Name: Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-16T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Poznaj dynamikę endosomów w żywych zakończeniach nerwowych węża za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego. Ta metoda umożliwia obserwację fuzji i egzocytozy endosomów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez U.S. National Institutes of Health Grant NS-024572 (dla R.S.W.).

1. Barwienie preparatu barwnikami Supravital
<ol>
	<li>Aby zapoznać się z protokołem sekcji węża do pończoch, patrz Stewart i wsp.5 oraz Teng i wsp.6 Tkanka gadzia pozostaje fizjologiczna przez dłuższy czas i z mniejszym zanieczyszczeniem bakteryjnym, gdy jest przechowywana w niskich temperaturach (patrz poniżej). Tkanka ssaków jest zwykle utrzymywana w temperaturze pokojowej lub wyższej.</li>
	<li>W celu barwienia lizosomalnym barwnikiem witalnym rozpuść barwnik w zimnym roztworze Ringera w stosunku 1:5 000 (0,2 μM). Inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Umyj kilka razy zimnymi dzwonkami. Obraz tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>W przypadku barwienia FM1-43 przy użyciu stymulacji KCl należy rozcieńczyć barwnik w Ringerach o wysokiej zawartości KCl 1:500 (7 μM). Inkubować w temperaturze 4 °C maksymalnie 30-60 sekund. Umyj szybko trzy razy zimnymi Ringerami, ~1 min/płukanie. Obraz tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>W przypadku barwienia FM1-43 przy użyciu stymulacji hipertonicznej (sacharozy) należy rozcieńczyć barwnik w 0,5 M sacharozy Ringera, jak powyżej. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 2-5 minut. Umyć jak w kroku 1.3 powyżej zimnymi dzwonkami. Obraz tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>W przypadku barwienia FM1-43 za pomocą stymulacji elektrycznej, patrz Teng i wsp.6 Krótko mówiąc, preparat umieszcza się w naczyniu zawierającym fizjologiczny roztwór soli fizjologicznej i barwnik. Nerw jest stymulowany zaprogramowanym ciągiem impulsów prostokątnych o długości 200 μs (~7 V, 30 Hz, 18 μs). Umyć jak w kroku 1.3 powyżej zimnymi dzwonkami. Obraz tak szybko, jak to możliwe.</li>
</ol>
2. Konfiguracja przygotowania do obrazowania
<ol>
	<li>Ustaw preparat tak, aby interesujące nas struktury znajdowały się jak najbliżej obiektywu mikroskopu.</li>
	<li>Jeśli używany jest mikroskop odwrócony, należy użyć komory, której dno zawiera cienkie okrągłe szkiełko nakrywkowe. Zazwyczaj komora obrazowania powinna mieć cienkie dno ze stali nierdzewnej ze szklaną szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 25 mm o grubości #1 pośrodku. W przypadku użycia mikroskopu pionowego dolne szkiełko nakrywkowe nie jest wymagane, ale jest przydatne, aby umożliwić obrazowanie w świetle przechodzącym (np. kontrast interferencyjny różnicowy, DIC) w celu zorientowania próbki i zlokalizowania interesujących obiektów.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni obiektyw, aby uzyskać najwyższą możliwą rozdzielczość 3D. Istnieją kompromisy między przysłoną numeryczną (nie dotyczy), odległością roboczą, powiększeniem i rodzajem obiektywu (suchy, zanurzony w wodzie i oleju). W przypadku cienkich preparatów, takich jak kultury tkankowe, najlepsze są obiektywy olejowe. Za pomocą mikroskopu pionowego nałóż szkiełko nakrywkowe na kąpiel wodną i użyj olejku immersyjnego między górną częścią szkiełka nakrywkowego a obiektywem.</li>
	<li>Jeśli używane jest oprogramowanie do dekonwolucji, dostawca może zapewnić z góry określone funkcje rozrzutu punktowego (PSF) dla określonych celów. W przypadku braku takich informacji lub w przypadku wybrania obiektywu bez podparcia, należy określić poliestrowe włókna odcinkowe poprzez obrazowanie mikrokropek fluorescencyjnych lub podobnych obiektów o ograniczonej dyfrakcji7,8.</li>
</ol>
3. Ustal żądaną głębię ostrości i liczbę żądanych obrazów na klatkę poklatkową
<ol>
	<li>Wybierz całkowitą głębię ostrości, tak aby poruszające się lub oddziałujące ze sobą struktury zainteresowania nie znikały ani nie traciły ostrości podczas poruszania się w kierunku z. Pole z powinno nieznacznie przekraczać pionowy wymiar obrazowanej komórki lub procesu komórkowego. W przypadku końcówek silnikowych kręgowców typowo przyjmuje się 15-20 μm.</li>
	<li>Oblicz krok osi Z wymagany dla każdego przyrostu ostrości. Rozdzielczość wzdłuż osi z różni się w zależności od właściwości obiektywu; Jest to około jednej czwartej rozdzielczości płaszczyzny X-Y. Jeśli używane jest oprogramowanie do obrazowania konfokalnego lub dekonwolucji, rozdzielczość osi z ulega poprawie. Poprawiono rozdzielczość końcową poprzez celowe nadpróbkowanie w kierunku z 5, ale zobacz także krok 3.3 poniżej. Typowy odstęp między krokami mieści się w zakresie 400-1 500 nm dla obiektywów 40-100X. Światło powinno być wyłączone między każdym obrazem z krokiem z.</li>
	<li>Wybierz liczbę obrazów na stos z, czyli żądaną głębię ostrości podzieloną przez interwał kroku. Czas na wykonanie typowego z-stacka to 1-10 sekund. Szybko poruszające się obiekty (100 nm/s) mogą wydawać się rozmyte w stosie obrazów 3D, ponieważ każda płaszczyzna obrazu odpowiada nieco innemu punktowi czasowemu. Ponadto, każde dodatkowe zdjęcie przyczynia się do fotowybielania i możliwej fototoksyczności (patrz Dyskusja). Jeśli którakolwiek z tych sytuacji ma zastosowanie, wybierz większy krok z, aby zebrać mniej obrazów na stos. Kompensacja nastąpiła później za pomocą oprogramowania do interpolacji obrazu (krok 6.3 poniżej).</li>
</ol>
4. Wybierz liczbę klatek na sekundę poklatkową
Wybierz poprzez eksperymentowanie szybkość, która jest wystarczająca do płynnego rozwiązywania zmian w czasie, takich jak ruch, interakcje lub zdarzenia fuzji9. Niedostateczne próbkowanie może powodować artefakty ruchu (błędy próbkowania), podczas gdy nadpróbkowanie niepotrzebnie zwiększa ekspozycję na światło. Zebrać albo pojedynczą długą sekwencję, albo kilka powtarzających się sekwencji z tego samego preparatu, z których każda ma stosunkowo mały całkowity odstęp czasu (np. 10 punktów czasowych x 30 sekund przerwy = 5 minut). Jeśli to możliwe, view preparat z ciągłym oświetleniem epifluorescencyjnym, aby z grubsza oszacować prędkości ruchu, w tym dryf całego preparatu, jeśli jest obecny.
5. Wykonaj wszystkie obrazowania na żywo dla konkretnego przygotowania
Reptiliańskie preparaty zazwyczaj pozostają mocne przez ~1-2 godziny, dłużej, jeśli są schłodzone.
6. Analizuj dane zgodnie z pożądanym zastosowaniem
<ol>
	<li>Zachowaj wszystkie nieprzetworzone pliki danych. Podczas gdy cyfrowa pamięć masowa zwykle nie stanowi problemu, czas przetwarzania jest znaczący nawet w przypadku szybkich komputerów osobistych lub stacji roboczych. Z tego powodu przytnij obrazy do obszaru zainteresowania [ROI]. Upewnij się, że cały obszar zainteresowania znajduje się w przyciętym oknie przez cały przebieg czasu.</li>
	<li>Dekonwoluuj stosy obrazów za pomocą odpowiedniego oprogramowania i odpowiedniej funkcji rozrzutu punktowego. Upewnij się, że rozdzielczość została poprawiona i że algorytm dekonwolucji nie wygenerował żadnego artefaktu. Rysunek 3 przedstawia przykładowe obrazy.</li>
	<li>Użyj algorytmu interpolacji, aby rozszerzyć rozdzielczość pozorną osi z. Sugeruje się 6-krotne rozszerzenie z rzeczywistej separacji płaszczyzny obrazu 1,5 μm do pozornej separacji 0,25 μm. Alternatywnie można użyć kombinacji nadpróbkowania (krok 3.2) i interpolacji.</li>
	<li>W razie potrzeby wykonaj regulacje kontrastu, jasności, filtrowania szumów, fotowybielania i innych typowych korekt przetwarzania obrazu. Standardy manipulacji obrazami nakazują, aby w przypadku większości prac naukowych odpowiednie było stosowanie tych samych poprawek do wszystkich obrazów, zarówno w stosie, jak i w różnych punktach czasowych. Konsekwencje konkretnej korekty powinny być oceniane spośród wszystkich obrazów 9.</li>
	<li>Wybierz określony tryb wyświetlania dla eksportu danych. Najprostszym sposobem wyświetlania jest wideo stereo przy użyciu czerwono-zielonych lub czerwono-niebieskich anaglifów (przykłady na rysunku 3), par stereo lub naprzemiennych oprawek lewego/prawego oka z okularami migawkowymi. Anaglify są ograniczone do jednokolorowych. W razie potrzeby zwiększ pozorną głębię obrazu, aby poprawić rozdzielczość wizualną osi z.</li>
	<li>Eksperymentuj z różnymi technikami filtrowania i ulepszania obrazu. Na przykład filtrowanie Laplace'a jest przydatne do zwiększania kontrastu małych struktur nad tłem. Jasność pikseli w środku uruchomionego okna jest zwiększana, podczas gdy jasność otaczających obszarów jest zmniejszana. Należy pamiętać, że niektóre metody filtrowania nie działają dobrze w połączeniu.</li>
	<li>Zastosować korektę dryftu, jeśli w czasie występuje znaczny ruch preparatu. Taki ruch jest powszechny w żywych mięśniach, nawet z dodanymi lekami w celu tłumienia potencjałów czynnościowych i potencjałów synaptycznych. Algorytm rejestracji pikseli (np. IMARIS, Adobe AfterEffects, wtyczka TurboReg do ImageJ) wyrównuje obrazy poklatkowe i może zredukować, ale zwykle nie całkowicie wyeliminować taki ruch.</li>
</ol>

<ol><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy-tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy-tips and tools.</a> J. Cell Sci. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Tinevez, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+method+for+measuring+phototoxicity+of+a+live+cell+imaging+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope.</a> Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).</li>
<li>Snapp, E. L., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+and+evaluation+of+FRETexperiments+to+measure+proteinproximities+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).</li>
<li>Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late%22+macroendosomes+and+acidic+endosomes+in+vertebrate+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals.</a> J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).</li>
<li>Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroendocytosis+and+endosome+processing+in+snake+motor+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons.</a> J. Physiol. 582, 243-262 (2007).</li>
<li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19, 373-385 (1999).</li>
<li>Swedlow, J. R., Platani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+wide-field+microscopy+and+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution.</a> Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).</li>
<li>Cromey, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+images+are+data%3A+and+should+be+treated+as+such%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Digital images are data: and should be treated as such.</a> Methods Mol. Biol. Taatjes, D. J., Roth, J. 931, 1-27 (2013).</li>
<li>Teng, H., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+near+active+zones+in+snake+motor+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals.</a> J. Neurosci. 20 (21), 7986-7993 (2000).</li>
<li>Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+active+zones%3A+hot+spots+for+endocytosis+in+vertebrate+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals.</a> J. Neurosci. 19 (12), 4855-4866 (1999).</li>
<li>Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTan%2C+TTT+%22Microscopy%3A+Science%2C+Technology%2C+Applications+and+Education%22">Microscopy: Science, Technology, Applications and Education</a>. Mendez-Vilas, A., Diaz, J. , 1495-1505 (2010).</li>
<li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+C.+elegans+embryos+using+an+epifluorescent+microscope+and+open+source+software%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Najbardziej krytycznym aspektem obrazowania 4D jest zarządzanie czasem trwania i intensywnością ekspozycji na światło. Fotowybielanie zmniejsza stosunek sygnału do szumu obrazu i może być problematyczne lub nie, w zależności od różnych czynników, w tym wyboru fluoroforów. Niespecyficzne uszkodzenia żywej tkanki (fototoksyczność) są związane z fotowybielaniem i czasami można je zidentyfikować za pomocą sond fluorescencyjnych zaprojektowanych do tego celu2,12 lub poprzez badanie morfologii za pomocą odpowiedniej...

Obrazowanie poklatkowe żywej tkanki zapewnia wizualny dostęp do dynamicznych relacji struktura-funkcja, które nie mogą być docenione w stałych lub żywych preparatach zobrazowanych w jednym punkcie czasu. Często jednak kompromisem w dostępie do informacji czasowych jest zmniejszenie rozdzielczości optycznej. Obiektywy zanurzeniowe z olejkiem o dużej aperturze numerycznej są niepraktyczne w żywej tkance ze względu na ich wąski zakres ostrości, pozostawiając jako jedyną alternatywę obiektywy zanurzone w wodzie lub suche. Co więcej, zwiększona rozdzielczość zapewniana przez optykę konfokalną nie może być wykorzystana w niektórych żywych preparatach ze względu na fototoksyczność wynikającą ze stosunkowo wysokich wymaganych poziomów oświetlenia1,2. Wreszcie, chociaż dostępnych jest kilka technik optycznych w czasie rzeczywistym lub poklatkowych, które oferują zwiększoną rozdzielczość, ich zastosowanie jest ograniczone do preparatów, w których interesujące struktury można umieścić w odległości kilkuset nanometrów od obiektywu1. Opisana metoda wykorzystuje stosunkowo tani sprzęt, jest wszechstronna, a jednocześnie oferuje lepszą rozdzielczość w porównaniu z częściej stosowanymi technikami poklatkowymi. Przeznaczony jest do stosowania w indywidualnych laboratoriach, a także w zakładach obrazowania.
Metoda wykorzystuje konwencjonalną mikroskopię epifluorescencyjną, połączoną z czułą kamerą cyfrową i sprzętem zaprojektowanym do szybkiego pozyskiwania zestawów obrazów w nieco różnych płaszczyznach ogniskowych (z-stacks). Każdy stos z jest cyfrowo zdekonwolucjonowany w celu zwiększenia rozdzielczości. Jedną z cech obrazowania poklatkowego 3D (4D) jest precyzyjne śledzenie poruszających się organelli lub innych struktur. Po prawidłowym ustawieniu obrazowane struktury nie tracą ostrości, a ruch we wszystkich trzech kierunkach można obserwować i określać ilościowo. W związku z tym niemożliwe jest, aby poplamiona struktura zniknęła w jednej lub kilku klatkach poklatkowych, po prostu dryfując powyżej lub poniżej wąskiej płaszczyzny ogniskowej. Metoda ta służy również jako czułe narzędzie do oceny interakcji i możliwego łączenia małych struktur. Konwencjonalne obrazy epifluorescencyjne lub konfokalne struktur w pobliżu granicy dyfrakcji (kilkaset nm) nie potwierdzają fuzji, nawet jeśli połączone obrazy wykazują nakładanie się ich odpowiednich etykiet3. Sugeruje się fuzję, ale możliwe jest, że obiekty są oddzielone poziomo lub pionowo odległością poniżej granicy dyfrakcji. Z kolei obrazowanie trój- lub czterowymiarowe pozwala na oglądanie obiektów w każdym z trzech kierunków ortogonalnych. Pojawienie się fuzji we wszystkich trzech widokach zwiększa poziom pewności. A w niektórych żywych preparatach ukierunkowany lub Brownowski ruch przypuszczalnie zrośniętych obiektów dostarcza dalszych dowodów, gdy obie etykiety poruszają się razem w czasie. Oczywiście, gdy znajduje się w pobliżu granicy dyfrakcyjnej, poziom pewności w odróżnianiu struktur od tła lub wykazywaniu, że zawierają one dwa barwniki (fuzja), nie jest absolutny. W stosownych przypadkach bardziej odpowiednie są specjalistyczne techniki, takie jak transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET)4.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SGC5</td><td>Biotium, Hayward, CA</td><td>70057</td><td>Stężenie końcowe: 10 mM</td></tr><tr><td>FM1-43FX</td><td>Invitrogen, Karlowe Wary, CA</td><td>F35335</td><td>Stężenie końcowe: 7</td></tr><tr><td>mM LysoTracker Red</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>L7528</td><td>Stężenie końcowe: 0,2 mM</td></tr><tr><td>Reptilian Ringers pH 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>2,5 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3,6</td></tr><tr><td>mM MgSO4</td><td></td><td></td><td>1,8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibasic)</td><td></td><td></td><td>1,0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5,0 mM</td></tr><tr><td>High KCl Reptilian Dzwonki pH 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>86 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>60 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3,6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1,8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibasic)</td><td></td><td></td><td>1,0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5,0 mM</td></tr><tr><td>Wysokie Dzwonki sacharozy pH 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>2,5 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3,6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1,8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (dwupodstawowy)</td><td></td><td></td><td>1,0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5,0 mM</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td></td><td></td><td>0,5 M (17,1 g/50 ml)</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Axioplan 200</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><<td>a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr><tr><td>Obiektyw wodny N-Achroplan 63X; n.d.=0,9; Odległość robocza=2,4 mm&nbsp;</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><<td>a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr><tr><td>DG4 kombinowany przełącznik źródła światła/filtra wzbudzenia</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>Lampa ksenonowa 175W</td> arc<td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td></tr><tr><td>Lambda 10-2&nbsp; przełącznik koła filtrów emisji</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td></td><td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td></tr><tr><td>Kamera CCD Sensicam</td><td>Cooke Instruments, Tonawanda, NY</td><td></td><<td>a href="http://www.cookecorp.com/">www.cookecorp.com</a></td></tr><tr><td>Cascade 512 CCD</td><td>camera Photometrics, Tucson, AZ</td><td></td><<td>a href="http://www.photometrics.com/">www.photometrics.com</a></td></tr><tr><td>Naczynia obrazowe - wykonane we własnym zakresie - średnica 11 cm; Szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm #1 osadzone; kołki</td><td></td><td></td><td></td> magnetyczne</tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 5.0</td><td>Innowacje w zakresie inteligentnego obrazowania, Denver, CO</td><td>Dekonwolucja; Korekcja dryfu; Prezentacja danych 3D i 4D</td><td><a href="http://www.intelligent-imaging.com/">www.intelligent-imaging.com</a></td></tr><tr><td>IMARIS 7.5.2</td><td>Bitplane, South Windsor, CT</td><td>Korekcja dryfu; Prezentacja danych 3D i 4D</td><td><a href="http://www.bitplane.com/">www.bitplane.com</a></td></tr><tr><td>AfterEffects CS6</td><td>Adobe, San Jose, CA</td><td>Korekta</td> <td>dryfu<a href="http://www.adobe.com/">www.adobe.com</a></td></tr><tr><td>ImageJ 1.46</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td>Dostępnych jest wiele wtyczek; Budowa par stereo</td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td></tr><tr><td>Zeiss LSM</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td>Budowa par stereo</td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr></tbody></table>

wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie światłem zostało użyte do badania zachowania małych struktur w obrębie zakończeń nerwów ruchowych cienkiego mięśnia poprzecznego brzucha węża do pończoch. Surowe dane składają się z poklatkowych sekwencji stosów 3D Z. Każdy stos zawiera od 4 do 20 obrazów uzyskanych za pomocą optyki epifluorescencyjnej w płaszczyznach ogniskowych oddalonych od siebie o 400-1500 nm. Etapy pozyskiwania stosów obrazów, takie jak regulacja ostrości, przełączanie długości fal wzbudzenia i obsługa aparatu cyfrowego, są w jak największym stopniu zautomatyzowane, aby zmaksymalizować szybkość obrazu i zminimalizować uszkodzenia tkanek spowodowane ekspozycją na światło. Po akwizycji zestaw stosów obrazów jest dekonwolucjonowany w celu poprawy rozdzielczości przestrzennej, konwertowany do pożądanego formatu 3D i wykorzystywany do stworzenia "filmu" 4D, który nadaje się do różnych analiz komputerowych, w zależności od poszukiwanych danych eksperymentalnych. Jednym z zastosowań jest badanie dynamicznego zachowania dwóch klas endosomów znajdujących się w zakończeniach nerwowych - makroendosomów (ME) i endosomów kwaśnych (AE) - których rozmiary (200-800 nm dla obu typów) są na granicy dyfrakcji lub w jej pobliżu. Dostęp do informacji 3D w każdym punkcie czasowym ma kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnym obrazowaniem poklatkowym. W szczególności wielkość i prędkość ruchu struktur można określić ilościowo w czasie bez utraty ostrości. Przykłady danych z obrazowania 4D pokazują, że ME zbliżają się do błony plazmatycznej i znikają, co sugeruje, że są egzocytozowane, a nie po prostu poruszają się pionowo od jednej płaszczyzny ostrości. Ujawniono również przypuszczalną fuzję ME i AE poprzez wizualizację nakładania się na siebie dwóch struktur zawierających barwnik, jak to widać w każdych trzech ortogonalnych rzutach.

Przedstawione dane pochodzą z zakończeń nerwowo-mięśniowych węża (patrz widoki przy małym i dużym powiększeniu na Rysunku 3; pobieranie barwnika endocytycznego (FM1-43) tworzy mgiełkę wypełniającą każdy buton) i w szczególności z makroendosomów (MEs) oraz endosomów kwaśnych (AEs) w obrębie tych zakończeń5. MEs powstają w wyniku endocytozy masowej podczas aktywności neuronalnej10, a ich liczba spada wykładniczo wraz z upływem czasu po ustaniu aktywności6. Zastosowanie obra...

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców. Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Ogólnym celem tej procedury jest dokładne obrazowanie endosomów w przestrzeni trójwymiarowej w czasie lub w czterech wymiarach. Jest to realizowane poprzez najpierw wypreparowanie mięśni węża i ułożenie tkanki w naczyniu do obrazowania. Drugim krokiem jest barwienie tkanki barwnikami witalnymi w celu stymulacji tworzenia endosomów.Następnie wykonuje się obrazowanie preparatu w czterech wymiarach dla jednego lub więcej złączy nerwowo-mięśniowych. Ostatnim etapem jest dokładna analiza danych w celu scharakteryzowania zachowania makroendosomów. W rezultacie obecność i ruch endosomów w czasie w obrębie przestrzeni presynaptycznej mogą zostać wykazane za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego.Główną zaletą tej techniki jest fakt, że mięsień brzuszny węża ma grubość zaledwie jednego włókna, co pozwala na uzyskanie wysokiej jakości obrazów przy użyciu standardowej mikroskopii epifluorescencyjnej. W niniejszym protokole wykorzystane zostaną preparaty tkanek węża zwyczajnego. Tkanki gadzią należy przechowywać w niskich temperaturach, aby dłużej zachowały właściwości fizjologiczne i były mniej podatne na kontaminację bakteryjną. W przypadku barwienia lizosomów barwnikiem witalnym, barwnik rozpuszcza się w proporcji od 1:1 000 do 1:5 000 w zimnym roztworze Ringera dla gadów.Aby uzyskać stężenie końcowe 0,2 µM, należy dodać barwnik do tkanki i inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Po 15 minutach tkankę należy kilkukrotnie przemyć zimnym roztworem Ringera w przypadku wszystkich barwień FM 1-43. Przed barwieniem należy zamocować próbkę w szalce do obrazowania z pinami magnetycznymi.W tym filmie zaprezentowane zostanie wyłącznie barwienie FM 1 43 z wykorzystaniem stymulacji chlorkiem potasu. Do tkanki dodaje się barwnik rozcieńczony w stosunku 1:500 w roztworze Ringera z wysoką zawartością chlorku potasu, aby uzyskać stężenie końcowe 7 µM, a następnie inkubuje tkankę w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 30–60 s. Następnie tkankę szybko płucze się trzykrotnie zimnym roztworem Ringera, poświęcając około jednej minuty na każde płukanie.Wszystkie tkanki należy obrazować jak najszybciej po zabarwieniu i przemyciu zimnym roztworem Ringera. W przypadku użycia mikroskopu odwróconego należy zastosować komorę obrazującą, której dno zawiera cienką, okrągłą lamellkę. Zazwyczaj komora obrazująca powinna posiadać cienkie dno ze stali nierdzewnej o średnicy 25 millimeter.Umieść szkiełko nakrywkowe o grubości nr 1 w centrum, aby przygotować preparat do obrazowania. Ustaw je za pomocą pinów magnetycznych tak, aby mięsień znajdował się jak najbliżej centrum naczynia do obrazowania i leżał jak najpłaskiej. Przykryj preparat niewielką objętością roztworu Ringera.Zamocuj szalkę, umieszczając ją jak najbliżej centrum stolika. Wybierz odpowiedni obiektyw, aby uzyskać najwyższą możliwą rozdzielczość 3D. We wszystkich eksperymentach w niniejszej demonstracji zostanie użyty obiektyw 63 x w wodzie.Aby rozpocząć tę procedurę, otwórz okno obrazowania w programie slide book 5.0. W zakładkach znajduje się kilka menu. Wybierz obiektyw 63 x w wodzie, korzystając z drugiej zakładki Z. Ustaw interwał stosu Z.W tym przykładzie do obrazowania na żywo zastosowano krok Z wynoszący 1.5 micronów. Należy wybrać częstotliwość klatek dla sekwencji time-lapse. Optymalna częstotliwość to taka, która jest wystarczająca do płynnego odwzorowania zmian w czasie, takich jak interakcje ruchowe czy zdarzenia fuzji.Na przykład 10 punktów czasowych w odstępach co 32 sekundy dla całkowitego przedziału czasu wynoszącego pięć minut. Następnie, wyświetlając obraz na żywo z terminala z manualnym ustawieniem ostrości na górnej granicy interesującego obszaru ostrości, wybierz całkowitą głębię ostrości, przesuwając się nieco powyżej tego punktu. Wybierz opcję set top.Powoli zmieniaj ostrość przez próbkę, aż wszystko stanie się nieostre. Ponownie liczba płaszczyzn i wartości całkowitego zakresu przesuwu wyświetlone na ekranie wskażą głębię ostrości wybraną w oknie przechwytywania. Zaznacz przycisk opcji użytych pozycji górnej i dolnej, aby przenieść właśnie wybrane parametry. W celu wykonania przechwytywania obrazu rozpocznij akwizycję obrazów.Zakończ wszystkie pomiary obrazowania na żywo dla konkretnej preparacji. Zachowaj wszystkie surowe pliki danych, ponieważ przechowywanie cyfrowe zazwyczaj nie stanowi problemu. Czas przetwarzania jest znaczący, nawet w przypadku szybkich komputerów osobistych lub stacji roboczych.Z tego powodu należy przyciąć obrazy do obszaru zainteresowania, upewniając się, że cały ten obszar znajduje się w przyciętym oknie przez cały czas trwania procesu. Kurs D może obejmować stosy obrazów przy użyciu odpowiedniego oprogramowania i właściwej funkcji rozproszenia punktowego (point spread function), aby potwierdzić poprawę rozdzielczości oraz upewnić się, że algorytm dekonwolucji nie wygenerował żadnych artefaktów. Należy zastosować algorytm interpolacji w celu rozszerzenia osi Z.Sugeruje się zastosowanie pozornej rozdzielczości, czyli sześciokrotnego zwiększenia z rzeczywistego odstępu płaszczyzny obrazu wynoszącego 1.5 mikrona do pozornego odstępu 0.25 mikrona. W razie potrzeby należy przeprowadzić korektę kontrastu i jasności, filtrowanie szumów, fotowybielanie oraz inne typowe operacje przetwarzania obrazu.Standardy manipulacji obrazem wskazują, że w większości prac naukowych właściwe jest stosowanie tych samych korekt do wszystkich obrazów, zarówno w obrębie jednego stosu, jak i w różnych punktach czasowych. Skutek konkretnej regulacji powinien zostać oceniony we wszystkich obrazach. Należy eksperymentować z różnymi technikami filtrowania i ulepszania obrazu.Na przykład odszumianie i filtrowanie są przydatne do zwiększenia kontrastu małych struktur względem tła. Jasność pikseli w centrum przesuwnego okna zostaje zwiększona, podczas gdy jasność obszarów otaczających jest zmniejszana. Należy zauważyć, że niektóre metody filtrowania nie współpracują ze sobą prawidłowo.Zastosuj korekcję dryfu, jeśli w czasie występuje znaczne przemieszczenie preparatu. Taki ruch jest powszechny w żywej tkance mięśniowej, nawet po dodaniu leków hamujących potencjały czynnościowe i potencjały synaptyczne. Algorytm rejestracji pikseli wyrównuje obrazy z serii czasowej i może zredukować, choć zazwyczaj nie całkowicie wyeliminować, tego rodzaju ruchu.W niniejszym badaniu wykorzystano obrazowanie 4D na żywo zakończeń nerwowo-mięśniowych węża, aby ustalić, czy makroendosomy lub me przemieszczają się w stronę błony plazmatycznej i szybko znikają, co sugeruje, że ich liczba zmniejsza się z powodu dostępu niektórych z nich do cyto. Dane przedstawiono w formie widoków wolumetrycznych 3D w sześciu punktach czasowych z odstępem klatek wynoszącym 60 s. Aby zilustrować głębokość Z pojedynczego butonu, można zaobserwować me oddalający się od osi Y wskazanej czerwoną przerywaną linią na przestrzeni kilku klatek, zanim zniknie między piątym a szóstym punktem czasowym; fakt, że czas potrzebny do zniknięcia był krótszy niż odstęp między klatkami, jest zgodny z egzocytozą bezpośrednio przed zniknięciem.Wygląda na to, że ME znajduje się w błonie plazmatycznej batona. Ten sam surowy zestaw danych przedstawiono następnie w formie filmu przy mniejszym powiększeniu. Sekwencja jest krótko wstrzymywana na początku każdego z 24 kroków rotacji 3D wokół osi Y, aby zwrócić uwagę na ME wskazanym czerwoną strzałką, który za chwilę zniknie.Należy zauważyć, że ME jest widoczny, gdy zbliża się do krawędzi butonu, a następnie znika i nie pojawia się ponownie w niektórych perspektywach obserwacji. Ze względu na niższą rozdzielczość w osi Z w porównaniu z rozdzielczością w osiach XY, kształt ME wydaje się wydłużać i skracać w zależności od perspektywy patrzenia. Badania z użyciem mikroskopii elektronowej wykazały, że endosomy w zakończeniach motorycznych są małe i ich rozmiary oscylują w pobliżu granicy dyfrakcyjnej światła.Zatem fuzji tych endosomów nie można jednoznacznie odróżnić od bliskiego sąsiedztwa przestrzennego w mikroskopii świetlnej. W niniejszym badaniu Mees zostały oznakowane barwnikiem FM 1 43 (kolor zielony), a endosomy kwaśne (AEs) zostały oznakowane lizosomalnym barwnikiem witalnym (kolor czerwony). Dane z jednego punktu czasowego filmu 4D przedstawiono jako widoki wolumetryczne 3D w trzech orientacjach.Górne panele od pierwszego do trzeciego przedstawiają konwencjonalny widok z góry na płaszczyznę XY. Środkowe panele od czwartego do szóstego przedstawiają widok prostopadły do płaszczyzny XY w kierunku dużej czerwonej strzałki. Dolne panele od siódmego do dziewiątego przedstawiają widok prostopadły do obu powyższych widoków w kierunku dużej niebieskiej strzałki.Jedno me jest zaznaczone zieloną strzałką, a dwa AE są zaznaczone czerwonymi strzałkami. W czterech zapisach obrazów D sporadycznie odnotowano struktury fluorescencyjne w obu kolorach, które pojawiały się jako żółte. W tym przykładzie endosom zawierający oba barwniki jest zaznaczony żółtą strzałką na panelach trzy, sześć i dziewięć.Nakładanie się kolorów czerwonego i zielonego jest jednakowo całkowite we wszystkich trzech rzutach ortogonalnych, co wskazuje na domniemaną fuzję me me ae. Ten film przedstawia ten sam zestaw danych skonfigurowany do obrotu wokół osi Y w tempie jednej klatki na sekundę. Domniemana fuzja MEAE pozostaje żółta z każdej perspektywy.Dekonwolucja cyfrowa jest użytecznym narzędziem do zwiększania rozdzielczości obrazów 3D, jak i 4D. Przedstawiono tutaj porównanie danych surowych i danych po dekonwolucji dla typowego zakończenia nerwowego węża, barwionego podczas stymulacji barwnikiem FM 1 43. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje od 30 do 60 minut, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące kolokalizacji makroendosomów z markerami presynaptycznymi.

visualization-endosome-dynamics-living-nerve-terminals-with-four

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wizualizacja dynamiki endosomu w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Niniejszy protokół opisuje sekcję larw Drosophila in vivo w celu obrazowania ruchu pęcherzyków aksonalnych znakowanych białkiem GFP wzdłuż szyn mikrotubularnych.

In vivo wizualizacja pęcherzyków synaptycznych w aksonach segmentowych larw Drosophila

Ten film pokazuje, jak pęcherzyki neuronalne są znakowane specyficznymi białkami fluorescencyjnymi, aby uwidocznić ich ruch. Najpierw plazmid kodujący białko fluorescencyjne jest inkubowany ze środkiem transfekcyjnym, a następnie wprowadzany do kultury neuronów. Następnie pozyskiwane są obrazy neuronów i analizowane w celu śledzenia ruchu pęcherzyków.

Wizualizacja ruchliwości pęcherzyków w neuronach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Źródło: Boyer, N. P. et. al., Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy. J. Vis. exp. (2020) Ten film przedstawia metodę fotoaktywacji fluorescencji do analizy transport neurofilamentów w mielinowanych aksonach nerwów obwodowych. Śledząc fotoaktywowane zielone neurofilamenty znakowane fluoroforem, technika ta dostarcza informacji na temat transportu aksonalnego w chorobach neurodegeneracyjnych.

Obrazowanie fotoaktywacji fluorescencyjnej transportu neurofilamentów w mielinizowanych aksonach myszy 

Źródło: Zhilyakov, N. V. et al., Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2021)Ten film przedstawia technikę obrazowania polegającą na rejestrowaniu szybkich stanów przejściowych wapnia na zakończeniach nerwowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Stymulując nerw i wychwytując zmiany fluorescencji spowodowane barwnikami wiążącymi wapń, wizualizuje dynamiczny napływ i usuwanie...

Obrazowanie szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwowych myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej

Przedstawiono protokół dynamicznego obrazowania podłużnego i selektywnego laserowego uszkadzania zakończeń nerwowych u reporterowych myszy transgenicznych.

In vivo (in vivo) Mikroskopia dwufotonowa pojedynczych zakończeń nerwowych w skórze

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Badanie transportu błonowego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Jest to wygodna metoda, którą można dostosować do ilościowego oznaczania transportu błonowego w układzie nerwowym.

Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Ten protokół opisuje analizę fluorescencyjnie znakowanych przedziałów wewnątrzkomórkowych w pączkujących drożdżach za pomocą wielokolorowej mikroskopii konfokalnej 4D (time-lapse 3D). Parametry obrazowania dobierane są tak, aby wychwycić odpowiednie sygnały przy jednoczesnym ograniczeniu fotouszkodzeń. Niestandardowe wtyczki ImageJ umożliwiają śledzenie oznaczonych struktur i analizę ilościową.

Mikroskopia 4D drożdży

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Artykuł opisuje optymalizację parametrów akwizycji mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji aksonalnego transportu endogennych znakowanych ładunków w rozdzielczości pojedynczego neuronu u żywego nicienia.

Optymalizacja wizualizacji transportu aksonalnego ładunków endogennych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej u żywych Caenorhabditis elegans

Poznaj dynamikę endosomów w żywych zakończeniach nerwowych węża za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego. Ta metoda umożliwia obserwację fuzji i egzocytozy endosomów w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Przeglądaj więcej filmów