Name: Modelowanie spontanicznego przerzutowego raka nerkowokomórkowego (mRCC) u myszy po nefrektomii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Poznaj modelowanie spontanicznego przerzutowego raka nerkowokomórkowego u myszy po nefrektomii. Ta metoda umożliwia ocenę postępu choroby i skuteczności terapii eksperymentalnych w badaniach onkologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni laboratorium dr Roberta S. Kerbela (University of Toronto, Sunnybrook Research Institute, Toronto, Kanada) za pomoc techniczną i ekspertyzę w rozwoju tej procedury. Chcielibyśmy również podziękować dr Sandrze Sexton i Departamentowi Laboratoryjnych Zasobów Zwierzęcych Instytutu Raka w Roswell Park. Praca ta została wsparta nagrodą przyznaną przez Roswell Park Alliance Foundation (dla JMLE).

1. Ortotopowa implantacja guza nerki
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa
	<ol>
		<li>Przed implantacją ortotopową należy wyhodować mysie komórki RENCALUC jako monowarstwę do 75% konfluencji.</li>
		<li>Po trypsynizacji i ponownym zawieszeniu w pożywce zawierającej 5% FBS, odwirować komórki z prędkością 1 000 obr./min, 4 °C przez 5 minut, powtarzając 3 razy, aby przemyć w PBS. Następnie ponownie zawiesić komórki w pożywce bez surowicy do stężenia 5 x 104 RENCALUC/5 μl pożywki bez surowicy. 
		Uwaga: W zależności od użytego wariantu lub linii komórkowej, komórki mogą być ponownie zawieszone w stosunku 1:1 pożywki wolnej od matrigelu i surowicy, aby spowolnić bardzo agresywny wzrost i rozprzestrzenianie się komórek myszy po implantacji. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chirurgia i implantacja komórkowa 
	Uwaga: Wszystkie opisane w nim badania na zwierzętach, w tym utrzymanie i określenie eksperymentalnych punktów końcowych, zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) zatwierdzonym przez Roswell Park Cancer Institute.
	<ol>
		<li>Znieczulij jedną mysz Balb/C za pomocą izofluranu (2-3%). Uszczypnij stopę i sprawdź, czy nie ma odruchu, aby zapewnić wystarczające znieczulenie. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Umieść mysz w prawej pozycji bocznej i ogol lewą stronę między przednią a tylną kończyną. Nałóż alkohol i jod wzdłuż grzbietowej części lędźwiowej, aby aseptycznie przygotować obszar do nacięcia.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych rozpocznij 1 cm nacięcie skóry w kierunku wzdłużnym między ostatnim żebrem a stawem biodrowym. Poluzuj tkankę łączną pod skórą za pomocą nożyczek do preparowania. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj 0,5 cm nacięcie w kierunku wzdłużnym w ścianie brzucha. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie docisnąć otwartą ranę – spowoduje to uzewnętrznienie nerki i pozwoli na delikatne unieruchomienie narządu przed wstrzyknięciem.</li>
		<li>Załadować do strzykawki Hamilton 5 μl przygotowanej mieszaniny komórek. W przypadku implantacji podtorebkowej można zastosować dwie metody implantacji:
		<ol>
			<li>Powierzchowne: Biegnąc równolegle do nerki zorientowanej podłużnie, wprowadzić igłę pod torebkę nerkową (ale powyżej miąższu) skośną krawędzią do góry. Po umieszczeniu igły należy wstrzyknąć wszystkie komórki, aż utworzy się mały biały pęcherzyk. Powoli wyjąć igłę z kapsułki i natychmiast osuszyć wstrzyknięcie sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką, aby wchłonąć wszelkie wycieki i zapobiec rozprzestrzenianiu się komórek.</li>
			<li>Wewnętrzne: Ze ściętą krawędzią do góry i zaczynając od strony nerki przeciwnej do końcowego miejsca implantacji, wprowadzić igłę przez wnętrze nerki, aż igła będzie widoczna (ale nie przebijająca) przestrzeni podtorebkowej. Wstrzyknij wszystkie komórki, aż utworzy się biała bańka i miejsce wstrzyknięcia wymazu, aby zapobiec wyciekowi.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Delikatnie przywróć nerkę do jamy ciała. Zamknij ścianę brzucha za pomocą wchłanialnego szwu 5-0 Vicryl. Po zakończeniu ściągnij warstwę skóry do siebie i umieść 2-3 klipsy do ran. Upewnij się, że klipsy są mocne i równomiernie rozmieszczone, aby nie było odsłoniętych ran. Przed rekonwalescencją należy podać podskórnie 500 μl 0,9% NaCl i 100 μl buprenorfiny (0,01 mg/ml) za pomocą igły 25 G. Rutynowo monitoruj rozmieszczenie i stabilność klipsa i usuń go po 10 dniach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Nefrektomia/Usunięcie guza pierwotnego
<ol>
	<li>Należy postępować zgodnie z identycznym protokołem znieczulenia, unieruchomienia, nacięcia i odsłonięcia nerki u myszy, jak opisano w sekcjach 1.2.1 i 1.2.2 (powyżej).</li>
	<li>Użyj drugiej pary kleszczy, aby odizolować nerkę, delikatnie usuwając łączącą tkankę tłuszczową z końca ogonowego i nadnercza z czaszkowego końca nerki. Delikatnie chwytając nerkę, użyj wchłanialnego szwu 5-0 Vicryl, aby utworzyć podwójny węzeł wokół moczowodu, tętnicy nerkowej i żyły. Powoli zabezpiecz, a następnie przeciąć nad węzłem, aby usunąć nerkę. Jeśli wystąpią jakiekolwiek oznaki natychmiastowej utraty krwi lub istnieje ryzyko niewystarczającego uchwycenia szwu na moczowodzie, tętnicy i żyle, użyj kauteryzatora zamiast nożyczek, aby przeciąć powyżej węzła.  </li>
	<li>Po usunięciu nerki dokładnie sprawdź, czy nie ma krwawienia z zawiązanej tętnicy i w razie potrzeby użyj kauteryzatora. Zamknij ścianę brzucha za pomocą 5-0 Vicryl. Ściągnąć warstwę skóry i umieścić 2-3 klipsy do ran, zachowując te same środki ostrożności, jak opisano w 1.2.4. Ściśle monitoruj zwierzę codziennie po operacji pod kątem oznak niepokoju, krwawienia lub ograniczonej mobilności. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi bezpieczeństwa zwierząt.</li>
</ol>
3. Monitorowanie progresji i lokalizacji przerzutów w punkcie końcowym
<ol>
	<li>Kwantyfikacja choroby z przerzutami: monitorowanie bioluminescencyjne
	<ol>
		<li>Patrz metodologia opisana wcześniej w JOVE do monitorowania przerzutów przy użyciu komórek transfekowanych lucyferazem i oznaczanych ilościowo za pomocą systemu obrazowania Xenogen IVIS 11,12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualny przewodnik po sekcji zwłok do oceny porównawczej rozmieszczenia przerzutów
	<ol>
		<li>Składanie zwierząt w ofierze zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi przy użyciu punktów końcowych, w tym oznak niepokoju, trudności w oddychaniu, utraty wagi itp. 
		Uwaga: Ścisłe monitorowanie zwierząt ma kluczowe znaczenie, ponieważ spontaniczna progresja przerzutów może być bardzo zmienna i szybka. </li>
		<li>Użyj nożyczek chirurgicznych, aby zainicjować nacięcie nad cewką moczową, które biegnie w górę klatki piersiowej do dolnej żuchwy. Użyj nożyczek, aby oddzielić skórę od mięśnia ściany brzucha.</li>
		<li>Zainicjuj nacięcia wzdłuż rąk i nóg. Oderwij skórę. Dokładnie zbadaj powięź skóry i ścianę brzucha pod kątem guzków, a następnie powierzchowne węzły chłonne: pachwinowe, ramienne, pachowe i powierzchowne szyjne.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie w ścianie brzucha i przetnij wzdłuż lewej i prawej bocznej strony aż do przepony. Jednym poziomym cięciem usuń przednią część ściany brzucha, aby odsłonić wnętrzności.</li>
		<li>Zbadaj niezakłócony wygląd wnętrzności pod kątem rażąco zauważalnych guzów. Zwróć również uwagę na zawartość żołądka i jelit; Jeśli są puste, mysz mogła nie być w stanie jeść. Jeśli zawartość jest ciemna, może to wskazywać na krwotok z górnego/dolnego odcinka przewodu pokarmowego.</li>
		<li>Wizualnie oceń każdy narząd pod kątem obecności lub braku guza, przypisując łączny wynik dla każdej grupy myszy (4 zwierzęta na grupę są używane jako przykład na rysunku 1D-i). 
		Uwagi: 1) Powiększenie węzłów chłonnych niekoniecznie oznacza, że jest to wzrost guza; Jeśli jest duży, bardzo jędrny i ma białawy kolor, prawdopodobnie jest to guzek przerzutowy. 2) Nadmierna mleczna lub mętna ciecz w jamie brzusznej wskazuje na wodobrzusze. Wodobrzusze może obejmować stałe nagromadzenia na narządach jamy brzusznej, szczególnie między płatami wątroby a żołądkiem. 3) W przypadku narządów, takich jak płuca, może występować wiele guzków, które można policzyć do celów porównań między poszczególnymi zwierzętami (patrz na przykład 13).</li>
		<li>Zidentyfikuj poważne guzy lub nieprawidłowości poszczególnych narządów jamy brzusznej: wątroby, śledziony, nerek i trzustki, ostrożnie usuwając i myjąc PBS z butelki do spryskiwania.</li>
		<li>Po usunięciu narządów jamy brzusznej należy sprawdzić węzły chłonne jamy brzusznej, w tym węzeł chłonny lędźwiowy, krzyżowy, nerkowy i krezkowy.</li>
		<li>Oceń przeponę pod kątem objawów rozprzestrzeniania się przerzutów. 
		Uwaga: Rozległe rozproszenie na przeponie może spowodować utratę kurczliwości, co prowadzi do utrudnienia lub utraty oddechu.</li>
		<li>Usuń przeponę i wykonaj dwa boczne nacięcia w jamie piersiowej, usuwając część czołową, aby odsłonić płuca i serce.</li>
		<li>Usuń płuca i serce, delikatnie chwytając i podnosząc przełyk oraz przecinając tchawicę nad sercem. Oceń tkanki pod kątem guzków. Ściśnij serce. Brak sprężystej konsystencji może wskazywać na obecność guza.</li>
		<li>Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć liniowo czaszkę. Delikatnie usuń małe kawałki czaszki, aż cały mózg zostanie odsłonięty. Szukaj w całym mózgu widocznych guzków lub nieprawidłowości, przebarwień.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).</li>
<li>Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endostatin+neoadjuvant+gene+therapy+extends+survival+in+an+orthotopic+metastatic+mouse+model+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Endostatin neoadjuvant gene therapy extends survival in an orthotopic metastatic mouse model of renal cell carcinoma.</a> Biomed. Pharmacother. 66, 237-241 (2012).</li>
<li>Amagai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+of+interleukin-2+and+sorafenib+improves+survival+benefits+and+prevents+spontaneous+pulmonary+metastasis+in+murine+renal+cell+carcinoma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Combination therapy of interleukin-2 and sorafenib improves survival benefits and prevents spontaneous pulmonary metastasis in murine renal cell carcinoma models.</a> Jpn. J. Clin. Oncol. 40, 503-507 (2010).</li>
<li>Steeg, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Drug+Development+Must+Consider+the+Impact+on+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preclinical Drug Development Must Consider the Impact on Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 15, 4529-4530 (2009).</li>
<li>Guerin, E., Man, S., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+postsurgical+advanced+metastatic+breast+cancer+more+accurately+replicates+the+clinical+efficacy+of+antiangiogenic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A model of postsurgical advanced metastatic breast cancer more accurately replicates the clinical efficacy of antiangiogenic drugs.</a> Cancer Res. 73, 2743-2748 (2013).</li>
<li>Day, C. P., Carter, J., Bonomi, C., Hollingshead, M., Merlino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+therapeutic+response+of+residual+metastatic+disease+is+distinct+from+its+primary+tumor+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Preclinical therapeutic response of residual metastatic disease is distinct from its primary tumor of origin.</a> Int. J. Cancer. 130, 190-199 (2012).</li>
<li>Ebos, J. M., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+therapy%3A+impact+on+invasion%2C+disease+progression%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic therapy: impact on invasion, disease progression, and metastasis.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 210-221 (2011).</li>
<li>Naito, S., Walker, S. M., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+of+human+renal+cell+carcinoma+cells+with+high+metastatic+potential+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">In vivo selection of human renal cell carcinoma cells with high metastatic potential in nude mice.</a> Clin. Exp. Metastasis. 7, 381-389 (1989).</li>
<li>Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+implantation+in+essential+for+the+selection%2C+growth+and+metastasis+of+human+renal+cell+cancer+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Orthotopic implantation in essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice.</a> Cancer Metastasis Rev. 9, 145-165 (1990).</li>
<li>Saiki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+invasive+and+metastatic+phenotype+in+human+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Characterization of the invasive and metastatic phenotype in human renal cell carcinoma.</a> Clin. Exp. Metastasis. 9, 551-566 (1991).</li>
<li>Mohanty, S., Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis assay.</a> J. Vis. Exp. 42 (1942), (2010).</li>
<li>Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+model+of+serous+ovarian+cancer+in+immunocompetent+mice+for+in+vivo+tumor+imaging+and+monitoring+of+tumor+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ebos, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+metastasis+after+short-term+treatment+with+a+potent+inhibitor+of+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis.</a> Cancer Cell. 15, 232-239 (2009).</li>
<li>Yang, O. C., Maxwell, P. H., Pollard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+cell+carcinoma%3A+translational+aspects+of+metabolism+and+therapeutic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Renal cell carcinoma: translational aspects of metabolism and therapeutic consequences.</a> Kidney Int. 84 (4), 667-681 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Celem tego protokołu jest ocena klinicznie istotnej spontanicznej choroby przerzutowej przy użyciu syngenicznego modelu guza myszy w celu opisania technik implantacji/resekcji. Obecnie większość badań przedklinicznych oceniających nowe eksperymentalne terapie nie obejmuje badań nad chorobą przerzutową, a tylko nieliczne podsumowują etapy wzrostu guza pierwotnego, resekcji chirurgicznej i ewentualnego spontanicznego rozprzestrzeniania się przerzutów. Do tej pory genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) wygenerowane w ...

Główną przyczyną śmiertelności u pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym (RCC) jest ogólnoustrojowa choroba przerzutowa, która zwykle występuje po chirurgicznym usunięciu guza pierwotnego rosnącego w nerce. Jednak bardzo niewiele przedklinicznych modeli nowotworów oceniających eksperymentalne terapie u myszy obejmuje chorobę przerzutową, a jeszcze mniej wiernie oddaje kliniczne etapy zlokalizowanego wzrostu, operacji oraz spontanicznej inicjacji i progresji mikroprzerzutów 1-3. Ta luka w testach staje się coraz ważniejsza w ocenie nowych terapii, ponieważ czasami uderzające efekty przeciwnowotworowe obserwowane w modelach zwierzęcych nie zawsze przekładały się na podobnie skuteczne leczenie pacjentów 4. Takie różnice w wynikach mogą wynikać z różnic w skuteczności leków między zlokalizowanymi ektopowymi lub ortotopowymi modelami guza pierwotnego a późnym stadium choroby przerzutowej 5-7. W przypadku RCC tylko w kilku badaniach zastosowano ustalone protokoły na zwierzętach, które obejmują spontaniczne nawroty choroby, które naśladują pacjentów, którzy zazwyczaj mieli całkowicie lub częściowo usunięte nerki zawierające guz 2,3. Przyczyny tego braku w testowaniu modeli mysich są różne. Po pierwsze, istnieje wysoki koszt zwierzęcy i nieodłączna zmienność selekcji komórek nowotworowych i potencjału przerzutowego. Na przykład ludzkie linie komórkowe nerki mają tendencję do rzadkich przerzutów i muszą być selekcjonowane w wielu rundach ortotopowej implantacji pierwotnej i selekcji przerzutowej, aby uzyskać warianty, które konsekwentnie rozprzestrzeniają się i tworzą odległe zmiany (patrz opis takiej ludzkiej linii komórkowej wyprowadzonej 8-10). I odwrotnie, komórki myszy w modelach immunokompetentnych mają tendencję do agresywnego zachowania, a niskiej liczbie komórek należy wstrzyknąć matrigel, aby zmniejszyć natychmiastowe rozprzestrzenianie się ogólnoustrojowe 3. Po drugie, trudności techniczne w wykonaniu prawidłowej implantacji, resekcji chirurgicznej (nefrektomii) oraz śledzeniu (i ilościowym) spontanicznego wzrostu przerzutów mogą być wyzwaniem, a przy stosowaniu tej techniki należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych zmiennych (szczegóły w Dyskusji). Celem tego protokołu jest opisanie podstawowych etapów (a także potencjalnych pułapek) implantacji ortotopowej, resekcji (nefrektomii) i monitorowania spontanicznej przerzutowej choroby RCC oraz zaoferowanie wytycznych do standaryzowanego (i szerszego) stosowania w laboratoriach naukowych, które oceniają skuteczność eksperymentalnych środków terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>DMEM-wysoki poziom glukozy z Pyr. I L-Glutamina</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS bez wapnia & Magnesium</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>musi być trzymany na lodzie</td></tr><tr><td>Maść okulistyczna ze sztucznymi łzami i smarem</td><td>Akorn Animal Health</td><td>17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Kieszonkowy trymer dla zwierząt</td><td>Braintree scientific</td><td>CLP9931B</td><td></td></tr><tr><td>Wacik nasączony alkoholem</td><td>VWR</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>wacik z roztworem betadyny</td><td>VWR</td><td>67618-152-01</td><td></td></tr><tr><td>MICRO DISSECTING sissors proste, - Ostrza 25 mm - 4.5"&nbsp;</td><td>Southpointe chirurgiczne</td><td>kleszcze do tęczówki RS-5982</td><td></td></tr><tr><td>, ząbkowane, zakrzywione, INS15915</td><td>naukowe Kent</td><td></td> o długości 10 cm <td>potrzebują dwóch z tych</td></tr><tr><td>10 i mikro; l Strzykawka Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>30 G, 45 stopni, igła RN</td><td>Hamilton</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny aplikator z bawełnianą końcówką</td><td>VWR</td><td>10805-144</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do kauteryzacji wysokotemperaturowej</td><td>Kent scientific</td><td>INS500392</td><td></td></tr><tr><td>5-0 powlekany Vicryl, konwencjonalna igła do cięcia&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>J834</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator do klipsów Reflex do klipsów 7 mm Kent</td><td>scientific</td><td>INS500343</td><td></td></tr><tr><td>Klipsy refleksyjne, 7 mm, niesterylne</td><td>Kent scientific</td><td>INS500344</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do usuwania, długość 12 cm</td><td>Kent scientific</td><td>INS500347</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Chlorek sodu</td><td>Baxter Healthcare</td><td>2B1322</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina 0,01 mg/ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła 25 G 5/8"</td><td>VWR</td><td>BD305122</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 1 ml bez igły</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td></td></tr><tr>technologia<td>D-Luciferin</td><td>Gold Bio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie spontanicznego przerzutowego raka nerkowokomórkowego (mrcc) u myszy po nefrektomii

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

Jednym z kluczowych wyzwań dla lepszego testowania nowych eksperymentalnych terapii raka nerkowokomórkowego (RCC) jest opracowanie modeli, które wiernie odwzorowują wczesne i późne stadium progresji choroby przerzutowej. Typowe modele implantacji guza wykorzystują ektopową lub ortotopową implantację guza pierwotnego, ale niewiele z nich obejmuje układową spontaniczną chorobę przerzutową, która naśladuje warunki kliniczne. Protokół ten opisuje kluczowe kroki do rozwoju etapów progresji choroby RCC podobnych do pacjentów. Po pierwsze, wykorzystuje wysoce przerzutową linię komórek nowotworowych myszy w modelu syngenetycznym, aby pokazać ortotopową implantację komórek nowotworowych. Metody obejmują powierzchowną i wewnętrzną implantację do przestrzeni podtorebkowej za pomocą komórek połączonych z matrigelem, aby zapobiec przeciekaniu i wczesnemu rozprzestrzenianiu się. Następnie opisano procedury wycinania nerki zawierającej nowotwór (nefrektomia), z krytyczną opieką przed i po operacji na myszach. Na koniec przedstawiono kroki niezbędne do monitorowania i oceny progresji choroby mikro- i makroprzerzutowej, w tym obrazowanie bioluminescencyjne, a także przedstawiono szczegółowy wizualny przewodnik po sekcji zwłok w celu oceny rozkładu chorób ogólnoustrojowych. Celem opisu tego protokołu jest ułatwienie powszechnego stosowania klinicznie istotnych modeli przerzutowego raka nerkowokomórkowego w celu poprawy wartości predykcyjnej przyszłych badań terapeutycznych.

Rysunek 1A przedstawia schemat opisujący procedury szczegółowo omówione w tym podsumowaniu protokołu. Na każdym etapie należy wziąć pod uwagę kilka istotnych czynników. Na przykład w Kroku 1 pokazano dwie metody implantacji komórek nowotworowych do przestrzeni podtorebkowej nerki. Komórki nowotworowe można implantować do przestrzeni podtorebkowej, tworząc małą białą pęcherzykową strukturę potwierdzającą lokalne umieszczenie komórek, zapobiegając wyciekowi poprzez ostrożne wyjęcie igły i przetarcie nadmia...

Modele spontanicznej progresji choroby raka nerkowokomórkowego z przerzutami (RCC) mogą być używane do oceny leczenia w klinicznie istotnych warunkach. Protokół ten demonstruje różne procedury ortotopowej implantacji komórek nowotworowych nerki, prawidłowej nefrektomii, a na koniec przedstawia przewodnik po sekcji zwłok do wizualnej i bioluminescencyjnej oceny obciążenia i lokalizacji przerzutów.

Modelowanie spontanicznego przerzutowego raka nerkowokomórkowego (mRCC) u myszy po nefrektomii

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie spontanicznych przerzutów raka jasnokomórkowego nerki o istotnym znaczeniu klinicznym. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie komórek reka Luke do implantacji, a następnie przeprowadzenie ortotopowej implantacji komórek nowotworowych do nerki.Następnie, po wzroście guza, guz pierwotny zostaje usunięty poprzez wykonanie nefrektomii. Ostatnim krokiem jest monitorowanie progresji spontanicznych przerzutów po nefrektomii oraz ocena rozprzestrzeniania się choroby w różnych lokalizacjach. Ostatecznie protokół ten umożliwia monitorowanie spontanicznego przerzutowego raka komórkowego nerki i stanowi wytyczne do standaryzacji oceny skuteczności eksperymentalnych metod terapeutycznych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ektopowa, często powierzchowna lub podskórna implantacja komórek nowotworowych, jest to, że odzwierciedla ona raka jasnokomórkowego nerki lub RCC w postaci występującej u pacjentów, co obejmuje zdolność komórek nowotworowych do rozprzestrzeniania się w organizmie. Znaczenie tej techniki wykracza poza samą diagnostykę i obejmuje leczenie raka nerki, ponieważ to systematyczna choroba przerzutowa jest w rzeczywistości główną przyczyną śmiertelności pacjentów. Modele mysie zazwyczaj nie odtwarzają spontanicznej choroby przerzutowej, która może czasem wystąpić po nefrektomii.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat spontanicznego przerzutowego przebiegu RCC, można ją również zastosować do innych typów nowotworów, w których typowe jest usunięcie guza pierwotnego, a główną przyczyną śmiertelności jest nawrót choroby w postaci przerzutów pooperacyjnych. Obejmuje to między innymi modele raka piersi oraz czerniaka.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, po pierwsze, z powodu trudności w zlokalizowaniu nerki oraz zapewnieniem, aby komórki nowotworowe pozostały zlokalizowane w miejscu implantacji i nie wyciekały. Po drugie, kwestią jest to, czy zabieg jest przeprowadzany efektywnie i umożliwia regenerację pooperacyjną. Przed implantacją ortotopową należy hodować mysie komórki reca oznakowane lucyferazą lub komórki reka Luke w monowarstwie do 75% konfluencji; po trypsynizacji i ponownym zawieszeniu w medium zawierającym 5% FBS, należy odwirować komórki, powtarzając czynność trzykrotnie z przemywaniem w PBS, a następnie zawiesić komórki w medium beztłuszczowym do stężenia 5 × 10⁴ renco Luke na 5 µL medium beztłuszczowego.Po znieczuleniu myszy z modelem jelitowym przy użyciu 2 do 3% izofluranu, należy uszczypnąć stopę, aby sprawdzić stopień znieczulenia. Po zastosowaniu maści weterynaryjnej na oczy w celu zapobiegania ich wysychaniu, ułożyć mysz w pozycji bocznej prawej i ogolić lewą stronę ciała pomiędzy przednimi a tylnymi kończynami. Następnie obszar grzbietowy w okolicy lędźwiowej należy przemyć alkoholem i jodyną. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonać nacięcie skóry o długości jednego centymetra w kierunku podłużnym pomiędzy ostatnim żebrem a stawem biodrowym.Następnie za pomocą nożyczek do tępej dyssekcji poluzuj tkankę łączną pod skórą. Dalej, używając nożyczek chirurgicznych, wykonaj nacięcie o długości 0,5 centymetra w kierunku podłużnym w ścianie brzusznej. Teraz za pomocą zakrzywionej pęsety delikatnie odsuń tkanki wokół otwartej rany.Pozwala to na wyłonienie nerki i jej delikatną immobilizację przed wykonaniem iniekcji. Napełnij strzykawkę Hamiltona pięcioma µL przygotowanej mieszaniny komórek w celu przeprowadzenia powierzchownej implantacji podtorebkowej. Trzymając igłę równolegle do podłużnej osi nerki, ściętym końcem do góry, wprowadź ją pod torebkę nerki, ale powyżej miąższu.Po umieszczeniu igły w odpowiednim miejscu, wstrzyknij wszystkie komórki, aż utworzy się mały biały pęcherzyk. Powoli wyjmij igłę z torebki i natychmiast użyj sterylnego aplikatora z bawełnianym końcem, aby zablokować miejsce wstrzyknięcia w celu przeprowadzenia wewnętrznej implantacji podtorebkowej. Zacznij od strony nerki przeciwnej do pożądanego miejsca implantacji.Trzymaj igłę tak, aby ścięta końcówka była skierowana do góry i do wewnątrz. Wprowadź ją przez wnętrze nerki, aż igła stanie się widoczna, uważając, aby nie przebić przestrzeni podtorebkowej po przeciwnej stronie. Wstrzykuj komórki do momentu utworzenia się białej pęcherzyka, a następnie przetrzyj miejsce wstrzyknięcia, aby zapobiec wyciekowi.Ostrożnie wprowadź nerkę z powrotem do jamy ciała. Zamknij ścianę brzusną, używając wchłanialnej nici Vicryl 5.0. Po zakończeniu zbliż warstwę skóry i załóż dwa do trzech klamer skórnych przed etapem rekonwalescencji.Podaj podskórnie 500 µL 0,9% NaCl oraz 100 µL buprenorfiny. Od 26 do 30 dni po implantacji znieczul zwierzę i odsłoń nerkę w sposób opisany wcześniej. Następnie za pomocą pincety delikatnie usuń tkankę tłuszczową łączącą guzowaty koniec nerki i usuń nadnercze z końca czaszkowego.Za pomocą pęsety delikatnie chwyć nerkę, a następnie przesuń wchłanialną nicią 5.0 Vicryl wokół moczowodu, tętnicy nerkowej i żyły nerkowej. Następnie, po zaciśnięciu nici kleszczykami hemostatycznymi, powoli zawiąż podwójny węzeł. Za pomocą nożyczek przetnij nici powyżej węzła i usuń nerkę.Po usunięciu nerki należy dokładnie sprawdzić, czy z miejsca nacięcia lub tętnicy nie występuje krwawienie, a w razie potrzeby zastosować kauteryzację. Po zaszyciu ściany brzucha nicią 5.0 Vicryl, skórę należy zamknąć za pomocą klamer chirurgicznych. Zwierzę należy monitorować codziennie pod kątem objawów stresu, krwawienia lub ograniczonej ruchomości.Po eutanazji zwierzęcia należy użyć nożyczek chirurgicznych, aby wykonać nacięcie zaczynając powyżej cewki moczowej i kontynuując je w górę przez jamę klatki piersiowej aż do dolnej żuchwy. Za pomocą nożyczek tępych należy oddzielić skórę od mięśni ściany brzusznej. Następnie należy naciąć skórę wzdłuż kończyn przednich i tylnych, a potem powoli ją odwarstwić.Dokładnie obejrzyj powięź skórną i ścianę brzucha w poszukiwaniu guzków. Następnie obejrzyj powierzchowne węzły chłonne. Wykonaj nacięcie w ścianie brzucha i przetnij ją wzdłuż lewej i prawej strony bocznej aż do przepony.Wykonać jedno cięcie poziome. Usunąć przednią część ściany brzusznej, aby odsłonić trzewia. Zbadać nienaruszony wygląd trzewi w celu wykrycia makroskopowo widocznych guzów.Należy również sprawdzić zawartość żołądka i jelit pod kątem obecności pokarmu lub krwawienia. Każdy organ należy ocenić wizualnie pod kątem obecności lub braku guzów, korzystając z listy kontrolnej obejmującej 22 miejsca; wyniki dla zwierząt w danej grupie są zestawione w tabeli w celu porównania rozkładu choroby. Następnie należy ostrożnie usunąć wątrobę i przemyć ją roztworem PBS.Następnie należy zbadać organ pod kątem obecności dużych guzów lub nieprawidłowości i ocenić go w ten sam sposób co wcześniej. Następnie należy usunąć i ocenić śledzionę, nerkę oraz trzustkę. W kolejnym kroku należy zbadać węzły chłonne jamy brzusznej, w tym węzły chłonne lędźwiowo-krzyżowe, nerkowe i krezkowe.Po ocenie przepony pod kątem oznak przerzutów, usunąć przeponę i wykonać dwa boczne nacięcia w jamie klatki piersiowej, usuwając część przednią w celu odsłonięcia płuc i serca, a następnie delikatnie unieść przełyk i przeciąć tchawicę powyżej serca. Po usunięciu płuc i serca ocenić tkanki pod kątem obecności guzków. Następnie za pomocą pęsety ścisnąć serce.Brak spójności sprężystości może wskazywać na obecność guza. Na koniec użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć czaszkę liniowo. Ostrożnie usuwaj małe fragmenty czaszki, aż cały mózg zostanie odsłonięty.W celu oceny występowania, rozmieszczenia i nasilenia choroby w pięciu różnych grupach zwierząt zastosowano wizualny system punktacji. Grupy te wykazywały różny zakres i stopień zaawansowania choroby. Dodatkowy pomiar w postaci obrazowania bioluminescencyjnego, przeprowadzonego bezpośrednio po uśmierceniu zwierząt, został wykorzystany do ilościowej oceny mikro- i makroprzerzutów.Po opanowaniu obu technik, implantację, nefrektomię lub nekropsję można przeprowadzić w ciągu od 5 do 10 minut na zwierzę, pod warunkiem właściwego wykonania procedury. Aby zbadać, czy odpowiedzi na leczenie będą różnić się w zależności od typów przerzutowych komórek nowotworowych. Komórki z przerzutowego raka komórkowego nerki.Obecnie stosuje się implantację tkanek pacjentów bezpośrednio do organizmów zwierzęcych w celu oceny wzrostu choroby miejscowej i przerzutowej po jej rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się RCC do analizy klinicznie istotnej progresji choroby oraz odpowiedzi na terapię. W szczególności sprawdzano, czy odpowiedzi te różnią się w zależności od tego, czy choroba miała charakter pierwotny miejscowy, czy też wynikała z samoistnego wzrostu przerzutowego.Należy pamiętać, że praca z małymi zwierzętami poddawanymi wielokrotnym zabiegom chirurgicznym wymaga ścisłego przestrzegania instytucjonalnych wytycznych dotyczących protokołów badań na zwierzętach oraz zachowania warunków sterylnych. Komfort zwierzęcia i jego rekonwalescencja są kluczowymi zmiennymi dla prawidłowego przeprowadzenia tej procedury.

modeling-spontaneous-metastatic-renal-cell-carcinoma-mrcc-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Modelowanie spontanicznego przerzutującego raka nerczycowego (mRCC) u myszy po nerkozbiorze

Do ustanowienia tego modelu można wykorzystać dwie techniki: wstrzyknięcie zawiesiny komórek nowotworowych w ścianę kątnicy lub przeszczepienie fragmentu guza podskórnego na kątnicę. Model ten jest przydatny do badania naturalnej progresji raka jelita grubego oraz testowania nowych środków terapeutycznych przeciwko rakowi jelita grubego.

Ortotopowy model raka jelita grubego u myszy

Ten film opisuje protokół tworzenia mysiego modelu spontanicznych przerzutów ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem jelita grubego lub PDX. Te modele ksenoprzeszczepów częściowo naśladują cechy ludzkich nowotworów i rozumieją krytyczne aspekty nowotworów złośliwych u ludzi, w tym inwazję i przerzuty.

Mysie modele spontanicznych przerzutów: platforma do badania potencjału przerzutowego komórek raka jelita grubego wstrzykiwanych ortotopowo

W tym filmie rozwijamy ortotopowy mysi model raka nerkowokomórkowego. Model ten skutkuje powtarzalnymi guzami pierwotnymi w wstrzykniętej nerce i przerzutami w płucach, co pozwala na ocenę postępu choroby i leczenia.

Generowanie modelu raka nerkowokomórkowego: protokół rozwoju ortotopowego mysiego modelu RCC poprzez donerkową implantację komórek rakowych

Ten ortotopowy model ludzkiego raka prostaty pozwala na ilościowe określenie wielkości guza, krążących komórek nowotworowych i tworzenie wyraźnych przerzutów do płuc. Ponieważ komórki muszą uciec z narządu pierwotnego, dostać się do krwiobiegu i zagnieździć się w miejscu wtórnym, model ten skutecznie podsumowuje scenariusz u ludzi.

Ortotopowy mysi model przerzutów ludzkiego raka prostaty

Opisany jest ortotopowy model pierwotnego guza raka piersi i chirurgiczne usunięcie pierwotnego guza w celu przedłużenia życia myszy w celu wytworzenia spontanicznych przerzutów. Wzrost i progresja guza są monitorowane i oznaczane ilościowo za pomocą obrazowania fluorescencyjnego lucyferazy.

Ortotopowy mysi model spontanicznych przerzutów raka piersi

Rak prostaty jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych. Ortotopowy model raka stanowi użyteczne podejście do zrozumienia biologii raka prostaty i oceny skuteczności schematów terapeutycznych. Protokół ten opisuje szczegółowe kroki niezbędne do ustalenia ortotopowego modelu myszy raka prostaty.

Przedkliniczny ortotopowy mysi model ludzkiego raka prostaty

Implementacja ortotopowego modelu raka nerkowokomórkowego u myszy immunokompetentnych daje badaczowi klinicznie istotny system zdefiniowany przez obecność pierwotnego guza nerki i przerzutów do płuc u tego samego zwierzęcia. System ten może być stosowany do przedklinicznego testowania różnych metod leczenia in vivo.

Syngeniczny mysi model przerzutowego raka nerkowokomórkowego do ilościowej i podłużnej oceny terapii przedklinicznych

Wprowadzamy mysi ortotopowy model raka piersi i model radykalnej mastektomii z technologią bioluminescencji, aby określić ilościowo obciążenie guza, aby naśladować postęp ludzkiego raka piersi.

Generowanie mysiego ortotopowego modelu raka piersi z przerzutami i wykonywanie radykalnej mastektomii u myszy

Ten protokół opisuje generowanie modeli ortotopowych ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów poprzez dopęcherzowe wkraplanie komórek raka urotelialnego o wysokim stopniu złośliwości lub dodoodbytnicze wstrzykiwanie komórek raka jelita grubego do myszy z nieotyłym cukrzycą/ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD/SCID) w celu pierwotnego wzrostu guza i spontanicznych przerzutów pod wpływem komórek zrębu węzłów chłonnych, co naśladuje postęp ludzkich chorób przerzutowych.

Ortotopowe modele ksenoprzeszczepów pobrane od pacjentów dla ludzkiego raka urotelialnokomórkowego i raka jelita grubego, wzrostu guza i spontanicznych przerzutów

Szczegółowo opisujemy klinicznie istotny model raka jelita grubego z przerzutami do wątroby (CRLM) oraz wpływ reperfuzji niedokrwienia wątroby (I/R) na wzrost guza i przerzuty. Model ten może pomóc w lepszym zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw indukowanego przez operację wzrostu przerzutów do wątroby.

Mysi model przerzutowych guzów wątroby w warunkach uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego

Rak jasnokomórkowy nerki z przerzutami jest chorobą, która nie posiada kompleksowego modelu zwierzęcego do dokładnych badań przedklinicznych. Protokół ten ilustruje dwa nowatorskie modele zwierzęce choroby: ortotopowo wszczepiony model myszy i model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka, z których oba wykazują przerzuty do płuc przypominające przypadki kliniczne.

Porównanie modelu przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki ustalonej w nerce myszy i na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurczaka

Poznaj modelowanie spontanicznego przerzutowego raka nerkowokomórkowego u myszy po nefrektomii. Ta metoda umożliwia ocenę postępu choroby i skuteczności terapii eksperymentalnych w badaniach onkologicznych.

Modelowanie spontanicznego przerzutowego raka nerkowokomórkowego (mRCC) u myszy po nefrektomii

Przeglądaj więcej filmów