszczelek lub taśmy (aby zapobiec zanieczyszczeniu przestrzeni nad wodą z otoczenia).</li>
	<li>Zamontuj jeden z portów bazowych (Rysunek 1, port #1) HCT za pomocą sterylnej przezroczystej rurki 3/8" (ID) o długości około 10 cali, wyposażonej w 3-kierunkowy kran na końcówce do zbierania skoncentrowanej emulsji.</li>
	<li>Zamontuj drugi port podstawy (Rysunek 1, port #2) za pomocą sterylnej rurki 3/8" (ID) o długości około 36". Przeprowadź tę rurkę przez pompę rolkową. Zamontuj wlot homogenizatora o wysokim ścinaniu za pomocą trójnika z dwoma portami i podłącz w następujący sposób: podłącz rurkę z portu #2 przez pompę rolkową i podłącz do bocznego portu trójnika. Podłącz drugi port do butli z tlenem za pomocą przepływomierza tlenu gazowego o niskim przepływie.</li>
	<li>Podłączyć port wylotowy homogenizatora szybkotnącego do portu wlotowego liniowego wymiennika ciepła utrzymywanego w temperaturze 4 °C. Podłącz port wylotowy wymiennika ciepła do portu powrotnego HCT (Rysunek 1, port #3), tworząc system zamkniętej pętli.</li>
	<li>Podłącz butlę tlenu (za pomocą przepływomierza) do HCT (Rysunek 1, port #4). Podłącz monitor składu gazu, który jest otwarty na atmosferę, do górnego portu HCT (Rysunek 1, port #5).</li>
	<li>Jeśli pożądana jest sterylność, wysterylizuj elementy szklane i metalowe przed każdym użyciem w autoklawie. Przed każdym użyciem wysterylizuj elementy przewodów i plastikowe złączki tlenkiem etylenu. Jest to szczególnie ważne, jeśli produkt ma być badany in vivo.</li>
</ol>
2. Produkcja LOM
<ol>
	<li>Umieścić 20 g GMP 1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosfocholiny (DSPC) i 10 g cholesterolu w podstawie HCT. Dodać 1 l Plasma-Lyte A do HCT i mieszać ręcznie przez 1 minutę, wprowadzając jak najwięcej lipidów do fazy wodnej.</li>
	<li>Opuść mieszalnik jednostopniowy do fazy wodnej, upewniając się, że cała głowica mieszalnika jest pokryta fazą wodną. Upewnij się, że górna część HCT jest gazoszczelna (patrz krok 1.1 powyżej) i że nie ma otwartych portów bocznych. Włącz źródło gazu podłączone do portu #4 i poczekaj, aż frakcja tlenu w przestrzeni HCT osiągnie >95%. Przy 10 l/min (l/min) powinno to zająć ~10 min.</li>
	<li>Za pomocą mieszalnika jednostopniowego mieszać emulsję prekursora przez 5 minut z prędkością 5 000 obr./min. Powstała mieszanina powinna wydawać się bladobiała i nie zawierać widocznych grudek lipidowych. Po wymieszaniu, niewykorzystana mieszanina lipidowo-wodna może być przechowywana w temperaturze 4 ºC do 30 dni przed jednorazowym użyciem.</li>
	<li>Cały układ w pętli zamkniętej zalać emulsją prekursorową, włączając pompę rolkową przy natężeniu 1,3 l/min. Po zalaniu układu utrzymuj pompę włączoną na poziomie 1.3 l/min.</li>
	<li>Aby rozpocząć produkcję LOM, należy włączyć homogenizator szybkotnący w linii do 7 500 obr./min. Natychmiast po tym należy włączyć dopływ tlenu do części wlotowej homogenizatora o natężeniu 0,5 l/min. Utrzymuj jednostopniowy mikser (w HCT) włączony przy 3,500 obr./min. LOM powstają na styku łopat wirnika i sit emulsora w homogenizatorze liniowym (rysunek 2). W ciągu kilku minut płyn powinien stać się widocznie bardziej lepki. Bardziej rygorystycznym podejściem jest określenie lepkości w funkcji czasu, co można zrobić, usuwając podwielokrotności z portu 1 podczas wytwarzania i analizując za pomocą lepkościomierza. 
	Uwaga: Jeśli w przewodach wychodzących z mieszalnika znajdują się widoczne pęcherzyki powietrza, przepływ tlenu do homogenizatora liniowego jest zbyt duży. Zmniejszać przepływ gazu, aż płyn stanie się nieprzezroczysty i nie będzie zawierał widocznych pęcherzyków gazu.</li>
	<li>Uruchom system na 15 minut, a następnie wyłącz homogenizator szybkotnący i dopływ do niego tlenu. Kontynuuj uruchamianie jednostopniowego mieszalnika w HCT, aż emulsja zostanie usunięta; Łagodzi to separację faz i utrzymuje produkt w miarę jednorodny w HCT. 
	Uwaga: Objętość emulsji wypełnionej gazem powinna wzrosnąć około 2-3 razy w fazie zagęszczania szeregowego. Jeśli tak się nie stanie, sprawdź, czy tlen przepływa do homogenizatora szybkotnącego i czy stężenia lipidów w emulsji prekursorowej są prawidłowe. Wydajność produkcji spada wraz ze spadkiem stężenia lipidów.</li>
</ol>
3. Gromadzenie, koncentracja, ocena i przechowywanie LOM-ów
<ol>
	<li>Podłącz sterylną, zmodyfikowaną strzykawkę typu luer-lock o pojemności 140 ml do kranu podłączonego do portu podstawowego #1 na naczyniu zbiorczym. Pobrać 100 ml płynu. Szczelnie zakręcić strzykawkę i powtarzać czynność tak długo, aż cały płyn zostanie usunięty.
	<ol>
		<li>Zmodyfikować strzykawki, pobierając 100 ml powietrza do strzykawki, a następnie odpiłowując nadmiar tłoka i materiału strzykawki powyżej oznaczenia 140 ml. Napełniać i opróżniać strzykawki za pomocą kleszczyków zębatych w celu pobrania tłoka. Ta modyfikacja pozwala na łatwiejsze wirowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować strzykawki z zakorkowanym końcem skierowanym w dół w chłodzonym (4 ºC) wiaderku wirującym o stężeniu 225 x g przez 10 min.</li>
	<li>Po odwirowaniu pojawią się trzy warstwy materiału. Usunąć dolną warstwę nadmiaru mętnej fazy wodnej i wyrzucić. Druga warstwa jest jasnobiała i zawiera skoncentrowane LOM. Przenieść skoncentrowaną pianę do nieprzepuszczalnej dla gazu strzykawki za pomocą trójdrogowego kurka, aby zapobiec zanieczyszczeniu gazem w pomieszczeniu. Odrzuć ostatnią warstwę, która zawiera wolny tlen gazowy z pękniętych LOM.</li>
	<li>Jakość piany można ocenić poprzez osiągnięcie ≥90% gazu skoncentrowanej piany. Oblicz stężenie gazu w następujący sposób: 
	Objętość % gazu = [(Waga piany/ Objętość piany)- 1] x 100
	<ol>
		<li>W ramach drugiej kontroli jakości należy określić rozmiar mikropęcherzyków poprzez zaciemnienie światła, aby określić, czy wielkość cząstek mieści się w oczekiwanym zakresie. Należy zauważyć, że zmiana czasu homogenizacji lub receptury może zmienić wielkość pęcherzyków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szczelnie zakryć szklaną strzykawkę ze złączką typu luer-lock. Skoncentrowane LOM można rozcieńczać Plasma-Lyte A w momencie użycia. Strzykawki mogą być przechowywane w temperaturze 22, 4 lub -20 ºC; Niższe temperatury mogą zapewnić większą stabilność okresu przydatności do spożycia7.</li>
</ol>

<ol><li>Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+loaded+microbubble+design+for+ultrasound+triggered+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery.</a> Soft Matter. 5 (11), 2161-2170 (2009).</li>
<li>Ren, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ultrasound+Microbubble+Carrying+Gene+and+Tat+Peptide%3A+Preparation+and+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Academic+Radiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization.</a> Academic Radiology. 16 (12), 1457-1465 (2009).</li>
<li>Tinkov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubbles+as+Ultrasound+Triggered+Drug+Carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (6), 1935-1961 (2009).</li>
<li>Hernot, S., Klibanov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubbles+in+ultrasound-triggered+drug+and+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (10), 1153-1166 (2008).</li>
<li>Lanza, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+site-targeted+ultrasonic+contrast+agent+with+broad+biomedical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application.</a> Circulation. 94 (12), 3334-3340 (1996).</li>
<li>Cavalli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+dextran+nanobubbles+for+oxygen+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery.</a> International Journal of Pharmaceutics. 381 (2), 160-165 (2009).</li>
<li>Kheir, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+Gas-Filled+Microparticles+Provide+Intravenous+Oxygen+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery.</a> Science Translational Medicine. 4 (140), (2012).</li>
<li>Lindner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+rheology+of+definity+microbubbles+after+intra-arterial+and+intravenous+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Echocardiography%22%5BJournal%5D)">Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 15 (5), 396-403 (2002).</li>
<li>Zhao, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+characterization+and+in+vivo+observation+of+phospholipid-based+gas-filled+microbubbles+containing+hirudin%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (9), 1237-1243 (2005).</li>
<li>Seo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Assembly+of+Monodisperse%2C+Nanoparticle-Incorporated+Perfluorocarbon+Microbubbles+for+Medical+Imaging+and+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy.</a> Langmuir. 26 (17), 13855-13860 (2010).</li>
<li>Wan, J. D., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coated+Gas+Bubbles+for+the+Continuous+Synthesis+of+Hollow+Inorganic+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles.</a> Langmuir. 28 (1), 37-41 (2012).</li>
<li>Duncanson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monodisperse+Gas-Filled+Microparticles+from+Reactions+in+Double+Emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions.</a> Langmuir. 28 (17), 6742-6745 (2012).</li>
<li>Kendall, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaled-Up+Production+of+Monodisperse%2C+Dual+Layer+Microbubbles+Using+Multi-Array+Microfluidic+Module+for+Medical+Imaging+and+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Bubble+Science+Engineering+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 4 (1), 12-20 (2012).</li>
<li>Szijjarto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Perfluorocarbon+Gases+on+the+Size+and+Stability+Characteristics+of+Phospholipid-Coated+Microbubbles%3A+Osmotic+Effect+versus+Interfacial+Film+Stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization.</a> Langmuir. 28 (2), 1182-1189 (2012).</li>
<li>Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid-Coated+Gas+Bubble+Engineering%3A+Key+Parameters+for+Size+and+Stability+Control%2C+as+Determined+by+an+Acoustical+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method.</a> Langmuir. 26 (3), 1649-1655 (2010).</li>
<li>Swanson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid-Stabilized+Microbubble+Foam+for+Injectable+Oxygen+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery.</a> Langmuir. 26 (20), 15726-15729 (2010).</li>
<li>Kvåle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+fractionation+of+gas-filled+microspheres+by+flotation%5BTitle%5D)+AND+%22Separations+Technology%22%5BJournal%5D)">Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation.</a> Separations Technology. 6 (4), 219-226 (1996).</li>
<li>Dressaire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+polygonal+nanopatterning+of+stable+microbubbles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles.</a> Science. 320 (5880), 1198-1201 (2008).</li>
<li>Kheir, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+Manufacture+of+Concentrated+Oxygen+Gas-Filled+Microparticles+for+Intravenous+Oxygen+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery.</a> Advanced Healthcare Materials. , (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Najważniejsze kroki do stworzenia skoncentrowanych, wysoce natlenionych LOM obejmują: 1) zapewnienie, że przestrzeń nad głową w HCT pozostaje w pełni natleniona; 2) zapewnienie, że czystość lipidowych substancji pomocniczych jest optymalna (w tym warunki przechowywania i stosowania produktów GMP); 3) upewnienie się, że sproszkowane lipidy całkowicie wymieszają się z fazą wodną przed zalaniem systemu; oraz 4) zwrócenie szczególnej uwagi na wzrost frakcji gazowej w HCT w celu zapewnienia, aby udział objętościowy gazu nie p...

Mikropęcherzyki złożone z białek, polimerów i lipidów zostały opracowane jako wektory do dostarczania leków, terapii genowej i ultradźwiękowych środków kontrastowych1-5. Ponieważ te zastosowania terapeutyczne wymagają wewnątrznaczyniowego utrzymywania się mikropęcherzyków, takie mikropęcherzyki są zwykle wypełnione obojętnymi gazami o dużej masie cząsteczkowej, takimi jak perfluorowęglowodory6, które mają niską rozpuszczalność we krwi i stabilizują pęcherzyk3,4.
Ostatnio, mikropęcherzyki tlenu na bazie lipidów (LOM) zostały zaprojektowane tak, aby dostarczać terapeutyczne dawki tlenu, które mogą zachować dostarczanie tlenu przez narządy końcowe i zapobiec niestabilności hemodynamicznej w okresach niedrożności dróg oddechowych lub hipoksemii7. Emulsje przeznaczone do dożylnego podawania gazów wymagają innych cech konstrukcyjnych niż te stosowane do ultrasonograficznych środków kontrastowych lub celowanego podawania leków. Po pierwsze, ponieważ organizm zużywa duże ilości tlenu gazowego (~200 ml/min), LOM muszą być produkowane i wstrzykiwane na dużą skalę. Wymaga to, aby proces produkcyjny był wydajny. Po drugie, proces produkcyjny powinien odbywać się w obiegu zamkniętym, aby uniknąć zanieczyszczenia azotem poprzez wystawienie LOM (które powinny być wypełnione 100% tlenem) na działanie otaczającego powietrza. Po trzecie, ponieważ celem LOM jest dożylne dostarczanie gazu, frakcja gazowa LOM powinna być zmaksymalizowana, biorąc pod uwagę ograniczenia narzucone przez lepkość emulsji7. Wreszcie, podobnie jak w przypadku każdego wstrzykiwania dożylnego, precyzyjna kontrola rozkładu wielkości cząstek jest niezbędna do uniknięcia niedrożności mikronaczyniowej8.
Istnieje kilka sprawdzonych metod produkcji mikropęcherzyków. Sonikacja wykorzystuje ultradźwięki o wysokiej intensywności i niskiej częstotliwości stosowane do granicy faz powietrze-płyn emulsji, która zawiera środek powierzchniowo czynny, taki jak amfipatyczny fosfolipid, w obecności przestrzeni gazowej w celu wytworzenia mikropęcherzyków7,9. Proces ten można kontrolować poprzez zmianę częstotliwości ultradźwięków, mocy i czasu trwania impulsu, a uzyskany rozkład wielkości można dostosować do produkcji mikropęcherzyków o określonym rozkładzie wielkości, chociaż sonikacja jest rzadko stosowana w produkcji mikropęcherzyków stosowanych klinicznie. Amalgamacja to intensywne mechaniczne mieszanie środka powierzchniowo czynnego i gazu w układzie zamkniętym, który jest również trudny do skalowania w celu dostosowania do dużych objętości2. Mikrofluidyka oparta na kropelkach umożliwia precyzyjną kontrolę rozkładu wielkości mikropęcherzyków10-13. Chociaż tradycyjnie trudno jest zwiększyć skalę, opisano wielokanałowe, szybkie mikroprzepływy, które zwiększają wydajność produkcji mikropęcherzyków13. Mikropęcherzyki wytwarzane przy użyciu którejkolwiek z tych metod mogą wymagać procesów rozdrabniania po produkcji, takich jak frakcjonowanie odśrodkowe14,15 i flotacja mikropęcherzyków16,17.
Inną sprawdzoną metodą wytwarzania wysoce stabilnych mikropęcherzyków jest homogenizacjaścinająca 6, która może skutkować stabilizującym sześciokątnym wzorem fosfolipidowym na powierzchni mikropęcherzyków18. Opierając się na tej koncepcji, opisujemy zastosowanie homogenizatora wysokotnącego w linii w celu stworzenia samoorganizujących się LOM19. W tym procesie homogenizator wykorzystuje szybko obracające się ostrza w bliskiej odległości od sit emultora o drobnych oczkach, tworząc wysokie mechaniczne i hydrauliczne ścinanie w celu tworzenia mikropęcherzyków. Seryjne zagęszczanie emulsji lipidowej przez ten system daje coraz bardziej skoncentrowaną frakcję gazową, która może być jeszcze bardziej zagęszczona przez wirowanie.

<table><tbody><tr><td>1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DSPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>770365</td><td>Produkt alternatywny: nie-GMP z Ameryki Północnej (Coatsome MC-8080)</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C75209</td><td></td></tr><tr><td>Plasma-Lyte A</td><td>VWR</td><td>80089-818</td><td>Alternatywnie można użyć</td></tr><tr><td>naczynia zbiorczego</td> NaCl Glass <td>Specialty Glass, Inc.</td><td>Kontakt niestandardowy</td><td>: Pam Zurbrick - 281-595-2210</td></tr><tr><td>Monitor składu gazów (tlenu)</td><td>Precyzyjny</td><td>PM5900L</td><td></td></tr><tr><td>medyczny Pompa rolkowa Sarns 8000</td><td>Calicut Medical</td><td>16407</td><td>Część modułowego systemu perfuzyjnego</td></tr><tr><td>Wymiennik ciepła BIOtherm Laboratoryjny</td> mieszalnik liniowy <td>Medtronic</td><td>ECMOtherm-II</td><td></td></tr><tr><td>Verso</td><td>Silverson Machines, Inc</td><td>TH-IL-102-VERSO</td><td>Użyj wielostopniowych głowic roboczych i przedłużenia front-end z</td></tr><tr><td>trójnikiem trójnika do portu wlotowego Silverson Verso</td><td>Innowacje</td><td>procesowe Kontakt niestandardowy</td><td>: Brian Leavitt - 508-423-2266</td></tr><tr><td>Mikser laboratoryjny L5M-A</td><td>Silverson Machines, Inc</td><td>NC0136483</td><td>Użyj sitka emulsora siatkowego (drobnego)</td></tr><tr><td>Kleszcze zębate Rochester-Ochsner</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-18</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 140 ml</td><td>Kendall Healthcare Monoject</td><td>8881114030</td><td>Upewnij się, że jest blokada luer.</td></tr><tr><td>IX71 Mikroskop światła odwróconego</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Kamera mikroskopowa Retiga-2000R</td><td>QImaging</td><td>RET-2000R-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>Accusizer 780A Autodilution</td><td>PSS-NICOMP Systemy wymiarowania cząstek</td><td>Poza produkcją</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja skoncentrowanych, mikropęcherzykowych emulsji tlenowych na bazie lipidów metodą homogenizacji przy wysokim ścinaniu i stężeniu seryjnym

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Mikropęcherzyki wypełnione gazem zostały opracowane jako ultradźwiękowe środki kontrastowe i dostarczające leki. Mikropęcherzyki mogą być wytwarzane przez przetwarzanie środków powierzchniowo czynnych za pomocą sonikacji, mieszania mechanicznego, urządzeń mikroprzepływowych lub homogenizacji. Ostatnio mikropęcherzyki tlenu na bazie lipidów (LOM) zostały zaprojektowane do dożylnego dostarczania tlenu w nagłych wypadkach medycznych, odwracając zagrażającą życiu hipoksemię i zapobiegając późniejszemu uszkodzeniu narządów, zatrzymaniu akcji serca i śmierci. Przedstawiono metody zwiększania skali produkcji wysoko natlenionych mikropęcherzyków z wykorzystaniem homogenizatora szybkotnącego w pętli zamkniętej. W wyniku tego procesu można wyprodukować 2 litry skoncentrowanych LOM (90% objętości) w ciągu 90 minut. Otrzymane pęcherzyki mają średnią średnicę ~2 μm i profil reologiczny zgodny z profilem krwi po rozcieńczeniu do 60% objętości. Technika ta wytwarza LOM o dużej pojemności i wysokiej czystości tlenu, co sugeruje, że technika ta może być przydatna w laboratoriach badawczych zajmujących się badaniami translacyjnymi.

Homogenizacja o wysokim ścinaniu umożliwia wydajną (tj. w ciągu jednego popołudnia) produkcję wystarczającej ilości LOM do badania na zwierzętach i nie wymaga specjalistycznej wiedzy technicznej. Po osiągnięciu biegłości w tej metodzie, w ciągu 90 min można wytworzyć do 2 L skoncentrowanych LOM.
Rozmiar i morfologię mikropęcherzyków oceniono za pomocą mikroskopii świetlnej oraz metody przesłaniania światła. Podczas wizualizacji 10 μl próbki LOMs odnotowano obecność sferycznych LOMs, a...

Opisujemy metody produkcji dużych ilości mikropęcherzyków tlenu na bazie lipidów (LOM) przeznaczonych do dożylnego dostarczania tlenu za pomocą homogenizacji przy wysokim ścinaniu i seryjnym zagęszczeniu.

Produkcja skoncentrowanych, mikropęcherzykowych emulsji tlenowych na bazie lipidów metodą homogenizacji przy wysokim ścinaniu i stężeniu seryjnym

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie dużej objętości samomontujących się, lipidowych mikropęcherzyków tlenu (OMS) do dożylnego podawania tlenu. Jest to realizowane przy użyciu homogenizatora o wysokich siłach ścinających oraz szczelnego zbiornika w celu produkcji i seryjnego zagęszczania OMS. Drugim krokiem jest wykorzystanie zmodyfikowanych strzykawek do ekstruzji emulsji LOM zawierającej 70% objętościowo tlenu.Następnie emulsję zagęszcza się poprzez wirowanie, aby uzyskać piankę tlenową o objętościowej zawartości tlenu wynoszącej 90%. Ostatnim krokiem jest kontrola jakości polegająca na obliczeniu objętościowego procentu tlenu oraz ocenie rozkładu wielkości cząstek z wykorzystaniem technologii rozpraszania światła. W rezultacie homogenizacja wysokoprężna pozwala uzyskać dwa litry OMS zawierającego 90% tlenu objętościowo.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami wytwarzania, takimi jak sonikacja i amalgamacja, jest to, że homogenizacja pozwala na produkcję samomontujących się mikropęcherzyków w ilościach rzędu litrów, co jest objętością niezbędną do badań nad terapeutycznym dostarczaniem tlenu u dużych zwierząt. Jednym z zastosowań tej techniki jest leczenie pacjentów z ciężką hypoksemią, ponieważ wypełnione gazowym tlenem mikropęcherzyki przenoszą tlen do deoksyhemoglobiny w ciągu kilku sekund i przenoszą trzykrotnie większą zawartość tlenu niż krew Visual. Demonstracja tej metody jest istotna ze względu na głębokość głowicy homogenizatora.Utrzymanie środowiska czysto utleniającego oraz odróżnienie skoncentrowanego LMS od fazy wodnej może być trudne do oszacowania. System do produkcji lipidowych mikropęcherzyków tlenu lub OMS składa się ze zbiornika magazynującego i zagęszczającego (HCT) wyposażonego w mieszałkę jednostopniową, liniowego homogenizatora wysokociśnieniowego, pompy rolkowej do przemieszczania cieczy między HCT a homogenizatorem oraz wymiennika ciepła.Aby rozpocząć konfigurację systemu, umieść wysterylizowany szklany zbiornik o szerokim wlewie i pojemności czterech litrów, wyposażony w dwa porty dolne i trzy porty boczne, pod mieszadłem jednostopniowym. Jeden z portów dolnych (port nr 1 HCT) podłącz do sterylnego przezroczystego wężyka o średnicy wewnętrznej 3/8 cala i długości około 10 cali, wyposażonego na końcówce w trójdrożny kurek do pobierania skoncentrowanej emulsji. Następnie drugi port dolny (port nr 2) podłącz do sterylnego wężyka o średnicy wewnętrznej 3/8 cala i długości około 36 cali. Przewieź ten wężyk przez pompę perystaltyczną.Wlot homogenizatora wysokoprzepływowego jest wyposażony w trójnik z dwoma portami. Podłącz cewkę z portu numer dwa przez pompę perkystaltyczną do bocznego portu trójnika. Drugi port podłącz do butli z tlenem, korzystając z przepływomierza tlenu o niskim przepływie.Podłącz port wylotowy homogenizatora wysokoprzepływowego do portu wlotowego przelotowego wymiennika ciepła utrzymywanego w temperaturze 4 °C. Podłącz port wylotowy wymiennika ciepła do portu powrotnego HCT, tworząc system w obiegu zamkniętym. Podłącz butlę z tlenem za pomocą przepływomierza do portu numer cztery HCT.Na koniec podłącz monitor składu gazów, otwarty do atmosfery, do górnego portu HCT. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść 20 gramów GMP one two DYS steer oil, SN glycerol three PHOSPHOCHOLINE lub DSPC oraz 10 gramów cholesterolu w podstawie HCT. Dodaj jeden litr plasma light A do HCT i mieszaj ręcznie przez jedną minutę, włączając jak najwięcej lipidów w fazę wodną.Zanurz jednostopniowy mieszalnik w fazie wodnej, upewniając się, że cała głowica mieszalnika jest przykryta fazą wodną. Aby zapobiec zanieczyszczeniu przestrzeni nad cieczą powietrzem z otoczenia, należy użyć gumowych uszczelek lub taśmy, aby zapewnić szczelność gazową górnej części HCT i upewnić się, że żadne boczne porty nie są otwarte. Włącz źródło gazu podłączone do portu numer cztery i poczekaj, aż frakcja tlenu w przestrzeni nad cieczą HCT przekroczy 95%. Za pomocą jednostopniowego mieszalnika mieszaj emulsję prekursorową przez pięć minut. Przy 5,000 RPM otrzymana mieszanina powinna mieć bladobiały kolor i nie zawierać widocznych grudek lipidów.Po zmieszaniu niewykorzystana mieszanina lipidowo-wodna może być przechowywana w temperaturze 4°C do 30 dni przed użyciem. Należy zapowietrzyć cały system zamkniętego obiegu za pomocą emulsji prekursorowej, uruchamiając pompę perystaltyczną z przepływem 1,3 litra na minutę (LPM). Po zapowietrzeniu systemu należy pozostawić pompę włączoną przy 1,3 LPM, aby rozpocząć wytwarzanie LO.Ustaw liniowy homogenizator wysokoprzepływowy na 7 500 RPM. Następnie niezwłocznie uruchom przepływ tlenu do wlotowej części homogenizatora z prędkością 0,5 LPM. Pozostaw jednostopniowy mieszadło w HCT włączone przy 3 500 RPM.Oms tworzą się na styku łopatek wirnika i sit emulsyjnych w homogenizatorze przepływowym. W ciągu pierwszych kilku minut ciecz powinna stać się widocznie bardziej lepka. Uruchom system na 15 minut, a następnie wyłącz homogenizator o wysokim ścinaniu oraz dopływ tlenu do niego.Działanie to ogranicza separację faz i zapewnia względną jednorodność produktu w obrębie HCT. Należy zauważyć, że objętość emulsji wypełnionej gazem powinna zwiększyć się około dwu- do trzykrotnie podczas fazy seryjnej koncentracji. Strzykawki Luer-Lock o pojemności 140 ml, służące do zbierania wytworzonego OMS, zostały wcześniej zmodyfikowane poprzez nabranie do strzykawki 100 ml powietrza, a następnie odcięcie nadmiaru tłoka i obudowy strzykawki powyżej oznaczenia 140 ml.Do kurka odcinającego przymocowanego do portu podstawowego nr 1 naczynia zbiorczego podłącz sterylną zmodyfikowaną strzykawkę. Używając pęsety ząbkowanej, obniż tłok i pobierz 100 ml płynu, a następnie szczelnie zamknij strzykawkę zaślepką. Powtarzaj czynność do momentu usunięcia całego płynu. Wirowarką w chłodni odwiruj strzykawki z końcem zamkniętym skierowanym w dół przy 225 ×g przez 10 minut. Po wirowaniu widoczne będą trzy warstwy materiału; usuń i odrzuć dolną warstwę nadmiarowej, mętnej fazy wodnej.Druga warstwa jest jasnobiała i zawiera skoncentrowane oms. Przenieś skoncentrowaną pianę do nieprzepuszczalnej dla gazów strzykawki szklanej, używając trójdrożnego zaworu, aby zapobiec zanieczyszczeniu gazami z otoczenia. Usuń ostatnią warstwę, która zawiera wolny tlen pochodzący z pękniętych oms.Jakość piany można ocenić, obliczając stężenie gazu w następujący sposób. Piana wysokiej jakości osiągnie stężenie gazu większe lub równe 90% objętości; jako drugą kontrolę jakości wielkość mikropęcherzyków określa się metodą optycznego rozpraszania światła, aby sprawdzić, czy rozmiar cząsteczek mieści się w oczekiwanym zakresie. Należy zauważyć, że zmiana czasu homogenizacji lub składu formulacji może wpłynąć na rozmiar pęcherzyków; szklane strzykawki zawierające stężone oms należy szczelnie zamknąć.Przy zastosowaniu złączek typu Luer-Lock strzykawki można przechowywać w temperaturze 22°C, 4°C lub -20°C. Niższe temperatury mogą zapewnić zwiększoną stabilność okresu trwałości. Stosując ten protokół, do 2 L stężonego OMS można przygotować w ciągu 90 minut.Wizualizacja 10 µL próbki OMS za pomocą mikroskopii świetlnej wykazała obecność sferycznych OMS oraz względną ilość resztek lipidowych. Gdy tę samą próbkę OMS oceniono za pomocą rozpraszania światła, średnica cząstek wynosiła 2,624 ± 0,332 µm. Ponad 90% OMS miało średnicę poniżej 10 µm, a populacja była polydyspersyjna.Lepkość emulsji była silnie zależna od frakcji gazu, a tym samym od stężenia mikropęcherzyków. Alikwoty emulsji LOM o objętości 2 ml przy zawartości gazu 60, 70 i 90% obj. badano za pomocą pomiaru przepływu w stanie ustalonym z wykorzystaniem płyt równoległych o średnicy 40 mm.Przy zmianie naprężenia od 0,1 do 1000 past gass OMS zawierających 60% objętości gazu, geometria wykazała profil radiologiczny podobny do ludzkiej krwi. Zawartość tlenu w OMS badano poprzez dodawanie różnych objętości tlenu zawartego w 60% objętości OMS do alikwotów odgazowanej krwi ludzkiej o znanym deficycie tlenu. Zależność między objętością tlenu dodanego w OMS a objętościowym wzrostem zawartości tlenu we krwi wynosiła 1,053 plus lub minus 0,03025.Sugeruje to, że przetestowane OMS zawierały niemal 100% tlenu, wykazywały niewielką liczbę uwięzionych pęcherzyków gazu i skutecznie przekazywały cały ładunek tlenu do ludzkiej krwi in vitro. Po opanowaniu ta technika może być wykorzystana do wytworzenia dwóch litrów LMS w 90 minut, pod warunkiem że zostanie przeprowadzona prawidłowo i wydajnie. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o stałej kontroli wizualnej gromadzonego OMS oraz o przeprowadzeniu kontroli jakości po skoncentrowaniu piany LOM. Po zastosowaniu tej procedury produkcyjnej OMS mogą być wykorzystywane do wielkoskalowych wlewów dożylnych i dostarczania gazów terapeutycznych.

manufacture-concentrated-lipid-based-oxygen-microbubble-emulsions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wytwarzanie skoncentrowanych emulsji mikrobąbelek tlenu na bazie lipidów przez wysokoprężne homogenizowanie i szereg koncentracji

Łącząc generowanie monodyspersyjnych kropli z inercyjnym porządkowaniem komórek i cząsteczek, opisujemy metodę enkapsulacji pożądanej liczby komórek lub cząsteczek w pojedynczej kropli z częstotliwością rzędu kHz. Wykazujemy wydajność dwukrotnie przekraczającą wydajność enkapsulacji nieuporządkowanej w przypadku kropli z jedną lub dwiema cząsteczkami.

Wysokoprzepustowa mikroenkapsulacja pojedynczych komórek i wielu komórek

Niniejszy protokół opisuje metodę ekstruzji służącą do przygotowania pęcherzyków lipidowych o rozmiarach submikronowych i wysokim stopniu jednorodności. Metoda ta wykorzystuje system z kontrolą ciśnienia i regulowanym przepływem azotu do przygotowania liposomów. W opracowaniu przedstawiono przygotowanie lipidów1,2, ekstruzję liposomów oraz charakterystykę ich rozmiaru.

Metoda ekstruzji z kontrolowanym stałym ciśnieniem do przygotowania nano-rozmiarowych pęcherzyków lipidowych

Mikroprzepływowe natryskiwanie dwuwarstwy lipidowej na granicy kropelek zapewnia niezawodny sposób generowania pęcherzyków z kontrolą nad asymetrią błony, włączeniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiału. Technika ta może być stosowana do badania różnych systemów biologicznych, w których pożądane są biomolekuły podzielone na przedziały.

Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Mikroprzepływowe wytwarzanie podwójnych emulsji zazwyczaj obejmuje urządzenia o wzorzystej zwilżalności lub specjalnie wykonane elementy szklane. W tym miejscu opisujemy wytwarzanie i testowanie generatora podwójnej emulsji z polidimetylosiloksanu (PDMS), który nie wymaga obróbki powierzchni ani skomplikowanych procesów produkcyjnych i jest w stanie wytwarzać podwójne emulsje do 14 μm.

Podwójne wytwarzanie emulsji przy użyciu współosiowego urządzenia do ustawiania ostrości przepływu z polidimetylosiloksanu (PDMS)

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

Protokół przedstawia zoptymalizowane parametry przygotowania termoczułych liposomów za pomocą urządzenia mikrofluidycznego do mikromiksera w jodełkę. Umożliwia to również kokapsułkowanie doksorubicyny i zieleni indocyjaninowej do liposomów oraz fototermiczne uwalnianie doksorubicyny w celu kontrolowanego/wyzwalanego uwalniania leku.

Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy

Ten protokół opisuje metodę generowania dużych ilości mikropęcherzyków dekafluorobutanu zamkniętych w lipidach za pomocą sonikacji końcówki sondy, a następnie kondensacji ich w nanokropelki z przesunięciem fazowym za pomocą wytłaczania wysokociśnieniowego i filtracji mechanicznej.

Produkcja nanokropelek dekafluorobutanu z filtrem membranowym z przesunięciem fazowym z wstępnie uformowanych mikropęcherzyków

Obecny protokół opisuje montaż liposomów wspomagany oktanolem (OLA), technikę mikroprzepływową do generowania biokompatybilnych liposomów. OLA wytwarza monorozproszone liposomy o rozmiarach mikronów z wydajną enkapsulacją, co pozwala na natychmiastowe eksperymentowanie na chipie. Przewiduje się, że protokół ten będzie szczególnie przydatny w biologii syntetycznej i badaniach nad komórkami syntetycznymi.

Wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii

Ten protokół opisuje wytwarzanie mikropęcherzyków lipidowych i kompatybilną metodę radioznakowania mikropęcherzyków w jednym garnku z nieoczyszczającą &gt;95% skutecznością znakowania, która zachowuje właściwości fizykochemiczne mikropęcherzyków. Metoda ta jest skuteczna w przypadku różnych preparatów mikropęcherzyków lipidowych i może być dostosowana do generowania mikropęcherzyków radioaktywnych i/lub fluorescencyjnych.

Wytwarzanie i znakowanie mikropęcherzyków za pomocą znaczników fluorescencyjnych i radioaktywnych

Celowana destrukcja mikropęcherzyków za pomocą ultradźwięków (UTMD) może być wykorzystywana do ukierunkowanego, miejscowego dostarczania cząsteczek bioaktywnych, w tym genów terapeutycznych, do organów docelowych dostępnych dla fal ultradźwiękowych, takich jak serce i wątroba1-6.

Wprowadzenie do techniki ukierunkowanego niszczenia mikropęcherzyków za pomocą ultradźwięków

Poznaj metodę produkcji mikropęcherzyków tlenowych na bazie lipidów z wykorzystaniem homogenizacji przy wysokim ścinaniu i stężenia seryjnego. Technika ta umożliwia wytworzenie dwóch litrów emulsji z 90% zawartością tlenu do zastosowań wewnątrzżylnych.

Produkcja skoncentrowanych, mikropęcherzykowych emulsji tlenowych na bazie lipidów metodą homogenizacji przy wysokim ścinaniu i stężeniu seryjnym (Wideo) | JoVE Journal

Produkcja skoncentrowanych, mikropęcherzykowych emulsji tlenowych na bazie lipidów metodą homogenizacji przy wysokim ścinaniu i stężeniu seryjnym

Przeglądaj więcej filmów