Metoda wytwarzania neutrofilii płucnej przy użyciu lipopolisacharydu w aerozolu
15 grudnia 2014
Opisujemy metodę wywoływania neutrofilowego zapalenia płuc poprzez prowokację do aerozolowanego lipopolisacharydu za pomocą nebulizacji, do modelowania ostrego uszkodzenia płuc. Ponadto opisano podstawowe techniki operacyjne izolacji płuc, intubacji tchawicy i płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.
Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie spójnej i powtarzalnej neutrofilii dróg oddechowych poprzez ekspozycję na LPS w aerozolu. Osiąga się to poprzez uprzednie załadowanie LPS zawieszonego w soli fizjologicznej do nebulizatora podłączonego do komory ekspozycyjnej. Następnie myszy są poddawane działaniu LPS w aerozolu, a następnie pobiera się płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe i zlicza komórki zapalne w płukaniu.
Na koniec tkanka płucna jest utrwalana, formalnie w celu osadzenia i przekroju oraz analizy immunohistochemicznej. Ostatecznie całkowita i różnicowa liczba komórek w płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym może być wykorzystana do oceny rekrutacji neutrofili do płuc. Główne zalety tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak dotchawicze podawanie LPS, to równomierne rozprowadzenie aerozolu LPS w płucach, łatwość wykonania i minimalne szkolenie wymagane do pomyślnego zastosowania Aby wytworzyć aerozol LPS przy użyciu odpowiednich środków ochrony indywidualnej i w wentylowanym kapturze zagrożenia biologicznego na poziomie dwóch, należy rozpocząć od włożenia czerwonego wlotu do nebulizatora, a następnie podłączyć nebulizator do sprężonego powietrza w pomieszczeniu za pomocą rurki dostarczonej przez producent.
Następnie za pomocą filtra powietrza podłącz wylot nebulizatora do przepływomierza masowego, a następnie podłącz przepływomierz masowy do źródła zasilania. Dostosuj przepływ powietrza do pięciu litrów na minutę, utrzymując ciśnienie na poziomie od jednego do dwóch barów, a następnie wyjmij przepływomierz masowy i odłącz przepływ powietrza. Następnie podłącz wylot nebulizatora do rurki rozwidlającej o średnicy 15,9 milimetra podłączonej do pudełek z pleksiglasu 2 1 50 na 1 63 na 2 0 5 milimetrów z pleksiglasu wyposażonych w zdejmowane pokrywy.
Każda skrzynka powinna mieć pięciomilimetrowy otwór po stronie przeciwnej do wlotu, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia. Teraz umieść do pięciu myszy w każdym pudełku i zamknij pokrywki. Następnie otwórz nebulizator.
Napełnij wkład czterema do ośmiu mililitrami LPS rozpuszczonego w soli fizjologicznej lub samym pojeździe z solą fizjologiczną i ponownie podłącz wlot do dopływu powietrza. Pozwól, aby aerozol spłynął do zamkniętych pojemników z pleksiglasu, stale monitorując zwierzęta i upewniając się, że dopływ powietrza pozostaje szczelnie przymocowany do wlotu nebulizatora podczas aerozolu. Po 10 minutach odłącz dopływ powietrza i pozostaw zwierzęta w pudełkach z pleksi na kolejne dwie minuty.
Następnie otwórz pokrywki. Pozwól aerozolowi się rozproszyć i wróć do klatek w eksperymentalnym punkcie końcowym Dla każdego zwierzęcia po kolei najpierw użyj nożyczek, aby wykonać pojedyncze przednie tylne cięcie, aby odsłonić klatkę piersiową. Następnie podnieś klatkę piersiową za przedni koniec mostka i nakłuj przeponę w najbardziej brzusznym punkcie, nie wcinając się w żadną tkankę płucną.
Następnie otwórz klatkę piersiową za pomocą dwóch nacięć, które spotykają się poniżej szczęki w przednim tylnym kierunku. Po otwarciu klatki piersiowej użyj kleszczy, aby delikatnie ją rozsunąć i przeciąć tchawicę poniżej krtani. Teraz podnieś tchawicę i przetnij więzadła łączące płaty płuc z jamą klatki piersiowej.
Następnie delikatnie pociągnij płuca i tchawicę do góry i odsuń je od tkanki tłuszczowej i sercowej i umieść je na kawałku papieru do pakowania strzykawki. Następnie włóż rurkę polietylenową o grubości 0,965 milimetra do tchawicy i zabezpiecz ją sznurkiem jedwabnej nici. Zwiąż również wielopłatek jedwabną nicią, a następnie włóż igłę o rozmiarze 23 do rurki polietylenowej.
Następnie, aby zebrać płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, użyj jednomililitrowej strzykawki, aby powoli wstrzyknąć 250 mikrolitrów lodu zwanego sterylnym PBS do pojedynczego płata, a następnie ostrożnie postukać w płuca i 30 razy powoli wciągnąć płyn z powrotem do strzykawki i zebrać go w probówce po powtórzeniu procedury z 200 mikrolitrami świeżego PBS, Umieść płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe na lodzie do późniejszej analizy. Aby utrwalić tkankę płucną do analizy histologicznej, usuń wielopłatek i zatrzaśnij. Zamroź go na suchym lodzie.
Przechowuj płat w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby utrwalić tkankę do analizy histologicznej, zamontuj 60-mililitrową strzykawkę bez tłoka na metalowym stojaku i napompuj pojedynczy płat formaliną przez pięć minut. Następnie odłącz igłę i pociągnij za jedwabną nić, aby usunąć ją wraz z rurką polietylenową z tchawicy.
Jednocześnie zamykając tchawicę i utrzymując ciśnienie w płucach. Następnie zanurz płat w Forminie na 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj utrwaloną chusteczkę trzy razy przez co najmniej 20 minut za każdym razem w 70% etanolu.
Po osadzeniu odwodnionej tkanki w folii para, pokrój płat na odcinki o długości od czterech do pięciu mikronów i zabarwij skrawki hematyną i eoiną w celu oceny histologicznej. Całkowita liczba komórek w płynie popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych myszy wystawionych na działanie aerozolu generowanego tylko za pomocą nośnika wynosi zwykle około lub mniej niż 200 000 komórek. Komórki składają się z 95 do 100% komórek jednojądrzastych z zaledwie kilkoma limfocytami i bez neutrofili.
Myszy prowokowano jednym miligramem na mililitr aerozolu. LPS. Jednak wykazują zwiększoną całkowitą liczbę komórek w płynie popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych, zwykle większą niż 500 000 komórek po sześciu godzinach, przy naciekach komórkowych pozostających na wysokim poziomie po 24 godzinach i z profilem komórkowym przesuniętym w kierunku przewagi neutrofili. Podobny profil komórek zapalnych i neutrofilię płucną obserwuje się również przy nebulizacji pięciu miligramów na mililitr LPS.
Neutrofile obserwowano w błonie podśluzowej nabłonka, a także w przestrzeniach otaczających przewodzące drogi oddechowe i naczynia krwionośne po sześciu i 24 godzinach prowokacji LPS, ale nie w kontrolie. Myszy leczone solą fizjologiczną. Całkowita zawartość białka w płynie popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych myszy prowokacyjnych LPS jest zwiększona w porównaniu z myszami wystawionymi na działanie soli fizjologicznej, a ekspresja chemokinów chemokinów chemofili obojętnochłonnych c, XCL jeden i C XCL dwa jest również zwiększona u myszy z prowokacją LPS.
Chociaż ta metoda może dostarczyć wglądu w zapalenie płuc wywołane przez LP. Może być również stosowany do innych modeli chorobowych, takich jak infekcje bakteryjne lub wirusowe, ponieważ para w aerozolu może być dostosowana do wielu różnych wyzwań.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę indukowania neutrofilnego stanu zapalnego płuc poprzez nebulizację aerozolu z lipopolisarydem (LPS), co służy jako model ostrego uszkodzenia płuc. Przedstawiono w nim również podstawowe techniki chirurgiczne izolacji płuc, intubacji tchawicy oraz płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Zapalenie płuc
- Ostre uszkodzenie płuc
Wprowadzenie
- Aerozolowe LPS jest wykorzystywane do stworzenia modelu służącego do badania zapalenia neutrofilowego.
- Płukanie pęcherzykowo-oskrzelowe umożliwia pobranie komórek zapalnych.
- Zrozumienie rekrutacji neutrofili jest kluczowe dla badania chorób płuc.
- Metoda ta oferuje zalety w stosunku do tradycyjnych technik podawania LPS.
Cel badania
- W celu wywołania spójnej neutrofilii dróg oddechowych w kontrolowanym środowisku.
- W celu oceny rekrutacji neutrofili do płuc.
- W celu udoskonalenia istniejących metod indukowania zapalenia płuc.
Zastosowane metody
- Wprowadzanie LPS zawieszonego w soli fizjologicznej do nebulizatora.
- Poddawanie myszy działaniu aerozolu LPS w komorze ekspozycyjnej.
- Pobieranie płynu z przemywania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu policzenia komórek.
- Fiksacja tkanki płucnej do analizy immunohistochemicznej.
Główne wyniki
- Wykazano skuteczną rekrutację neutrofili przy użyciu aerozolowego LPS.
- Przedstawiono niezawodną metodę oceny stanu zapalnego płuc.
- Wykazano zalety w zakresie dystrybucji i łatwości zastosowania w porównaniu z metodami wewnątrz tchawiczymi.
- Umożliwiono szczegółową analizę odpowiedzi zapalnej w tkance płucnej.
Wnioski
- Metoda aerozolizacji LPS jest cennym narzędziem do badania stanu zapalnego płuc.
- Technika ta pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników w warunkach badawczych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu analizy interwencji terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza metoda umożliwia powtarzalną indukcję neutrofilii płucnej, która jest kluczową cechą patologiczną w ostrym uszkodzeniu płuc oraz w zapalnych chorobach płuc. Dzięki zastosowaniu zestandaryzowanego, niskokosztowego systemu podawania aerozolu, metoda ta wspiera walidację celów terapeutycznych i ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnych programach odkrywania leków, koncentrujących się na patologii płuc zależnej od neutrofili. Podejście to zwiększa wiarygodność prognostyczną modeli przedklinicznych poprzez dostarczanie mierzalnych wyników stanu zapalnego, istotnych dla przesiewu terapeutycznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów rekrutacji neutrofili oraz szlaków chemokin, takich jak CXCL1 i CXCL2, w kontrolowanych warunkach zapalnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowany model oceny oddziaływania na cel oraz modulacji szlaków w zapaleniu płuc indukowanym przez neutrofile.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie mierzalnych wyników płukania pęcherzykowo-oskrzelowego, w tym całkowitej i różnicowej liczby komórek oraz całkowitego poziomu białka w celu standaryzacji testów.
- Wartość operacyjna: Wspiera opracowanie powtarzalnych punktów końcowych stanu zapalnego do przesiewu związków modulujących napływ lub aktywację neutrofili.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje istotny w przebiegu choroby stan zapalny z udziałem neutrofili obserwowany w przebiegu ostrego uszkodzenia płuc u ludzi, wspierając dopasowanie translacyjnych biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Ułatwia podejmowanie decyzji o rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, umożliwiając spójną ocenę związków przeciwzapalnych lub modulujących neutrofile w wielu badaniach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności, szczególnie w programach skoncentrowanych na zapaleniu płuc i uszkodzeniach tkanek indukowanych przez neutrofile.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków chemoatraktantów neutrofilnych oraz modulacji kaskady zapalnej w miąższu płuc.
- Przesiewy: Zapewnia standaryzowany stan zapalenia neutrofilnego w celu wiarygodnego przesiewu związków i walidacji celów w modelach chorób płuc.
- Analityka: Dostarcza ilościowych wyników płukania pęcherzykowego (liczba komórek, poziomy białek, procent neutrofili) w celu porównania odpowiedzi zapalnych w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Modeluje istotne dla ludzi neutrofilne zapalenie płuc, umożliwiając ciągłość przedkliniczną dla ostrego uszkodzenia płuc i pokrewnych wskazań.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia niskokosztową platformę wymagającą minimalnego przeszkolenia, przeznaczoną do wielokrotnego wykorzystania w wielu projektach badających zapalenie płuc lub interakcje gospodarz-patogen.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję zmienności w indukcji stanu zapalnego z udziałem neutrofili.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i skalowalność dzięki standaryzowanemu podawaniu aerozolu oraz minimalnym wymaganiom dotyczącym wiedzy technicznej.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczanie mechanistycznie istotnych, mierzalnych fenotypów zapalnych na wczesnym etapie procesu odkrywania leków.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o spójne dane dotyczące rekrutacji neutrofili i ekspresji chemokin.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga podstawowego przeszkolenia w zakresie generowania aerozoli, obchodzenia się z myszami oraz techniki przemywania oskrzeli i pęcherzyków płucnych.
- Zależy od dostępu do nebulizatora, źródła sprężonego powietrza, komory ekspozycyjnej z pleksiglasu oraz komory z laminarnym przepływem powietrza do pracy z LPS.
- Wymaga standaryzacji stężenia LPS, czasu ekspozycji oraz warunków poekspozycyjnych pomiędzy laboratoriami w celu zapewnienia porównywalności wyników między badaniami.
- Wymaga rozważenia niezbędnych adaptacji podczas stosowania systemu do podawania innych czynników aerozolowych, takich jak patogeny wirusowe lub bakteryjne.
- Ograniczone do eksploracyjnych badań niezgodnych z GMP; nieodpowiednie do regulowanej toksykologii lub produkcji materiałów klinicznych bez dodatkowej walidacji.
