In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne przeprowadzenie in-vivo optogenetycznej stymulacji ośrodkowego układu nerwowego gryzoni u wybudzonego, swobodnie poruszającego się zwierzęcia. Osiąga się to poprzez uprzednie ustawienie i skonfigurowanie odpowiedniego systemu laserowego do wykonywania stymulacji optogenetycznej. Następnie światłowody kompatybilne z testami behawioralnymi są ustawiane tak, aby dostarczały światło laserowe do wszczepionego światłowodu i do obszaru mózgu wyrażającego opsynę.

Następnie zwierzę jest przywiązywane do systemu laserowego w celu stymulacji optogenetycznej i umieszczane w aparacie do testów behawioralnych. Wreszcie, zdefiniowane przez eksperymentatora parametry stymulacji świetlnej w celu włączenia lub wyłączenia neuronów są dostarczane, gdy zwierzę wykonuje zadanie behawioralne. Ostatecznie, in vivo, stymulacja optogenetyczna jest wykorzystywana, aby umożliwić kontrolę w czasie rzeczywistym określonych populacji neuronów lub obwodów nerwowych u obudzonych, zachowujących się zwierząt w celu określenia ich funkcjonalnej roli w danym zachowaniu będącym przedmiotem zainteresowania.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że pozwala ona na kontrolę w czasie rzeczywistym genetycznie i przestrzennie zdefiniowanych populacji neuronów u obudzonych, zachowujących się zwierząt z rozdzielczością czasową wymaganą do powiązania wzorców aktywności neuronalnej ze złożonymi stanami behawioralnymi. Protokół ten zakłada użycie laserów klasy trzeciej B i wymaga przestrzegania odpowiednich wytycznych dotyczących szkolenia i bezpieczeństwa. Podczas pracy z laserami, przy których procedury osiowania stwarzają szczególnie wysokie ryzyko, należy nosić okulary ochronne przez cały czas pracy z laserami, przy czym procedury ustawiania stanowią szczególnie wysokie ryzyko, po ustawieniu aparatury laserowej zgodnie z protokołem tekstowym, przeprowadzić bezdotykowe sprzęganie laserowe wewnętrznego niebieskiego lasera, najpierw ustawiając przełączniki z tyłu lasera na prąd i TTL na tranzystorowy tryb logiczny tranzystora w celu stałego oświetlenia z przodu sterownika, Upewnij się, że pokrętło zasilania jest ustawione na zero.

Następnie włącz laser, najpierw włączając sterownik, a następnie lasera. Aby zapewnić bezpieczeństwo oczu, powoli wyreguluj pokrętło zasilania tak, aby emitowane było około jednego miliwata światła laserowego. Następnie odczekaj od 10 do 15 minut, aż laser się rozgrzeje.

Następnie podłącz tester światłowodowych bezpośrednio do wolnego końca krosowego łącznika i włącz tester. Następnie wyreguluj kąt łącznika tak, aby czerwona wiązka poruszała się prosto z powrotem w kierunku środka zwierciadła dichroicznego. Ścieżka wiązki czerwonego światła emitowanego przez tester jest dokładną drogą, którą będzie musiało podążać przychodzące światło laserowe, aby zostać sprzężone z laserem.

Aby wykonać wyrównanie kursu, użyj bocznych i poziomych pokręteł na lusterkach kinematycznych, aby skierować wiązkę światła laserowego do łącznika. Nie przejmuj się, jeśli w tym czasie nie jest emitowane niebieskie światło z krosowego dołączonego do łącznika. Teraz umieść pojedynczy kawałek półprzezroczystego papieru bezpośrednio przed lustrem dichroicznym, pomiędzy dichroikiem a łącznikiem.

Po tej samej stronie tego papieru będzie zarówno niebieska, jak i czerwona kropka odpowiednio z lasera i testera. Dokonaj precyzyjnej regulacji pierwszego lusterka kierowniczego, ostrożnie regulując boczne i poziome pokrętła, aby wyrównać środek czerwonej kropki z niebieską kropką. Przesuń papier z powrotem w kierunku łącznika, tak aby znalazł się bezpośrednio przed nim, i wyreguluj pokrętła na drugim lustrze dichroicznym, aby wyrównać wiązkę laserową z wiązką czerwoną.

Kontynuuj dokonywanie precyzyjnych regulacji dwóch lusterek, aż środek niebieskiej i czerwonej belki zostanie dokładnie wyrównany. Coline, wyjmij tester z przewodu łącznika. Światło lasera powinno być teraz wpuszczane z końca krosowego łącznika.

Aby określić wydajność sprzężenia, użyj miernika mocy światła, aby porównać moc światła wchodzącego do łącznika z mocą światła emitowaną z końca światłowodu. Sprawność sprzęgania większa niż 80% jest uważana za bardzo dobrą przy zachowaniu pozycji zwierciadła dichroicznego. Użyj dwóch lusterek kierowniczych dla zewnętrznego żółtego lasera i postępuj zgodnie z procedurą wyrównania, którą właśnie pokazano, aby sprzęgnąć żółty laser, aby skonfigurować światłowód do stymulacji pojedynczej myszy.

Zacznij od użycia adaptera wspornika F-C-F-C-L bezpośrednio przymocowanego do płytki stykowej, aby podłączyć krosowy łącznika do krosowego z grubym płaszczem. Przymocuj złącze obrotowe komutatora do wolnych końców krosowego z grubą osłoną. Następnie przymocuj krosowy dla zwierząt do komutatora.

Przymocuj dzieloną tuleję łączącą do wolnego metalowego dzikiego końca krosowego dla zwierząt, nie wciskając tulei do końca. Dzikie pozostawiają około 0,5 centymetra odsłoniętego rękawa, ponieważ to właśnie on łączy się ze światłowodem przymocowanym do zwierzęcia za pomocą BNC. Podłącz sterownik niebieskiego lasera do generatora impulsów i włącz generator impulsów.

Teraz załóż odpowiednie okulary ochronne. Następnie po upewnieniu się, że pokrętło zasilania z przodu sterownika jest ustawione na zero, włącz laser, najpierw włączając sterownik, a następnie lasera z laserem ustawionym w tryb dodatni TT L. Powoli wyreguluj pokrętło z przodu lasera i użyj miernika mocy światła, aby ustawić emisję światła od pięciu do 10 miliwatów z końcówki krosowego dla zwierząt.

Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat tego ustawienia. Przełącz niebieski laser w tryb analogowy do stymulacji in vivo i odczekaj od 10 do 15 minut, aż laser się rozgrzeje. Następnie delikatnie przymocuj mysz i podłącz dzieloną tuleję na zwierzęcym krosowym do przewlekłego wszczepialnego włókna.

Upewnij się, że końce obu włókien nawiązują ze sobą fizyczny kontakt, używając szczeliny na tulei łączącej jako okna do wizualizacji bezpośredniego kontaktu między nimi. Pozwól myszy na regenerację przez kilka minut przed rozpoczęciem testów behawioralnych. Następnie umieść zwierzę w aparacie do testów behawioralnych, upewniając się, że przewód połączeniowy jest wolny od zaczepów.

Użyj generatora impulsów, aby impulsować niebieski laser o określonej częstotliwości, który aktywuje opcję wyboru. Po zakończeniu eksperymentu potwierdź histologicznie rozmieszczenie wirusa i błonnika, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym, aby uzyskać dokładną interpretację wyników behawioralnych. Pod mikroskopem należy sprawdzić miejsce ekspresji opsyny i implantu włóknistego oraz wizualnie potwierdzić prawidłowe umiejscowienie iniekcji wirusa i implantu na podstawie wybranych współrzędnych.

W tym przykładzie wyników behawioralnych uzyskanych poprzez stymulację optogenetyczną in vivo, neurony dopaminowe w obszarze brzusznym lub VTA myszy z kremem hydroksylazy tyrozynowej zostały transdukowane albo ze stabilną funkcją krokową OPSIN lub EYFP jako kontrolowany wirus, a implant włóknisty został przewlekle wszczepiony. Grupy myszy były jednocześnie stymulowane, a zachowanie lokomotywy rejestrowano przez jedną godzinę, jak pokazano tutaj. Wielokrotna stymulacja operacji i transdukowana mysz po lewej stronie skutkowały hiperaktywnym fenotypem, który utrzymywał się przez cały czas stymulacji.

Chociaż po testach behawioralnych nie zaobserwowano żadnych zmian w zachowaniu lokomotywy u myszy kontrolnej po prawej stronie, przeprowadzono immunohistochemię w celu zweryfikowania dokładnego kierowania wirusa na neurony dopaminowe VTA, a rozmieszczenie włókien zostało wizualnie potwierdzone, jak pokazano na tym rysunku po opanowaniu. Technika ta może być wykorzystana do manipulowania aktywnością neuronalną w dowolnym obszarze mózgu w połączeniu z różnymi testami behawioralnymi jako funkcjonalny odczyt modulacji obwodów neuronalnych.