Name: Pomiar rdzeniowego hamowania presynaptycznego u myszy za pomocą zapisu potencjału korzenia grzbietowego in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Poznaj metodę pomiaru rdzeniowego hamowania presynaptycznego u myszy za pomocą zapisu potencjału korzenia grzbietowego in vivo. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów bólu i integracji sygnałów w rdzeniu kręgowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Manfredowi Heckmannowi za pomocne dyskusje podczas tworzenia metody. Ponadto dziękujemy Claudii Sommer za pomoc techniczną i Frankowi Schubertowi za wsparcie przy produkcji filmu. Prace były wspierane przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) z Niemiec, FKZ: 01EO1002 oraz Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych (IZKF) Szpitala Uniwersyteckiego w Jenie.

Wszystkie procedury eksperymentalne wymienione w poniższym protokole zostały zatwierdzone przez władze kraju związkowego Turyngii (Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12).
1. Przygotowania do eksperymentu
<ol>
	<li>Produkcja elektrod ssących
	<ol>
		<li>Pobrać mikropipetę za pomocą standardowej kapilary ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikropipet, np. standardowej elektrody krosowej.</li>
		<li>Przełamać elektrodę do średnicy końcówki 0,5-1 mm (nieco większej niż średnica korzeni grzbietowych) za pomocą pilnika diamentowego.</li>
		<li>Wypoleruj końcówkę na gorąco, aby nie uszkodziła korzenia grzbietowego po zassaniu. Odpowiednia będzie standardowa latarka laboratoryjna.</li>
		<li>Zamontuj szklane żarnik na uchwycie elektrody podłączonym do strzykawki, przez którą można zastosować podciśnienie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworów
	<ol>
		<li>Znieczulenie iniekcyjne dla myszy: Wymieszaj 0,75 ml ketaminy 10%, 0,24 ml ksylazyny 2% i 5 ml 0,9% soli fizjologicznej. 10 μl/g masy ciała (m.c.) roztworu wstrzykuje się dootrzewnowo (i.p.).</li>
		<li>Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF): Rozcieńczyć w wodzie podwójnie destylowanej następujące sole (w mM): NaCl 134; KCl 3; KH2PO4 1,25; MgSO4•H2O 2; NaHCO3 25; CaCl2 2; D-glukoza 10. DodaćH2O2do końcowego stężenia 0,003%. Używaj zawsze świeżo przygotowanego roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie konfiguracji nagrywania (rysunek 2)
	<ol>
		<li>Podłącz wzmacniacz do interfejsu komputera w celu digitalizacji danych.</li>
		<li>Użyj programu komputerowego lub zegara analogowego, aby wyzwolić stymulator impulsów kwadratowych i akwizycję danych na dysku twardym komputera.</li>
		<li>Używaj chlorkowanych drutów srebrnych podłączonych do standardowych uchwytów elektrod szklanych, jak do stymulacji i nagrywania.</li>
		<li>Zmontuj trzy manipulatory do stymulacji, rejestracji i elektrody referencyjnej odpowiednio wokół ramy stereotaktycznej dla myszy, tak aby wszystkie elektrody miały później dostęp do przygotowanego rdzenia kręgowego.</li>
		<li>Podłącz rurki i strzykawki do uchwytów elektrod, aby były jabłkowe, aby wytworzyć podciśnienie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ogólne uwagi dotyczące eksperymentów na zwierzętach i przygotowania zwierząt do procedury nagrywania
<ol>
	<li>Wszystkie eksperymenty na myszach należy przeprowadzać zgodnie z wytycznymi odpowiedniej instytucjonalnej komisji ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania. Wykonuj wszystkie operacje i nagrania w głębokiej narkozie, upewniając się, że cierpienie zwierząt jest zminimalizowane.</li>
	<li>Znieczulić zwierzę przez wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny (odpowiednio 125 mg i 8 mg na g masy ciała ketaminy i ksylazyny; 10 μl/g m.c. przygotowanego roztworu, jak opisano powyżej). W razie potrzeby podczas długotrwałych nagrań można wykonać dodatkowe iniekcje i.p. lub i.m. 
	Uwaga: Powtarzające się wstrzyknięcia domięśniowe 0,05-0,1 ml roztworu ketaminy/ksylazyny w górną część ud okazały się odpowiednie do utrzymywania zwierzęcia w głębokim znieczuleniu przez okres do 3 godzin.</li>
	<li>Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Zamocuj głowę zwierzęcia w ramie stereotaktycznej i użyj poduszki grzewczej z sondą doodbytniczą i pętlą odruchową, aby kontrolować temperaturę ciała zwierzęcia podczas eksperymentu. Mocowanie rdzenia kręgowego w ramie stereotaktycznej nie jest konieczne.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem przygotowania należy sprawdzić głębokość narkozy poprzez odruch mrugania oczami i drganie między palcami u nóg myszy. Odruchy powinny zostać zniesione.</li>
	<li>Otwórz skórę wzdłuż linii środkowej nad rdzeniem kręgowym od górnego poziomu klatki piersiowej do dolnych obszarów lędźwiowych, aby uzyskać czyste pole operacyjne za pomocą skalpela. Nie używaj nożyczek do wykonywania nacięć skóry. Ostrożnie odczep skórę od leżącej pod spodem tkanki. Podczas kolejnych kroków należy zwilżyć ranę 0,9% solą fizjologiczną.</li>
	<li>Przetnij ścięgna i tkankę łączną po obu stronach kręgów od poziomu lędźwiowego do piersiowego za pomocą skalpela i nożyczek.</li>
	<li>Usuń wyrostki kolczyste i resztę tkanki łącznej wokół kręgów za pomocą małego szczypiec.</li>
	<li>Ostrożnie rozbij kręgi szczypcem, zaczynając od poziomu lędźwiowego (L4/L5) pod mikroskopem preparacyjnym. Wepchnij końcówkę szczypiec w przestrzeń między kręgami a rdzeniem kręgowym i rozsuń kawałki kości. Nie uszkadzaj opony twardej i unikaj ucisku na rdzeń kręgowy. Oba te czynniki mają kluczowe znaczenie dla sukcesu. Utrzymuj rdzeń kręgowy w wilgotnym stanie podczas całego zabiegu. Przejdź do środkowego poziomu klatki piersiowej.</li>
</ol>
3. Oddzielenie korzeni grzbietowych i zapis DRP (Rysunek 2)
<ol>
	<li>Ostrożnie otwórz oponę twardą za pomocą cienkiej igły (30 G) z zagiętą końcówką. Od teraz używaj aCSF do nawilżania.</li>
	<li>Oddziel korzenie grzbietowe tak daleko, jak to możliwe, za pomocą miernika i odetnij dwa sąsiednie korzenie tak dystalnie, jak to możliwe. Energiczne ciągnięcie za korzenie podczas separacji wpływa na powodzenie eksperymentu.</li>
	<li>Opuść elektrodę ssącą w dół do korzeni grzbietowych. Dodaj jak najwięcej płynu mózgowo-rdzeniowego do rdzenia kręgowego, ponieważ płyn pomaga zassać korzenie grzbietowe.</li>
	<li>Zassać odcięty koniec jednego korzenia grzbietowego do jednej szklanej pipety, stosując podciśnienie przez strzykawkę. W razie potrzeby przesuń korzeń grzbietowy przed otwór elektrody za pomocą cienkiej igły.</li>
	<li>Jeśli korzeń grzbietowy leży suchy w elektrodzie ssącej, dodaj trochę aCSF do jego końcówki, ostrożnie ssąc, aż pipeta zostanie wystarczająco wypełniona aCSF.</li>
	<li>Po zassaniu korzenia grzbietowego podnieś końcówkę elektrody z rdzenia kręgowego. Należy uważać, aby żaden "mostek wodny" między końcówką pipety a rdzeniem kręgowym nie spowodował zwarcia elektrody rejestrującej/stymulującej.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.3-3.6 dla sąsiedniego korzenia ipsilateralnego.</li>
	<li>Umieść elektrodę odniesienia jak najbliżej korzeni grzbietowych i utrzymuj ją zwilżoną, nakładając płyn CSF.</li>
	<li>Ustalając konfigurację nagrywania, jeden korzeń jest już wybrany do stymulacji, a drugi do nagrywania. Zwiększaj napięcie stopniowo, podczas gdy nagrywanie od drugiego korzenia grzbietowego odbywa się w bieżącym trybie cęgowym. Można zauważyć krótkie odchylenie w dół, po którym następuje powolne, długotrwałe odchylenie w górę, reprezentujące DRP.</li>
	<li>Dostosuj napięcie bodźca do poziomów supramaksymalnych i nagraj kilka przemiatania (co najmniej 20 - 30 przeciągnięć/korzeń grzbietowy przy 0,1 Hz, filtruj między 0,3 Hz-3 kHz).</li>
	<li>Nagrywaj krótkie ciągi trzech bodźców (100 Hz), aby uzyskać informacje o zależnym od czasu sumowaniu DRP.</li>
	<li>Przełącz miejsce nagrywania i stymulacji na dodatkowe nagrania kontralateralne.</li>
	<li>Zwierzęta nie są przeznaczone do przeżycia zabiegu. Składanie ofiar ze zwierząt po ostatnim nagraniu przez dekapitację, nadal pod wpływem głębokiego znieczulenia (ketamina/ksylazyna, patrz wyżej, krok 2.2).</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Przenieś dane do programu analitycznego (np. Sigma Plot, Igor Pro lub MATLAB).</li>
	<li>Oblicz średnie ślady z 20-30 przebiegów.</li>
	<li>Weź maksymalną amplitudę ugięcia napięcia (od linii podstawowej; Amplituda piku DRP) do dalszej analizy (rysunek 3).</li>
	<li>Oblicz stosunek amplitudy piku DRP po trzech impulsach i pojedynczym impulsie, aby uzyskać miarę zależnego od czasu sumowania kolejnych potencjałów.</li>
</ol>

<ol><li>Eccles, J. C., Eccles, R. M., Magni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+inhibitory+action+attributable+to+presynaptic+depolarization+produced+by+muscle+afferent+volleys%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Central inhibitory action attributable to presynaptic depolarization produced by muscle afferent volleys.</a> J. Physiol. 159, 147-166 (1961).</li>
<li>Levy, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+gaba+in+primary+afferent+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The role of gaba in primary afferent depolarization.</a> Prog. Neurobiol. 9, 211-267 (1977).</li>
<li>Eccles, J. C., Magni, F., Willis, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarization+of+central+terminals+of+Group+I+afferent+fibres+from+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Depolarization of central terminals of Group I afferent fibres from muscle.</a> J. Physiol. 160, 62-93 (1962).</li>
<li>Eccles, J. C., Schmidt, R., Willis, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Studies+on+Presynaptic+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Studies on Presynaptic Inhibition.</a> J. Physiol. 168, 500-530 (1963).</li>
<li>Maxwell, D. J., Bannatyne, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+muscle+spindle+afferent+terminations+in+lamina+VI+of+the+cat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of muscle spindle afferent terminations in lamina VI of the cat spinal cord.</a> Brain Res. 288, 297-301 (1983).</li>
<li>Barber, R. P., Vaughn, J. E., Saito, K., McLaughlin, B. J., Roberts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+terminals+are+presynaptic+to+primary+afferent+terminals+in+the+substantia+gelatinosa+of+the+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">GABAergic terminals are presynaptic to primary afferent terminals in the substantia gelatinosa of the rat spinal cord.</a> Brain Res. 141, 35-55 (1978).</li>
<li>Wall, P. D., Lidierth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+sources+of+a+dorsal+root+potential%3A+their+interactions+and+origins+in+the+superficial+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Five sources of a dorsal root potential: their interactions and origins in the superficial dorsal horn.</a> J. Neurophysiol. 78, 860-871 (1997).</li>
<li>Rudomin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+lost+presynaptic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">In search of lost presynaptic inhibition.</a> Exp. Brain Res. 196, 139-151 (2009).</li>
<li>Rudomin, P., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+inhibition+in+the+vertebrate+spinal+cord+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Presynaptic inhibition in the vertebrate spinal cord revisited.</a> Exp. Brain Res. 129, 1-37 (1999).</li>
<li>Kullmann, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic%2C+extrasynaptic+and+axonal+GABAA+receptors+in+the+CNS%3A+where+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Biophys.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic, extrasynaptic and axonal GABAA receptors in the CNS: where and why?</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 87, 33-46 (2005).</li>
<li>Hochman, S., Shreckengost, J., Kimura, H., Quevedo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+inhibition+of+primary+afferents+by+depolarization%3A+observations+supporting+nontraditional+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic inhibition of primary afferents by depolarization: observations supporting nontraditional mechanisms.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 140-152 (2010).</li>
<li>Thompson, S. W., Wall, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+GABA+and+5-HT+receptor+antagonists+on+rat+dorsal+root+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">The effect of GABA and 5-HT receptor antagonists on rat dorsal root potentials.</a> Neurosci. Lett. 217, 153-156 (1996).</li>
<li>Enriquez-Denton, M., Manjarrez, E., Rudomin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+PAD+and+presynaptic+inhibition+of+muscle+spindle+afferents+after+peripheral+nerve+crush%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Persistence of PAD and presynaptic inhibition of muscle spindle afferents after peripheral nerve crush.</a> Brain Res. 1027, 179-187 (2004).</li>
<li>Wall, P. D., Devor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+peripheral+nerve+injury+on+dorsal+root+potentials+and+on+transmission+of+afferent+signals+into+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of peripheral nerve injury on dorsal root potentials and on transmission of afferent signals into the spinal cord.</a> Brain Res. 209, 95-111 (1981).</li>
<li>Witschi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+%CE%B12-GABAA+Receptors+in+Primary+Afferent+Depolarization+and+Spinal+Pain+Control%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic α2-GABAA Receptors in Primary Afferent Depolarization and Spinal Pain Control.</a> J. Neurosci. 31, 8134-8142 (2011).</li>
<li>Calancie, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+alterations+in+presynaptic+inhibition+contribute+to+segmental+hypo-+and+hyperexcitability+after+spinal+cord+injury+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Evidence that alterations in presynaptic inhibition contribute to segmental hypo- and hyperexcitability after spinal cord injury in.</a> 89, 177-186 (1993).</li>
<li>Geis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li>
<li>Geis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+directed+against+amphiphysin+induces+anxiety+behavior+in+a+rat+model+after+intrathecal+passive+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Human IgG directed against amphiphysin induces anxiety behavior in a rat model after intrathecal passive transfer.</a> J. Neural Transm. 119 (8), 981-985 (2012).</li>
<li>Barron, D. H., Matthews, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interpretation+of+potential+changes+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The interpretation of potential changes in the spinal cord.</a> J. Physiol. 92, 276-321 (1938).</li>
<li>Schmidt, R. F., Trautwein, W., Zimmermann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+root+potentials+evoked+by+natural+stimulation+of+cutaneous+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dorsal root potentials evoked by natural stimulation of cutaneous afferents.</a> Nature. 212, 522-523 (1966).</li>
<li>Eccles, J. C., Schmidt, R. F., Willis, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+inhibition+of+the+spinal+monosynaptic+reflex+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic inhibition of the spinal monosynaptic reflex pathway.</a> J. Physiol. 161, 282-297 (1962).</li>
<li>Manjarrez, E., Rojas-Piloni, J. G., Jimenez, I., Rudomin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+transmission+from+segmental+afferents+by+spontaneous+activity+of+dorsal+horn+spinal+neurones+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic transmission from segmental afferents by spontaneous activity of dorsal horn spinal neurones in the cat.</a> J. Physiol. 529 Pt 2, 445-460 (2000).</li>
<li>Geis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Stiff-Person+Syndrome+IgG+Induces+Anxious+Behavior+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human Stiff-Person Syndrome IgG Induces Anxious Behavior in Rats.</a> PLoS One. 6, e16775(2011).</li>
<li>Martinez-Gomez, J., Lopez-Garcia, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+pharmacological+characterisation+of+ascending+anterolateral+axons+in+the+in+vitro+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and pharmacological characterisation of ascending anterolateral axons in the in vitro mouse spinal cord.</a> J. Neurosci. Methods. 146, 84-90 (2005).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Zewnątrz- i wewnątrzkomórkowe elektrofizjologiczne zapisy aktywności neuronalnej i potencjałów synaptycznych in vivo są najnowocześniejszymi technikami badania funkcji neuronalnych i patofizjologii OUN. Integracja kręgosłupa ma kluczowe znaczenie dla funkcji motorycznych, np . ruchów kończyn i multimodalnej percepcji sensorycznej. Hamowanie presynaptyczne jest jednym z krytycznych mechanizmów w tym procesie obliczeniowym, zapewniającym odpowiednie reakcje na bodźce sensoryczne. Synapsy GABA-ergiczne na ...

Hamowanie presynaptyczne jest jednym z najpotężniejszych mechanizmów hamujących w rdzeniu kręgowym. Hamuje pobudzające potencjały postsynaptyczne (EPSP) w monosynaptycznie wzbudzonych neuronach ruchowych bez zmiany potencjału błony postsynaptycznej i pobudliwości neuronów ruchowych1-3. Pierwotna depolaryzacja aferentna (PAD) indukowana przez GABA-ergiczne synapsy akso-aksonalne na czuciowe włókna presynaptyczne jest mechanizmem leżącym u podstaw4-7 (patrz również ryc. 1a). Synapsy te zawierają receptory GABAA iGABA B (GABAAR i GABABR). Aktywność GABA, AR prowadzi do wzrostu przewodnictwa chlorków, które wywołuje PAD ze względu na lokalną dystrybucję jonów. Ta depolaryzacja blokuje propagację potencjałów czynnościowych do zakończeń aksonów i zmniejsza ich siłę, prowadząc do zmniejszonego napływu Ca2+ i zmniejszenia uwalniania nadajnika. Aktywacja receptorów GABAB nie przyczynia się do PAD, ale prowadzi do zmniejszenia napływu Ca2 +, zwiększając w ten sposób hamowanie presynaptyczne. Podczas gdy aktywacja GABAAR wydaje się być zaangażowana w krótkotrwałe hamowanie, GABABR są zaangażowane w długoterminową modulację8-10. Oprócz GABA, który odpowiada za główną część PAD i hamowania presynaptycznego, inne systemy przekaźnikowe mogą również modulować i przyczyniać się do tego mechanizmu11,12.
Patologiczne zmiany w hamowaniu presynaptycznym wydają się być kluczowe w kilku stanach chorobowych, np. zapalenie obwodowe i ból neuropatyczny13,14, a także nieprawidłowe przetwarzanie bólu ośrodkowego15, uraz rdzenia kręgowego16 i choroba OUN z nadpobudliwością motoryczną, w której pośredniczy wadliwa transmisja GABA-ergyczna17,18. Dlatego oszacowanie inhibicji presynaptycznej jest warte zbadania eksperymentalnych stanów patologicznych na poziomie rdzenia kręgowego in vivo. PAD powoduje powstanie potencjałów przewodzonych objętościowo, zapewniając bezpośrednią miarę hamowania presynaptycznego w rdzeniu kręgowym. Potencjały te nazywane są potencjałami korzeni grzbietowych (DRP) i można je zmierzyć z korzeni grzbietowych rdzenia kręgowego po stymulacji sąsiednich korzeni grzbietowych7.
Pierwsze pomiary DRP zostały odnotowane u kotów i żab19 i były intensywnie badane u kotów przez Ecclesa, Schmidta i innych na początku lat siedemdziesiątych3,4,20,21. Podczas gdy zapisy in vivo DRP u kotów22 i szczurów23 były szeroko stosowane, pomiary na myszach wykonywano prawie wyłącznie w izolowanych preparatach rdzenia kręgowego ex vivo 15,24. W tym miejscu opisujemy metodę rejestrowania DRP u znieczulonych myszy in vivo, co pozwala na bezpośredni pomiar hamowania presynaptycznego w nienaruszonym organizmie.

<table><tbody><tr><td>Rurki szklane (średnica wewnętrzna 1,16 mm)</td><td>Science Products (Hofheim, Niemcy)</td><td>GB200F-10</td><td>Inne rurki szklane mogą być również odpowiednie</td></tr><tr><td>Roztwór do superfuzji (sterylny, 0,9% NaCl)</td><td>Braun Melsungen AG</td><td>3570350</td><td></td></tr><tr><td>Rompun 2% (ksylazyna)</td><td>Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine 10%</td><td>Medistar GmbH (Ascheberg, Niemcy)</td><td>KETAMIN 10%</td><td></td></tr><tr><td>30 G Mikroigłowy / Sterican</td><td>Braun Melsungen AG</td><td>4656300</td><td></td></tr><tr><td>Sole do aCSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Diverse</td><td></td></tr><tr><td>S88 Dual Output Square Pulse</td><td>Grass Technologies (Warwick, USA)</td><td>S88X</td><td></td></tr><tr><td>SIU5 RF Transformer Isolation Unit</td><td>Grass Technologies (Warwick, USA)</td><td>SIU-V</td><td></td></tr><tr><td>InstruTECH LIH 8+8</td><td>HEKA ( Lambrecht, Deutschland)</td><td>LIH 8+8 + oprogramowanie Patchmaster</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalny wzmacniacz</td><td>NPI (Tamm, Deutschland)</td><td>ELC-03X</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments (Novato, USA)</td>Mikroskop preparacyjny <td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus (Tokio, Japonia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments (Novato, USA)</td><td>MPC-200/MPC-325</td><td>Możliwe również mikromanipulatory mechaniczne</td></tr><tr><td>Homeotermiczny system</td><td>Stoelting (Wood Dale, USA)</td><td>50300V</td><td></td></tr><tr><td>Wewnątrz/zewnątrzkomórkowy uchwyt elektrody rejestrującej</td><td>Aparat Harvarda (Holliston, USA)</td><td>641227</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar rdzeniowego hamowania presynaptycznego u myszy za pomocą zapisu potencjału korzenia grzbietowego in vivo

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Hamowanie presynaptyczne jest jednym z najpotężniejszych mechanizmów hamujących w rdzeniu kręgowym. Podstawowym mechanizmem fizjologicznym jest depolaryzacja pierwotnych włókien doprowadzających, w której pośredniczą synapsy akso-aksonalne GABA-ergiczne (pierwotna depolaryzacja aferentna). Siłę pierwotnej depolaryzacji aferentnej można zmierzyć, rejestrując potencjały przewodzone objętościowo w korzeniu grzbietowym (potencjały korzenia grzbietowego, DRP). Patologiczne zmiany hamowania presynaptycznego mają kluczowe znaczenie w nieprawidłowym centralnym przetwarzaniu niektórych stanów bólowych oraz w niektórych zaburzeniach nadpobudliwości ruchowej. W tym miejscu opisujemy metodę rejestrowania DRP in vivo u myszy. Wyjaśniono przygotowanie korzeni grzbietowych rdzenia kręgowego u znieczulonego zwierzęcia oraz procedurę rejestracji za pomocą elektrod ssących. Metoda ta pozwala na pomiar GABA-ergicznego DRP, a tym samym oszacowanie rdzeniowego hamowania presynaptycznego u żywej myszy. W połączeniu z transgenicznymi modelami myszy, zapis DRP może służyć jako potężne narzędzie do badania patofizjologii kręgosłupa związanej z chorobą. Zapis in vivo ma kilka zalet w porównaniu z preparatami izolowanymi ex vivo rdzenia kręgowego, np. możliwość jednoczesnego rejestrowania lub manipulowania sieciami nadrdzeniowymi oraz indukcja DRP poprzez stymulację nerwów obwodowych.

Typowe zapisy DRP przedstawiono na Rysunku 3. Po wyraźnym artefakcie stymulacji zazwyczaj następuje krótkie odchylenie w dół. Następnie wyraźnie widoczne jest powolne, długotrwałe odchylenie w górę, reprezentujące DRP. W części zapisów odruchy korzenia grzbietowego są widoczne jako małe skoki na szczycie DRP. U normalnych myszy typu dzikiego odruchy korzenia grzbietowego pojawiają się najczęściej, gdy napięcie stymulacji jest zbyt wysokie. Ponieważ odruchów korzenia grzbietowego nie można wywołać z wysok...

Inhibicyjne presynaptyczne GABAergiczne jest potężnym mechanizmem hamującym w rdzeniu kręgowym, ważnym dla integracji sygnałów motorycznych i czuciowych w sieciach rdzenia kręgowego. Podstawową pierwotną depolaryzację aferentną można zmierzyć poprzez rejestrację potencjałów korzenia grzbietowego (DRP). Tutaj demonstrujemy metodę rejestracji in vivo DRP u myszy.

Pomiar rdzeniowego hamowania presynaptycznego u myszy za pomocą zapisu potencjału korzenia grzbietowego in vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Hamowanie presynaptyczne jest jednym z najsilniejszych mechanizmów hamowania w rdzeniu kręgowym. Patologiczne zmiany w hamowaniu presynaptycznym odgrywają istotną rolę w mechanizmach kilku wzorców chorobowych, na przykład w przypadku bólu neuropatycznego i zapalnego, a także nieprawidłowego centralnego przetwarzania bólu.Ma to istotne znaczenie w przypadku urazów rdzenia kręgowego oraz zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego z nadmierną pobudliwością ruchową. Dlatego podczas badań nad modelami zwierzęcymi tych schorzeń, poznanie siły hamowania presynaptycznego dostarczyłoby istotnych informacji. Przedstawiamy tutaj metodę oceny hamowania presynaptycznego w modelu mysim.Hamowanie presynaptyczne in vivo jest pośredniczone przez depolaryzację pierwotnych zakończeń nerwowych, wywołaną przez GABAergiczne synapsy aksonalno-aksonalne na presynaptycznych włóknach sensorycznych. Aktywność receptorów GABA-A prowadzi do wzrostu przewodnictwa chlorkowego, co następnie wywołuje depolaryzację aferentną pierwotną ze względu na lokalny rozkład stężeń jonów. Depolaryzacja ta blokuje propagację potencjałów czynnościowych do zakończeń aksonalnych i zmniejsza ich amplitudę, co prowadzi do ograniczenia napływu wapnia i redukcji uwalniania neuroprzekaźnika.W ten sposób potencjały pobudzające postsynaptyczne w neuronach monrosynaptycznie pobudzanych mogą być hamowane bez zmiany potencjału błony postsynaptycznej i pobudliwości neuronów. Potencjał przewodzony objętościowo tej pierwotnej depolaryzacji ENT stanowi bezpośrednią miarę hamowania presynaptycznego w rdzeniu kręgowym; potencjały te można mierzyć z korzeni grzbietowych rdzenia kręgowego po stymulacji, a nazywa się je potencjałami korzeni grzbietowych. Pomiar potencjałów korzeni grzbietowych jest dobrze ugruntowany i szeroko stosowany u kotów, szczurów i żab, natomiast u myszy rejestracje były wykonywane niemal wyłącznie w preparatach izolowanego rdzenia kręgowego ex vivo. Opisujemy tutaj metodę rejestracji tych potencjałów korzeniowych u znieczulonych myszy in vivo, co pozwala na bezpośredni pomiar hamowania presynaptycznego w nienaruszonym organizmie.Do rejestracji DRP in vivo u myszy niezbędny jest następujący sprzęt. Standardowe narzędzia stereotaktyczne, stereomikroskop oraz trzy manipulatory do odpowiedniego pozycjonowania elektrody stymulującej, elektrody rejestrującej i elektrody referencyjnej. Ponadto wymagana jest rama dla myszy oraz mata grzewcza do kontroli temperatury ciała myszy podczas stymulacji i rejestracji, a także stymulator.Do poprawy stosunku sygnału do szumu wymagany jest standardowy wzmacniacz oraz układ akwizycji danych. Podczas rejestracji DRP niezbędne jest wykonanie specjalistycznych elektrod. Wyciągnij konwencjonalne rurki szklane za pomocą standardowej wyciągarki do pipet.Złam końcówkę elektrody za pomocą diamentowego pilnika, aby poszerzyć otwór wierzchołkowy. Wygładź końcówkę, polerując ją standardową palnikiem laboratoryjnym. Przed rozpoczęciem przygotowań znieczul zwierzę, podając ketaminę w zastrzyku domięśniowym (IP), a następnie unieruchom głowę myszy w stereotypowej ramie.Następnie sprawdź głębokość znieczulenia, uciskając tylną łapę (PO) myszy. Rozpocznij przygotowanie dopiero wtedy, gdy nie będzie widocznego cofania łapy; głębokość znieczulenia należy sprawdzać wielokrotnie w trakcie procedury. W razie potrzeby wykonuj powtarzalne zastrzyki ketaminy w tylny mięsień czworogłowy.Przedłuż znieczulenie, monitorując temperaturę ciała zwierzęcia za pomocą sondy rektalnej. W celu przygotowania słupów tylnych otwórz skórę wzdłuż linii środkowej grzbietu.Oddziel skórę od tkanki podścielonej, aby odizolować kręg od otaczającej go tkanki łącznej. Wykonaj dwa nacięcia po obu stronach kręgosłupa i poszerz je, rozsuwając tkankę skalpelem. Następnie usuń wyrostki kolczyste S za pomocą małych kleszczy kostnych.Zacznij od poziomu odcinka lędźwiowego. Przejdź do poziomów środkowego odcinka piersiowego, aby zapobiec wysychaniu rany operacyjnej. Umieść niewielkie kawałki gazy wokół rany i zwilż je 0.9% chlorkiem sodu.Następnie należy rozpocząć przygotowanie rdzenia kręgowego, zaczynając od odcinka lędźwiowego. Ostrożnie wsuń końcówkę wypustki kostnej w przestrzeń między dwa sąsiednie kręgi. Należy zwrócić szczególną uwagę na to, aby w maksymalnym stopniu zminimalizować nacisk wywierany na rdzeń kręgowy.Przejdź do poziomów piersiowych, nawilżając rdzeń kręgowy sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Powtarzaj tę czynność podczas wszystkich kolejnych etapów. Ostrożnie otwórz durometr, używając igły 30G.Następnie poluzuj i oddziel od kręgosłupa dwa sąsiednie korzenie po tej samej stronie. Potem przetnij korzenie tak dystalnie, jak to możliwe. W trakcie procedury.Należy zapobiegać nadmiernemu naciąganiu korzeni, ponieważ utrudni to ostatecznie prawidłową rejestrację DRP. Po umieszczeniu elektrody referencyjnej blisko rdzenia kręgowego, należy przesunąć końcówkę jednej elektrody sekcyjnej w bezpośrednie sąsiedztwo proksymalnego końca jednego korzenia grzbietowego. Następnie należy umieścić korzeń grzbietowy nad otworem końcówki elektrody ssącej.Następnie zassać korzeń grzbietowy do elektrody, przykładając krótkotrwałe podciśnienie za pomocą strzykawki połączonej z elektrodą. Potem wypełnić elektrodę płynem A CSF, przykładając niskie, ciągłe podciśnienie, aż roztwór otoczy zarówno korzeń grzbietowy, jak i srebrny drut chlorkowy wewnątrz elektrody. Następnie unieść końcówkę elektrody znad rdzenia kręgowego, aby żaden mostek cieczowy nie powodował zwarcia elektrody.Powtórz czynności dla drugiego sąsiedniego korzenia po tej samej stronie. Po ustawieniu obu elektrod rozpocznij rejestrację potencjałów korzeni grzbietowych (DRP), stymulując jeden korzeń i rejestrując sygnał z drugiego; zwiększ napięcie bodźca do poziomów supramaksymalnych. Typowe zapisy potencjałów korzeni grzbietowych wyglądają jak ten przedstawiony na lewym panelu.Krótki artefakt stymulacyjny jest następowany przez krótkie wychylenie dodatnie i przedłużone wychylenie ujemne. Ostatnie wychylenie stanowi właściwy potencjał korzenia grzbietowego. Jego amplitudę można obliczyć w stosunku do linii bazowej rejestrowanej bezpośrednio przed zapisem bodźca.Kilka śladów z jednej pary korzeni, będących artefaktami ruchów oddechowych lub artefaktami EKG, może zakłócać rejestrowany DRP. Po pomyślnym zarejestrowaniu sygnału możliwe jest zamienienie miejsc stymulacji i rejestracji oraz przeprowadzenie drugiego pomiaru. Przedstawiona metoda rejestracji.Pomiary potencjałów korzeniowych in vivo umożliwiają ocenę pierwotnego wejścia, antypolaryzacji oraz stanu całego organizmu zwierzęcia, szczególnie w połączeniu z wykorzystaniem myszy zmodyfikowanych genetycznie. Może to być potężne narzędzie do badania mechanizmów leżących u podstaw inhibicji rdzeniowej. Integracja rdzeniowa ma kluczowe znaczenie dla funkcji motorycznych i multimodalnej percepcji sensorycznej.Ta metoda jest użyteczna w badaniach nad bólem, urazami rdzenia kręgowego, urazami nerwów obwodowych oraz stanami zapalnymi. Rejestracja DRP in vivo umożliwia analizę oddziaływań aktywności nadrdzeniowej i pad. Nie jest to możliwe w przypadku izolowanych preparatów rdzenia kręgowego zazwyczaj stosowanych do pomiaru DRP u myszy.W zasadzie podawanie leków do rdzenia kręgowego jest możliwe podczas rejestracji. Lokalne podawanie za pomocą dodatkowych pipet mogłoby usprawnić i przyspieszyć kontrolę lokalnego stężenia leku.

measuring-spinal-presynaptic-inhibition-mice-dorsal-root-potential

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Pomiar hamowania przedsynaptycznego rdzenia kręgowego u myszy poprzez rejestrację potencjału korzeni grzbietowych in vivo

Opisano protokół obrazowania in vivo służący do monitorowania pierwotnych aksonów sensorycznych po zmiażdżeniu korzenia grzbietowego. Procedury te wykorzystują fluorescencyjną mikroskopię szerokopolową oraz myszy transgeniczne thy1-YFP i umożliwiają wielokrotne obrazowanie regeneracji aksonów na odcinku 4 cm w obwodowym układzie nerwowym (PNS) oraz oddziaływań aksonów z granicą ośrodkowego układu nerwowego (CNS).

Obrazowanie na żywo aksonów korzeni grzbietowych po ryzotomii

Opisano technikę obrazowania służącą do monitorowania zmian potencjału błonowego z rozdzielczością przestrzenną poniżej mikrometra i rozdzielczością czasową poniżej milisekundy. Technika ta, oparta na wzbudzaniu laserowym barwników wrażliwych na napięcie, umożliwia pomiar sygnałów w aksonach i kolaterałach aksonalnych, końcowych gałęziach dendrytycznych oraz pojedynczych kolcach dendrytycznych.

Rejestracja za pomocą barwników napięciowo-czułych z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych pojedynczych neuronów w skrawkach mózgu

Źródło: Shannonhouse, J., et al. In vivo Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego. J. Vis. Exp. (2023). Film przedstawia technikę obrazowania wapnia in vivo w celu monitorowania aktywności neuronalnej w zwojach korzenia grzbietowego (DRG) myszy transgenicznej. Neurony DRG wyrażają wskaźnik wapnia, który zwiększa intensywność fluorescencji po związaniu się z wapniem. Bodźce mechaniczne lub termiczne...

Obrazowanie in vivo wapnia zespołów neuronalnych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego myszy

Źródło: Lai, J., et al. Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcje środków hamujących do mózgu gryzonia. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje technikę opartą na mikroiniekcjach do jednoczesnego rejestrowania i hamowania neuronów w wzgórku górnym szczura. Procedura obejmuje celowanie stereotaktyczne, wiercenie czaszki i wprowadzenie iniekrody, która dostarcza neuroprzekaźnik hamujący, jednocześnie rejestrując aktywność neuronów. Stymulacja światłem wywołuje potencjały...

Hamowanie aktywności neuronalnej i jej wykrywanie za pomocą elektrofizjologii u szczura

Pomiary właściwości przewodnictwa nerwowego in vivo są przykładem potężnego narzędzia do charakteryzowania różnych zwierzęcych modeli chorób nerwowo-mięśniowych. Tutaj przedstawiamy łatwy i niezawodny protokół, za pomocą którego można przeprowadzić analizę elektrofizjologiczną nerwów kulszowych znieczulonych myszy.

In vivo (in vivo) Pomiary elektrofizjologiczne nerwów kulszowych myszy

Pokazujemy, jak przygotować ukośne wycinki rdzenia kręgowego u młodych myszy. Preparat ten pozwala na stymulację korzeni brzusznych.

Przygotowanie skośnych wycinków rdzenia kręgowego do stymulacji korzeni brzusznych

Pomiar przewodnictwa nerwowego jest użytecznym narzędziem do oceny mysich modeli neurodegeneracji, ale często jest stosowany tylko do stymulacji nerwu kulszowego w kończynach tylnych. W tym miejscu opisujemy technikę pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) in vivo w mięśniach kończyn przednich myszy unerwionych przez splot ramienny.

In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych

Zapis jednowłóknisty to skuteczna technika elektrofizjologiczna, która ma zastosowanie do ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Wraz z przygotowaniem nienaruszonego DRG z przyczepionym nerwem kulszowym badany jest mechanizm niewydolności przewodzenia. Oba protokoły poprawiają zrozumienie związku obwodowego układu nerwowego z bólem.

Zastosowanie zapisu pojedynczego włókna in vivo i nienaruszonego zwoju korzenia grzbietowego z przyczepionym nerwem kulszowym w celu zbadania mechanizmu uszkodzenia przewodzenia

Ten protokół opisuje in vivo wewnątrzkomórkowy zapis neuronów lędźwiowych szczura z jednoczesną przezrdzeniową stymulacją prądem stałym. Metoda ta pozwala na pomiar właściwości błony i rejestrację rytmicznego odpalania neuronów ruchowych przed, w trakcie i po anodowej lub katodowej polaryzacji rdzenia kręgowego.

Wewnątrzkomórkowy zapis in vivo zidentyfikowanych typów neuronów rdzeniowych szczura podczas transrdzeniowej stymulacji prądem stałym

Obecny protokół opisuje obrazowanie wapnia in vivo do pomiaru odpowiedzi zespołów neuronów DRG lędźwiowych-6 na bodźce somatyczne i trzewne. Można dokonać dokładnych porównań między neuronami reagującymi na różne bodźce. Protokół ten jest cenny w badaniu mechanizmów bólu trzewnego i stymulacji somatycznej, takich jak akupunktura.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe reakcji neuronów zwojów korzenia grzbietowego na bodźce somatyczne i trzewne

To badanie przedstawia chirurgiczną manipulację polegającą na uwidocznieniu T-DRG u znieczulonych myszy do obrazowania wapnia in vivo, wraz z synchronicznymi zapisami EKG. Metoda ta stanowi najnowocześniejsze narzędzie do badania obwodowej stymulacji nerwów elektrycznych i danych wejściowych narządów trzewnych klatki piersiowej, a także ich interakcji na podstawowym poziomie sensorycznym.

Obrazowanie in vivo wapnia zwojów korzenia grzbietowego klatki piersiowej (DRG) i zapis EKG w celu badania stymulacji nerwów obwodowych

Poznaj metodę pomiaru rdzeniowego hamowania presynaptycznego u myszy za pomocą zapisu potencjału korzenia grzbietowego in vivo. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów bólu i integracji sygnałów w rdzeniu kręgowym.

Pomiar rdzeniowego hamowania presynaptycznego u myszy za pomocą zapisu potencjału korzenia grzbietowego in vivo

Przeglądaj więcej filmów