Hodowla i postępowanie z embrionami rybek zebrafish

Ryby danio (zebrafish) stanowią niewielki, lecz potężny system modelowy. Te płodne ryby mogą generować setki potomstwa tygodniowo i wiele tysięcy w ciągu całego swojego życia. Szybki rozwój zewnętrzny oraz przezroczyste ciała sprawiają, że embriony są idealne do różnorodnych zastosowań. Niniejszy film omówi podstawy zbierania i obsługi embrionów, a następnie opisze aktualne metody badawcze wykorzystujące embriony ryb danio.

Aby wygenerować embriony, warto poznać podstawowe informacje na temat zachowań godowych danio pręgowanych.

Danio pręgowane rozmnażają się płciowo, więc do hodowli niezbędne są zarówno osobniki męskie, jak i żeńskie. Samce mają smuklejsze ciała z lekko czerwonawym odcieniem, natomiast samice mają większe, srebrzyste brzuchy wypełnione ikrą.

Okresowe kojarzenie sprawia, że jaja pozostają zdrowe, jednak produkcja tak dużej liczby jaj wymaga dużego wysiłku, dlatego poszczególne samice powinny być kojone tylko raz w tygodniu.

Wreszcie, podobnie jak u wielu innych zwierząt, zachowania godowe ryb są kierowane przez procesy sensoryczne.

Sygnały węchowe wysyłane przez samca pomagają przygotować samicę do tarła, natomiast odpowiednie oświetlenie pobudza obie ryby do działania.

Po nauce rozróżniania osobników męskich i żeńskich ryb, nadszedł czas na przygotowanie krzyżówki.

W hodowli zebrafish badacze wykorzystują zbiorniki zaprojektowane specjalnie do rozrodu. Zbiorniki hodowlane zazwyczaj posiadają wyjmowaną wkładkę z otworami, przez które mogą przelecieć jaja. Rozwiązanie to chroni ikrę przed zjedzeniem przez głodne dorosłe ryby.

W celu rozpoczęcia procesu, po południu lub wieczorem umieść dorosłe ryby w zbiornikach hodowlanych. Aby zebrać embriony wczesnego stadium następnego dnia rano, oddziel ryby płci męskiej i żeńskiej przegrodą, co zapobiegnie rozrodowi przed momentem rozpoczęcia eksperymentu. Aby zapobiec wyskakiwaniu ryb, należy upewnić się, że zbiornik hodowlany jest przykryty pokrywą. Następnie pozostaw ryby na noc, aby mogły się do siebie przyzwyczaić.

Po spędzeniu wspólnej nocy w zbiorniku do rozrodu, ryby poczują potrzebę zapłodnienia następnego ranka.

Pierwszym krokiem rano jest usunięcie przegrody oddzielającej samca od samicy w celu zainicjowania tarła. Jeśli przegroda nie została zastosowana, ryby złożą ikrę wkrótce po zapaleniu światła.

Gdy samce gonią samice w zbiorniku, stymulują one składanie ikry, jednocześnie uwalniając nasienie do wody w celu zapłodnienia. Po usunięciu przegrody należy odczekać około 15 - 30 minut, aby ryby miały czas na zapłodnienie. Następnie należy usunąć dorosłe osobniki ze zbiornika, używając siatki lub wyjmując wkład zbiornika i przenosząc ryby do innego akwarium.

Następnie wodę wraz z embrionami należy przelać przez gęste sitko do herbaty w celu ich zebrania. Potem, używając „wody do jaj”, należy spłukać embriony z sitka do szalki Petriego. Może być konieczne przeniesienie embrionów między szalkami, aby uzyskać optymalną gęstość od 50 do 100 sztuk na szalkę. Aby zapewnić prawidłowe tempo rozwoju, należy umieścić szalki w inkubatorze w temperaturze 28.5 °C.

Po uzyskaniu embrionów należy obchodzić się z nimi z należytą ostrożnością, gdyż są one kluczowe dla przeprowadzonych eksperymentów. Przejrzyjmy kilka wskazówek.

Aby utrzymać embriony w dobrym stanie, należy zadbać o czystość wody w szalkach Petriego i usunięcie z niej zanieczyszczeń. Martwe embriony stają się nieprzezroczyste i powinny być codziennie usuwane. Dodatkowo do wody można dodać błękit metylowy, aby zapobiec rozwojowi grzybów.

W każdym przypadku przenoszenia embrionów z jednej szalki do drugiej należy użyć pipety transferowej. Poprzez delikatne zakręcanie szalką można skoncentrować embriony w centrum naczynia, co ułatwia ich pobieranie pipetą.

Niektóre protokoły wymagają dodatkowych kroków w celu utrzymania embrionów. Przez pierwsze trzy dni życia embriony zebrafish rozwijają się wewnątrz chorionu, który może utrudniać manipulacje. Chorion można usunąć poprzez traktowanie enzymem proteolitycznym, pronazą, lub usuwając go ręcznie za pomocą pęsety. Ponadto w ciągu 24 godzin u zebrafish zaczyna rozwijać się pigment, co widać tutaj na przykładzie larwy zebrafish, a co może utrudniać badanie mikroskopowe. Aby rozwiązać ten problem, naukowcy dodają do wody PTU, który hamuje produkcję pigmentu – melaniny.

Skoro wiesz już, jak pozyskiwać i pielęgnować embriony rybek danio, przyjrzyjmy się sposobom, w jakie badacze wykorzystują je w odkryciach naukowych.

Zewnętrzny rozwój embrionów rybek danio umożliwia manipulacje genetyczne poprzez mikroiniekcję DNA, RNA lub reagentów do wyciszania genów. Metoda ta prowadzi do równomiernego rozprzestrzenienia wstrzykniętego materiału w całym embrionie i może wywołać widoczne fenotypy wynikające z nadekspresji lub utraty białka. Tę samą technikę można zastosować do tworzenia ryb transgenicznych, w których konkretne struktury są znakowane ekspresją białek fluorescencyjnych.

Dodatkowo niewielki rozmiar embrionów i larw rybek danio sprawia, że są one idealne do fenotypowego przesiewu chemicznego. W tej metodzie embriony umieszcza się w płytkach 96-dołkowych, a następnie poddaje działaniu bibliotek małych cząsteczek poprzez dodanie odczynników chemicznych do wody. Następnie płytki z rybami są analizowane pod kątem wad morfologicznych, takich jak pokazany tutaj nieprawidłowy rozwój.

Wreszcie, przezroczystość embrionów rybek danio sprawia, że są one doskonale przystosowane do mikroskopii. Żywe embriony wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w konkretnych typach komórek mogą zostać zamocowane i zobrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej, co pozwala badaczom obserwować ruchy komórek w rozwijających się tkankach w czasie.

Właśnie obejrzeli Państwo film JoVE na temat hodowli danio-przeżalka oraz postępowania z zarodkami. W tym materiale omówiliśmy podstawy kojarzenia, przygotowanie zbiorników hodowlanych oraz techniki manipulacji zarodkami. Przedstawiliśmy również niektóre metody badawcze, które wykorzystują potencjał tych niewielkich, lecz cennych zarodków. Dziękujemy za uwagę!