Przekrój rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego
21 maja 2014
Po przecięciu kręgosłupa, dorosłe rybki pręgowane wracają do stanu funkcjonalnego w ciągu sześciu tygodni po urazie. Aby wykorzystać przezroczystość larw i szybszy powrót do zdrowia, przedstawiamy metodę transekcji rdzenia kręgowego larwy. Po przecięciu obserwujemy regenerację czuciową rozpoczynającą się po 2 dniach od urazu i ruch zgięcia C po 3 dniach od urazu.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest zapewnienie całkowitego przerwania rdzenia kręgowego u larw rybek zebra za pomocą relatywnie wysokoprzepływowej i powtarzalnej metody, przy jednoczesnym zmaksymalizowaniu przeżywalności. Osiąga się to poprzez uprzednie kojarzenie osobników dorosłych o odpowiednim genotypie i przeprowadzenie niezbędnego przesiewu. Drugim krokiem jest hodowla embrionów do piątego dnia po zapłodnieniu.
Następnie należy przeprowadzić przekrecie przy użyciu ściętej pipety do mikroiniekcji. Na koniec rannym rybom pozwala się na rekonwalescencję w medium z dodatkiem antybiotyków aż do zakończenia eksperymentu. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię immunofluorescencyjną, aby wykazać odpowiedź progenitorów neuronalnych na uraz.
Główne zalety tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak te opracowane w laboratoriach Beckera i Fetchera, obejmują możliwość badania większej liczby zwierząt, krótszy czas rekonwalescencji oraz wykorzystanie narzędzi genetycznych, które nie są dostępne u dorosłych danio przebrzuchłych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji, takie jak odpowiedź progenitorów neuronalnych na uraz. Przygotowania należy rozpocząć od wykonania płyt chirurgicznych z wykorzystaniem szalek Petriego o średnicy 60 mm oraz zestawu elastomeru silikonowego To Cell Guard 180 4.
Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, napełnij płytki maksymalnie do połowy i poczekaj do ich spolimeryzowania. Następnie przechowuj przykryte płytki w temperaturze pokojowej.
Następnie należy wykonać mikropipety poprzez podgrzewanie i wyciąganie cienkościennych kapilar borokrzemianowych w polaryzatorze do mikropipet, stosując te same parametry, które wykorzystano do sporządzenia igieł do mikroiniekcji pod mikroskopem stereologicznym. Za pomocą pęsety należy odłamać końcówkę mikropipety tak, aby jej średnica wynosiła około 200 mikronów. Następnie należy sfazować złamaną krawędź mikro-szlifierką, początkowo pod kątem 35 stopni, a następnie wykonać drugie fazowanie pod kątem 25 stopni, gdy ustanie dźwięk szlifowania.
Sprawdzić pod stereomikroskopem, czy końcówka jest ostra i gładka. Użycie zbyt szerokiej końcówki może prowadzić do większej śmiertelności ze względu na zwiększone prawdopodobieństwo uszkodzenia aorty grzbietowej. Natomiast końcówka zbyt wąska ma tendencję do ześlizgiwania się po skórze zamiast przecinania tkanek; prawidłowo ścięte mikropipety należy przechowywać w szalce Petriego na niewielkiej ilości gliny przez siedem dni przed operacją.
Przygotuj zbiorniki do tarła dla samców i samic spr. Ryby zbierz zapłodnione embriony następnego ranka, trzy godziny po zapaleniu świateł, aby zapewnić maksymalną wydajność.
W przypadku użycia transgenicznej linii reporterowej o mieszanych genotypach, należy umieścić 100 embrionów na płytkę i inkubować płytki w temperaturze 28,5°C. W przypadku użycia linii reporterowej należy przeprowadzić przesiew embrionów pod kątem ekspresji fluorescencyjnej 48 godzin po zapłodnieniu.
Pozostaw fluorescencyjne embriony do dojrzewania w temperaturze 28,5 °C aż do stadium larwalnego lub do piątego dnia po zapłodnieniu. Przygotuj płytkę operacyjną, pokrywając cell guard roztworem E2 z dodatkiem 10 mg/L siarczanu gentamycyny i tricyny. Dodatkowo przygotuj naczynie do rekonwalescencji, wlewając 25 ml E2 i siarczanu gentamycyny do szalki Petriego o średnicy 100 mm.
Kolejnym krokiem jest przygotowanie uchwytu skalpela poprzez sklejenie taśmą trzech wymazówek. W ten sposób powstaje trójkątne narzędzie z trzema rowkami. Następnie zamocuj przygotowaną mikropipetę do wymazówek, przyklejając ją taśmą do jednego z rowków w celu ukończenia skalpela; odłóż mikropipetę do momentu, aż będzie potrzebna.
Zabieg chirurgiczny należy rozpocząć od znieczulenia jednej płytki zawierającej 25 larw jednocześnie. Stosując trica, ryby są uznawane za wystarczająco znieczulone, gdy przestają wykazywać reakcję na dotyk. Przenieś larwy na płytkę do operacji i umieść ją pod mikroskopem dissectingowym.
Przy maksymalnym powiększeniu obróć jedną larwę tak, aby leżała na boku, a jej grzbiet znajdował się najbliżej ręki trzymającej skalpel. Ustaw pęsetę tak, aby opierała się o osłonę komórki. Pod kątem do szerokości larwy oprzyj szklany skalpel o jedno z ramion pęsety.
Nacnij grzbietowo-boczną powierzchnię larw na poziomie otworu odbytniczego. Należy upewnić się, że cięcie nie wykracza poza brzeg brzuszny rdzenia kręgowego. Następnie przekręć skalpel, aby przeciąć rdzeń kręgowy.
Wymagany obrót jest zazwyczaj znacznie mniejszy niż 90 stopni. Powtórz przekrój rdzenia kręgowego u pozostałych larw. Po zakończeniu operacji na partii larw, użyj pipety tylnej i pompy pipetującej, aby przenieść rannych zwierząt na płytkę regeneracyjną.
Aby zniwelować działanie anestezji, podczas przenoszenia należy najpierw chwycić larwę za głowę lub ogon. Po ustąpieniu działania anestezji nie należy wyginać larw, aby nie obciążać miejsca urazu. Przenieś ranną larwę z płytki regeneracyjnej na płytki o średnicy 100 milimetrów wypełnione 25 mililitrami E2 i siarczanu gentamycyny, zachowując zagęszczenie 25 larw na płytkę.
Następnie umieść je w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C do czasu zagojenia się rany. Codziennie sprawdzaj płytki, usuwając wszystkie chore lub martwe zwierzęta.
Nie wymieniaj medium, dopóki w medium nie pojawią się widoczne skupiska pierwotniaków słodkowodnych. Podczas wymiany medium nie przenoś ryb na nową płytkę. Zamiast tego usuń jak największą ilość medium i wypełnij tę samą płytkę nowym medium.
Powtarzaj wymianę medium w razie potrzeby, aby zmniejszyć populację coops. Karmij larwy codziennie niewielką ilością proszkowej karmy dla narybku. Tutaj przedstawiono rybkę danio przebruzną w pierwszym dniu po całkowitym przerwaniu rdzenia kręgowego.
Po urazie GFP jest wyrażane we wszystkich neuronach, a żółta strzałka wskazuje miejsce urazu. Przedstawiono tutaj rybkę zebra z całkowicie przerwanym rdzeniem kręgowym w trzeciej dobie po urazie. Ta utrwalona rybka zebra z etykietowaniem UCD wykazuje całkowite przerwanie rdzenia kręgowego.
Żółta strzałka ponownie wskazuje miejsce urazu. W przeciwieństwie do niego, sąsiedni obszar znakowania neuronów wzdłuż brzusznej krawędzi rdzenia kręgowego u tej utrwalonej rybki zebra trzy dni po urazie wskazuje na niepełne przerwanie.
Po opanowaniu techniki, za jej pomocą można przetwarzać 300 larw na godzinę.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę przecinania rdzenia kręgowego u larw zebrafish, wykorzystując ich przejrzystość oraz szybką regenerację. Po przecięciu obserwuje się powrót czucia już w 2. dniu po urazie, natomiast ruch typu C-bend odnotowuje się w 3. dniu po urazie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia regeneracyjna
- Modele rybek danio pręgowanych
Wstęp
- Urazy rdzenia kręgowego stanowią istotne wyzwanie w procesie rekonwalescencji.
- Danio pręgowany jest cennym modelem do badania regeneracji rdzenia kręgowego.
- Larwy danio pręgowanego oferują liczne zalety dzięki swojej przejrzystości oraz szybkiemu gojeniu.
- Zrozumienie mechanizmów regeneracji może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnej metody przecinania rdzenia kręgowego u larw zebrafish.
- Ocena przebiegu czasowego oraz mechanizmów regeneracji po urazie.
- Wykorzystanie mikroskopii immunofluorescencyjnej do oceny odpowiedzi neuronalnych.
Zastosowane metody
- Krzyżowanie dorosłych rybek zebrafish o odpowiednim genotypie.
- Screening i hodowla zarodków do piątego dnia po zapłodnieniu.
- Wykonanie przekroju przy użyciu ściętej pod kątem pipety do mikroiniekcji.
- Rekonwalescencja rannych ryb w pożywce z dodatkiem antybiotyków.
Główne wyniki
- Powrót funkcji zaobserwowano do szóstego tygodnia po urazie.
- Powrót czucia rozpoczyna się 2 dni po urazie.
- Ruch typu C-bend odnotowano do 3. dnia po urazie.
- Mikroskopia immunofluorescencyjna wykazuje odpowiedź progenitorów neuronalnych.
Wnioski
- Metoda ta pozwala na skuteczne przerwanie rdzenia kręgowego u larw zebrafish.
- Szybka rekonwalescencja dostarcza wiedzy na temat regeneracji rdzenia kręgowego.
- Wyniki mogą przyczynić się do zrozumienia mechanizmów naprawy neuronalnej.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Larwy danio pręgowanego umożliwiają szybką, wysokoprzepustową ocenę regeneracji rdzenia kręgowego, stanowiąc model uzupełniający dla systemów dorosłych w celu wczesnego etapu ograniczania ryzyka mechanistycznego. Metoda ta wspiera walidację celów poprzez dostarczanie mierzalnych odczytów funkcjonalnej i sensorycznej regeneracji w ciągu kilku dni, co przyspiesza przedkliniczną ocenę kandydatów o działaniu neurorestauracyjnym. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w zakresie angażowania celów i modulacji szlaków przed optymalizacją wiodących związków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych z odrastaniem aksonów i inicjacją neurogenezy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne wskaźniki przecięcia i regeneracji w celu spójnej oceny oddziaływania na cel.
- Wartość prognostyczna: Wczesne odczyty sensoryczne i motoryczne wspomagają funkcjonalną walidację celu oraz ograniczanie ryzyka związanego ze szlakami sygnałowymi.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Generuje standaryzowane modele uszkodzeń odpowiednie do przesiewu związków i analizy zależności dawka-odpowiedź.
- Wyniki ilościowe: Umożliwia pomiar początku regeneracji sensorycznej (2 dpi), ruchu w kształcie litery C (3 dpi) oraz wznowienia pływania (5 dpi) jako punktów końcowych funkcji.
- Skalowalność: Umożliwia przetwarzanie do 300 larw na godzinę, co ułatwia prowadzenie kampanii przesiewowych o średniej przepustowości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Modeluje zachowane mechanizmy regeneracji istotne dla patofizjologii urazów rdzenia kręgowego u ludzi.
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez wspólne wskaźniki odpowiedzi progenitorowych neuronów.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Umożliwia wczesne podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) na podstawie kinetyki powrotu funkcji, co zmniejsza ryzyko niepowodzeń w późnych etapach.
Integracja potoków przetwarzania i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając model kręgowca do walidacji celu i przesiewania mechanistycznego przed etapem identyfikacji związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących celów neuroregeneracyjnych poprzez obserwowalne harmonogramy powrotu funkcji sensorycznych i motorycznych.
- Przesiewy: Dostarcza standaryzowanych, mierzalnych fenotypów do oceny wpływu związków na regenerację.
- Analityka: Mikroskopia immunofluorescencyjna umożliwia obiektywną kwantyfikację proliferacji i migracji progenitorów neuronalnych jako biomarkerów mechanistycznych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki uzyskane na larwach z modelami dorosłych ryb zebrafish oraz ssaków poprzez konserwowane szlaki regeneracyjne.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do iteracyjnej walidacji celów w ramach wielu programów neuroregeneracyjnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu poprzez bezpośrednią obserwację dynamiki regeneracji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i standaryzację dzięki zdefiniowanym protokołom przecinania i regeneracji.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej oceny funkcjonalnej celów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów neuroregeneracyjnych skorygowaną o ryzyko, w oparciu o kinetykę regeneracji.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obsługi danio pręgowanego, mikrochirurgii i mikroskopii fluorescencyjnej.
- Metoda zależy od przygotowania pipet do mikroiniekcji oraz infrastruktury do obserwacji behawioralnych.
- Konieczne jest zastosowanie ustandaryzowanych protokołów znieczulenia i rekonwalescencji we wszystkich zespołach.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują tło genetyczne oraz kompatybilność transgenicznych reporterów.
- Ograniczenia praktyczne obejmują rozmiar larw oraz konieczność zastosowania precyzyjnej techniki przecięcia grzbietowo-bocznego.
