Nieinwazyjne obrazowanie i analiza niedokrwienia mózgu u żywych szczurów przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej z ¹⁸F-FDG

Ogólnym celem tego wspólnego projektu jest obrazowanie zmian w rozkładzie radioaktywnego znacznika glukozy w mózgach szczurów przed i po udarze. Jest to realizowane poprzez wywołanie niedokrwienia mózgu u szczurów z wykorzystaniem procedury okluzji środkowej tętnicy mózgowej. Następnym krokiem jest wstrzyknięcie radioznacznika Fluor deoxy glucose oraz wykonanie obrazowania za pomocą tomografii pozytonowej.

Ostatnim krokiem jest analiza danych przy użyciu szablonu obszaru zainteresowania w mózgu (volume of interest), który jest anatomicznie współrejestrowany z mózgiem szczura. W efekcie obrazowanie PET szczurów z niedokrwieniem mózgu może być wykorzystywane do pomiaru regionalnych różnic w wychwycie przez mózg sond radiologicznych, takich jak Fluor deoxy glucose, podczas podłużnych badań postępu choroby. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak nekropsja i histologia, jest fakt, że obrazowanie PET jest nieinwazyjne i może być stosowane w sposób podłużny do badania metod leczenia oraz linearnego postępu udaru.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mają trudności z ustanowieniem zwierzęcego modelu udaru. Wykorzystanie punktów orientacyjnych, takich jak tętnice szyjne wewnętrzna i zewnętrzna, znacznie ułatwi tę procedurę. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa dla przeprowadzenia analizy VOI, która jest możliwa dzięki nałożeniu atlasu szablonu mózgu PMOD na dane PET mózgu badanego osobnika.

Chirurg powinien zmienić rękawiczki na czyste i sterylne po przygotowaniu pola operacyjnego oraz używać sterylnych instrumentów. W tym badaniu należy wykorzystać samce szczurów linii Sprague-Dawley o masie ciała od 220 do 270 g, zaczynając od wykonania obrazowania PET i CT przed operacją. Aby uzyskać wartość bazową dla wychwytu F 18 FDG, znieczulono szczury przy użyciu 2,5% izofluranu podawanego przez maskę nosową.

Następnie umieść zwierzę w pozycji grzbietowej na podgrzewaczu, upewniając się za pomocą ucisku łapy, że zwierzę jest w pełni znieczulone. Następnie unieruchom przednie kończyny. W kolejnym kroku ogol grzbietową powierzchnię szyi zwierzęcia i przygotuj ogolony obszar za pomocą 70% ethanol, a następnie 10% roztworu povidone iodine.

Następnie za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie o długości od 2 do 2,5 cm, w odległości 0,5 cm na prawo od tchawicy, równolegle do niej. Następnie, stosując rozwarstwianie tępym narzędziem, zlokalizuj tętnicę szyjną wspólną i użyj rozwieraczy, aby ułatwić wizualizację naczynia. Po zidentyfikowaniu naczynia, nałóż mikroklamrę na tętnicę szyjną wspólną. Następnie zlokalizuj pierwszy punkt rozgałęzienia, którym będzie tętnica szyjna zewnętrzna (ECA) oraz tętnica szyjna wewnętrzna (ICA). Wypal mniejsze odgałęzienia odchodzące od tętnicy szyjnej zewnętrznej, takie jak tętnica potyliczna.

Następnie należy podwiązać tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) w pobliżu odgałęzienia tętnicy tarczycowej za pomocą szwu jedwabnego 4-0, pozostawiając zapas nici, aby kleszczyki hemostatyczne mogły utrzymać szew na miejscu. Aby zaciisnąć szwy kleszczykami, należy pociągnąć ECA w kierunku ogonowym, aż znajdzie się ona równolegle do tętnicy szyjnej wspólnej. Teraz należy wypalić ECA powyżej szwu.

Następnie zlokalizuj tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) i użyj kolejnego mikroklemy, aby ją zamknąć. Potem za pomocą małych nożyczek sprężynowych wykonaj niewielki otwór w tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA). Wprowadź zatyczkę i zawiąż wokół niej szew, aby zapobiec przepływowi krwi.

Teraz zdejmij mikroclamp z tętnicy szyjnej wewnętrznej i przesuwaj okluder, aż poczujesz opór. Upewnij się, że okluder wchodzi do tętnicy szyjnej wewnętrznej, a nie do tętnicy podniebiennej java. Następnie zdejmij mikroclamp z tętnicy szyjnej wspólnej i odetnij nadmiar okludera lub nici chirurgicznej.

Następnie użyj dziewięciomilimetrowych klipsów do ran, aby zamknąć nacięcie skóry. Wybudź zwierzę z narkozy i poczekaj, aż odzyska przytomność. Następnie wykonaj badanie PET CT 1,5 godziny po procedurze udaru po dwóch godzinach.

Ponownie w pełni znieczul szczura izofluranem i usuń klipsy zamykające ranę. Następnie zlokalizuj koniec okluzora i usuń go z tętnicy środkowej mózgu, delikatnie go pociągając, aż biała końcówka okluzora zetknie się ze szwami. Nie wyciągaj go jednak całkowicie, ponieważ spowoduje to krwawienie.

Na koniec wymień klipsy zamykające ranę. Następnie wybudź zwierzę z narkozy i poczekaj, aż odzyska przytomność. Następnie ponownie przeprowadź skanowanie zwierzęcia, 24 godziny po reperfuzji.

W celu ilościowego określenia uszkodzeń tkanki mózgowej spowodowanych udarem. Jak wspomniano wcześniej, zwierzę należy poddać skanowaniu przed wywołaniem udaru, następnie 1,5 godziny po udarze oraz na koniec 26 godzin po udarze.

Aby ilościowo ocenić uszkodzenie tkanki mózgowej w wyniku udaru przed obrazowaniem, znieczul szczura za pomocą 2,5% gazu izofluranowego w komorze anestezjologicznej. Następnie wstrzyknij do żyły ogonowej około 500 micro curies fluorodeoksyglukozy. Pozostaw szczura do wybudzenia przez jedną godzinę.

Następnie ponownie podaj środek znieczulający przed obrazowaniem. Umieść znieczuplonego szczura na standardowym podłożu dla szczurów z maską nosową do znieczulenia izofluranem. Zmierz w milimetrach odległość między nosem szczura a krawędzią podłoża i zapisz tę wartość jako przesunięcie poziome.

Następnie umieść zwierzę w skanerze i skonfiguruj badanie, wprowadzając przesunięcie poziome, masę ciała zwierzęcia, wstrzyknięcie, dawkę związku oraz datę i godzinę. Następnie kliknij przycisk start study, aby rozpocząć skanowanie, a po jego zakończeniu dokonaj rekonstrukcji danych. Przeprowadź analizę obrazu opisaną w niniejszym materiale, korzystając z oprogramowania analitycznego PMOD wraz z atlasem mózgu W Schiffera.

Zacznij od przejścia do karty ręcznej koregistracji (manual co-registration) u góry ekranu. Następnie wybierz kartę warstwowania (slicing). W dalszej kolejności użyj pustego białego prostokąta do obrotu skanów mikro PET oraz wypełnionego białego prostokąta.

Aby przesunąć skany mikro-PET, należy wyrównać oba skany, lokalizując punkty orientacyjne, takie jak gruczoły twarde oraz górne i tylne cechy mózgu, które mogą posłużyć do dopasowania skanu mikro-PET do modelu mózgu. Następnie należy dostosować skan mikro-PET, aż będzie on zgodny z atlasem mózgu. W razie potrzeby należy obrócić skan mikro-PET o 180 stopni w rzucie czołowym i znacząco podnieść skan w rzucie strzałkowym, wprowadzając jednocześnie inne niewielkie zmiany orientacji.

Następnie przejdź do karty pełnoekranowej fuzji. Wybierz źródło A w prawym górnym rogu ekranu. Następnie przejdź do atlasu szablonów.

Na dole strony wybierz szczura z menu rozwijanego. Opcjonalnie wróć do karty ręcznej korejestracji, gdzie atlas powinien pojawić się nałożony na atlas mózgu. Atlas może zostać wykorzystany do pomocy w dopasowaniu skanu mikro PET i atlasu mózgu po zakończeniu wyrównania.

Powróć do karty pełnoekranowej fuzji. Na obrazie mózgu pojawi się szablon wskazujący sekcje mózgu, dla których zostaną obliczone statystyki VOI. Teraz wybierz źródło B w prawym górnym rogu ekranu.

Następnie wybierz przycisk statystyk VOI. Zapisz wyświetlający się arkusz kalkulacyjny, wybierając opcję zapisz, a następnie zapisz w systemie plików. W polu nazwy pliku wpisz pożądaną nazwę.

Następnie, wykorzystując te dane, można przeprowadzić analizę obrazów w celu ich wizualizacji oraz utworzenia sekwencji obrazów za pomocą oprogramowania do obrazowania vol view. Szczegóły dotyczące etapów analizy i wizualizacji znajdują się w manuskrypcie towarzyszącym temu filmowi. Przedstawiono tutaj reprezentatywne dane obrazowe z badań PET i tomografii komputerowej (x-ray CT) szczura w punktach czasowych 24 godziny przed i 24 godziny po reperfuzji; po 24 godzinach odnotowano gwałtowny spadek poboru glukozy w półkuli ipsilateralnej, co sugeruje rozległe uszkodzenie tkanki w wyniku wywołanego udaru niedokrwiennego.

Białe strzałki wskazują miejsca zmniejszonego wychwytu FDG w wyniku uszkodzeń spowodowanych udarem. Przedstawione są tutaj dane FDG PET szczura 24 godziny po perfuzji, połączone z atlasem szablonowym VOI mózgu. W analizie kolory kreskowane oznaczają poszczególne VOI atlasu szablonowego mózgu.

Na koniec widzimy stosunki sygnału FDG PET z półkuli prawej do lewej oraz standardowe wartości wychwytu (SUV) dla każdego obszaru z atlasu mózgu szczura W Schiffera, raportowane dla skanów wykonanych przed wystąpieniem udaru niedokrwiennego, 1,5 godziny oraz 24 godziny po reperfuzji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać rzetelną wiedzę na temat tego, jak stworzyć model niedokrwienia mózgu u szczurów, a także jak przeprowadzić obrazowanie FDG PET tych zwierząt i wykorzystać atlas szablonowy mózgu do przeprowadzenia rygorystycznej analizy VOI uzyskanych danych.