Kompletny protokół uszkodzenia rdzenia kręgowego i rozwarstwienia mózgu w celu późniejszej hybrydyzacji in situ u larw minoga morskiego
14 października 2014
Minogi odzyskują lokomocję po całkowitym urazie rdzenia kręgowego. Jednak niektóre neurony projekcji rdzeniowej są dobrymi regeneratorami, a inne nie. W artykule przedstawiono techniki przetrzymywania larw minoga morskiego (i niedawno przekształconych osobników dorosłych), wytwarzania kompletnych przekrojów rdzenia kręgowego oraz przygotowania całych mózgów i rdzeni kręgowych do hybrydyzacji in situ.
Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie pełnej analizy rdzenia kręgowego, przecięcia i sekcji mózgu w celu zbadania prowadzenia przez Axon po urazie. Osiąga się to poprzez pierwszą transekcję, rdzeń kręgowy lampre na poziomie piątej skrzela. Następnie mózg jest preparowany i przypinany do syl guarda.
Po utrwaleniu mózgu może być przechowywany w metanolu lub natychmiast wykorzystany do hybrydyzacji in situ, ostatecznie zmiany w ekspresji aksonalu. Receptory naprowadzania można zaobserwować w regenerujących się kręgach po urazie rdzenia kręgowego. Przewagą techniki, którą zamierzamy dzisiaj zademonstrować, w porównaniu z bardziej konwencjonalnym cięciem parafiny lub kriostatem, jest to, że pozwala zobaczyć cały mózg, w tym neurony, które wystają do rdzenia kręgowego, które są duże i zidentyfikowane.
Demonstruje tę procedurę dr Kathy Zang, naukowiec w naszym laboratorium Od strumieni zasilających dopływy jeziora Michigan do rzeki Delaware w Pensylwanii lub strumieni w Maine. Larwa lampka morskiego typu dzikiego tego gatunku. Zdobyto pet mize na Marusie.
Larwy w wieku od czterech do 7 lat mają od 10 do 14 centymetrów długości i są wystarczająco duże, aby można je było zranić i rozwarstwić. Utrzymuj je w grupach po 52, po sto. W zbiornikach świeżej wody o pojemności 50 galonów o temperaturze 16 stopni Celsjusza.
Zbiornik wymaga jednocalowego podłoża żwirowego, aby minóg mógł pożyczyć Cała woda dodana do zbiornika powinna być kondycjonowana za pomocą filtrowania i napowietrzania węglem drzewnym przez co najmniej 48 godzin przed dodaniem do zbiornika. Pod warunkiem, że zwierzęta zostaną wykorzystane w ciągu jednego roku, nie ma potrzeby karmienia ich do tej procedury. Miej pod ręką świeżo przygotowany roztwór dzwonka.
Najpierw przenieś lampę do nasyconego wodnego roztworu benzokainy. Po znieczuleniu przenieś go do naczynia wypełnionego do połowy sil guardem. Połóż danie na lodzie i posyp danie lodem.
Zimne dzwonki. Zabezpiecz zwierzę trzema szpilkami do owadów o średnicy 0,15, jedną na pysku i dwie na piątym skrzelu. Następnie umieść go pod mikroskopem stereoskopowym do operacji.
Zacznij od użycia skalpela z numerem 11, aby wykonać podłużne nacięcie wzdłuż grzbietowej linii środkowej na poziomie piątej skrzela. Spowoduje to odsłonięcie rdzenia kręgowego podczas wykonywania tego nacięcia. Użyj dwóch haczyków wykonanych ze szpilek do owadów, aby zabezpieczyć ściany ciała za pomocą nożyczek Castro nr osiem.
Wykonaj prostopadłe cięcie w poprzek odsłoniętego rdzenia kręgowego. Sprawdź odcięte końce rdzenia kręgowego, aby upewnić się, że przecięcie zostało zakończone. Następnie za pomocą kleszczy wyrównaj odcięte końce i zamknij ranę.
Przenieś lawę lampre na kawałek bibuły filtracyjnej nasączonej roztworem dzwonka. Przenieś preparat na lodowe podłoże na godzinę, aby rana mogła wyschnąć po godzinie. Przenieś lawę do jej małego zbiornika z lodowatą wodą.
Pozwól mu się tam zagoić przez 24 godziny. Po 24 godzinach sprawdź, czy ruch jest podłączony do przecięcia. Jeśli są jakieś ruchy, to znaczy, że przecięcie było niekompletne.
Jeśli tak nie jest, oznacza to, że transekt był dobry i zwierzę można przenieść do zbiornika o temperaturze pokojowej w celu regeneracji, podczas gdy zwierzę wraca do zdrowia. Zmieniaj wodę co dwa do trzech dni. Gdy transektowane zwierzę zostanie wystarczająco odzyskane, znieczulij je i przygotuj do sekcji, jak opisano wcześniej.
Aby wypreparować mózg, zacznij od poprzecznego nacięcia między nozdrzem a narządem szyszynki. Następnie, w przypadku cielęciny Castro, nożyczki przecinają tkankę otaczającą mózg, jednocześnie zabezpieczając zwierzę. Z kleszczami.
Białe owalne struktury po obu stronach pnia mózgu to torebki uszne. Po odsłonięciu mózgu użyj kleszczy, aby usunąć splot naczyniówkowy. Następnie użyj zmodyfikowanych haczyków na kołki, aby rozłożyć głowę zwierzęcia i odsłonić nerwy czaszkowe.
Następnie przeciąć rdzeń kręgowy poprzecznie nożyczkami, jednocześnie zabezpieczając rdzeń kręgowy kleszczami. Przetnij nerwy czaszkowe, aby wypreparować mózg. Następnie przenieś mózg na mały kawałek silikonu i zabezpiecz go tam.
Za pomocą jednej szpilki do owadów w rdzeniu kręgowym i jednej szpilki przez jedną z opuszki węchowej. Następnie za pomocą nożyczek przetnij spoidło opuszki węchowej, spoidło ochronne mózgu i oex pnia mózgu wzdłuż grzbietowej linii środkowej. Po przecięciu spoidła i oex, odchyl płytki A LR na boki i przypnij je płasko do silikonu za pomocą łącznie siedmiu szpilek przeciw owadom, dwóch w opuszkach węchowych, dwóch na krawędziach cięcia, spoidła ochronnego mózgu, dwóch w przedłużonym oex i jednego w linii środkowej rdzenia kręgowego.
Teraz, używając odczynników wolnych od RNA, utrwal preparat w 4% para formaldehydzie w temperaturze pokojowej przez trzy godziny, delikatnie mieszając. Mózgi mogą być następnie analizowane przez dwie hybrydyzacje in situ przy użyciu opisanej metody ekspresji neogenu w transkryptach zidentyfikowano w rdzeniu kręgowym, rzutując neurony kontrolne, zwierzęta i zwierzęta. Dwa tygodnie po zmianie widocznej tutaj jest reprezentatywna nieuszkodzona kontrola.
Po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego nastąpiły zmiany w ekspresji receptora neogenu. Po dwóch tygodniach receptor neogenu w grupie niekontrolnej uległ preferencyjnej ekspresji w złych regeneratorach, takich jak neurony M1 I, jeden, I, dwa, I, cztery, lub MTH. Rozwój tej techniki utorował nam drogę do badania ekspresji receptorów przewodnich, receptorów siarczanu chondroityny, protio, glikanów i aktywacji odlewanych zasad w tym samym mózgu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia techniki przeprowadzania całkowitego przerwania rdzenia kręgowego oraz sekcji mózgu u minogów morskich. Podkreśla ono powrót zdolności lokomocyjnych po urazie rdzenia kręgowego oraz zdolności regeneracyjne specyficznych neuronów z projekcjami do rdzenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia regeneracyjna
- Odpowiedź na uraz
Wstęp
- Minogi morskie mogą odzyskać zdolność poruszania się po całkowitym uszkodzeniu rdzenia kręgowego.
- Niektóre neurony rzutujące do rdzenia wykazują dobre właściwości regeneracyjne.
- Zrozumienie prowadzenia aksonów po urazie jest kluczowe dla uzyskania wiedzy na temat regeneracji rdzenia kręgowego.
- W niniejszym badaniu do analizy wykorzystano techniki hybrydyzacji in situ.
Cel badania
- Zbadanie mechanizmów prowadzenia aksonów po urazie rdzenia kręgowego.
- Przedstawienie technik przekcięcia rdzenia kręgowego oraz sekcji mózgu.
- Analiza zmian w ekspresji receptorów prowadzenia aksonów.
Zastosowane metody
- Całkowita przekrawanie rdzenia kręgowego na poziomie piątego skrzela.
- Disekcja mózgu i utrwalenie do analizy.
- Przechowywanie próbek mózgu w metanolu lub bezpośrednie wykorzystanie do hybrydyzacji in situ.
- Przygotowanie preparatu całego narządu w celu wizualizacji dużych, zidentyfikowanych neuronów rzutujących do rdzenia kręgowego.
Główne wyniki
- Wykazano powrót zdolności lokomocyjnych u minogów po urazie.
- Zidentyfikowano różnice w zdolnościach regeneracyjnych pomiędzy neuronami rzutującymi do rdzenia kręgowego.
- Wykazano zmiany w ekspresji receptorów prowadzenia aksonów w regenerujących się kręgach.
- Podkreślono zalety technik całego preparatu (wholmount) w porównaniu do tradycyjnych metod sekcjonowania.
Wnioski
- Przedstawione techniki dostarczają cennych informacji na temat regeneracji rdzenia kręgowego.
- Zrozumienie regeneracji neuronów może pomóc w opracowaniu przyszłych strategii terapeutycznych.
- Preparaty całych organizmów (wholemount) umożliwiają kompleksową analizę połączeń neuronalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w poszukiwaniu celów regeneracji aksonów poprzez zapewnienie systemu relewantnego dla choroby do badania wewnętrznych odpowiedzi neuronalnych na uraz rdzenia kręgowego. Preparaty całych organów wspierają walidację celów dzięki bezpośredniej wizualizacji dużych, możliwych do zidentyfikowania neuronów rzutujących do rdzenia kręgowego, co ułatwia porównawczą analizę ekspresji genów między dobrymi a słabymi regeneratorami. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkryć poprzez powiązanie fenotypów molekularnych z funkcjonalnymi efektami regeneracji w modelu OUN kręgowców.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez porównywanie profili ekspresji genów między funkcjonalnie odmiennymi populacjami neuronów.
- Wartość operacyjna: Dostarcza powtarzalnej metody izolacji i analizy specyficznych podtypów neuronów zaangażowanych w niepowodzenie lub sukces regeneracji.
- Wartość strategiczna: Wspiera priorytetyzację celów terapeutycznych poprzez identyfikację sygnatur molekularnych związanych z potencjałem regeneracyjnym.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do ilościowej oceny zmian w ekspresji receptorów prowadzenia aksonów po urazie.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie całych preparatów OUN w celu uzyskania spójnych wyników hybrydyzacji in situ w różnych warunkach doświadczalnych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia skalowalny screening receptorów prowadzenia, receptorów siarczanu chondroityny oraz powiązanych celów na jednej platformie.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ustanawia istotność w kontekście choroby poprzez modelowanie dynamiki uszkodzeń i regeneracji OUN kręgowców u minogi morskiej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od fazy odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki spójnemu przygotowaniu preparatów całych narządów.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju z uwzględnieniem analizy ryzyka, umożliwiając mechanistyczną redukcję ryzyka w obszarze szlaków prowadzenia aksonów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesów odkrywania leków – od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego – dostarczając odczytów molekularnych, które pozwalają na opracowanie strategii modulacji szlaków sygnałowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie bezpośredniego porównania ekspresji genów w zidentyfikowanych neuronach regenerujących się i nieregenerujących się.
- Screening: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu przygotowaniu preparatów całych organów, kompatybilnemu z multipleksową hybrydyzacją in situ dla receptorów prowadzenia aksonów.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty przestrzenne zmian ekspresji receptorów, co pozwala zespołom korelować przesunięcia molekularne z fenotypowymi wynikami regeneracji.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez model uszkodzenia OUN kręgowców, który wykazuje powrót funkcji i proksymalną regenerację aksonów.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do badania wielu rodzin receptorów prowadzenia (np. Neogen, siarczan chondroityny, proteoglikany) w tym samym kontekście neuronalnym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach regeneracji aksonów dzięki bezpośredniej rozdzielczości neuronalnej.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność sekcji oraz fiksacji neuronów na potrzeby późniejszych analiz molekularnych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wczesnych dowodów z biomarkerów na zaangażowanie celu w neuronach zdolnych do regeneracji.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów prowadzenia aksonów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o dynamikę ekspresji w zwalidowanych populacjach neuronalnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach mikrosurgicalnych w celu przecięcia rdzenia kręgowego i sekcji mózgu u larw minoga morskiego.
- Zależne od dostępu do stereomikroskopu, szpilek entomologicznych, podłoży silikonowych oraz odczynników wolnych od RNaz do przygotowania i utrwalenia preparatów całych organów.
- Wymaga standaryzacji protokołów znieczulenia, rekonwalescencji i utrwalania pomiędzy zespołami w celu zapewnienia spójnej jakości tkanek.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania protokołów podczas ich przenoszenia między różnymi etapami rozwoju lub gatunkami ze względu na różnice w anatomii i wielkości OUN.
- Ograniczone 24-godzinnym oknem gojenia po urazie, niezbędnym do potwierdzenia całkowitego przecięcia przed przejściem do etapu rekonwalescencji i sekcji.
