Pomiar rdzeniowego hamowania presynaptycznego u myszy za pomocą zapisu potencjału korzenia grzbietowego in vivo
29 marca 2014
Inhibicyjne presynaptyczne GABAergiczne jest potężnym mechanizmem hamującym w rdzeniu kręgowym, ważnym dla integracji sygnałów motorycznych i czuciowych w sieciach rdzenia kręgowego. Podstawową pierwotną depolaryzację aferentną można zmierzyć poprzez rejestrację potencjałów korzenia grzbietowego (DRP). Tutaj demonstrujemy metodę rejestracji in vivo DRP u myszy.
Hamowanie presynaptyczne jest jednym z najsilniejszych mechanizmów hamowania w rdzeniu kręgowym. Patologiczne zmiany w hamowaniu presynaptycznym odgrywają istotną rolę w mechanizmach kilku wzorców chorobowych, na przykład w przypadku bólu neuropatycznego i zapalnego, a także nieprawidłowego centralnego przetwarzania bólu.
Ma to istotne znaczenie w przypadku urazów rdzenia kręgowego oraz zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego z nadmierną pobudliwością ruchową. Dlatego podczas badań nad modelami zwierzęcymi tych schorzeń, poznanie siły hamowania presynaptycznego dostarczyłoby istotnych informacji. Przedstawiamy tutaj metodę oceny hamowania presynaptycznego w modelu mysim.
Hamowanie presynaptyczne in vivo jest pośredniczone przez depolaryzację pierwotnych zakończeń nerwowych, wywołaną przez GABAergiczne synapsy aksonalno-aksonalne na presynaptycznych włóknach sensorycznych. Aktywność receptorów GABA-A prowadzi do wzrostu przewodnictwa chlorkowego, co następnie wywołuje depolaryzację aferentną pierwotną ze względu na lokalny rozkład stężeń jonów. Depolaryzacja ta blokuje propagację potencjałów czynnościowych do zakończeń aksonalnych i zmniejsza ich amplitudę, co prowadzi do ograniczenia napływu wapnia i redukcji uwalniania neuroprzekaźnika.
W ten sposób potencjały pobudzające postsynaptyczne w neuronach monrosynaptycznie pobudzanych mogą być hamowane bez zmiany potencjału błony postsynaptycznej i pobudliwości neuronów. Potencjał przewodzony objętościowo tej pierwotnej depolaryzacji ENT stanowi bezpośrednią miarę hamowania presynaptycznego w rdzeniu kręgowym; potencjały te można mierzyć z korzeni grzbietowych rdzenia kręgowego po stymulacji, a nazywa się je potencjałami korzeni grzbietowych. Pomiar potencjałów korzeni grzbietowych jest dobrze ugruntowany i szeroko stosowany u kotów, szczurów i żab, natomiast u myszy rejestracje były wykonywane niemal wyłącznie w preparatach izolowanego rdzenia kręgowego ex vivo. Opisujemy tutaj metodę rejestracji tych potencjałów korzeniowych u znieczulonych myszy in vivo, co pozwala na bezpośredni pomiar hamowania presynaptycznego w nienaruszonym organizmie.
Do rejestracji DRP in vivo u myszy niezbędny jest następujący sprzęt. Standardowe narzędzia stereotaktyczne, stereomikroskop oraz trzy manipulatory do odpowiedniego pozycjonowania elektrody stymulującej, elektrody rejestrującej i elektrody referencyjnej. Ponadto wymagana jest rama dla myszy oraz mata grzewcza do kontroli temperatury ciała myszy podczas stymulacji i rejestracji, a także stymulator.
Do poprawy stosunku sygnału do szumu wymagany jest standardowy wzmacniacz oraz układ akwizycji danych. Podczas rejestracji DRP niezbędne jest wykonanie specjalistycznych elektrod. Wyciągnij konwencjonalne rurki szklane za pomocą standardowej wyciągarki do pipet.
Złam końcówkę elektrody za pomocą diamentowego pilnika, aby poszerzyć otwór wierzchołkowy. Wygładź końcówkę, polerując ją standardową palnikiem laboratoryjnym. Przed rozpoczęciem przygotowań znieczul zwierzę, podając ketaminę w zastrzyku domięśniowym (IP), a następnie unieruchom głowę myszy w stereotypowej ramie.
Następnie sprawdź głębokość znieczulenia, uciskając tylną łapę (PO) myszy. Rozpocznij przygotowanie dopiero wtedy, gdy nie będzie widocznego cofania łapy; głębokość znieczulenia należy sprawdzać wielokrotnie w trakcie procedury. W razie potrzeby wykonuj powtarzalne zastrzyki ketaminy w tylny mięsień czworogłowy.
Przedłuż znieczulenie, monitorując temperaturę ciała zwierzęcia za pomocą sondy rektalnej. W celu przygotowania słupów tylnych otwórz skórę wzdłuż linii środkowej grzbietu.
Oddziel skórę od tkanki podścielonej, aby odizolować kręg od otaczającej go tkanki łącznej. Wykonaj dwa nacięcia po obu stronach kręgosłupa i poszerz je, rozsuwając tkankę skalpelem. Następnie usuń wyrostki kolczyste S za pomocą małych kleszczy kostnych.
Zacznij od poziomu odcinka lędźwiowego. Przejdź do poziomów środkowego odcinka piersiowego, aby zapobiec wysychaniu rany operacyjnej. Umieść niewielkie kawałki gazy wokół rany i zwilż je 0.9% chlorkiem sodu.
Następnie należy rozpocząć przygotowanie rdzenia kręgowego, zaczynając od odcinka lędźwiowego. Ostrożnie wsuń końcówkę wypustki kostnej w przestrzeń między dwa sąsiednie kręgi. Należy zwrócić szczególną uwagę na to, aby w maksymalnym stopniu zminimalizować nacisk wywierany na rdzeń kręgowy.
Przejdź do poziomów piersiowych, nawilżając rdzeń kręgowy sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Powtarzaj tę czynność podczas wszystkich kolejnych etapów. Ostrożnie otwórz durometr, używając igły 30G.
Następnie poluzuj i oddziel od kręgosłupa dwa sąsiednie korzenie po tej samej stronie. Potem przetnij korzenie tak dystalnie, jak to możliwe. W trakcie procedury.
Należy zapobiegać nadmiernemu naciąganiu korzeni, ponieważ utrudni to ostatecznie prawidłową rejestrację DRP. Po umieszczeniu elektrody referencyjnej blisko rdzenia kręgowego, należy przesunąć końcówkę jednej elektrody sekcyjnej w bezpośrednie sąsiedztwo proksymalnego końca jednego korzenia grzbietowego. Następnie należy umieścić korzeń grzbietowy nad otworem końcówki elektrody ssącej.
Następnie zassać korzeń grzbietowy do elektrody, przykładając krótkotrwałe podciśnienie za pomocą strzykawki połączonej z elektrodą. Potem wypełnić elektrodę płynem A CSF, przykładając niskie, ciągłe podciśnienie, aż roztwór otoczy zarówno korzeń grzbietowy, jak i srebrny drut chlorkowy wewnątrz elektrody. Następnie unieść końcówkę elektrody znad rdzenia kręgowego, aby żaden mostek cieczowy nie powodował zwarcia elektrody.
Powtórz czynności dla drugiego sąsiedniego korzenia po tej samej stronie. Po ustawieniu obu elektrod rozpocznij rejestrację potencjałów korzeni grzbietowych (DRP), stymulując jeden korzeń i rejestrując sygnał z drugiego; zwiększ napięcie bodźca do poziomów supramaksymalnych. Typowe zapisy potencjałów korzeni grzbietowych wyglądają jak ten przedstawiony na lewym panelu.
Krótki artefakt stymulacyjny jest następowany przez krótkie wychylenie dodatnie i przedłużone wychylenie ujemne. Ostatnie wychylenie stanowi właściwy potencjał korzenia grzbietowego. Jego amplitudę można obliczyć w stosunku do linii bazowej rejestrowanej bezpośrednio przed zapisem bodźca.
Kilka śladów z jednej pary korzeni, będących artefaktami ruchów oddechowych lub artefaktami EKG, może zakłócać rejestrowany DRP. Po pomyślnym zarejestrowaniu sygnału możliwe jest zamienienie miejsc stymulacji i rejestracji oraz przeprowadzenie drugiego pomiaru. Przedstawiona metoda rejestracji.
Pomiary potencjałów korzeniowych in vivo umożliwiają ocenę pierwotnego wejścia, antypolaryzacji oraz stanu całego organizmu zwierzęcia, szczególnie w połączeniu z wykorzystaniem myszy zmodyfikowanych genetycznie. Może to być potężne narzędzie do badania mechanizmów leżących u podstaw inhibicji rdzeniowej. Integracja rdzeniowa ma kluczowe znaczenie dla funkcji motorycznych i multimodalnej percepcji sensorycznej.
Ta metoda jest użyteczna w badaniach nad bólem, urazami rdzenia kręgowego, urazami nerwów obwodowych oraz stanami zapalnymi. Rejestracja DRP in vivo umożliwia analizę oddziaływań aktywności nadrdzeniowej i pad. Nie jest to możliwe w przypadku izolowanych preparatów rdzenia kręgowego zazwyczaj stosowanych do pomiaru DRP u myszy.
W zasadzie podawanie leków do rdzenia kręgowego jest możliwe podczas rejestracji. Lokalne podawanie za pomocą dodatkowych pipet mogłoby usprawnić i przyspieszyć kontrolę lokalnego stężenia leku.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje GABAergiczną inhibicję presynaptyczną w rdzeniu kręgowym, która jest kluczowym mechanizmem integrowania sygnałów motorycznych i sensorycznych. Przedstawiona metoda obejmuje rejestrację potencjałów korzeni grzbietowych (DRP) in vivo u myszy, co pozwala na uzyskanie wiedzy na temat inhibicji presynaptycznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Badania nad rdzeniem kręgowym
Wstęp
- Hamowanie presynaptyczne jest istotnym mechanizmem hamującym w rdzeniu kręgowym.
- Patologiczne zmiany w tym procesie hamowania są powiązane z różnymi chorobami.
- Zrozumienie hamowania presynaptycznego jest kluczowe dla badania urazów rdzenia kręgowego i zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego.
- Modele zwierzęce pomagają w ocenie siły hamowania presynaptycznego.
Cel badania
- Przedstawienie metody oceny hamowania presynaptycznego u myszy.
- Dostarczenie informacji na temat roli hamowania presynaptycznego w mechanizmach bólu.
- Pogłębienie zrozumienia integracji sieci rdzenia kręgowego.
Zastosowane metody
- Rejestracja potencjałów korzenia grzbietowego (DRP) in vivo.
- Wykorzystanie modeli mysich do badania inhibicji presynaptycznej.
- Techniki elektrofizjologiczne służące do pomiaru siły inhibicji.
- Analiza integracji sygnałów motorycznych i sensorycznych.
Główne wyniki
- Zaprezentowano wiarygodną metodę pomiaru DRP in vivo.
- Przedstawiono dowody na rolę hamowania presynaptycznego w funkcjonowaniu rdzenia kręgowego.
- Podkreślono znaczenie tego mechanizmu w różnych stanach bólowych.
- Przyczyniono się do zrozumienia integracji sygnałów sensorycznych i motorycznych.
Wnioski
- Hamowanie presynaptyczne jest kluczowe dla funkcjonowania sieci rdzenia kręgowego.
- Przedstawiona metoda może pomóc w przyszłych badaniach nad bólem i zaburzeniami rdzenia kręgowego.
- Zrozumienie tego mechanizmu może prowadzić do lepszych strategii terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośredni pomiar in vivo hamowania presynaptycznego w rdzeniu kręgowym za pomocą rejestracji potencjału korzenia grzbietowego (DRP) u myszy umożliwia precyzyjne badanie modulacji GABAergicznej w nienaruszonych obwodach neuronalnych. Zdolność ta jest kluczowa dla weryfikacji hipotez mechanistycznych w modelach bólu i nadmiernej pobudliwości ruchowej, co wspiera ciągłość translacyjną od etapu odkryć do badań przedklinicznych. Zgodność tej metody z transgenicznymi modelami mysimi zwiększa jej wartość w zakresie walidacji celów terapeutycznych istotnych dla danej choroby oraz w badaniach mechanistycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią kwantyfikację presynaptycznego hamowania GABAergicznego w istotnych dla przebiegu chorób szlakach neuronalnych.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka dla celów terapeutycznych w zaburzeniach bólowych i ruchowych poprzez pomiar funkcjonalnego hamowania in vivo.
- Ułatwia opartą na hipotezach walidację rdzeniowych mechanizmów hamowania w modelach genetycznie zmodyfikowanych.
Przesiew i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany odczyt elektrofizjologiczny do opracowywania testów funkcjonalnych w obwodach neuronalnych.
- Umożliwia powtarzalny pomiar amplitudy DRP jako ilościowego wyniku w badaniach przesiewowych związków chemicznych lub genetycznych.
- Wspiera standaryzację testów neuronalnych in vivo w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami chorób istotnymi dla bólu neuropatycznego, stanu zapalnego oraz nadpobudliwości ruchowej.
- Umożliwia ocenę interakcji nadrdzeniowych i obwodowych w nienaruszonych organizmach, co zwiększa translacyjną wartość prognostyczną.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój celów terapeutycznych i interwencji w oparciu o funkcjonalne dane in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje etap wczesnego odkrywania z walidacją przedkliniczną, łącząc badania mechanistyczne z badaniami translacyjnymi w zakresie zaburzeń bólowych i ruchowych.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia bezpośrednie odczyty funkcjonalne do weryfikacji hipotez dotyczących hamujących mechanizmów rdzeniowych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych pomiarów DRP, odpowiednich do opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie amplitud DRP w różnych warunkach eksperymentalnych i genotypach.
- Badania translacyjne: Zachowuje istotność fizjologiczną dzięki utrzymaniu połączeń nadrdzeniowych i obwodowych in vivo.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Możliwość adaptacji do różnorodnych modeli transgenicznych i kontekstów chorobowych w celu szerokiego zastosowania w badaniach i rozwoju (R&D).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz badaniach mechanistycznych nad hamowaniem rdzeniowym.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje in vivo badania elektrofizjologiczne w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez dostarczenie dowodów funkcjonalnych w systemach istotnych dla danej choroby.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i interwencji z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o mechanistyczne dane in vivo.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektrofizjologii in vivo oraz operacji na rdzeniu kręgowym myszy.
- Wymaga specjalistycznej aparatury, w tym elektrod ssących i wzmacniaczy do rejestracji DRP.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów znieczulenia, chirurgii i rejestracji w ramach zespołu.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych modeli transgenicznych i chorobowych przy zastosowaniu odpowiednich modyfikacji proceduralnych.
- Potencjalne ograniczenia obejmują złożoność techniczną oraz wrażliwość na artefakty fizjologiczne.
