Name: Metoda wytwarzania neutrofilii płucnej przy użyciu lipopolisacharydu w aerozolu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania neutrofilii płucnej przy użyciu aerozolowego lipopolisacharydu u myszy. Technika obejmuje nebulizację LPS, pobieranie płukania oskrzelowo-pęcherzykowego oraz analizę immunohistochemiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Kerstin Thim (AstraZeneca, Lund, Szwecja), Benicie Dahlberg i Dr. Andersowi Eklundowi (Karolinska Institutet, Sztokholm, Szwecja) oraz Dr. Martinowi Stampfli (McMaster University, Hamilton, ON, Kanada) za umiejętną pomoc i fachowe porady.

Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyki ds. dobrostanu zwierząt w północnym Sztokholmie. Procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z prawem szwedzkim.
1. Generowanie aerozolu LPS
<ol>
	<li>Rozpuścić 0,5 g oczyszczonego LPS P. aeruginosa w 50 ml sterylnej soli fizjologicznej przy delikatnym mieszaniu i zweryfikować stopień rozpuszczenia. Rozcieńczyć 1 ml rozpuszczonego LPS w 9 ml sterylnej soli fizjologicznej do końcowego stężenia 1 mg/ml. Chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Odmrozić rozpuszczony LPS w ciemności w temperaturze pokojowej i dokładnie wymieszać bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>W wentylowanej komorze biologicznej klasy II włożyć czerwony wlot do nebulizatora i połączyć nebulizator z powietrzem pokojowym pod ciśnieniem za pomocą rurek dostarczonych przez producenta (należy zapoznać się ze schematem urządzeń eksperymentalnych przedstawionym na Rysunku 1). 
	UWAGA: podczas ekspozycji należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej, w tym wielorazowy respirator półmaskowy z filtrami przeciwcząsteczkowymi, gogle, rękawiczki oraz odzież ochronną.</li>
</ol>
<img alt="Schemat systemu nebulizacji z myszą w pudełku z pleksiglasu do badania ekspozycji na aerozol; przewody i filtr." src="/files/ftp_upload/51470/51470fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie urządzeń eksperymentalnych wykorzystywanych do generowania aerozolu. Wlot nebulizatora jest połączony z zasilaniem powietrznym. Wylot nebulizatora jest najpierw połączony z przepływomierzem za pomocą rurki o średnicy 15,9 mm i filtra powietrza, a zasilanie powietrzem jest ustawione na 5,0 L/m przy ciśnieniu 2 kbar. Następnie wylot zostaje połączony z pudełkiem z pleksiglasu wyposażonym w wyjmowane pokrywy i otwory o średnicy 5 mm w celu zapobiegania wzrostowi ciśnienia.
<ol start="4">
	<li>Podłączyć wylot nebulizatora do przepływomierza masowego za pomocą filtra powietrza. Podłączyć przepływomierz masowy do zasilania elektrycznego.</li>
	<li>Ustawić dopływ powietrza na 5 L/min, utrzymując ciśnienie na poziomie 1.0-2.0 bar.</li>
	<li>Zdjąć przepływomierz masowy i odłączyć dopływ powietrza.</li>
	<li>Podłączyć wylot nebulizatora do rurki o średnicy 15.9 mm, która rozdziela się i łączy z dwoma pudełkami z pleksiglasu o wymiarach 150 x 163 x 205 mm, wyposażonymi w zdejmowane pokrywy. Każde pudełko powinno posiadać otwór o średnicy 5 mm w ścianie przeciwległej do wlotu, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia.</li>
	<li>Umieścić do 5 myszy w każdym pudełku z pleksiglasu i zamknąć pokrywy.</li>
	<li>Otworzyć nebulizator i napełnić wkładnik co najmniej 4 ml LPS rozpuszczonego w sterylnym roztworze soli fizjologicznej lub samym nośnikiem (sterylna sól fizjologiczna; objętość nie powinna przekraczać 8 ml). Ponownie podłączyć wlot do dopływu powietrza.</li>
	<li>Pozostawić aerozol w zamkniętych pudełkach z pleksiglasu przez 10 min. stale monitorować zwierzęta. Upewnić się, że dopływ powietrza jest szczelnie przymocowany do wlotu nebulizatora.</li>
	<li>Odłączyć dopływ powietrza. Pozostawić zwierzęta w pudełkach z pleksiglasu przez 2 min przy zamkniętych pokrywach.</li>
	<li>Otworzyć pokrywy, aby umożliwić rozproszenie aerozolu, a następnie przenieść zwierzęta z powrotem do klatek. Jeśli zwierzęta są wilgotne, umieścić klatki na podkładce grzewczej ustawionej na niską temperaturę, aby zapobiec hipotermii.</li>
	<li>Stale monitorować zwierzęta przez pierwsze 30 min, a następnie co 2 hr przez pierwsze 6 hr. Zwierzęta powinny wykazywać prawidłowy wzorzec oddychania i aktywność w trakcie oraz po procedurze nebulizacji.</li>
</ol>
2. Płukanie pęcherzykowo-oskrzelowe (BAL)
<ol>
	<li>W punkcie końcowym eksperymentu głęboko znieczul zwierzęta izofluranem do uzyskania efektu zgodnie z zaleceniami personelu weterynaryjnego danej instytucji. Uciśnij tylną łapę, aby sprawdzić odruch wycofania i upewnić się, że głębokość znieczulenia jest wystarczająca do przeprowadzenia zabiegu chirurgicznego. Spryskaj futro zwierząt 70% etanolem.</li>
	<li>Otwórz jamę brzuszną za pomocą nożyczek i przetnij aortę, aby doprowadzić do upuszczenia krwi z organizmu zwierzęcia. Połóż kawałek tkaniny na brzuchu, aby wchłonęła krew.</li>
	<li>Po eutanazji wykonaj jedno cięcie nożyczkami w kierunku przednio-tylnym, aby odsłonić klatkę piersiową. Unieś klatkę piersiową za przednią część mostka i za pomocą nożyczek przebij przeponę w najbardziej brzusznej części, uważając, aby nie przeciąć żadnego płata płuc. Otwórz klatkę piersiową, wykonując dwa cięcia w kierunku przednio-tylnym (spotykające się poniżej żuchwy).</li>
	<li>Ostrożnie rozsuń klatkę piersiową za pomocą pęsety i przetnij tchawicę poniżej krtani.</li>
	<li>Unieś tchawicę pęsetą i usuń płuca, przecinając więzadła łączące płaty z jamą klatki piersiowej i delikatnie pociągając za tkankę tłuszczową i serce.</li>
	<li>Wprowadź rurkę polietylenową (średnica wewnętrzna: 0,58 mm; średnica zewnętrzna: 0,965 mm) do tchawicy i zabezpiecz rurkę jedwabną nicią.</li>
	<li>Powiąż nicią jedwabną płat wielodzielny (cztery płaty prawego płuca).</li>
	<li>Wprowadź igłę 23G do rurki polietylenowej i powoli wstrzyknij 250 µl lodowatego sterylnego PBS do pojedynczego płata za pomocą strzykawki 1 ml.</li>
	<li>Ostrożnie opukaj płuca 30 razy i zbierz ciecz do strzykawki. Powtórz procedurę z 200 µl PBS (z całkowitej wstrzykniętej objętości 450 µl z pojedynczego płata powinno zostać odzyskane około 300 µl PBS).</li>
	<li>Przechowuj płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) w lodzie lub natychmiast dokonaj zliczenia komórek BAL. Policz komórki za pomocą komory countingowej (hemocytometru), używając roztworu Turka do barwienia komórek11. Oblicz całkowitą liczbę komórek, mnożąc liczbę komórek przez współczynnik rozcieńczenia roztworu barwiącego oraz objętość pola zliczanego w hemocytometrze.</li>
	<li>Przygotuj różnicowe zliczenia komórek z komórek poddanych cytocentryfugacji zgodnie z opisem zamieszczonym w innym opracowaniu11.</li>
</ol>
3. Fixacja tkanki płucnej w formalinie do oceny histologicznej
<ol>
	<li>Wyjąć wielopłat i zamrozić gwałtownie na suchym lodzie. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Zamocować strzykawkę 60 ml bez tłoka na metalowym statywie. Napełnić strzykawkę 10% formaliną tak, aby jej poziom znajdował się 20 cm powyżej blatu laboratoryjnego, co zapewni stałe ciśnienie równe 20 cm słupa cieczy.</li>
	<li>Połączyć igłę 23 G zabezpieczoną w tchawicy ze strzykawką 60 ml za pomocą plastikowej rurki z zaworem do kontrolowania przepływu formaliny.</li>
	<li>Wprowadzić formalinę do płata płuca przez 5 min. Odłączyć igłę i usunąć ją wraz z rurką polietylenową z tchawicy, pociągając za jedwabną nić, aby zamknąć tchawicę i utrzymać ciśnienie w płucu.</li>
	<li>Zanurzyć płat płuca w formalinie i utrwalać przez 24 hr w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć utrwaloną tkankę trzy razy przez co najmniej 20 min 70% etanolem, a następnie odwodnić do ksylenu zgodnie z poniższym schematem (każdy etap po 1 hr):
	<ul>
		<li>3x 70% etanol</li>
		<li>3x 95% etanol</li>
		<li>3x 100% etanol</li>
		<li>3x ksylen</li>
		<li>1x parafina (ciekła)</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Zatopić odwodnioną tkankę w parafinie, wykonać skrawki o grubości 4-5 µm i zabarwić hematoksyliną i eozyną w celu oceny histologicznej.</li>
</ol>

<ol><li>King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Lipopolysaccharide+biosynthesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Review: Lipopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Innate Immun. 15, 261-312 (2009).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol Med. 17, 293-307 (2011).</li>
<li>Pesci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cells+and+mediators+in+bronchial+lavage+of+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> Eur Respir J. 12, 380-386 (1998).</li>
<li>Hoogerwerf, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Inflammation+Induced+by+Lipoteichoic+Acid+or+Lipopolysaccharide+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung Inflammation Induced by Lipoteichoic Acid or Lipopolysaccharide in Humans.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178, 34-41 (2008).</li>
<li>Scheuchenzuber, W. J., Eskew, M. L., Zarkower, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+humoral+responses+to+Escherichia+coli+and+sheep+red+blood+cell+antigens+introduced+via+the+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative humoral responses to Escherichia coli and sheep red blood cell antigens introduced via the respiratory tract.</a> Exp Lung Res. 13, 97-112 (1987).</li>
<li>Asti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+lung+injury+in+mice.+I.+Concomitant+evaluation+of+inflammatory+cells+and+haemorrhagic+lung+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. I. Concomitant evaluation of inflammatory cells and haemorrhagic lung damage.</a> Pulm Pharmacol Ther. 13, 61-69 (2000).</li>
<li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+deposition+of+therapeutic+particles+during+spontaneous+and+controlled+inhalations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pharmaceutical+sciences%22%5BJournal%5D)">Total deposition of therapeutic particles during spontaneous and controlled inhalations.</a> Journal of pharmaceutical sciences. 89, 724-731 (2000).</li>
<li>Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+rats%3A+comparative+assessment+of+intratracheal+instillation+and+aerosol+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation.</a> Toxicology. 304, 158-166 (2013).</li>
<li>Skerrett, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+type+1+TNF+receptor+in+lung+inflammation+after+inhalation+of+endotoxin+or+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of the type 1 TNF receptor in lung inflammation after inhalation of endotoxin or Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 276, L715-L727 (1999).</li>
<li>Roos, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial-C%2FEBPbeta+contributes+to+LPS-induced+inflammation+and+its+suppression+by+formoterol%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial-C/EBPbeta contributes to LPS-induced inflammation and its suppression by formoterol.</a> Biochem Biophys Res Commun. 423, 134-139 (2012).</li>
<li>Didon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial+CCAAT%2Fenhancer-binding+protein-beta+is+necessary+for+the+integrity+of+inflammatory+responses+to+cigarette+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial CCAAT/enhancer-binding protein-beta is necessary for the integrity of inflammatory responses to cigarette smoke.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184, 233-242 (2011).</li>
<li>Silverpil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+on+IL-23+exerted+by+IL-17A+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Negative feedback on IL-23 exerted by IL-17A during pulmonary inflammation.</a> Innate Immunity. 19, 479-492 (2013).</li>
<li>Mercer, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase-Activated+Receptor-1%2C+CCL2+and+CCL7+Regulate+Acute+Neutrophilic+Lung+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteinase-Activated Receptor-1, CCL2 and CCL7 Regulate Acute Neutrophilic Lung Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. , (2013).</li>
<li>Korkmaz, B., Horwitz, M. S., Jenne, D. E., Gauthier, F. Neutrophil Elastase, Proteinase 3, and Cathepsin G as Therapeutic Targets in Human Diseases. Pharmacological Reviews. 62, 726-759 (2010).</li>
<li>Bafadhel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Exacerbations+of+COPD%3A+Identification+of+Biological+Clusters+and+Their+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acute Exacerbations of COPD: Identification of Biological Clusters and Their Biomarkers.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 201104-200597 (2011).</li>
<li>Hurst, J. R., Perera, W. R., Wilkinson, T. M. A., Donaldson, G. C., Donaldson, G. C., Wedzicha, G. C. Systemic and Upper and Lower Airway Inflammation at Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHurst%2C+JR+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22">Am. J. Respir. Crit. Care Med</a>. 173, 71-78 (2006).</li>
<li>Rabe, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Strategy+for+the+Diagnosis%2C+Management%2C+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease%3A+GOLD+Executive+Summary%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: GOLD Executive Summary.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).</li>
</ol>

Abraham Roos otrzymał honorarium wykładowcy od Boehringer Ingelheim, stypendia podróżne od AstraZeneca R&D oraz grant badawczy od AstraZeneca R&D. Magnus Nord jest pełnoetatowym pracownikiem AstraZeneca R&D i otrzymał granty badawcze od AstraZeneca R&D. Johan Grunewald i Tove Berg są współbadaczami w niepowiązanym projekcie badawczym finansowanym przez AstraZeneca R&D.

Aerozol LPS generuje reakcję zapalną w drogach oddechowych, charakteryzującą się neutrofilami w błonie podśluzowej nabłonka, przestrzeniach otaczających przewodzące drogi oddechowe, a także przestrzeniach pęcherzykowych. Jest to, wraz ze zwiększoną całkowitą zawartością białka w BALF, wskazującą na wyciek osocza, reprezentatywną dla patologii ostrego uszkodzenia płuc. Ponieważ LPS wywołuje jałowe zapalenie, reakcja jest niezależna od adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej i istnieją ograniczenia co do znaczenia infekcji...

Lipopolisacharyd (LPS) jest składnikiem ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych1. Wyzwanie dla LPS to dobrze udokumentowany model ostrego uszkodzenia płuc, zespołu charakteryzującego się ostrym zapaleniem neutrofilowym i obrzękiem2. Ponadto neutrofilia płucna jest również cechą charakterystyczną przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP)3, a prowokacja LPS u ludzi została wykorzystana do modelowania zaostrzeńPOChP 4. W związku z tym eksperymentalne modele ekspozycji na LPS są klinicznie istotnymi i cennymi narzędziami do zrozumienia patologii człowieka.
Celem opisanego tutaj dostarczania LPS w aerozolu do płuc jest wywołanie neutrofilowej odpowiedzi zapalnej w przewodzących i oddechowych drogach oddechowych, bez udziału całego organizmu. Kilka technik wyzwania LPS zostało opisanych wcześniej. Wstrzyknięcie dożylne LPS jest najczęściej stosowaną drogą podawania. Chociaż ta technika jest łatwo dostępna, pierwotne uszkodzenie dotyczy śródbłonka, z wtórnym zniszczeniem nabłonka płucnego w wyniku migracji neutrofili do płuc. Podanie dożylne wywołuje również ogólnoustrojowe zapalenie2, co może komplikować obraz kliniczny w modelach zwierzęcych. Zapalenie ogólnoustrojowe nie jest natomiast obserwowane w przypadku podawania dotchawniczego. Technika ta jest jednak pracochłonna i wymaga znieczulenia, a także znacznego treningu 5,6 . Ponadto odkładanie się w płucach tą drogą podania jest zależne od oddychania7. W związku z tym na osadzanie w płucach ma wpływ głębokość znieczulenia potrzebnego do podania dotchawiczego i można zaobserwować zmienne osadzanie w drogach oddechowych. W przeciwieństwie do tego, poród płucny za pomocą LPS w aerozolu wymaga minimalnego przeszkolenia i można go łatwo przeprowadzić na dużej liczbie zwierząt z niewielkimi lub żadnymi różnicami między osobnikami 5,8 . Niedawne badanie potwierdza, że dostarczanie aerozolu jest lepsze niż droga dotchawicza w odniesieniu do osadzania się oraz że bardziej odpowiednie dawki LPS wywołują zapalenie neutrofilowe w tym modelu8.
Poprzednie badania wykazały, że prowokacja do aerozolowanego Psuedomonas aeruginosa LPS generuje wyraźną reakcję zapalną w świetle dróg oddechowych i miąższu płucnym, w tym w przestrzeniach pęcherzykowych 9,10. Stan zapalny charakteryzuje się przewagą neutrofili i obecnością obrzęku płuc, a zatem może być stosowany do zwalczania patogenezy ostrego uszkodzenia płuc i uzyskania dalszej wiedzy na temat mechanizmów przyczyniających się do patologii choroby.

<table><tbody><tr><td>Oczyszczony &lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt; LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Szkodliwy. Zalecane oczyszczanie. Można stosować LPS oczyszczone z innych bakterii.</td></tr><tr><td>Nebulizator Pari LC sprint star</td><td>PARI Respiratory Equipment Inc.</td><td>023G1250</td><td></td></tr><tr><td>Przepływomierz masowy TSI 4040</td><td>TSI</td><td>4040</td><td>Można stosować produkt alternatywny od innego dostawcy.</td></tr><tr><td>Wężyk Tygon 15.9 mm Saint-Gobain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z685704</td><td>Zalecana marka.</td></tr><tr><td>Pudełka z pleksiglasu z wyjmowanymi pokrywami</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td>N/A</td><td>150 x 163 x 205 mm (otwór 2 mm z boku).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Maska wielorazowa 3M Half Facepiece</td><td>3M</td><td>7503</td><td>Zalecana marka.</td></tr><tr><td>Zaawansowane filtry cząsteczkowe (P100) 3M&amp;nbsp;</td><td>3M</td><td>2291</td><td>Zalecana marka.</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>VWR</td><td>233-1104</td><td>Można stosować preferowane nożyczki.</td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>VWR</td><td>232-1313</td><td>Można stosować preferowaną pincetę.</td></tr><tr><td>Wężyk polietylenowy Intramedic PE50</td><td>BD</td><td>427411</td><td>Zalecana marka.</td></tr><tr><td>Nić jedwabna Ethicon 2-0 Perma-hand</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td>Zalecana marka.</td></tr><tr><td>Igła G 26 &amp;frac12;</td><td></td><td></td><td>Istnieją alternatywni dostawcy.</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml BD z końcówką typu slip-tip, niesterylna</td><td><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=301025" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BD</a></td><td>301205</td><td>Istnieją alternatywni dostawcy.</td></tr><tr><td>Strzykawka 60 ml BD Luer-Lok, niesterylna, polipropylenowa</td><td>BD</td><td>301035</td><td>Istnieją alternatywni dostawcy.</td></tr><tr><td>Hematoksylina i eozyna Fluka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3972</td><td>Istnieją alternatywni dostawcy.</td></tr><tr><td>Roztwór T&amp;uuml;rka</td><td>Merck Millipore</td><td>109277</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka nakładkowa</td><td></td><td></td><td>Istnieją alternatywni producenci.</td></tr><tr><td>Cytowirówka Cytospin 4</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>Można stosować alternatywną wirówkę.</td></tr><tr><td>Zestaw barwiący HEMA-3 stat pack</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-123-869</td><td>Istnieją alternatywne zestawy barwiące.</td></tr><tr><td>Formalina, neutralnie buforowana, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>Istnieją alternatywni dostawcy.</td></tr></tbody></table>

metoda wytwarzania neutrofilii płucnej przy użyciu lipopolisacharydu w aerozolu

A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

Ostre uszkodzenie płuc (ALI) jest ciężką chorobą charakteryzującą się neutrofilią pęcherzyków płucnych, z ograniczonymi możliwościami leczenia i wysoką śmiertelnością. Eksperymentalne modele ALI mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia patogenezy chorób. Lipopolisacharyd (LPS) pochodzący z bakterii Gram-dodatnich indukuje neutrofilowe zapalenie w drogach oddechowych i miąższu płuc myszy. Skuteczne dostarczanie do płuc związków, takich jak LPS, jest jednak trudne do osiągnięcia. W opisanym tutaj podejściu dostarczanie płucne u myszy uzyskuje się poprzez prowokację do aerozolowego Pseudomonas aeruginosa LPS. Rozpuszczony LPS był aerozolowany za pomocą nebulizatora podłączonego do sprężonego powietrza. Myszy były wystawione na ciągły przepływ aerozolu LPS w pudełku z pleksiglasu przez 10 minut, a następnie kondycjonowanie przez 2 minuty po odstawieniu aerozolu. Następnie przeprowadzono intubację tchawicy, a następnie płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, a następnie perfuzję formaliny, co pozwala na scharakteryzowanie jałowego zapalenia płuc. Aerozol LPS generuje zapalenie płuc charakteryzujące się neutrofilią pęcherzykową, wykrywaną w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych i ocenie histologicznej. Technikę tę można skonfigurować niewielkim kosztem przy użyciu kilku urządzeń i wymaga minimalnego szkolenia i wiedzy. System ekspozycji może być zatem rutynowo wykonywany w dowolnym laboratorium, co może przyczynić się do lepszego zrozumienia patologii płuc.

Wywołanie reakcji na aerozolowe LPS P. aeruginosa zazwyczaj skutkuje wyraźną odpowiedzią zapalną w świetle dróg oddechowych i przestrzeni pęcherzyków płucnych, charakteryzującą się przewagą neutrofili zarówno we wczesnych, jak i późnych punktach czasowych.
Aerozolowy LPS indukuje neutrofilię płucną
Myszy szczepów C57BL/6by i BALB/c poddano działaniu aerozolu z LPS P. aeruginosa lub samego nośnika, a następnie oznaczono liczbę neutrofili w BALF. Całko...

Opisujemy metodę wywoływania neutrofilowego zapalenia płuc poprzez prowokację do aerozolowanego lipopolisacharydu za pomocą nebulizacji, do modelowania ostrego uszkodzenia płuc. Ponadto opisano podstawowe techniki operacyjne izolacji płuc, intubacji tchawicy i płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.

Metoda wytwarzania neutrofilii płucnej przy użyciu lipopolisacharydu w aerozolu

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wywołanie spójnej i powtarzalnej neutrofilii dróg oddechowych poprzez ekspozycję na aerozol z LPS. Osiąga się to poprzez uprzednie wprowadzenie LPS zawieszonego w soli fizjologicznej do nebulizatora połączonego z komorą ekspozycyjną. Następnie myszy są poddawane działaniu aerozolu z LPS, po czym pobiera się płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe i przeprowadza zliczanie komórek zapalnych w uzyskanym płukaniu.Na koniec tkankę płuc utrwala się formaliną w celu przygotowania bloków do skrawania oraz analizy immunohistochemicznej. Ostatecznie całkowita i różnicowa liczba komórek w płuczce pęcherzykowo-oskrzelowej może służyć do oceny rekrutacji neutrofili do płuc. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak intratrachealna administracja LPS, są równomierny rozkład aerozolu LPS w całym płucu, łatwość wykonania oraz minimalne przeszkolenie wymagane do skutecznego zastosowania. Aby wytworzyć aerozol LPS, stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej i pracując w wentylowanej komorze biologicznej poziomu drugiego, należy rozpocząć od włożenia czerwonego wlotu do nebulizatora, a następnie podłączyć nebulizator do sprężonego powietrza pokojowego za pomocą rurek dostarczonych przez producenta.Następnie za pomocą filtra powietrza połącz wylot nebulizatora z przepływomierzem masowym, a następnie podłącz przepływomierz masowy do zasilania elektrycznego. Ustaw przepływ powietrza na 5 l/min, utrzymując ciśnienie na poziomie od 1 do 2 bar, a następnie zdejmij przepływomierz masowy i odłącz dopływ powietrza. Następnie połącz wylot nebulizatora z 15,9 mm rurką rozgałęźną podłączoną do dwóch pudełek z pleksiglasu o wymiarach 150 x 163 x 205 mm, wyposażonych w zdejmowane pokrywy.W każdej klatce, po przeciwnej stronie niż wlot, należy wykonać otwór o średnicy 5 mm, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia. Następnie należy umieścić do pięciu myszy w każdej klatce i zamknąć pokrywy. Po tym kroku należy uruchomić nebulizator.Napełnij wkładnik od czterech do ośmiu mililitrów LPS rozpuszczonego w soli fizjologicznej lub samą solą fizjologiczną jako nośnikiem, a następnie ponownie podłącz wlot do źródła powietrza. Pozwól aerozolowi wpływać do zamkniętych pudełek z pleksiglasu, stale monitorując zwierzęta i upewniając się, że dopływ powietrza pozostaje szczelnie połączony z wlotem nebulizatora podczas aerozolizacji. Po 10 minutach odłącz źródło powietrza i pozostaw zwierzęta w pudełkach z pleksiglasu na kolejne dwie minuty.Następnie otwórz pokrywy. Pozwól aerozolowi rozproszyć się i przenieś myszy z powrotem do klatek po zakończeniu eksperymentu. Dla każdego zwierzęcia po kolei, najpierw za pomocą nożyczek wykonaj pojedyncze cięcie w kierunku przednio-tylnym, aby odsłonić klatkę piersiową. Następnie unieś klatkę piersiową za przednią końcówkę mostka i przebij przeponę w najbardziej brzusznym punkcie, uważając, aby nie uszkodzić tkanki płucnej.Następnie otwórz klatkę piersiową, wykonując dwa cięcia zbiegające się pod żuchwą w kierunku przednio-tylnym. Po otwarciu klatki piersiowej za pomocą pęsety delikatnie rozsuń żebra i przetnij tchawicę poniżej krtani. Teraz unieś tchawicę i przetnij więzadła łączące płaty płuc z jamą klatki piersiowej.Następnie delikatnie wyciągnij płuca i tchawicę, oddzielając je od tkanki tłuszczowej i serca, i połóż je na fragmencie papieru z opakowania strzykawki. Następnie wprowadź polietylenową rurkę o średnicy 0,965 mm do tchawicy i zabezpiecz ją jedwabną nicią. Zawiąż również wielopłat również jedwabną nicią, a następnie wprowadź igłę 23 G do rurki polietylenowej.Następnie, aby przeprowadzić płukanie pęcherzyków płucnych, należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml, aby powoli wstrzyknąć 250 µL schłodzonego sterylnego PBS do pojedynczego płata; ostrożnie opukując płuca o powierzchnię blatu roboczego 30 razy, należy powoli odessać ciecz do strzykawki i zebrać ją do probówki. Po powtórzeniu tej procedury z użyciem 200 µL świeżego PBS, pobraną płukaninę pęcherzykową należy umieścić na lodzie do późniejszej analizy. Aby utrwalić tkankę płucną do analizy histologicznej, należy usunąć wielopłat i zamrozić go gwałtownie na suchym lodzie.Przechowywać płat w temperaturze -80 °C. Aby utrwalić tkankę do analizy histologicznej, zamocować strzykawkę o pojemności 60 ml bez tłoka na metalnym statywie i przeprowadzić insuflację pojedynczego płata formaliną przez pięć minut. Następnie odłączyć igłę i pociągnąć za jedwabną nić, aby usunąć ją wraz z rurką polietylenową z tchawicy.Jednocześnie zamykamy tchawicę, utrzymując ciśnienie w płucu. Następnie zanurzamy płat w Forminie na 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsius. Następnego dnia utrwaloną tkankę płuczemy trzykrotnie, przez co najmniej 20 minut za każdym razem, w 70% etanolu.Po zatopieniu odwodnionej tkanki w parafina film, należy wykonać skrawki płata o grubości od czterech do pięciu mikronów, a następnie zabarwić je hematoksyliną i eozyną w celu oceny histologicznej. Całkowita liczba komórek w płyku z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego u myszy eksponowanych na aerozol generowany z samym nośnikiem wynosi zazwyczaj około 200 000 komórek lub mniej. Komórki te składają się w 95 do 100% z komórek jednojądrowych, z niewielką liczbą limfocytów i brakiem neutrofili.Myszy poddane działaniu aerozolu LPS w stężeniu 1 mg/mL wykazują zwiększoną całkowitą liczbę komórek w płyku z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego, zazwyczaj przekraczającą 500 000 komórek po sześciu godzinach, przy czym nacieki komórkowe pozostają liczne po 24 godzinach, a profil komórkowy przesuwa się w stronę przewagi neutrofili. Podobny profil komórek zapalnych oraz neutrofilię płucną obserwuje się również po nebulizacji LPS w stężeniu 5 mg/mL.Neutrofile zaobserwowano w submukozie nabłonka, a także w przestrzeniach otaczających drogi oddechowe i naczynia krwionośne po 6 i 24 godzinach od podania LPS, czego nie stwierdzono u myszy kontrolnych traktowanych solą fizjologiczną. Całkowita zawartość białka w płyku z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego u myszy po podaniu LPS jest zwiększona w porównaniu z myszami eksponowanymi na sól fizjologiczną, a ekspresja chemokin przyciągających neutrofile CXCL1 i CXCL2 jest również zwiększona u myszy po podaniu LPS.Choć metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o zapaleniu płuc indukowanym przez LP, może ona zostać zastosowana również w innych modelach chorób, takich jak infekcje bakteryjne lub wirusowe, ponieważ aerozolową parę można dostosować do podania wielu różnych czynników wywołujących.

a-method-for-generating-pulmonary-neutrophilia-using-aerosolized

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metoda generowania neutrofilii płucnej z użyciem aerozolizowanego lipopolisacharydu

Przedstawiamy sposób wykorzystania mikroskopii dwufotonowej do obserwacji dynamiki granulocytów neutrofilnych w zainfekowanych płucach podczas fagocytowania patogenów lub wytwarzania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NETs).

Bezpośrednia obserwacja fagocytozy i tworzenia sieciy z neutrofili (NET) w zakażonych płucach przy użyciu mikroskopii dwufotonowej

Source: Yuan, Z., et al. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates an in vivo mouse model for inducing and analyzing acute lung injury (ALI) using intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide. The inflammatory cascade triggered by alveolar macrophages and neutrophils leads to epithelial and endothelial barrier disruption, allowing fluid and immune cells to accumulate in the alveoli. Alveolar...

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

Ten film opisuje procedurę generowania torebki powietrznej w tkance podskórnej myszy i zbierania wysięków zapalnych w odpowiedzi na podanie lipopolisacharydu in vivo. Ten film obejmuje również analizę infiltracji neutrofili w woreczku powietrznym.

Model myszy w woreczku powietrznym do zbierania wysięku zapalnego wywołanego lipopolisacharydem

Odpowiedź immunologiczna gospodarza na infekcję patogenem jest ściśle regulowanym procesem. Wykorzystując model ekspozycji płuc na lipopolisacharydy u myszy, możliwe jest przeprowadzenie oceny w wysokiej rozdzielczości złożonych mechanizmów związanych z patogenezą choroby.

Wykorzystanie dotchawczego podawania PAMP w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy

Obecna praca ilustruje wygodę stosowania immunoterapii podjęzykowej w celu wzmocnienia wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w płucach i zapewnienia ochrony przed ostrym pneumokokowym zapaleniem płuc u myszy.

Immunoterapia podjęzykowa jako alternatywa dla indukowania ochrony przed ostrymi infekcjami dróg oddechowych

W literaturze opisano kilka metod modelowania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. W niniejszym artykule opisano nieinwazyjną, niedrogą i szybką metodę wywoływania zapalenia płuc poprzez aspirację (tj. wdychanie) inokulum bakteryjnego pipetowanego do jamy ustnej i gardła. Szczegółowo opisano również dalsze metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc.

Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

Myszy wystawione na działanie dootrzewnowego LPS wydzielają egzosomy w płynie płukania oskrzelowo-pęcherzykowym (BAL), które są wypełnione miRNA. Korzystając z systemu kohodowli, pokazujemy, że egzosomy uwalniane w płynie BAL zaburzają ekspresję białek połączeń ścisłych w komórkach nabłonka oskrzeli i zwiększają ekspresję cytokin prozapalnych, które uwydatniają uszkodzenie płuc.

Egzosomy płukania oskrzelowo-pęcherzykowego w septycznym uszkodzeniu płuc wywołanym lipopolisacharydem

Przedstawiona tutaj jest procedura krok po kroku do wywołania ostrego uszkodzenia płuc u myszy poprzez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydu dotchawiczego i przeprowadzenie analizy FACS próbek krwi, płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i tkanki płucnej. Minimalna inwazyjność, prosta obsługa, dobra odtwarzalność i miareczkowanie ciężkości choroby to zalety tego podejścia.

Wywoływanie ostrego uszkodzenia płuc u myszy przez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydów dotchawiczych

Myszy narażone na działanie ozonu i endotoksyn bakteryjnych wykazują rozległą śmierć komórek, w tym neutrofili. Zaobserwowaliśmy adaptacje komórkowe, takie jak zakłócenie blaszek cytoszkieletu, zwiększona ekspresja komórkowa podjednostki syntazy ATP kompleksu V β i angiostatyny w płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym, supresja odpowiedzi immunologicznej płuc i opóźniona rekrutacja neutrofili.

Wizualizacja adaptacji komórek płuc podczas połączonego ozonu i ostrego mysiego uszkodzenia płuc wywołanego ozonem i LPS

Tutaj proponujemy protokół dostarczania lipopolisacharydów dotchawiczych (LPS) poprzez nieinwazyjną intubację dotchawiczą ustno-gardłową. Metoda ta minimalizuje uraz związany z zabiegiem chirurgicznym u zwierzęcia i dokładnie dostarcza LPS do tchawicy, a następnie do płuc.

Nieinwazyjne wkraplanie lipopolisacharydu dotchawiczego u myszy

W tym badaniu wykazano, że nieinwazyjna technika instylacji tchawicy pozwala na rozwój ALI u szczurów za pomocą podstawowego laryngoskopu, aby zapewnić precyzyjne dostarczanie LPS do płuc. LPS jest wprowadzany za pomocą rurki tchawicowej za pomocą laryngoskopu. Skala uszkodzenia płuc jest oceniana w wielu punktach czasowych.

Nieinwazyjne podanie lipopolisacharydu przez endotchawicę w celu wywołania ostrego uszkodzenia płuc u gryzoni

Poznaj metodę wytwarzania neutrofilii płucnej przy użyciu aerozolowego lipopolisacharydu u myszy. Technika obejmuje nebulizację LPS, pobieranie płukania oskrzelowo-pęcherzykowego oraz analizę immunohistochemiczną.

Metoda wytwarzania neutrofilii płucnej przy użyciu lipopolisacharydu w aerozolu

Przeglądaj więcej filmów