Name: Przekrój rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-21T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Poznaj metodę przekroju rdzenia kręgowego u larw Danio rerio, wykorzystującą przezroczystość i szybką regenerację. Technika umożliwia obserwację odpowiedzi progenitorów nerwowych już po 2 dniach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni ośrodkowi zebranych Uniwersytetu Utah za hodowlę zwierząt. R.I.D. był wspierany przez NIH R56NS053897, a L.K.B. był stażystą przeddoktoranckim wspieranym przez inicjatywę HHMI Med-Into-Grad.

Danio pręgowany był hodowany i hodowany zgodnie ze standardowymi procedurami; eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Utah.
1. Przygotowanie płyt chirurgicznych
<ol>
	<li>Płytki chirurgiczne należy wykonać przy użyciu szalek Petriego o średnicy 60 mm i zestawu elastomeru silikonowego Sylgard 184, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Napełnij naczynia nie więcej niż do połowy i pozostaw do polimeryzacji. Przechowywać pod przykryciem w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikropipet
<ol>
	<li>Wytwarzanie mikropipet poprzez podgrzewanie i ciągnięcie cienkościennych rurek kapilarnych borokrzemianu w ściągaczu do mikropipet przy użyciu tych samych ustawień, co do produkcji igieł do mikroiniekcji.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym odłamać końcówkę mikropipety o średnicy około 200 μm za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Skośną krawędź za pomocą mikroszlifierki początkowo do 35°, a następnie drugie ukosowanie pod kątem 25°. Upewnij się, że końcówka jest ostra i gładka. Gotową mikropipetę ze skosem przechowuj na szalce Petriego na niewielkiej ilości gliny.</li>
</ol>
3. Przygotowanie larw danio pręgowanego
<ol>
	<li>Na 7 dni przed zabiegiem należy założyć zbiorniki godowe samców i samic danio pręgowanego.</li>
	<li>Zbierz zarodki następnego ranka, 3 godziny po zapaleniu się świateł, aby zapewnić maksymalny plon. W przypadku stosowania transgenicznej linii reporterowej, takiej jak Tg(elevl3:eGFP)knu3, należy sortować zapłodnione zarodki na płytce 100/100 mm w 25 ml E3 w temperaturze 28,5 °C. W przypadku stosowania typu dzikiego należy posortować zapłodnione zarodki na płytce 25/100 mm w 25 ml E3 w temperaturze 28,5 °C.</li>
	<li>Jeśli używasz linii reporterowej, przebadaj zarodki pod kątem ekspresji fluorescencyjnej przy 48 hpf. Pozostawić zidentyfikowane zarodki do dojrzewania w gęstości 25/100 mm na płytce w 25 ml E3 w temperaturze 28,5 °C.</li>
	<li>Gdy larwy osiągną 5 dpf, przygotuj płytkę chirurgiczną, pokrywając Sylgard E2 + 10 mg/L Siarczan Gentamycyny (GS) + Trikaina.
	<ol>
		<li>Przygotować naczynie regeneracyjne, dodając 25 ml E2 + GS do szalki Petriego o średnicy 100 mm.</li>
		<li>Przygotuj skalpel, sklejając ze sobą trzy waciki. Utworzy to trójkątne narzędzie z trzema rowkami.</li>
		<li>Zamontuj przygotowaną mikropipetę na wacikach, wklejając ją taśmą w jeden z rowków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku ponownego użycia mikropipet, przed zamontowaniem na wacikach przepłukać E2 + GS do czystej postaci strzykawką o pojemności 1 ml i igłą 27 G.</li>
</ol>
4. Chirurgia
<ol>
	<li>Znieczulaj jednorazowo 1 płytkę larw (25 ryb) Trikainą. Ryby są wystarczająco znieczulone, gdy nie wykazują już reakcji na dotyk. Ważne jest, aby ryby były całkowicie znieczulone przed operacją, w przeciwnym razie będą drgać, gdy dotknie ich skalpel. Operacja wykonywana jest pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Przenieś larwy na płytkę chirurgiczną.
	<ol>
		<li>W maksymalnym powiększeniu obracaj jedną larwę na raz, tak aby leżała na boku plecami jak najbliżej ręki trzymającej skalpel.</li>
		<li>Ustaw kleszcze tak, aby spoczywały na Sylgardzie, pod kątem na szerokość larwy.</li>
		<li>Opierając szklany skalpel o jedno z ramion kleszczy, wciąć się w grzbietową boczną powierzchnię larwy na poziomie porów odbytu, uważając, aby nie ciąć poza brzuszną krawędź struny grzbietowej. Przekręć skalpel, aby przeciąć rdzeń kręgowy.</li>
		<li>Powtórz z pozostałymi larwami. 
		Uwaga: jeśli larwa krwawi, nie wyzdrowieje po operacji. Natychmiast usuń larwę z płytki chirurgicznej i poddaj ją eutanazji przez przedawkowanie trikainy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu operacji na partii larw przenieś zranione zwierzęta na płytkę rekonwalescencji. Ma to na celu wsparcie w oczyszczaniu znieczulenia.
	<ol>
		<li>Uwaga: zbierając zranione larwy do przenoszenia, upewnij się, że są one zbierane głową lub ogonem jako pierwsze: nie obciążaj miejsca urazu poprzez zginanie larw. 
		Uwaga: Wszystkie urządzenia używane do zabiegów chirurgicznych mogą być ponownie użyte, w tym mikropipety.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Odzyskiwanie
<ol>
	<li>Przenieść zranione larwy z płytki regeneracyjnej na płytki o średnicy 100 mm wypełnione 25 ml E2 + GS o gęstości 25 na płytkę. Pozostawić do rekonwalescencji w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C.</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj talerze, usuwając chore i martwe zwierzęta. Nie zmieniaj pożywki, dopóki Coleps (pierwotniaki słodkowodne) nie będą widoczne w pożywce. Podczas zmiany podłoża nie przenoś ryby na nowy talerz; Zamiast tego usuń jak najwięcej nośnika i zalej tę samą płytę nowymi nośnikami. Powtórz w razie potrzeby, aby zmniejszyć populację Coleps.</li>
	<li>Podawaj codziennie niewielką ilość sproszkowanego pokarmu dla narybku. 
	Uwaga: Żywy pokarm (np. pantofelek lub wrotki) nie może być podawany zranionym larwom, dopóki nie odzyskają one zdolności poruszania się. W przeciwnym razie żywy pokarm skolonizuje miejsce urazu i zabije larwy.</li>
</ol>

<ol><li>Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+bridging+the+lesion+and+the+role+of+neurotrophic+factors+in+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+brain+research%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair.</a> Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).</li>
<li>Mikami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+dendritic+cells+in+injured+adult+spinal+cord+results+in+activation+of+endogenous+neural+stem%2Fprogenitor+cells+leading+to+de+novo+neurogenesis+and+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery.</a> Journal of neuroscience research. 76 (4), 453-465 (2004).</li>
<li>Chernoff, E. A. G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+regeneration%3A+intrinsic+properties+and+emerging+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).</li>
<li>Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+tyrosine+hydroxylase+and+serotonergic+systems+in+the+regenerating+spinal+cord+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).</li>
<li>Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1.1+is+involved+in+spinal+cord+regeneration+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).</li>
<li>Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+after+crush+injury+in+adult+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).</li>
<li>Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf-dependent+glial+cell+bridges+facilitate+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7477-7492 (2012).</li>
<li>Reimer, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+regeneration+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Motor neuron regeneration in adult zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).</li>
<li>Hale, M. E., Ritter, D. A., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+confocal+study+of+spinal+interneurons+in+living+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">A confocal study of spinal interneurons in living larval zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 437 (1), 1-16 (2001).</li>
<li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li>
<li>McClenahan, P., Troup, M., Scott, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fin-tail+coordination+during+escape+and+predatory+behavior+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fin-tail coordination during escape and predatory behavior in larval zebrafish.</a> PloS one. 7 (2), (2012).</li>
<li>Kim, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repressor+activity+of+Headless%2FTcf3+is+essential+for+vertebrate+head+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head formation.</a> Nature. 407 (6806), 913-916 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas początkowej nauki tej techniki zalecamy wykonanie nie więcej niż 50-100 transsekcji podczas jednej sesji. Po opanowaniu tej techniki jesteśmy w stanie dokonać transekcji do 300 zarodków na godzinę; Jednak ten poziom przepustowości wymaga kilku miesięcy cotygodniowej praktyki. Zalecamy również ćwiczenie z linią reporterową i sprawdzanie całkowitego przecięcia, dopóki częstość występowania niepełnego przecięcia rdzenia kręgowego nie zmniejszy się do mniej niż 1%.
Przecięcie rdzenia kręgo...

Poważny uraz ludzkiego rdzenia kręgowego często powoduje trwały paraliż i utratę czucia poniżej poziomu urazu, z powodu niemożności odtworzenia aksonów lub ponownego zainicjowania neurogenezy1,2. Jednak w przeciwieństwie do ssaków, anamnioty, w tym salamandry i danio pręgowany (Danio rerio), wykazują solidną regenerację nawet po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego3,4.
Dorosły danio pręgowany jest dobrze znanym modelem do badania procesu powrotu do zdrowia po urazie rdzenia kręgowego5-7. Po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego u dorosłego danio pręgowanego obserwuje się przywrócenie funkcji czuciowych i lokomocyjnych po 6 tygodniach od urazu8. Aby zbadać proces regeneracji in vivo, zwróciliśmy się do przezroczystych larw danio pręgowanego9.
Tutaj prezentujemy metodę transekcji rdzenia kręgowego larwy danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia (dpf) za pomocą skośnej pipety do mikroiniekcji jako skalpela, zmodyfikowanej przez Bhatta, et al.10 Ta metoda zapewnia wysoką przepustowość, niską śmiertelność i odtwarzalność. Przy odrobinie wprawy można przeciąć 300 larw/godz., a po ponad 6 miesiącach transsekcji, w tym na ponad 3600 zwierzętach, 98,75% ± 0,72% przeżyło do 7 dni po urazie (dpi). Nasze dane wskazują również na szybkie odzyskiwanie czucia i lokomocji: przy 1 dpi cały ruch zranionej ryby jest napędzany wyłącznie przez lokomocję płetwy piersiowej. Jednak larwy zaczynają reagować na dotyk igły wolframowej ogonowo na przecięcie o 2 dpi, przywracają ruch zgięcia C o 3 dpi i wykazują drapieżne pływanie o 5 dpi11. Stosując barwienie przeciwciałami przeciwko acetylowanej tubulinie, potwierdziliśmy, że aksony są nieobecne w miejscu uszkodzenia przy 1 dpi, ale przekroczyły miejsce uszkodzenia o 5 dpi. Wierzymy, że ten protokół zapewni cenną technikę do badania odrastania aksonów i neurogenezy w rdzeniu kręgowym po urazie.

<table><tbody><tr><td>Szalka Petriego 60 mm</td><td>VWR</td><td>82050-544</td><td></td></tr><tr><td>100 mm szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td></td></tr><tr><td>PDMS, zestaw elastomerów silikonowych Sylgard 184</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>rurka kapilarna borokrzemianowa: OD 1,00 mm, ID 0,78 mm</td><td>Warner Instruments Inc.</td><td>64-0778</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Scientific Tools Inc.</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop rozdzielczy</td><td>Nikon</td><td>SMZ6454</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszlifierka</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Amresco Inc.</td><td>0304-5G</td><td>rozpuścić w wodzie 10 mg/ml, przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Acros Organics</td><td>118000100</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator z bawełnianą końcówką, drewniany, 6-calowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>Igła 27 G</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Smażenie żywności</td><td>Argent Labs</td><td>F-ARGE-PTL-CN</td><td>przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-97</td><td>Pudełko Filament FB330B</td></tr><tr><td colspan="4"><mocny>20x E2 (1 L); przechowywać w temperaturze RT</td></tr><tr><td>17,5 g NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>0,75 g KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>2,90 g CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>4,90 g MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Merck</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>0.41 g KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>0.12 g Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>500x NaCO3 (10 ml); zrobić świeże, wyrzuć dodatkowe</td></tr><tr><td>0,35 g NaCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">1x E2 (1 L); </mocny> przechowywać w temperaturze RT</td></tr><tr><td>50 ml 20 x E2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml świeży 500x NaCO3</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przekrój rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Ssaki nie są w stanie odzyskać czucia i motoryki po urazie rdzenia kręgowego z powodu braku odrostu aksonów poniżej poziomu urazu, jak również niemożności ponownego zainicjowania neurogenezy rdzeniowej. Jednak niektóre anamnioty, w tym danio pręgowany Danio rerio, wykazują zarówno czuciową, jak i funkcjonalną regenerację nawet po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego. Dorosły danio pręgowany jest uznanym organizmem modelowym do badania regeneracji po urazie rdzenia kręgowego, z regeneracją czuciową i motoryczną do 6 tygodni po urazie. Aby skorzystać z analizy in vivo procesu regeneracyjnego dostępnego u przezroczystych larw danio pręgowanego, a także narzędzi genetycznych niedostępnych u osoby dorosłej, wykorzystujemy larwy danio pręgowanego do badania regeneracji po przecięciu rdzenia kręgowego. Tutaj demonstrujemy metodę odtwarzalnej i weryfikowalnej transekcji rdzenia kręgowego larwy. Po przecięciu nasze dane pokazują regenerację czuciową rozpoczynającą się po 2 dniach od urazu (dpi), z ruchem zgięcia C wykrywalnym przez 3 dpi i wznowieniem swobodnego pływania przez 5 dpi. Dlatego proponujemy larwala danio pręgowanego jako narzędzie towarzyszące dorosłemu danio pręgowanemu do badania rekonwalescencji po urazie rdzenia kręgowego.

Aby zmniejszyć stopień uszkodzenia tkanek wokół miejsca urazu, kluczowe jest prawidłowe ścięcie końcówki mikropipety. Na rysunku 1A przedstawiono prawidłowo ściętą końcówkę. Stosowanie końcówki zbyt szerokiej (rysunek 1B) prowadzi zazwyczaj do większej śmiertelności ze względu na zwiększone prawdopodobieństwo uszkodzenia aorty grzbietowej, natomiast końcówka zbyt wąska (rysunek 1C) ma tendencję do ześlizgiwania się z powierzchni skóry zamiast przecinania tkanki.
<p c...

Po przecięciu kręgosłupa, dorosłe rybki pręgowane wracają do stanu funkcjonalnego w ciągu sześciu tygodni po urazie. Aby wykorzystać przezroczystość larw i szybszy powrót do zdrowia, przedstawiamy metodę transekcji rdzenia kręgowego larwy. Po przecięciu obserwujemy regenerację czuciową rozpoczynającą się po 2 dniach od urazu i ruch zgięcia C po 3 dniach od urazu.

Przekrój rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zapewnienie całkowitego przerwania rdzenia kręgowego u larw rybek zebra za pomocą relatywnie wysokoprzepływowej i powtarzalnej metody, przy jednoczesnym zmaksymalizowaniu przeżywalności. Osiąga się to poprzez uprzednie kojarzenie osobników dorosłych o odpowiednim genotypie i przeprowadzenie niezbędnego przesiewu. Drugim krokiem jest hodowla embrionów do piątego dnia po zapłodnieniu.Następnie należy przeprowadzić przekrecie przy użyciu ściętej pipety do mikroiniekcji. Na koniec rannym rybom pozwala się na rekonwalescencję w medium z dodatkiem antybiotyków aż do zakończenia eksperymentu. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię immunofluorescencyjną, aby wykazać odpowiedź progenitorów neuronalnych na uraz.Główne zalety tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak te opracowane w laboratoriach Beckera i Fetchera, obejmują możliwość badania większej liczby zwierząt, krótszy czas rekonwalescencji oraz wykorzystanie narzędzi genetycznych, które nie są dostępne u dorosłych danio przebrzuchłych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji, takie jak odpowiedź progenitorów neuronalnych na uraz. Przygotowania należy rozpocząć od wykonania płyt chirurgicznych z wykorzystaniem szalek Petriego o średnicy 60 mm oraz zestawu elastomeru silikonowego To Cell Guard 180 4.Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, napełnij płytki maksymalnie do połowy i poczekaj do ich spolimeryzowania. Następnie przechowuj przykryte płytki w temperaturze pokojowej.Następnie należy wykonać mikropipety poprzez podgrzewanie i wyciąganie cienkościennych kapilar borokrzemianowych w polaryzatorze do mikropipet, stosując te same parametry, które wykorzystano do sporządzenia igieł do mikroiniekcji pod mikroskopem stereologicznym. Za pomocą pęsety należy odłamać końcówkę mikropipety tak, aby jej średnica wynosiła około 200 mikronów. Następnie należy sfazować złamaną krawędź mikro-szlifierką, początkowo pod kątem 35 stopni, a następnie wykonać drugie fazowanie pod kątem 25 stopni, gdy ustanie dźwięk szlifowania.Sprawdzić pod stereomikroskopem, czy końcówka jest ostra i gładka. Użycie zbyt szerokiej końcówki może prowadzić do większej śmiertelności ze względu na zwiększone prawdopodobieństwo uszkodzenia aorty grzbietowej. Natomiast końcówka zbyt wąska ma tendencję do ześlizgiwania się po skórze zamiast przecinania tkanek; prawidłowo ścięte mikropipety należy przechowywać w szalce Petriego na niewielkiej ilości gliny przez siedem dni przed operacją.Przygotuj zbiorniki do tarła dla samców i samic spr. Ryby zbierz zapłodnione embriony następnego ranka, trzy godziny po zapaleniu świateł, aby zapewnić maksymalną wydajność.W przypadku użycia transgenicznej linii reporterowej o mieszanych genotypach, należy umieścić 100 embrionów na płytkę i inkubować płytki w temperaturze 28,5°C. W przypadku użycia linii reporterowej należy przeprowadzić przesiew embrionów pod kątem ekspresji fluorescencyjnej 48 godzin po zapłodnieniu.Pozostaw fluorescencyjne embriony do dojrzewania w temperaturze 28,5 °C aż do stadium larwalnego lub do piątego dnia po zapłodnieniu. Przygotuj płytkę operacyjną, pokrywając cell guard roztworem E2 z dodatkiem 10 mg/L siarczanu gentamycyny i tricyny. Dodatkowo przygotuj naczynie do rekonwalescencji, wlewając 25 ml E2 i siarczanu gentamycyny do szalki Petriego o średnicy 100 mm.Kolejnym krokiem jest przygotowanie uchwytu skalpela poprzez sklejenie taśmą trzech wymazówek. W ten sposób powstaje trójkątne narzędzie z trzema rowkami. Następnie zamocuj przygotowaną mikropipetę do wymazówek, przyklejając ją taśmą do jednego z rowków w celu ukończenia skalpela; odłóż mikropipetę do momentu, aż będzie potrzebna.Zabieg chirurgiczny należy rozpocząć od znieczulenia jednej płytki zawierającej 25 larw jednocześnie. Stosując trica, ryby są uznawane za wystarczająco znieczulone, gdy przestają wykazywać reakcję na dotyk. Przenieś larwy na płytkę do operacji i umieść ją pod mikroskopem dissectingowym.Przy maksymalnym powiększeniu obróć jedną larwę tak, aby leżała na boku, a jej grzbiet znajdował się najbliżej ręki trzymającej skalpel. Ustaw pęsetę tak, aby opierała się o osłonę komórki. Pod kątem do szerokości larwy oprzyj szklany skalpel o jedno z ramion pęsety.Nacnij grzbietowo-boczną powierzchnię larw na poziomie otworu odbytniczego. Należy upewnić się, że cięcie nie wykracza poza brzeg brzuszny rdzenia kręgowego. Następnie przekręć skalpel, aby przeciąć rdzeń kręgowy.Wymagany obrót jest zazwyczaj znacznie mniejszy niż 90 stopni. Powtórz przekrój rdzenia kręgowego u pozostałych larw. Po zakończeniu operacji na partii larw, użyj pipety tylnej i pompy pipetującej, aby przenieść rannych zwierząt na płytkę regeneracyjną.Aby zniwelować działanie anestezji, podczas przenoszenia należy najpierw chwycić larwę za głowę lub ogon. Po ustąpieniu działania anestezji nie należy wyginać larw, aby nie obciążać miejsca urazu. Przenieś ranną larwę z płytki regeneracyjnej na płytki o średnicy 100 milimetrów wypełnione 25 mililitrami E2 i siarczanu gentamycyny, zachowując zagęszczenie 25 larw na płytkę.Następnie umieść je w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C do czasu zagojenia się rany. Codziennie sprawdzaj płytki, usuwając wszystkie chore lub martwe zwierzęta.Nie wymieniaj medium, dopóki w medium nie pojawią się widoczne skupiska pierwotniaków słodkowodnych. Podczas wymiany medium nie przenoś ryb na nową płytkę. Zamiast tego usuń jak największą ilość medium i wypełnij tę samą płytkę nowym medium.Powtarzaj wymianę medium w razie potrzeby, aby zmniejszyć populację coops. Karmij larwy codziennie niewielką ilością proszkowej karmy dla narybku. Tutaj przedstawiono rybkę danio przebruzną w pierwszym dniu po całkowitym przerwaniu rdzenia kręgowego.Po urazie GFP jest wyrażane we wszystkich neuronach, a żółta strzałka wskazuje miejsce urazu. Przedstawiono tutaj rybkę zebra z całkowicie przerwanym rdzeniem kręgowym w trzeciej dobie po urazie. Ta utrwalona rybka zebra z etykietowaniem UCD wykazuje całkowite przerwanie rdzenia kręgowego.Żółta strzałka ponownie wskazuje miejsce urazu. W przeciwieństwie do niego, sąsiedni obszar znakowania neuronów wzdłuż brzusznej krawędzi rdzenia kręgowego u tej utrwalonej rybki zebra trzy dni po urazie wskazuje na niepełne przerwanie.Po opanowaniu techniki, za jej pomocą można przetwarzać 300 larw na godzinę.

spinal-cord-transection-in-the-larval-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przecięcie rdzenia kręgowego u larw rybki zwanej Zebrafish

Przedstawiona tutaj metoda obejmuje precyzyjne uszkadzanie żywych zarodków rybek danio (*zebrafish*) za pomocą wysokenergetycznych impulsów laserowych oraz późniejszą analizę tych obrażeń i ich regeneracji w czasie. Pokazujemy również, w jaki sposób można śledzić pojedyncze lub grupy genetycznie znakowanych komórek mięśni szkieletowych podczas i po uszkodzeniu indukowanym światłem laserowym.

Laserowe uszkodzenie szkieletowej muskulatury embrionów danio-ostrolepnego

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Minogi odzyskują lokomocję po całkowitym urazie rdzenia kręgowego. Jednak niektóre neurony projekcji rdzeniowej są dobrymi regeneratorami, a inne nie. W artykule przedstawiono techniki przetrzymywania larw minoga morskiego (i niedawno przekształconych osobników dorosłych), wytwarzania kompletnych przekrojów rdzenia kręgowego oraz przygotowania całych mózgów i rdzeni kręgowych do hybrydyzacji in situ.

Kompletny protokół uszkodzenia rdzenia kręgowego i rozwarstwienia mózgu w celu późniejszej hybrydyzacji in situ u larw minoga morskiego

Aby rzucić światło na komórkowe i molekularne mechanizmy neurogenezy i regeneracji dorosłego danio pręgowanego, opracowaliśmy protokół inwazyjnej chirurgii powodującej mechaniczne urazy u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego i późniejszego monitorowania zmian w ugodzonej półkuli za pomocą immunohistochemii lub hybrydyzacji in situ.

Rana kłuta dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego: metoda badania neurogenezy i regeneracji mózgu kręgowców

Ten manuskrypt opisuje metody zapisów elektrofizjologicznych z neuronów rdzeniowych zarodków i larw danio pręgowanego. Preparat utrzymuje neurony in situ i często wiąże się z minimalnym rozwarstwieniem. Metody te pozwalają na badanie elektrofizjologiczne różnych neuronów rdzeniowych, od początkowego nabycia pobudliwości elektrycznej do wczesnych stadiów larwalnych.

Przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych

Opisujemy protokół monitorowania zmian w aktywności neuronu doprowadzającego podczas poleceń motorycznych w modelowym systemie komórek rzęsatych kręgowców.

Aktywność neuronów aferentnych tylnej linii bocznej podczas pływania u danio pręgowanego

Zdolny do funkcjonalnego powrotu do zdrowia po urazie rdzenia kręgowego, dorosły danio pręgowany jest głównym modelowym systemem do wyjaśnienia wrodzonych mechanizmów regeneracji neuronów. Tutaj opisujemy testy wytrzymałości pływackiej i zachowania podczas pływania jako funkcjonalne odczyty regeneracji rdzenia kręgowego.

Ocena wytrzymałości pływackiej i zachowań związanych z pływaniem u dorosłych danio pręgowanego

Obecny protokół opisuje metodę wywoływania specyficznych tkankowo i wysoce powtarzalnych urazów u larw danio pręgowanego za pomocą laserowego systemu uszkodzeń połączonego z automatyczną platformą mikroprzepływową do obsługi larw.

Kontrolowane półautomatyczne urazy indukowane laserem do badania regeneracji rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Przecięcie rdzenia kręgowego kijanki Xenopus laevis jest odpowiednią metodą do badania uszkodzenia rdzenia kręgowego i regeneracji poprzez wykonanie poprzecznego cięcia, które całkowicie przecina rdzeń kręgowy na poziomie klatki piersiowej.

Przecięcie rdzenia kręgowego u kijanek Xenopus laevis

Ten protokół opisuje model kriouszkodzeń w celu wywołania głębokiego uszkodzenia kilku miomerów ogonowych u dorosłego danio pręgowanego. Metoda ta zapewnia nowe podejście do badania regeneracji mięśni szkieletowych po ciężkiej utracie tkanki u kręgowców innych niż ssaki.

Model kriouszkodzeń do badania regeneracji mięśni szkieletowych szypułki ogonowej u dorosłych danio pręgowanych

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepiania komórek o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w zarodkach i larwach danio pręgowanego na każdym etapie, między co najmniej 1 a 7 dniem po zapłodnieniu.

Przeszczep komórek w wysokiej rozdzielczości u embrionów i larw danio pręgowanego

Poznaj metodę przekroju rdzenia kręgowego u larw Danio rerio, wykorzystującą przezroczystość i szybką regenerację. Technika umożliwia obserwację odpowiedzi progenitorów nerwowych już po 2 dniach.

Przekrój rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów