Name: Kompletny protokół uszkodzenia rdzenia kręgowego i rozwarstwienia mózgu w celu późniejszej hybrydyzacji in situ u larw minoga morskiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj techniki przecięcia rdzenia kręgowego i rozwarstwienia mózgu u larw minoga morskiego w celu badania regeneracji neuronów. Ta metoda umożliwia analizę ekspresji receptorów wskazujących aksony po urazie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 dla Dr. Michaela E. Selzera; Grant badawczy Shriners SHC-85220 dla dr Michaela E. Selzera; oraz Shriners Research Grant SHC-85310 dla dr Michaela I. Shifmana. Dr Antón Barreiro-Iglesias był wspierany przez Fundación Barrié (Hiszpania) i Xunta de Galicia (Galicja, Hiszpania).

Zobacz Tabelę 1 dla wszystkich materiałów użytych w tym protokole.
Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Temple.
1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Pozyskać larwy minoga morskiego typu dzikiego (Petromyzon marinus L.), o długości 10 – 14 cm (4 – 7 lat) ze strumieni zasilających jezioro Michigan, z dopływów rzeki Delaware (Pensylwania) lub strumieni w stanie Maine.</li>
	<li>W laboratorium utrzymuj larwy w grupach po 50 - 100 zwierząt w zbiornikach słodkowodnych o pojemności 50 galonów w temperaturze 16 °C. Wyłóż zbiorniki calem żwiru, w którym larwy mogą się zakopać, a woda jest filtrowana węglem drzewnym i kondycjonowana kamieniami napowietrzającymi przez co najmniej 48 godzin w celu usunięcia chloru i innych zanieczyszczeń przed umieszczeniem w nich minogów. Nie ma potrzeby karmienia zwierząt, które poddają recyklingowi własne odpady, aż do dnia użycia.</li>
</ol>
2. Całkowite przecięcie rdzenia kręgowego
<ol>
	<li>Przed operacją rdzenia kręgowego należy przygotować roztwór Ringera dla minoga o następującym składzie: 110 mM NaCl, 2,1 mM KCl, 2,6 mM CaCl2, 1,8 mM MgCl2 i 10 mM bufor Tris; pH 7,4.</li>
	<li>Aby przeprowadzić przecięcie rdzenia kręgowego, umieść larwy w małym pojemniku, który ma być znieczulony 1% metanosulfonianem trikainy w lodowatym roztworze Ringera.</li>
	<li>Po znieczuleniu umieść zwierzęta na szalce Petriego wypełnionej do połowy Sylgardem (silikonem) i użyj 4 szpilek do owadów (średnica 0,15 mm), aby utrzymać zwierzęta w pozycji do operacji (jedna jest umieszczona na pysku zwierzęcia, jedna na ogonie i dwie na poziomie 5 skrzeli). Napełnij szalkę Petriego prawie do samej góry roztworem Ringera. Umieść naczynie z larwą na lodzie podczas wykonywania operacji pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Aby wykonać przecięcie rdzenia kręgowego w linii grzbietowej, środkowej, wykonaj podłużne nacięcie skalpelem (#11) na poziomie 5 skrzeli, aby uwidocznić rdzeń kręgowy. Początkowo skóra jest otwierana poprzez włożenie końcówki ostrza skalpela skierowaną do góry, a następnie tkanka mięśniowa jest bardzo delikatnie cięta, aż rdzeń kręgowy będzie widoczny z góry. Ułóż dwa haczyki ze szpilek owadów i użyj ich do przytrzymania ścian ciała w pozycji otwartej podczas wykonywania przecięcia rdzenia kręgowego.</li>
	<li>Całkowicie przeciąć rdzeń kręgowy na poziomie 5 skrzeli za pomocą nożyczek (Castroviejo #8), włóż nożyczki prostopadle do rdzenia kręgowego. Rdzeń kręgowy musi być całkowicie przecięty jednym czystym cięciem. Wizualizuj przecięte końce rdzenia kręgowego pod mikroskopem stereoskopowym, aby potwierdzić, że rdzeń kręgowy został całkowicie przecięty. Następnie wyrównaj odcięte końce rdzenia kręgowego po przecięciu za pomocą pary kleszczy (#4).</li>
	<li>Po wykonaniu przecięcia rdzenia kręgowego zamknij ranę w ścianie grzbietowej trzonu parą cienkich kleszczy i umieść larwy na lodzie na 1 godzinę, aby rana wyschła. Umieść kawałek bibuły filtracyjnej między lodem a larwami i namocz go roztworem Ringera minoga. Niska temperatura utrzymuje zwierzęta przy życiu, a jednocześnie pozwala na wyschnięcie rany na powietrzu, a tym samym pomaga zapobiegać infekcjom.</li>
	<li>Następnie przenieś larwy do małych zbiorników (1 larwa na zbiornik) z lodowatą wodą przez 24 godziny.</li>
	<li>Zbadaj uszkodzone larwy 1 dzień po przecięciu kręgosłupa, aby behawioralnie potwierdzić, że nie ma ruchu ogonowego do miejsca urazu. Przecięcie rdzenia kręgowego uważa się za zakończone, jeśli larwa może poruszać tylko głową rostralnie do miejsca urazu (na poziomie5 skrzeli). W takim przypadku larwy można teraz przenieść do zbiorników (1 larwa na zbiornik) ze słodką wodą o temperaturze pokojowej (23 °C), aby umożliwić im regenerację w wybranych punktach czasowych.</li>
	<li>W okresie rekonwalescencji zmieniaj wodę co 2 do 3 dni.</li>
</ol>
3. Preparacja mózgu i przygotowanie mózgu do hybrydyzacji in situ
<ol>
	<li>W pożądanych punktach czasowych po urazie należy ponownie znieczulić larwy minogów morskich i umieścić je i przypiąć do szalki Petriego roztworem Ringera, aby przeprowadzić sekcję mózgu, jak powyżej.</li>
	<li>Aby wypreparować mózg, najpierw wykonaj poprzeczne nacięcie skalpelem między nozdrzem a szyszynką. Stąd zacznij przecinać tkankę otaczającą mózg za pomocą nożyczek Castroviejo, trzymając ją kleszczami.</li>
	<li>Po odsłonięciu mózgu usuń splot naczyniówkowy za pomocą kleszczy i użyj haczyków, aby rozłożyć głowę zwierzęcia i odsłonić nerwy czaszkowe. Następnie przetnij rdzeń kręgowy poprzecznie nożyczkami Castroviejo. Przytrzymaj rdzeń kręgowy parą kleszczy, używając innej pary kleszczy do przecięcia nerwów czaszkowych w celu wypreparowania mózgu.</li>
	<li>Po sekcji umieść mózg na małym kawałku silikonu i przytrzymaj go na miejscu, wkładając 2 szpilki do owadów w opuszkach węchowych i 1 w rdzeń kręgowy. Następnie przetnij nożyczkami spoidła tylne i mózgowo-odbytnicze mózgu wzdłuż grzbietowej linii środkowej i odchyl płytki alar na boki i przypnij je płasko do silikonu za pomocą 4 szpilek na owady (ryc. 2).</li>
	<li>Przenieś kawałek silikonu z mózgiem do probówki zawierającej 4% paraformaldehydu w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (pH 7,4), aby utrwalić w temperaturze pokojowej przez 3 godziny na rotatorze.</li>
	<li>Po fiksacji użyj mózgu do pełnej hybrydyzacji in situ, jak opisano wcześniej (Swain i wsp., 1994). Mózgi zwierząt kontrolnych lub pozorowanych powinny być uruchamiane zawsze równolegle z mózgami zwierząt rannych. Cały mózg larwalny może być badany przez hybrydyzację in situ ze względu na jego płaski i cienki kształt, a także ze względu na brak mieliny10, co sprawia, że mózg jest dość przezroczysty.</li>
</ol>

<ol><li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li>
<li>Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li>
<li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li>
<li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li>
<li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning%2C+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li>
<li>Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li>
<li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li>
<li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li>
<li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li>
<li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+myelin+sheaths%3A+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li>
<li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół wykonania pełnej transkrypcji rdzenia kręgowego i tylnej sekcji mózgu u larw minogów morskich. Procedura ta pozwala na analizę różnic w ekspresji genów między możliwymi do zidentyfikowania neuronami wystającymi z rdzenia kręgowego po urazie rdzenia kręgowego za pomocą hybrydyzacji in situ całego mózgu. Krytycznym krokiem w procedurze jest prawidłowe wykonanie pełnego przecięcia rdzenia kręgowego, które można kontrolować, obserwując odcięte końce rdzenia kręgowego pod stereomikrosk...

U ssaków uraz rdzenia kręgowego (SCI) jest wyniszczającym stanem, który prowadzi do trwałej utraty funkcji poniżej miejsca urazu, ponieważ uszkodzone aksony nie regenerują się przez strefę urazu i nie łączą się ponownie z odpowiednimi celami. W przeciwieństwie do ssaków, minogi odzyskują lokomocję po całkowitym urazie rdzenia kręgowego. 1 Co ciekawe, minogi mają zestaw 36 neuronów wystających z rdzenia kręgowego, które są indywidualnie identyfikowalne w preparatach mózgowych z całego montażu ze względu na ich duży rozmiar2,3 (ryc. 1). Wszystkie te neurony wystające z rdzenia kręgowego są aksotomizowane przez pełną transsekcję rdzenia kręgowego na wysokim poziomie. Wcześniejsze badania naszej grupy i innych wykazały, że nawet w przypadku funkcjonalnego powrotu do zdrowia po SCI niektóre z tych neuronów wykazują bardzo niską zdolność regeneracyjną (są uważane za "złe regeneratory"), podczas gdy inne zwykle regenerują swój akson przez miejsce urazu (są uważane za "dobre regeneratory"). Ta cecha sprawia, że minogi są interesującym modelem kręgowców do badania różnic w ekspresji genów między dobrymi i złymi neuronami regeneratorowymi projekcji rdzeniowych, co z kolei doprowadzi do różnic w wewnętrznej zdolności regeneracyjnej neuronów, które próbują zregenerować swoje aksony w tym samym środowisku zewnętrznym. 1
Korzystając z tego modelu, wcześniej wykazaliśmy, że neurony rzutujące rdzeniowo o niskiej zdolności regeneracyjnej wykazują ekspresję receptorów cząsteczki przewodnictwa aksonalnego, takich jak UNC54,5 i neogenina,6, które pośredniczą w hamującym działaniu odpowiednio netryny i RGM. Ponadto, stosując tę metodę, nasza grupa wykazała również, że tylko dobre regeneratory wykazują odzyskanie ekspresji neurofilamentów po urazie i w trakcie procesu regeneracji. Ostatnio Busch i Morgan7 wykazali za pomocą immunofluorescencji, że złe regeneratory wykazują zwiększoną ekspresję synukleiny po urazie, co zostało powiązane przez autorów z faktem, że neurony wystające rdzeniowo "złego regeneratora" powoli umierają po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego5,7,8. Tak więc model minoga całkowitego uszkodzenia rdzenia kręgowego okazał się bardzo użytecznym modelem do zrozumienia, co sprawia, że neuron wystający z rdzenia kręgowego jest "złym regeneratorem" po aksotomii.
Aby przeprowadzić nasze badania, przeprowadzamy kompletny protokół operacji przecięcia rdzenia kręgowego i tylnej sekcji mózgu w pożądanych punktach czasowych po urazie, aby przeprowadzić pełną hybrydyzację in situ. W niniejszym artykule metodologicznym przedstawiono szczegółowy protokół prawidłowego przeprowadzenia pełnej operacji uszkodzenia rdzenia kręgowego u larw minogów, późniejszej konserwacji zwierząt oraz ostatecznej sekcji mózgu i przygotowania mózgu do całkowitej hybrydyzacji in situ. Wcześniej opisano szczegółowy protokół przeprowadzania pełnej hybrydyzacji in situ w mózgu larw minogów. 9 Ponadto ten protokół dotyczący uszkodzenia rdzenia kręgowego i sekcji mózgu może być również wykorzystany do przetworzenia mózgu do celów immunohistochemicznych lub innych metod histologicznych.

<table><tbody><tr><td>Sulfonian metanu trikainy</td><td>Widmo</td><td>TR108</td><td>Nasycony benzokainą roztwór w PBS na ofiarę</td></tr><tr><td>Skalpel #3</td><td>Narzędzia do nauki o sztuce (FST)</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza do skalpela: #11</td><td>Narzędzia do nauki pięknej&nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Castroviejo #8</td><td>Narzędzia do nauki pięknej&nbsp;</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze #4 & #5</td><td>Dumont, Szwajcaria</td><td>Roboz RS4955#</td><td>4 do rozwarstwienia rdzenia kręgowego; #5 do zdejmowania izolacji</td></tr><tr><td>z mikroskopu preparacyjnego</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning Co.</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki do owadów 0,15, 0,20 mm</td><td>Austerlitz</td><td>Brak katalogu #</td><td>0,15 mm do przypinania mózgu i rdzenia kręgowego; 0,20 mm do ciała</td></tr><tr><td>7 ml Probówki scyntylacyjne HDPE z nasadkami</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16%</td><td>Mikroskopia elektronowa Science (EMS)</td><td>19210</td><td>Rozcieńczyć do 4% w PBS</td></tr></tbody></table>

kompletny protokół uszkodzenia rdzenia kręgowego i rozwarstwienia mózgu w celu późniejszej hybrydyzacji in situ u larw minoga morskiego

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Po całkowitym uszkodzeniu rdzenia kręgowego, minogi morskie na początku są sparaliżowane poniżej poziomu przecięcia. Jednak po kilku tygodniach odzyskują lokomocję, a towarzyszy temu regeneracja na krótkim dystansie (kilka mm) aksonów propriordzeniowych i aksonów wystających rdzeniowo z pnia mózgu. Spośród 36 dużych, możliwych do zidentyfikowania neuronów wystających z rdzenia kręgowego, niektóre są dobrymi regeneratorami, a inne złymi. Neurony te najłatwiej można zidentyfikować w preparatach OUN w całości. Aby zrozumieć wewnętrzne mechanizmy neuronów, które sprzyjają lub hamują regenerację aksonów po urazie w OUN kręgowców, określamy różnice w ekspresji genów między dobrymi i złymi regeneratorami oraz jak na ekspresję wpływa transsekcja rdzenia kręgowego. W artykule przedstawiono techniki przetrzymywania larw i niedawno przekształconych dorosłych minogów morskich w zbiornikach słodkowodnych, wytwarzania kompletnych przekrojów rdzenia kręgowego pod mikroskopem oraz przygotowania całych komórek mózgu i rdzenia kręgowego do hybrydyzacji in situ. Krótko mówiąc, zwierzęta są trzymane w temperaturze 16 °C i znieczulane 1% benzokainą u minoga Ringera. Rdzeń kręgowy jest przecięty nożyczkami do irydektomii przez dostęp grzbietowy, a zwierzę może dojść do siebie w zbiornikach ze słodką wodą w temperaturze 23 °C. W przypadku hybrydyzacji in situ zwierzęta są ponownie znieczulane, a mózg i rdzeń usuwany za pomocą dostępu grzbietowego.

Jako przykład wyników, jakie można uzyskać przy zastosowaniu tej metody, na Rysunku 2 przedstawiono reprezentatywne obrazy całych mózgów ukazujące ekspresję transkryptów neogeniny w identyfikowalnych neuronach rzutujących do rdzenia kręgowego u larw minogów kontrolnych oraz 2 tygodnie po uszkodzeniu. Aby uzyskać pełne szczegóły, należy odwołać się do wcześniejszej pracy6, w której opisano związek między ekspresją neogeniny po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego a zdolnością regeneracyjną i...

Minogi odzyskują lokomocję po całkowitym urazie rdzenia kręgowego. Jednak niektóre neurony projekcji rdzeniowej są dobrymi regeneratorami, a inne nie. W artykule przedstawiono techniki przetrzymywania larw minoga morskiego (i niedawno przekształconych osobników dorosłych), wytwarzania kompletnych przekrojów rdzenia kręgowego oraz przygotowania całych mózgów i rdzeni kręgowych do hybrydyzacji in situ.

Kompletny protokół uszkodzenia rdzenia kręgowego i rozwarstwienia mózgu w celu późniejszej hybrydyzacji in situ u larw minoga morskiego

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie całkowitej transekcji rdzenia kręgowego oraz sekcji mózgu w celu badania prowadzenia aksonów po urazie. Osiąga się to poprzez wykonanie w pierwszej kolejności transekcji rdzenia kręgowego minogi na poziomie piątego skrzela. Następnie mózg zostaje wypreparowany i przymocowany do sylgardu za pomocą szpilek.Po utrwaleniu mózgu można go przechowywać w metanolu lub natychmiast wykorzystać do hybrydyzacji in situ; w efekcie można zaobserwować zmiany w ekspresji receptorów prowadzących aksony w regenerującym się rdzeniu kręgowym po urazie. Przewagą techniki, którą zaprezentujemy dzisiaj, nad bardziej konwencjonalnym krojeniem w parafinie lub kriostacie jest to, że pozwala ona na zobaczenie całego mózgu, w tym dużych i zidentyfikowanych neuronów rzutujących do rdzenia kręgowego.Procedurę demonstruje dr Kathy Zang, naukowiec w naszym laboratorium. Larwy morskich jędrzyc typu dzikiego gatunku Petromyzon marinus pozyskano z potoków zasilających dopływy jeziora Michigan, rzeki Delaware w Pensylwanii oraz potoków w Maine.Larwy w wieku od 4 do 7 lat mają od 10 do 14 centymetrów długości i są wystarczająco duże do przeprowadzenia urazu i sekcji. Należy utrzymywać je w grupach od 50 do 100 osobników w 50-galonowych zbiornikach z wodą słodką w temperaturze 16 °C.Zbiornik wymaga warstwy żwiru o grubości jednej cala, aby minogi mogły się zakopywać. Cała woda dodawana do zbiornika powinna być kondycjonowana poprzez filtrowanie węglem aktywnym i napowietrzanie przez co najmniej 48 godzin przed wlaniem jej do akwarium. Jeśli zwierzęta zostaną wykorzystane w ciągu jednego roku, nie ma potrzeby ich karmienia na potrzeby tej procedury. Należy przygotować świeży roztwór Ringera.Najpierw przenieś lampę do nasyconego wodnego roztworu benzokainy. Po znieczuleniu przenieś ją do szalki wypełnionej w połowie sil guardem. Postaw szalkę na lodzie i uzupełnij pozostałą przestrzeń w szalce lodem.Zimne roztwory Ringera. Unieruchom zwierzę za pomocą trzech szpilek entomologicznych o średnicy 0,15, jedną przy pysku i dwie przy piątym skrzęgu. Następnie umieść je pod stereomikroskopem w celu przeprowadzenia zabiegu.Rozpocznij od wykonania skalpelem nr 11 cięcia wzdłużnego wzdłuż linii środkowej grzbietu na wysokości piątego skrzela. Podczas wykonywania tego cięcia odsłonięty zostanie rdzeń kręgowy. Użyj dwóch haków wykonanych z igieł entomologicznych, aby zabezpieczyć ściany ciała, posługując się nożyczkami Castro reveal nr 8.Wykonaj cięcie prostopadłe przez odsłonięty rdzeń kręgowy. Obejrzyj przecięte końce rdzenia kręgowego, aby upewnić się, że przekrojenie jest całkowite. Następnie za pomocą pęsety wyrównaj przecięte końce i zamknij ranę.Przenieś larwę minoga na kawałek papieru filtracyjnego nasączonego roztworem Ringera. Umieść preparat na łożu z lodu na jedną godzinę, aby rana mogła wyschnąć. Następnie przenieś larwę do osobnego małego zbiornika z lodowatą wodą.Pozostawić do zagojenia na 24 godziny. Po 24 godzinach sprawdzić, czy występuje ruch w kierunku proksymalnym względem miejsca przecięcia. Jeśli stwierdzono jakiekolwiek ruchy, oznacza to, że przecięcie było niepełne.Jeśli nie występują, oznacza to, że przecięcie przebiegło pomyślnie i zwierzę można przenieść do zbiornika w temperaturze pokojowej w celu rekonwalescencji. Wymieniaj wodę co dwa do trzech dni. Gdy zwierzę po przecięciu dostatecznie powróci do zdrowia, poddaj je anestezji i przygotuj do sekcji zgodnie z wcześniej opisaną procedurą.Aby przeprowadzić sekcję mózgu, należy rozpocząć od nacięcia poprzecznego pomiędzy nozdrzem a organem szyszynkowym. Następnie, unieruchamiając zwierzę pęsetą, należy wyciąć tkankę otaczającą mózg za pomocą nożyczek typu Castro.Białe owalne struktury po obu stronach pnia mózgu to torebki słuchowe. Po odsłonięciu mózgu należy za pomocą pęsety usunąć splot naczyniówkowy. Następnie, używając zmodyfikowanych haczyków, należy rozszerzyć głowę zwierzęcia i odsłonić nerwy czaszkowe.Następnie, przytrzymując rdzeń kręgowy pęsetą, przetnij go w poprzek nożyczkami. Przetnij nerwy czaszkowe, aby wyizolować mózg. Następnie przenieś mózg na mały kawałek silikonu i przymocuj go w tym miejscu.Użyj jednej szpilki entomologicznej w rdzeniu kręgowym i jednej szpilki w jednej z opuszek węchowych. Następnie za pomocą nożyczek przetnij komisurę między opuszkami węchowymi, komisurę przedniego mózgu oraz oex pnia mózgu wzdłuż linii środkowej grzbietowej. Po przecięciu komisur i oex odchyl płyty A LR bocznie i przypnij je płasko do silikonu za pomocą łącznie siedmiu szpilek entomologicznych: dwóch w opuszkach węchowych, dwóch na krawędziach przeciętej komisury przedniego mózgu, dwóch w rozszerzonym oex i jednej w linii środkowej rdzenia kręgowego.Następnie, używając odczynników wolnych od RNaz, utrwal preparat w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez trzy godziny przy łagodnym mieszaniu. Mózgi można następnie analizować za pomocą hybrydyzacji in situ, stosując opisaną metodę; ekspresję transkryptów neogenu zidentyfikowano w rdzeniu kręgowym, neuronach projekcyjnych zwierząt kontrolnych oraz u zwierząt dwa tygodnie po uszkodzeniu. Tutaj przedstawiono reprezentatywną kontrolę bez uszkodzeń.Po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego nastąpiły zmiany w ekspresji receptora neogenu. Po dwóch tygodniach receptor neogenu w grupie niekontrolnej był preferencyjnie eksprymowany w słabych regeneratorach, takich jak neurony M1 I one I two I four lub MTH. Opracowanie tej techniki utorowało drogę do możliwości badania ekspresji receptorów kierowania, receptorów siarczanu chondroityny, proteoglikanów oraz aktywacji podstaw kast we wspólnym obszarze mózgu.

complete-spinal-cord-injury-brain-dissection-protocol-for-subsequent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Kompletny protokół urazu rdzenia kręgowego i sekcji mózgu przed kolejną hybrydyzacją in situ typu wholemount u larw Lamparta morskiego

Ten film demonstruje metodę badania uszkodzeń mózgu larw danio pręgowanego za pomocą wielkoskalowej skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM), techniki, która łączy elementy zarówno skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), jak i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości. Przedstawiono w nim etapy związane z przygotowaniem próbek i pozyskiwaniem obrazów STEM o wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji uszkodzenia mózgu.

Badanie uszkodzenia mózgu u larw danio pręgowanego za pomocą wielkoskalowej skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Po przecięciu kręgosłupa, dorosłe rybki pręgowane wracają do stanu funkcjonalnego w ciągu sześciu tygodni po urazie. Aby wykorzystać przezroczystość larw i szybszy powrót do zdrowia, przedstawiamy metodę transekcji rdzenia kręgowego larwy. Po przecięciu obserwujemy regenerację czuciową rozpoczynającą się po 2 dniach od urazu i ruch zgięcia C po 3 dniach od urazu.

Przekrój rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Rejestrowanie prądów Ca2+ na błonie czołowej uwalniania presynaptycznego jest kluczem do precyzyjnego zrozumienia wejścia Ca2+ i uwalniania neuroprzekaźników. Przedstawiamy ostrą dysocjację rdzenia kręgowego minoga, która daje funkcjonalne izolowane aksony siateczkowo-rdzeniowe, umożliwiające zapis bezpośrednio z błony czołowej uwalniającej poszczególne zakończenia presynaptyczne.

Ostra dysocjacja aksonów siateczkowo-rdzeniowych minoga w celu umożliwienia rejestracji z błony czołowej uwalniającej poszczególnych funkcjonalnych zakończeń presynaptycznych

Prezentujemy protokół wykorzystujący mikroskopię poklatkową z wzbudzeniem dwufotonowym do jednoczesnej wizualizacji dynamiki uszkodzeń aksonów i mielin w czasie rzeczywistym. Ten proponowany protokół pozwala na badanie zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych czynników, które mogą wpływać na los centralnego mielinizowanego aksonu po urazie i przyczyniać się do trwałej niepełnosprawności klinicznej.

Model uszkodzenia rdzenia kręgowego indukowany laserem ex vivo do oceny mechanizmów zwyrodnienia aksonów w czasie rzeczywistym

Choroby demielinizacyjne mogą być modelowane u zwierząt poprzez ogniskowe zastosowanie lizolecytyny do OUN. Pojedyncze wstrzyknięcie lizolecytyny do rdzenia kręgowego myszy powoduje zmianę, która spontanicznie naprawia się w czasie. Celem jest zbadanie czynników zaangażowanych w de- i remielinizację oraz przetestowanie środków usprawniających naprawę.

Eksperymentalna demienizacja i remielinizacja mysiego rdzenia kręgowego przez ogniskowe wstrzyknięcie lizolecytyny

Wielkoskalowa mikroskopia elektronowa 2D (EM), czyli nanotomia, to ogólnotkankowe zastosowanie nanoskalowej rozdzielczości EM. W tym miejscu opisujemy uniwersalną metodę nanotomii stosowaną do badania mózgu larw danio pręgowanego w zdrowiu i po nieinwazyjnym uszkodzeniu mózgu.

Wielkoskalowa skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (nanotomia) mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego

Ten manuskrypt opisuje metody zapisów elektrofizjologicznych z neuronów rdzeniowych zarodków i larw danio pręgowanego. Preparat utrzymuje neurony in situ i często wiąże się z minimalnym rozwarstwieniem. Metody te pozwalają na badanie elektrofizjologiczne różnych neuronów rdzeniowych, od początkowego nabycia pobudliwości elektrycznej do wczesnych stadiów larwalnych.

Przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych

Zmodyfikowaliśmy model spadku masy Marmarou dla dorosłego danio pręgowanego, aby zbadać szeroki zakres patologii po uszkodzeniu mózgu (TBI) i mechanizmy leżące u podstaw późniejszej regeneracji neuronów. Ten model TBI jest skalowalny, indukuje łagodne, umiarkowane lub ciężkie TBI i podsumowuje niejednorodność obrażeń obserwowaną u ludzi.

Skalowalny model do badania skutków obrażeń spowodowanych siłą u dorosłych danio pręgowanych

Obecny protokół opisuje metodę wywoływania specyficznych tkankowo i wysoce powtarzalnych urazów u larw danio pręgowanego za pomocą laserowego systemu uszkodzeń połączonego z automatyczną platformą mikroprzepływową do obsługi larw.

Kontrolowane półautomatyczne urazy indukowane laserem do badania regeneracji rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Przecięcie rdzenia kręgowego kijanki Xenopus laevis jest odpowiednią metodą do badania uszkodzenia rdzenia kręgowego i regeneracji poprzez wykonanie poprzecznego cięcia, które całkowicie przecina rdzeń kręgowy na poziomie klatki piersiowej.

Przecięcie rdzenia kręgowego u kijanek Xenopus laevis

Poznaj techniki przecięcia rdzenia kręgowego i rozwarstwienia mózgu u larw minoga morskiego w celu badania regeneracji neuronów. Ta metoda umożliwia analizę ekspresji receptorów wskazujących aksony po urazie.

Kompletny protokół uszkodzenia rdzenia kręgowego i rozwarstwienia mózgu w celu późniejszej hybrydyzacji in situ u larw minoga morskiego (Wideo) | JoVE Journal

Kompletny protokół uszkodzenia rdzenia kręgowego i rozwarstwienia mózgu w celu późniejszej hybrydyzacji in situ u larw minoga morskiego

Przeglądaj więcej filmów