Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Ogólnym celem tej procedury jest dokładne zobrazowanie endosomów w przestrzeni trójwymiarowej w czasie lub w czterech wymiarach. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie mięśni węża i ułożenie tkanki w naczyniu do obrazowania. Drugim krokiem jest zabarwienie tkanki niezbędnymi barwnikami, aby stymulować tworzenie endosomów.

Następnie preparat jest obrazowany w czterech wymiarach dla jednego lub więcej połączeń nerwowo-mięśniowych. Ostatnim krokiem jest dokładna analiza danych w celu scharakteryzowania zachowania makroendosomów. Ostatecznie obecność i ruch endosomów w czasie w przestrzeni presynaptycznej można wykazać za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego.

Główną zaletą tej techniki jest to, że mięsień brzuszny węża ma tylko grubość pojedynczego włókna, co pozwala na generowanie wysokiej jakości obrazów przy użyciu standardowej mikroskopii fluorescencyjnej epi W tym protokole zostaną użyte preparaty tkankowe z węża do pończoch. Tkanka powinna być przechowywana w niskich temperaturach, aby pozostała fizjologiczna przez dłuższy czas i przy mniejszym skażeniu bakteryjnym. W przypadku barwienia lizosomalnym barwnikiem życiowym barwnik rozpuszcza się od jednego do 5 000 w zimnym roztworze gadziego dzwonka.

Aby uzyskać końcowe stężenie 0,2 mikromola, dodaj barwnik do tkanki i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Po 15 minutach przemyj tkankę kilka razy zimnymi dzwonkami dla wszystkich zabarwień FM 1 43. Przed barwieniem należy wstępnie zamontować próbkę w naczyniu do obrazowania za pomocą kołków magnetycznych.

Na potrzeby tego filmu zostanie zademonstrowane tylko barwienie FM 1 43 przy użyciu stymulacji chlorkiem potasu. Barwnik rozcieńczony od jednego do 500 w pierścieniach o wysokiej zawartości chlorku potasu, aby uzyskać końcowe stężenie siedmiu mikromolowców, dodaje się do tkanki, a następnie tkankę inkubuje się w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez maksymalnie 30 do 60 sekund. Następnie szybko umyj trzy razy zimnymi dzwonkami przez około minutę na płukanie.

Wszystkie tkanki należy zobrazować tak szybko, jak to możliwe po zabarwieniu i umyciu zimnym roztworem dzwonka. Jeśli używany jest mikroskop odwrócony, należy użyć komory obrazowania, której dno zawiera cienkie okrągłe szkiełko nakrywkowe. Zazwyczaj komora obrazowania powinna mieć cienkie dno ze stali nierdzewnej o średnicy 25 milimetrów.

Szkiełko nakrywkowe o grubości numer jeden pośrodku, aby skonfigurować przygotowanie do obrazowania. Ustaw go za pomocą szpilek magnetycznych tak, aby mięsień był jak najlepiej wyśrodkowany w naczyniu do obrazowania i leżał jak najbardziej płasko. Przykryj preparat niewielką objętością roztworu dzwonka.

Zamontuj antenę, umieszczając ją jak najbliżej środka sceny. Wybierz odpowiedni obiektyw, aby uzyskać najwyższą możliwą rozdzielczość 3D. Cel wodny 63 x zostanie użyty we wszystkich eksperymentach w tej demonstracji.

Aby rozpocząć tę procedurę, otwórz okno obrazowania w skoroszycie slajdów 5.0. Kilka menu znajduje się tutaj w zakładkach. Wybierz obiektyw wodny 63 x za pomocą drugiej zakładki Z. Ustaw interwał stosu Z.

W tym przykładzie krok Z wynoszący 1,5 mikrona jest używany do obrazowania na żywo. Wybierz liczbę klatek na sekundę w trybie poklatkowym. Optymalna szybkość to taka, która jest wystarczająca do płynnego rozwiązywania zmian w czasie, takich jak interakcje ruchowe lub zdarzenia fuzji.

Na przykład 10 punktów czasowych w 32. odstępach czasu, co daje łączny interwał czasu wynoszący pięć minut. Następnie wybierz całkowitą głębię ostrości, wyświetlając terminal na żywo ręcznie skupiony na górze interesującego Cię ogniska, a następnie przejdź nieco powyżej. Wybierz opcję set top.

Powoli ustawiaj ostrość na próbce, aż wszystko stanie się nieostre. Również w tym przypadku liczba samolotów i łączne wartości przelotu będą wskazywać głębię ostrości wybraną w oknie przechwytywania. Wybierz przycisk radiowy używane pozycje górne i dolne, aby przenieść właśnie wybrane parametry Do przechwytywania obrazu rozpocznij akwizycję obrazu.

Wykonaj wszystkie obrazowania na żywo dla konkretnego preparatu. Zachowaj wszystkie surowe pliki danych, podczas gdy pamięć cyfrowa zwykle nie stanowi problemu. Czas przetwarzania jest znaczący nawet w przypadku szybkich komputerów osobistych lub stacji roboczych.

Z tego powodu przycinanie obrazów do obszaru zainteresowania gwarantuje, że cały obszar zainteresowania będzie znajdował się w przyciętym oknie przez cały czas. Kurs D może obejmować stosy obrazów przy użyciu odpowiedniego oprogramowania i prawidłowej funkcji rozrzutu punktowego, potwierdzić, że rozdzielczość została poprawiona i że algorytm dekonwolucji nie wygenerował żadnego artefaktu. Użyj algorytmu interpolacji, aby rozwinąć oś Z.

Sugerowana jest pozorna rozdzielczość, sześciokrotne rozszerzenie z rzeczywistej separacji płaszczyzny obrazu 1,5 mikrona do pozornej separacji 0,25 mikrona. Wykonaj regulacje kontrastu, jasności, filtrowania szumów, wybielania zdjęć i innych typowych korekt przetwarzania obrazu. W razie potrzeby.

Standardy manipulacji obrazami nakazują, aby w przypadku większości prac naukowych odpowiednie było stosowanie tych samych poprawek do wszystkich obrazów zarówno w stosie, jak i w różnych punktach czasowych. Konsekwencje danej korekty powinny być oceniane spośród wszystkich obrazów. Eksperymentuj z różnymi technikami filtrowania i ulepszania obrazu.

Na przykład lelos i filtrowanie są przydatne do zwiększenia kontrastu małych struktur nad tłem. Jasność pikseli w środku uruchomionego okna jest zwiększana, podczas gdy jasność otaczających obszarów jest zmniejszana. Należy pamiętać, że niektóre metody filtrowania nie działają dobrze w połączeniu.

Zastosować korektę dryftu, jeśli w czasie występuje znaczny ruch preparatu. Taki ruch jest powszechny w żywych mięśniach, nawet z dodanymi lekami w celu tłumienia potencjałów czynnościowych i potencjałów synaptycznych. Algorytm rejestracji pikseli wyrównuje obrazy poklatkowe i może zredukować, ale zwykle nie całkowicie wyeliminować taki ruch.

W tym badaniu wykorzystano cztery obrazowanie na żywo zakończeń nerwowo-mięśniowych węża w celu określenia, czy makroendosomy lub ja poruszają się w kierunku błony plazmatycznej i szybko znikają, co sugeruje, że ich liczba maleje, ponieważ niektóre z nich uzyskują dostęp do cyto. Dane są wyświetlane jako widoki objętości 3D w sześciu punktach czasowych z interwałem klatki wynoszącym 60 sekund. Aby zilustrować głębokość Z pojedynczego butonu, można zaobserwować, jak me oddala się od osi Y wskazywanej czerwoną przerywaną linią przez kilka klatek, zanim zniknie między punktami czasowymi piątym a szóstym, że czas potrzebny do zniknięcia był krótszy niż interwał klatki, jest zgodne z egzocytozą tuż przed zniknięciem.

Wydaje się, że ME znajduje się na błonie plazmatycznej pałek. Ten sam nieprzetworzony zestaw danych jest wyświetlany jako film w mniejszym powiększeniu. Sekwencja jest na chwilę zatrzymywana na początku każdego z 24 kroków obrotu 3D wokół osi Y, aby zwrócić uwagę na mający wkrótce zniknąć ja, oznaczony czerwoną strzałką.

Zauważ, że ME jest widoczne, zbliża się do krawędzi butonu, znika i nie powraca we wszystkich perspektywach oglądania. Ze względu na niższą rozdzielczość osi Z w porównaniu z rozdzielczością XY, kształt ME wydaje się wydłużać i skracać w zależności od perspektywy patrzenia. Badania mikroskopii elektronowej wykazały, że endosomy w końcach motorycznych są małe w pobliżu granicy dyfrakcji światła.

W związku z tym fuzji tych endosomów nie można absolutnie odróżnić od ścisłego związku przestrzennego na poziomie światła. W tym badaniu Mees oznaczono FM 1 43 wskazanym na zielono, a endosomy kwasowe lub AE oznaczono lizosomem. Barwnik życiodajny oznaczony na czerwono z jednego punktu czasowego filmu z czterech D jest wyświetlany jako widoki objętości 3D w trzech orientacjach.

Górne panele od pierwszego do trzeciego pokazują konwencjonalny widok znad płaszczyzny XY. Środkowe panele od czwartego do szóstego pokazują widok prostopadły do płaszczyzny XY i w kierunku dużej czerwonej strzałki. Dolne panele od siódmego do dziewiątego pokazują widok wzajemnie prostopadły do obu widoków powyżej, w kierunku dużej niebieskiej strzałki.

Ja jest oznaczone zieloną strzałką, a dwa AE są oznaczone czerwonymi strzałkami. Struktury, które fluoryzowały w obu kolorach wydając się żółtymi, były sporadycznie rejestrowane w czterech rekordach obrazów D. W tym przykładzie endosom zawierający oba barwniki jest oznaczony żółtą strzałką w panelach trzecim, szóstym i dziewiątym.

Nakładanie się czerwieni i zieleni jest jednakowo kompletne we wszystkich trzech rzutach ortogonalnych, co wskazuje na domniemaną fuzję em me ae. Ten film przedstawia ten sam zestaw danych skonfigurowany do obracania wokół osi Y z prędkością jednej klatki na sekundę. Przypuszczalna stopiona MEAE pozostaje żółta ze wszystkich perspektyw.

Dekonwolucja cyfrowa jest przydatnym narzędziem do zwiększania rozdzielczości obrazów 3D, a także czterech obrazów D. Porównanie danych pierwotnych i danych zdecentralizowanych przedstawiono tutaj. Dla jednego typowego zakończenia nerwowego węża barwionego podczas stymulacji FM 1 43 Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu 30 do 60 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak kolokalizacja makroendosomów z markerami presynaptycznymi.