Produkcja skoncentrowanych, mikropęcherzykowych emulsji tlenowych na bazie lipidów metodą homogenizacji przy wysokim ścinaniu i stężeniu seryjnym

Ogólnym celem tej procedury jest wyprodukowanie dużej ilości samoorganizującego się, opartego na lipidach tlenu, mikropęcherzyków lub OMS do dożylnego dostarczania tlenu. Osiąga się to za pomocą homogenizatora o wysokim stopniu ścinania i gazoszczelnego zbiornika do produkcji i seryjnego zagęszczania oms. Drugim krokiem jest użycie zmodyfikowanych strzykawek do wytłaczania emulsji LOM zawierającej 70 procent objętości tlenu.

Następnie emulsję zagęszcza się przez odwirowanie, aby uzyskać pianę tlenową o 90 procentach objętościowych. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie kontroli jakości poprzez obliczenie procentowej objętości tlenu i ocenę rozkładu wielkości cząstek przy użyciu technologii rozpraszania światła. Ostatecznie homogenizacja przy wysokim ścinaniu wytwarza dwa litry OMS zawierające 90% objętości tlenu.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami produkcji, takimi jak sonikacja i amalgamacja, jest to, że homogenizacja wytwarza samoorganizujące się mikropęcherzyki rzędu litrów, objętość niezbędną do testowania na dużych zwierzętach terapeutycznego dostarczania tlenu. Jednym z zastosowań tej techniki jest leczenie pacjentów z wysoką hipoksemią, ponieważ mikropęcherzyki wypełnione gazem tlenowym przenoszą tlen do deoksyhemoglobiny w ciągu kilku sekund i przenoszą trzykrotnie większą zawartość tlenu niż krew Wizualny. Demonstracja tej metody jest ważna ze względu na głębokość głowicy homogenizatora.

Utrzymanie czysto utlenionego środowiska i rozróżnienie skoncentrowanego LMS w porównaniu z fazą wodną może być trudne do docenienia. System dla produkcji. Tlen na bazie lipidów, mikropęcherzyki lub OMS składa się ze zbiornika do przechowywania i zagęszczania lub HCT wyposażonego w mieszalnik jednostopniowy, homogenizatora szybkotnącego w linii, pompy rolkowej do przemieszczania płynu między HCT a homogenizatorem oraz wymiennika ciepła.

Aby rozpocząć konfigurację systemu, umieść wysterylizowane czterolitrowe szklane naczynie zbiorcze z szerokimi otworami, wyposażone w dwa porty bazowe i trzy porty boczne, pod jednostopniowym mikserem dopasuj jeden z portów bazowych portu HCT numer jeden ze sterylnymi przezroczystymi rurkami o średnicy wewnętrznej trzech ósmych cali, o długości około 10 cali, wyposażonymi w trójdrożny kurek odcinający na końcówce do zbierania skoncentrowanej emulsji. Następnie zamontuj drugi port podstawowy, port numer dwa, ze sterylną rurką o średnicy wewnętrznej trzech ósmych cali i długości około 36 cali. Przeprowadź tę rurkę przez pompę rolkową.

Wlot homogenizatora o wysokim ścinaniu jest wyposażony w trójnik, który zawiera dwa porty. Podłącz rurkę z portu numer dwa przez pompę rolkową i podłącz do bocznego portu trójnika. Podłącz drugi port do butli z tlenem za pomocą przepływomierza tlenu o niskim przepływie.

Podłączyć port wylotowy homogenizatora szybkotnącego do króćca wlotowego liniowego wymiennika ciepła utrzymywanego w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podłącz port wylotowy wymiennika ciepła do portu powrotnego HCT, tworząc system zamkniętej pętli. Podłącz butlę tlenu za pomocą przepływomierza do HCT przez port numer cztery.

Na koniec podłącz monitor składu gazu, który jest otwarty na atmosferę, do górnego portu HCT. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść 20 gramów GMP jeden dwa DYS olej sterowy, SN glicerol, trzy FOSFOCHOLINA lub DSPC i 10 gramów cholesterolu w podstawie HCT. Dodaj jeden litr światła plazmowego A do HCT i mieszaj ręcznie przez jedną minutę, integrując jak najwięcej lipidów z fazą wodną.

Opuść mieszalnik jednostopniowy do fazy wodnej, upewniając się, że cała głowica mieszalnika jest pokryta fazą wodną Aby zapobiec zanieczyszczeniu przestrzeni nad wodą z otoczenia, użyj gumowych uszczelek lub taśmy, aby upewnić się, że górna część HCT jest gazoszczelna i nie ma otwartych bocznych portów. Włącz źródło gazu podłączone do portu numer cztery i poczekaj, aż frakcja tlenowa HCT Headspace osiągnie więcej niż 95%Używając jednostopniowej mieszanki mieszalnika, emulsji prekursora przez pięć minut. Przy 5 000 obr./min powstała mieszanina powinna wydawać się bladobiała i nie zawierać widocznych grudek lipidów.

Po wymieszaniu, niewykorzystana mieszanina wody lipidowej może być przechowywana w temperaturze czterech stopni Celsjusza do 30 dni przed spożyciem. Cały system w pętli zamkniętej należy zalać emulsją prekursorową, włączając pompę rolkową z prędkością 1,3 litra na minutę lub l/min. Po zalaniu systemu utrzymuj pompę włączoną na poziomie 1.3 l/min, aby rozpocząć produkcję LO.

Włącz wbudowany homogenizator wysokiego ścinania na 7 500 obr./min. Natychmiast po tym należy włączyć dopływ tlenu do części wlotowej homogenizatora o natężeniu 0,5 l/min. Utrzymuj jednostopniowy mikser w HCT włączony przy 3 500 obr./min.

Oms powstają na styku łopat wirnika i sit emulsyjnych w homogenizatorze liniowym. W ciągu pierwszych kilku minut płyn powinien stać się widocznie bardziej lepki. Uruchom system na 15 minut, a następnie wyłącz homogenizator wysokiego ciśnienia i dopływ do niego tlenu.

Ogranicza to separację faz i utrzymuje produkt w miarę jednorodny w HCT. Należy pamiętać, że objętość emulsji wypełnionej gazem powinna wzrosnąć około dwu- lub trzykrotnie w fazie zagęszczania szeregowego. 140-mililitrowe strzykawki blokujące przynętę do zbierania wyprodukowanego OMS zostały wcześniej zmodyfikowane poprzez pobranie 100 mililitrów powietrza do strzykawki, a następnie odpiłowanie nadmiaru tłoka i materiału strzykawki powyżej znaku 140 mililitrów.

Podłącz sterylną zmodyfikowaną strzykawkę do kurka odcinającego przymocowanego do portu podstawowego numer jeden na naczyniu zbiorczym, użyj kleszczyków zębatych, aby upuścić tłok i pobrać 100 mililitrów płynu, szczelnie zakręć strzykawkę, powtarzaj, aż cały płyn zostanie usunięty. Odwirować strzykawki z zakorkowanym końcem skierowanym w dół w chłodzonym wiadrze, wirować pod ciśnieniem 225 razy G przez 10 minut. Po odwirowaniu widoczne będą trzy warstwy materiału, wydalenie i odrzucenie dolnej warstwy nadmiaru mętnej fazy wodnej.

Druga warstwa jest jasnobiała i zawiera skoncentrowany oms. Przenieść skoncentrowaną pianę do nieprzepuszczalnej dla gazów szklanej strzykawki za pomocą trójdrożnego kurka zatrzymującego, aby zapobiec zanieczyszczeniu gazem z otoczenia. Odrzuć ostatnią warstwę, która zawiera wolny tlen gazowy z pękniętych omów.

Jakość piany można ocenić, obliczając stężenie gazu w następujący sposób. Pianka wysokiej jakości osiągnie stężenie gazu większe lub równe 90 procent objętości jako druga kontrola jakości mikropęcherzyków za pomocą rozpraszania światła optycznego w celu określenia, czy wielkość cząstek mieści się w oczekiwanym zakresie. Należy zauważyć, że zmiana czasu homogenizacji lub preparatu może zmienić wielkość pęcherzyków, szczelnie zamknięte szklane strzykawki zawierające skoncentrowane oms.

Dzięki mocowaniu z blokadą przynęty strzykawki mogą być przechowywane w temperaturze 22 stopni Celsjusza, czterech stopni Celsjusza lub minus 20 stopni Celsjusza. Niższe temperatury mogą zapewnić większą stabilność okresu przydatności do spożycia. Korzystając z tego protokołu, można wyprodukować do dwóch litrów skoncentrowanego OMS w ciągu 90 minut.

Wizualizacja 10-mikrolitrowej próbki OMS za pomocą mikroskopii świetlnej ujawniła sferyczny OMS, a także względną umiejscowienie resztek lipidowych. Gdy ta sama próbka OMS została oceniona za pomocą rozproszenia optycznego, średnia średnica cząstek wynosiła 2,624 plus minus 0,332 mikrometra. Ponad 90% OMS miało średnicę mniejszą niż 10 mikrometrów, a populacja była polidyspersyjna.

Lepkość emulsji była silnie zależna od frakcji gazowej, a tym samym od stężenia mikropęcherzyków. Dwie mililitrowe porcje emulsji LOM o stężeniach 60, 70 i 90. Procentową zawartość objętościową gazu badano za pomocą przemiatania przepływu w stanie ustalonym przy użyciu 40-milimetrowej płytki równoległej.

Geometria jako naprężenie zmieniała się od 0,1 do 1000 przy gazie OMS zawierającym 60 procent objętości gazu wykazywał profil radiologiczny podobny do ludzkiej krwi. Zawartość tlenu w OMS badano poprzez dodawanie różnych objętości tlenu zawartego w 60 procentach objętościowych OMS do podwielokrotności zdesaturowanej krwi ludzkiej ze znanym deficytem tlenu. Zależność między objętością tlenu dodanego w OMS a objętościowym wzrostem zawartości tlenu we krwi wynosiła 1,053 plus minus 0,03025.

Sugeruje to, że testowane OMS zawierają prawie 100% tlenu, wykazywały niewiele uwięzionych kieszeni gazowych i skutecznie przenoszą cały ładunek tlenu do ludzkiej krwi in vitro Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do wyprodukowania dwóch litrów LMS w 90 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo i wydajnie. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o zachowaniu kontroli wzrokowej gromadzącego się OMS oraz o przeprowadzaniu kontroli jakości po zagęszczeniu pianki LOM. Po tej procedurze produkcyjnej OMS może być stosowany do wstrzykiwań dożylnych na dużą skalę i dostarczania gazów terapeutycznych.