Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego
21 lutego 2014
Mikroprzepływowe natryskiwanie dwuwarstwy lipidowej na granicy kropelek zapewnia niezawodny sposób generowania pęcherzyków z kontrolą nad asymetrią błony, włączeniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiału. Technika ta może być stosowana do badania różnych systemów biologicznych, w których pożądane są biomolekuły podzielone na przedziały.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie pęcherzyków z dwuwarstwy fosfolipidowej z lepszą kontrolą nad błoną, szerokością, molarnością, monodyspersyjnością oraz zawartością wewnętrzną. Z wykorzystaniem systemu CAD wykonano komorę z arkuszy akrylowych i naturalnego kauczuku. Zawieszona dwuwarstwa lipidowa jest tworzona poprzez napełnienie komory lipidami i roztworem.
Następnie, w urządzeniu do natrysku konfiguruje się dyszę atramentową zawierającą roztwór do enkapsulacji. Po ustaleniu odpowiednich parametrów, impulsy natryskiwanej cieczy utworzą pęcherzyki z dwuwarstwy lipidowej. W rezultacie mikroprzepływowy natrysk pozwala na uzyskanie powtarzalnych, monodyspersyjnych pęcherzyków dwuwarstwowych.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak formowanie elektrostatyczne, emulsyfikacja czy generowanie kropli, jest zwiększony poziom kontroli nad błoną, jednostronną molarnością, monodyspersyjnością oraz zawartością wewnętrzną. Procedurę zaprezentuje Johanna Harrow, studentka studiów magisterskich z laboratorium, a wspierać ją będzie Kara Patel, studentka studiów licencjackich. Używając oprogramowania CAD, narysuj kształt komory, którą można wykonać z akrylu za pomocą wycinarki laserowej; następnie wywierć otwory o średnicy 1/16 cala na obu stronach złożonej komory akrylowej. Pozwoli to na odpływ do studzienki w kształcie nieskończoności.
Po drugie, wytnij nożyczkami mały prostokąt z arkusza akrylu o grubości 0,2 mm, który będzie służył jako dno kształtu nieskończoności. Przymocuj go w tym miejscu za pomocą szybko schnącego kleju, dbając o to, aby nie zabrudzić klejem obszarów widocznych. Arkusz akrylu powinien przylegać do ścianki komory i być stabilnie przymocowany do jej dna.
Po trzecie, użyj szybko schnącego kleju, aby przykleić cienki kawałek arkusza z naturalnego kauczuku nad wywierconymi otworami. Docisnąć je pęsetą. Sprawdzić szczelność wszystkich klejonych szwów.
Nie powinno być ich wcale. Na koniec, używając igły o rozmiarze 23 G, należy wykonać otwory w gumie poprzez wywiercone wcześniej otwory; przez te otwory zostanie włożona końcówka piezoelektrycznego drukującego atramentem. Komercyjne fosfolipidy należy rozpuścić w chloroformie i przechowywać w temperaturze -20 °C.
W tej demonstracji wykorzystano lipidy D-P-H-P-C lub DOPC. Lipidy rozpuszczone w chloroformie przenosi się do szklanej fiolki, trzymając ją pod kątem, a następnie delikatnie osuszają pod strumieniem argonu lub azotu.
Następnie umieść fiolkę z lekko poluzowanym nakrętką w próżni przez jedną do dwóch godzin, aby usunąć pozostałości rozpuszczalnika. Na tym etapie można również zastosować deskryptor. Teraz rozpuść lipidy w odpowiednim buforze, aby uzyskać końcowe stężenie lipidów wynoszące 25 mg/mL.
Wymieszaj roztwór w vortexie. Krótko uszczelnij nakrętkę za pomocą parafiny, a następnie poddaj sonikacji przez 15 minut. Przechowuj ten roztwór w temperaturze -20°C.
Następnie należy przygotować roztwór zapasowy sacharozy o osmolarności zbliżonej do fizjologicznej. Jest to roztwór do natrysku. W celu zwiększenia kontrastu lub uzyskania fluorescencji można dodać do roztworu kroplę ciemnego barwnika spożywczego lub kuleczki fluorescencyjne.
Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem sacharozy, aby usunąć uwięzione powietrze. Stuknij w strzykawkę, aby pęcherzyki powietrza wyniosły się do otworu wlewu i mogły zostać usunięte. Następnie przymocuj do strzykawki filtr o średnicy 33 mm i porach 0,22 µm i wypchnij jedną kroplę przez filtr.
Teraz odkręć adapter żeński druku atramentowego i dociśnij go do końca filtra. Wytłocz niewielką ilość cieczy, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Na koniec przymocuj strzykawkę do górnej części cieczy w drukarce atramentowej.
Jeśli strzykawka została prawidłowo podłączona, ciecz powinna dotrzeć do końcówki drukarki atramentowej. Najpierw zamocuj zespół strzykawki do stolika mikroskopu i podłącz kontroler drukarki atramentowej dla tego eksperymentu. Stolik i strzykawka wymagają niezależnego sterowania, przy czym oba elementy muszą poruszać się w trzech wymiarach w celu wizualizacji.
Przygotuj kamerę wysokich prędkości zdolną do rejestrowania co najmniej 1000 klatek na sekundę. Skonfiguruj ją tak, aby korzystała z automatycznego wyzwalania opartego na obrazie w celu rozpoczęcia nagrań. Następnie przymocuj komorę do stołu za pomocą taśmy i ostrożnie wyrównaj końcówkę drukarki atramentowej z otworem wykonanym w gumowej membranie po boku komory.
Najpierw ustawić pozycję „na oko”, a następnie dokonać precyzyjnej regulacji za pomocą mikroskopu. Po wyrównaniu, wycofać strzykawkę wzdłuż jednej osi, aby załadować kształt nieskończoności. Następnie delikatnie nacisnąć tłok, aby na dyszy utworzyła się kropla.
Zapewnia to początkowe ciśnienie wsteczne. Należy ustawić parametry strumieniowania. Następnie na ekranie zostaną wyświetlone konkretne wartości dla trapezoidalnej fali bipolarnej; przyłożone napięcie oraz liczba impulsów strumieniowania na wyzwalacz kontrolują rozmiar pęcherzyków.
Następnie napełnij komorę od 25 do 30 µL roztworu lipidów w odpowiednim czasie, pokrywając całą powierzchnię kształtu nieskończoności. Następnie do każdej studzienki dodaj 25 µL roztworu glukozy na zewnętrzną krawędź, pipetując powoli i płynnie; glukoza nie powinna zmieszać się z roztworem lipidów. W ciągu 10 minut w centrum komory utworzy się lipidowa dwuwarstwa.
Przygotowanie dwuwarstwy jest najkrytyczniejszym etapem, ponieważ jest ona niestabilna i może ulec przerwaniu w zależności od sposobu przygotowania. Należy zachować cierpliwość. Procedura uda się po kilkukrotnym przećwiczeniu napełniania komory.
Następnie ostrożnie wprowadź końcówkę drukarki atramentowej z powrotem do komory, gdy końcówka znajduje się w odległości 200 mikronów od interfejsu kropli. Rozpocznij proces wydzielania kropel z dwuwarstwy i zarejestruj dane; wykorzystanie drukarki atramentowej pozwoliło uzyskać wgląd w proces generowania pęcherzyków. Przykładowo, zmiana odległości między dyszą drukarki atramentowej a dwuwarstwą lipidową wpływała na siłę odkształcającą błonę. Zamknij.
Bliskość dwuwarstwy skupiła strumień jetu i zapobiegła rozpraszaniu energii przez błonę poza punkt generowania pęcherzyka. Ponadto zasięg wiru zwiększał się wraz z napięciem przyłożonym do aktuatora piezoelektrycznego. Proces tworzenia pęcherzyków zobrazowano jako sekwencję zdarzeń następujących po ich powstaniu.
Stabilność pęcherzyków miała tendencję do zmiany w zależności od ich średnicy, przy czym mniejsze pęcherzyki były bardziej stabilne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak generować pęcherzyki lipidowe z wykorzystaniem mikrofluidycznego strumieniowania.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia metodę generowania pęcherzyków z dwuwarstwy fosfolipidowej przy użyciu mikrofluidycznego strumieniowania przeciwko lipidowej dwuwarstwie na interfejsie kropli. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę nad asymetrią błony, wbudowywaniem białek transbłonowych oraz enkapsulacją materiałów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Biotechnologia
Wstęp
- Pęcherzyki z dwuwarstwy fosfolipidowej są niezbędne do badania bioczasteczek w przedziałach komórkowych.
- Techniki mikroprzepływowe zwiększają powtarzalność i kontrolę procesu tworzenia pęcherzyków.
- Zrozumienie właściwości błon jest kluczowe dla wielu zastosowań biologicznych.
- Technologia strumieniowania może usprawnić proces generowania pęcherzyków.
Cel badania
- W celu wytworzenia pęcherzyków o kontrolowanych charakterystykach błony.
- W celu ułatwienia wbudowania specyficznych białek w dwuwarstwę.
- W celu umożliwienia enkapsulacji różnych materiałów do celów badawczych.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie komory z arkuszy akrylowych i kauczuku naturalnego.
- Tworzenie zawieszonej dwuwarstwy lipidowej poprzez wypełnienie komory lipidami i roztworem.
- Konfiguracja aparatury do druku atramentowego w celu enkapsulacji roztworów.
- Ustalenie odpowiednich parametrów impulsów cieczy w druku atramentowym w celu tworzenia pęcherzyków.
Główne wyniki
- Mikrofluidyczny jetting pozwala na wytwarzanie powtarzalnych, monodyspersyjnych pęcherzyków dwuwarstwowych.
- Metoda ta umożliwia precyzyjną kontrolę nad właściwościami pęcherzyków.
- Enkapsulacja materiałów odbywa się w sposób efektywny.
- Pęcherzyki mogą być dostosowywane do różnych badań biologicznych.
Wnioski
- Mikrofluidyczny wyrzut kropli jest niezawodną techniką generowania pęcherzyków.
- Poprawiono kontrolę nad asymetrią błony oraz włączaniem białek.
- Metoda ta ma istotne znaczenie dla badania przedzielonych biomolekuł.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikrofluidyczne wyrzutowanie umożliwia precyzyjną kontrolę nad generowaniem pęcherzyków dwuwarstwowych z lipidów, wspierając powtarzalną produkcję olbrzymich pęcherzyków jednowarstwowych (GUVs) o zdefiniowanym składzie błony i zdolności enkapsulacji. Możliwość ta rozwiązuje kluczowy problem w badaniach nad biologią syntetyczną i dostarczaniem leków, zapewniając regulowaną platformę do modelowania układów komórkowych i testowania związków bioaktywnych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie walidacji celów, umożliwiając systematyczną analizę procesów zależnych od błony.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez kontrolowaną asymetrię błony oraz inkorporację białek transbłonowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez generowanie powtarzalnych systemów pęcherzykowych służących do wyjaśniania szlaków sygnałowych.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio dzięki dostarczaniu ilościowych wyników dotyczących oddziaływań lipid-białko oraz wydajności enkapsulacji.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez wytwarzanie monodyspersyjnych pęcherzyków o regulowanej wielkości i zawartości wewnętrznej.
- Wartość operacyjna: Rozwiązuje kwestie standaryzacji i powtarzalności testów dzięki precyzyjnym parametrom dozowania strumieniowego, które kontrolują proces tworzenia pęcherzyków.
- Gotowość do screeningu: Podkreśla skalowalność i możliwość ponownego wykorzystania platformy w celu niezawodnej oceny związków w wielu różnych warunkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Omówienie związku z przebiegiem choroby poprzez zastosowanie roztworów o osmolarności zbliżonej do fizjologicznej oraz śledzenia fluorescencyjnego w celu monitorowania pęcherzyków.
- Zgodność przedkliniczna: Opis ciągłości od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez umożliwienie enkapsulacji kandydatów terapeutycznych w celu przeprowadzenia badań stabilności i uwalniania.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wsparcie procesu podejmowania decyzji poprzez dostarczenie mierzalnych wyników dotyczących stabilności pęcherzyków oraz wydajności zależnej od ich średnicy.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z continuum odkryć, od wczesnego testowania hipotez po identyfikację związków wiodących, szczególnie w testach wymagających kontrolowanych środowisk membranowych oraz dostarczania związków w formie enkapsulowanej.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie systematycznej zmiany składu lipidów oraz wbudowywania białek transbłonowych w celu wyjaśnienia zależności w szlakach sygnałowych.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość do przeprowadzania analiz dzięki generowaniu monodyspersyjnych pęcherzyków, które zapewniają spójną ekspozycję na związki i powtarzalne wyniki.
- Analityka: Wskazuje na pomiary ilościowe, takie jak rozmiar pęcherzyków, szybkość ich tworzenia oraz wydajność enkapsulacji, które pomagają zespołom porównywać warunki eksperymentalne.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością badań przedklinicznych poprzez umożliwienie enkapsulacji leków lub biomolekuł w celu testowania stabilności i profilowania uwalniania.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako powtarzalną kompetencję, a nie technikę jednorazową, którą można dostosować do wielu projektów wymagających syntetycznych platform pęcherzykowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w mechanizmach związanych z błonami.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność produkcji pęcherzyków dla zastosowań wysokoprzepustowych.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje go/no-go, efektywność kapitałowa i zmniejszone ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki wczesnej minimalizacji ryzyka mechanizmów dostarczania.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o dalszym rozwoju w oparciu o dane dotyczące wydajności pęcherzyków.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrofluidyki, pracy z lipidami oraz mikroskopii w celu montażu komory i formowania dwuwarstwy.
- Zależny od aparatury, w tym urządzeń do druku atramentowego z napędem piezoelektrycznym, szybkich kamer oraz systemów suszenia próżniowego.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji roztworów lipidów, parametrów wyrzutu kropli oraz procedur wyrównywania komory.
- Obejmuje kwestie adaptacyjne dla różnych typów lipidów, białek transbłonowych i środków enkapsulujących w różnych systemach modelowych.
- Uwzględnia ograniczenia praktyczne, takie jak niestabilność dwuwarstwy podczas przygotowania oraz wrażliwość na wibracje otoczenia podczas wyrzutu kropli.
