Name: Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj metodę natryskiwania mikroprzepływowego do wytwarzania dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych z precyzyjną kontrolą asymetrii błony i inkorporacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Mike'owi Vaheyowi z Laboratorium Fletchera na Uniwersytecie Kalifornijskim w Berkeley za porady dotyczące parametrów mikroodrzutu. Praca ta była sponsorowana przez grant NIH DP2 HL117748-01.

1. Produkcja Komory Nieskończoności
<ol>
	<li>Zaprojektuj komorę nieskończoności (nazwaną tak ze względu na jej kształt) za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) i zapisz plik tak, aby był kompatybilny z wycinarką laserową. Aby utworzyć ten kształt, należy oddzielić dwa okręgi o średnicy 0,183 cala odległością od środka do środka wynoszącą 0,15 cala. Wytnij komorę od 1/8 do 3/16 w przezroczystym akrylu za pomocą wycinarki laserowej. Kształt nieskończoności ułatwia tworzenie dwuwarstwowych warstw i stabilność interfejsu kropel.</li>
	<li>Wywierć otwór 1/16 cala przez krawędź akrylowej komory do studni w kształcie nieskończoności. Powtórz po przeciwnej stronie. Wytnij mały prostokąt z arkusza akrylowego o grubości 0,2 mm za pomocą nożyczek lub wycinarki laserowej, aby służył jako dno studni.</li>
	<li>Nałóż cienką, ale kompletną warstwę szybkoschnącego kleju na jedną stronę akrylu o grubości 0,2 mm i przyklej ją do dna komory. Przytrzymaj akryl o grubości 0,2 mm mocno na miejscu przy dnie komory i dozuj klej na interfejsie, aby klej mógł utworzyć uszczelnienie, ale unikaj zakrywania viewobszar. Pamiętaj, aby wyrównać akryl tak, aby jego krawędź była równo z krawędzią ścianki komory i całkowicie zakrywała wycięcie w komorze nieskończoności. Pozwoli to na wystarczającą penetrację strumienia i zapobiegnie wyciekom ze studni.</li>
	<li>Wytnij dwa małe kawałki kauczuku naturalnego, aby zakryć wywiercone otwory. Nałóż szybkoschnący klej wokół otworu. Umieść gumę na otworze i dociśnij wszystkie obszary za pomocą kleszczy, aby zabezpieczyć. Powtórz te czynności dla obu wywierconych otworów. Upewnij się, że wszystkie połączenia klejone są kompletnymi uszczelnieniami, aby zapobiec wyciekom.</li>
	<li>Za pomocą igły o wadze 23 G, 1 cala przebij otwór w naturalnej gumie po obu stronach komory, aby ułatwić włożenie piezoelektrycznej końcówki do drukarki atramentowej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do eksperymentu
Przechowuj podstawowy roztwór lipidowy w chloroformie w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Do tego badania użyto 1,2-difitanoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPhPC) lub 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC). W tym protokole zwykle przygotowuje się 2 ml roztworu lipidów o stężeniu 25 mg/ml, który wystarcza na dwa miesiące, jeśli jest przechowywany w temperaturze -20 °C.
<ol>
	<li>Aby ponownie zawiesić lipid w n-dekanie, najpierw przenieś go z fiolki podstawowej do małego szklanego słoika i delikatnie wysusz pod argonem lub azotem. Podczas suszenia trzymaj słoik pod kątem, aby wystawić większą powierzchnię na działanie gazu, umożliwiając szybsze wyschnięcie lipidów.</li>
	<li>Trzymając tylko lekko przykręconą nakrętkę słoika, pozostaw wysuszony roztwór w próżni w eksykatorze na 1-2 godziny. Następnie dodaj n-dekan, aby rozpuścić lipid w stężeniu 25 mg/ml. Krótko zmieszać roztwór lipidowy i poddać go sonikacji w kąpieli sonikatora przez 15 minut. Odtworzony lipid należy przechowywać w n-dekanie w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotuj podstawowy roztwór sacharozy. Do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml dodać 900 μl 300 mM sacharozy i 100 μl 1% metylocelulozy (MC). Metyloceluloza jest dodawana w celu zwiększenia lepkości roztworu, co pomaga w natryskiwaniu. Opcjonalny krok: Dodaj opcjonalnie 1 μl ciemnego barwnika spożywczego lub kulek fluorescencyjnych, aby nadać odpowiednio większy kontrast lub fluorescencję podczas obrazowania. Roztwór ten jest roztworem sacharozy o stężeniu 300 mOsm, zaprojektowanym w celu dopasowania osmolarności komórkowej i zapewnienia kontrastu podczas mikrostrumieniowania.</li>
	<li>Pobrać roztwór do jednorazowej plastikowej strzykawki o pojemności 1 ml. Trzymając strzykawkę końcówką skierowaną do góry, kilkakrotnie przesuwaj trzonek, aby usunąć wszelkie pęcherzyki w kierunku końcówki, a następnie naciśnij tłok, aby wyrzucić uwięzione powietrze. Należy pamiętać o usunięciu całego powietrza ze strzykawki przed kontynuowaniem, ponieważ będzie to zakłócać prawidłowy skurcz piezoelektryczny odpowiedzialny za natryskiwanie.</li>
	<li>Zainstalować filtr 0,22 μm na końcu strzykawki. Aby zapobiec uwięzieniu powietrza w filtrze, należy trzymać strzykawkę pionowo i naciskać tłok, aż nad końcówką utworzy się kropla. Uwaga: Stwierdzono, że najlepiej sprawdza się filtr strzykawkowy o średnicy 33 mm, ale w celu zmniejszenia martwej objętości można użyć alternatywnych filtrów, tak małych, jak filtr strzykawkowy o średnicy 3 mm.</li>
	<li>Odkręć żeński adapter Luer drukarki atramentowej i mocno dociśnij go na końcu filtra. Ponownie wyrzuć płyn, aby zapobiec uwięzieniu powietrza. Wkręć górną część drukarki atramentowej. Płyn powinien przedostać się do końcówki drukarki atramentowej po jej całkowitym przymocowaniu.</li>
</ol>
3. Przygotowanie sprzętu
<ol>
	<li>Za pomocą zacisku V clamp zamontuj zespół strzykawki na stoliku mikroskopu. Podłącz przewód z drukarki atramentowej do kontrolera drukarki atramentowej. Uwaga: Dla tego protokołu zbudowano niestandardową scenę; Chociaż projekt stolika może być określony przez użytkownika, bardzo ważne jest, aby mieć niezależną kontrolę XY-Z nad strzykawką i kontrolę X-Y nad uchwytem próbki.</li>
	<li>Określ powiększenie i niezbędną kombinację soczewek, aby uzyskać pożądane obrazowanie. Tutaj używany jest obiektyw 10X i okular 10X.</li>
	<li>Użyj szybkiej kamery (≥1,000 kl./s), aby zobrazować natryskiwanie i generowanie pęcherzyków. Przed przystąpieniem do obrazowania należy przeprowadzić niezbędną kalibrację aparatu. Wykorzystaj automatyczne wyzwalanie oparte na obrazie w oprogramowaniu aparatu, aby zainicjować przechwytywanie obrazu.</li>
	<li>Zamontuj komorę nieskończoności na stoliku mikroskopu. Zabezpiecz komorę, przyklejając ją taśmą na miejscu na scenie.</li>
	<li>Ostrożnie wyrównaj końcówkę drukarki atramentowej z otworem przebitym w kauczuku naturalnym (patrz Rysunek 1b). Aby to zrobić, zbliż drukarkę atramentową do komory i wyreguluj położenie na oko, a następnie dokonaj bardziej precyzyjnych regulacji za pomocą soczewki mikroskopu. Postępuj ostrożnie, ponieważ zgrubne ruchy mogą uszkodzić końcówkę drukarki atramentowej.</li>
	<li>Po wyrównaniu drukarki atramentowej cofnij zespół strzykawki z dala od komory, aby zapobiec uszkodzeniu drukarki atramentowej podczas ładowania studzienek. Upewnij się, że ruch drukarki atramentowej jest jednokierunkowy, tak aby pozostał wyrównany z otworem w membranie.</li>
	<li>Delikatnie nacisnąć tłok zespołu strzykawki, aż na dyszy drukarki atramentowej utworzy się mała kropelka. Zapewni to pewne początkowe ciśnienie wsteczne.</li>
	<li>Wprowadź parametry natryskiwania. W przypadku trapezowej fali bipolarnej należy użyć następujących parametrów: częstotliwość impulsów 20 kHz, czas narastania 3 μs, czas trwania impulsu 35 μs, czas opadania 3 μs, napięcie przyłożone 65 V (amplituda impulsu) i 100 impulsów strumieniowych na wyzwolenie (liczba impulsu). Jednak przyłożone napięcie (amplituda impulsu) i liczba impulsów (impulsy strumieniowe na wyzwalanie) mogą być zmieniane w celu kontrolowania wielkości pęcherzyków.</li>
</ol>
4. Wytwarzanie pęcherzyków
<ol>
	<li>Dodać 25-30 μl roztworu lipidowego zawieszonego w n-dekanie do komory nieskończoności, pokrywając całą powierzchnię obu studzienek.</li>
	<li>Dodać 25 μl glukozy (o takiej samej osmolarności jak roztwór sacharozy) do najbardziej zewnętrznej krawędzi jednego dołka, pipetując powoli i płynnie. Po osadzeniu powinna powstać kropla glukozy, ponieważ roztwór glukozy i lipidów nie mieszają się. Dodaj kolejne 25 μl glukozy do przeciwległej studzienki, która utworzy kolejną kroplę i utworzy dwuwarstwową błonę lipidową na środku komory w ciągu 5-10 minut.</li>
	<li>Włóż atrament przez kauczuk naturalny i ostrożnie poprowadź go w kierunku dwuwarstwy interfejsu kropel. Zbliżaj się do dwuwarstwy powoli, ponieważ wprowadzony druk atramentowy przesunie objętość i może rozerwać dwuwarstwę.</li>
	<li>Gdy drukarka atramentowa znajdzie się w zakresie ~200 μm, zastosuj natryskiwanie z ustawieniami opisanymi w kroku 3.8. Odległość od dwuwarstwy może się różnić przede wszystkim w zależności od napięcia i liczby impulsów, a także innych parametrów. Protokół ten zaleca powolne zwiększanie ustawień (napięcie i liczba impulsów) oraz obserwację deformacji dwuwarstwowej.</li>
</ol>
5. Czyszczenie sprzętu
<ol>
	<li>Odłączyć zespół strzykawki od stolika mikroskopowego i wyrzucić plastikową strzykawkę o pojemności 1 ml oraz filtr.</li>
	<li>Aby wyczyścić drukarkę atramentową, zasysaj kolejno następujące roztwory, zanurzając końcówkę w roztworze 7-10 razy każdy: 70% etanolu, 2% roztworu Neutrad w ciepłej wodzie, 70% etanolu i ddH2O. Jeśli drukarka atramentowa nie przylega bezpiecznie do pipety aspiracyjnej, odetnij końcówkę pipety, aby utworzyć adapter.</li>
	<li>Osusz komorę chusteczką. Umieść komorę nieskończoności w zlewce o pojemności 250 ml z 2% v/v Neutrad w ciepłej wodzie i poddawaj sonikę przez 5-10 minut. Po sonikacji dokładnie wysuszyć studzienki pod sprężonym powietrzem. Wilgoć w studzienkach może zagrozić stabilności dwuwarstwowej membrany lipidowej, dlatego zaleca się również umieszczenie komór w piecu w temperaturze 60 °C na 15 minut.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+under+construction%3A+in+vitro+reconstitution+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).</li>
<li>Yeh, B. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+lessons+from+the+history+of+synthetic+organic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).</li>
<li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition%2C+asymmetry%2C+and+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Soc.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).</li>
<li>Liu, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-induced+bundling+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Phys%22%5BJournal%5D)">Membrane-induced bundling of actin filaments.</a> Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).</li>
<li>Brown, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+tropicalis+egg+extracts+provide+insight+into+scaling+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle.</a> J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320, 789-792 (2008).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Disc.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Liposome electroformation.</a> Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).</li>
<li>Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+Vesicles+as+Biochemical+Compartments%3A+The+Use+of+Microinjection+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques.</a> Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).</li>
<li>Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+emulsion+templated+monodisperse+phospholipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles.</a> Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).</li>
<li>Matosevic, S., Paegel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+Synthesis+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+a+Microfluidic+Assembly+Line%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).</li>
<li>Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Fabrication+of+Asymmetric+Giant+Lipid+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Inter%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles.</a> ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).</li>
<li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+droplet+interface+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).</li>
<li>Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+formation+of+unilamellar+lipid+vesicles+for+cell-like+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation.</a> Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).</li>
<li>Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+unilamellar+vesicle+electroformation+from+lipid+mixtures+to+native+membranes+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions.</a> Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).</li>
<li>Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+control+of+giant+unilamellar+vesicles+prepared+from+inverted+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets.</a> J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).</li>
<li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet Microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li>
<li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).</li>
<li>Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-coated+microdroplet+array+for+in+vitro+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis.</a> Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).</li>
<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+serves+as+a+membrane+domain+switch+in+model+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers.</a> Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opracowano wiele technik generowania pęcherzyków, w tym elektroformację, emulsję i generowanie kropelek14-16. Niezbędne są jednak nowe techniki eksperymentalne, aby umożliwić projektowanie systemów biologicznych o rosnącym podobieństwie do systemów żywych. W szczególności metody mikroprzepływowe zapewniły zwiększony poziom kontroli nad jednowarstwowością błony, monodyspersją wielkości i zawartością wewnętrzną17,18, zbliżając modele pęcherzyków do biologii. Ponadto charakterystyka i eksperymenty z wy...

Staje się coraz bardziej jasne, że biologia komórki to wieloskalowy problem, który wymaga integracji naszego zrozumienia od molekuł do komórek. W związku z tym dokładna wiedza o tym, jak cząsteczki działają indywidualnie, nie wystarcza do zrozumienia złożonych zachowań komórkowych. Wynika to częściowo z istnienia emergentnych zachowań układów wieloskładnikowych, czego przykładem jest odtworzenie interakcji sieci aktynowej z pęcherzykami lipidowymidwuwarstwowymi 4, montaż wrzeciona mitotycznego w ekstrakcie Xenopus 5 oraz dynamika przestrzenna maszynerii podziału komórek bakteryjnych6. Jednym ze sposobów uzupełnienia redukcjonistycznego podejścia do analizowania procesów molekularnych w systemach żywych jest przyjęcie odwrotnego podejścia polegającego na rekonstrukcji zachowań komórkowych przy użyciu minimalnego zestawu składników biologicznych. Kluczowym elementem tego podejścia jest niezawodna enkapsulacja biomolekuł w ograniczonej objętości, co jest kluczową cechą komórki.
Istnieje kilka strategii hermetyzacji biomolekuł do badania systemów biomimetycznych. Najbardziej istotnym biologicznie systemem są dwuwarstwowe błony lipidowe, które naśladują biochemiczne i fizyczne ograniczenia narzucone przez błonę plazmatyczną komórki. Tworzenie gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV) przez elektroformację7, jedną z najczęściej stosowanych technik wytwarzania GUV14, zwykle ma niską wydajność enkapsulacji ze względu na niekompatybilność z buforem o wysokiej zawartości soli8. Elektroformacja wymaga również dużych objętości próbek (>100 μl), co może stanowić problem w pracy z oczyszczonymi białkami i nieefektywnie włącza duże cząsteczki ze względu na trudności w dyfuzji między blisko rozmieszczonymi warstwami lipidowymi. Opracowano kilka mikroprzepływowych podejść do generowania pęcherzyków lipidowych. Metody podwójnej emulsji, które przepuszczają składniki przez dwa interfejsy między warstwami woda-olej-woda (W/O/W), polegają na odparowaniu lotnego rozpuszczalnika w celu stymulowania tworzenia dwuwarstw lipidowych9. Inni wykorzystali mikroprzepływową linię montażową, która wytwarza ciągły strumień dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych10 lub w dwóch niezależnych krokach11. Opracowaliśmy alternatywną technikę opartą na szybkim stosowaniu impulsów płynu do dwuwarstwy12 na granicy kropel w celu wytworzenia GUV o kontrolowanym rozmiarze, składzie i enkapsulacji. Nasze podejście, znane jako natryskiwanie mikroprzepływowe, oferuje połączone korzyści z kilku istniejących technik generowania pęcherzyków, zapewniając podejście do tworzenia funkcjonalnych systemów biomolekularnych do badania różnych problemów biologicznych.

<table><tbody><tr><td>Piezoelektryczna drukarka atramentowa</td><td>MicroFab Technologies</td><td>MJ-AL-01-xxx</td><td>xxx oznacza średnicę kryzy w mikronach</td></tr><tr><td>Sterownik Jet Drive III</td><td>MicroFab Technologies</td><td>CT-M3-02</td><td></td></tr><tr><td>Szybka kamera</td><td>Vision Research</td><td>MiroEX2</td><td></td></tr><tr><td>DPhPC lipid w chloroformie</td><td>Avanti</td><td>850356C</td><td>Zamawiany w małych porcjach w fiolkach</td></tr><tr><td>33 mm PVDF filtry, 0,2 i mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 1 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14823434</td><td></td></tr><tr><td>n-Decane</td><td>Acros Organics</td><td>111871000</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Acros Organics</td><td>410950010</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9084958</td><td></td></tr><tr><td>1/8 cala Akryl</td><td>McMaster Carr</td><td>8560K239</td><td>Projekty CAD dla komory w kształcie nieskończoności są dostępne na życzenie</td></tr><tr><td>0,2 mm Akryl</td><td>Astra Products</td><td>Clarex clear 001</td><td></td></tr><tr><td>Cement akrylowy</td><td>TAP Plastics</td><td>10693</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 495 Superglue</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9011323</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 3494 Wzmacniający UV klej</td><td>Strobele Dostawa</td><td>30765</td><td></td></tr><tr><td>Kauczuk naturalny</td><td>McMaster Carr</td><td>85995K14</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowe projekty CAD na scenie</td> domowej <td>roboty</td><td>są</td><td>dostępne na życzenie</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Biologia syntetyczna z dołu prezentuje nowatorskie podejście do badania i odtwarzania systemów biochemicznych oraz, potencjalnie, minimalnych organizmów. Ta rozwijająca się dziedzina angażuje inżynierów, chemików, biologów i fizyków do projektowania i łączenia podstawowych komponentów biologicznych w złożone, działające systemy od podstaw. Takie oddolne systemy mogłyby doprowadzić do opracowania sztucznych komórek na potrzeby podstawowych badań biologicznych i innowacyjnych terapii1,2. Gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) mogą służyć jako platforma modelowa dla biologii syntetycznej ze względu na ich strukturę i rozmiar błony przypominającej komórkę. Natryskiwanie mikroprzepływowe lub mikrojetting to technika, która pozwala na generowanie GUV o kontrolowanym rozmiarze, składzie błony, transbłonowym włączeniu białek i enkapsulacji3. Podstawową zasadą tej metody jest wykorzystanie wielu impulsów płynu o wysokiej częstotliwości generowanych przez piezoaktywowane urządzenie atramentowe w celu deformacji zawieszonej dwuwarstwy lipidowej w GUV. Proces ten jest podobny do wydmuchiwania baniek mydlanych z folii mydlanej. Zmieniając skład roztwóru, skład roztworu otaczającego i/lub składniki zawarte w dwuwarstwie, naukowcy mogą zastosować tę technikę do tworzenia niestandardowych pęcherzyków. W artykule opisano procedurę generowania prostych pęcherzyków z dwuwarstwy interfejsu kropelkowego za pomocą mikrostrumieniowania.

Zbudowaliśmy układ mikroprzepływowego strumieniowania na konwencjonalnym odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym z niestandardowym stolikiem złożonym z obrobionych części i mikrometrów ręcznych (Rycina 1). Charakterystyka dyszy atramentowej pozwala zrozumieć proces generowania pęcherzyków. Zmiana odległości między dyszą a dwuwarstwą lipidową wpływa na siłę przyłożoną w celu wywołania deformacji błony. Bliska odległość od dwuwarstwy skupia strumień cieczy i zapobiega rozpraszaniu energii przez błonę poza ...

Mikroprzepływowe natryskiwanie dwuwarstwy lipidowej na granicy kropelek zapewnia niezawodny sposób generowania pęcherzyków z kontrolą nad asymetrią błony, włączeniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiału. Technika ta może być stosowana do badania różnych systemów biologicznych, w których pożądane są biomolekuły podzielone na przedziały.

Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie pęcherzyków z dwuwarstwy fosfolipidowej z lepszą kontrolą nad błoną, szerokością, molarnością, monodyspersyjnością oraz zawartością wewnętrzną. Z wykorzystaniem systemu CAD wykonano komorę z arkuszy akrylowych i naturalnego kauczuku. Zawieszona dwuwarstwa lipidowa jest tworzona poprzez napełnienie komory lipidami i roztworem.Następnie, w urządzeniu do natrysku konfiguruje się dyszę atramentową zawierającą roztwór do enkapsulacji. Po ustaleniu odpowiednich parametrów, impulsy natryskiwanej cieczy utworzą pęcherzyki z dwuwarstwy lipidowej. W rezultacie mikroprzepływowy natrysk pozwala na uzyskanie powtarzalnych, monodyspersyjnych pęcherzyków dwuwarstwowych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak formowanie elektrostatyczne, emulsyfikacja czy generowanie kropli, jest zwiększony poziom kontroli nad błoną, jednostronną molarnością, monodyspersyjnością oraz zawartością wewnętrzną. Procedurę zaprezentuje Johanna Harrow, studentka studiów magisterskich z laboratorium, a wspierać ją będzie Kara Patel, studentka studiów licencjackich. Używając oprogramowania CAD, narysuj kształt komory, którą można wykona

lipid-bilayer-vesicle-generation-using-microfluidic-jetting

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Generowanie Wezykuli Z Dwuwarstwową Warstwą Lipidową Za Pomocą Mikrofluidowego Strumieniowania

Niniejszy protokół opisuje metodę ekstruzji służącą do przygotowania pęcherzyków lipidowych o rozmiarach submikronowych i wysokim stopniu jednorodności. Metoda ta wykorzystuje system z kontrolą ciśnienia i regulowanym przepływem azotu do przygotowania liposomów. W opracowaniu przedstawiono przygotowanie lipidów1,2, ekstruzję liposomów oraz charakterystykę ich rozmiaru.

Metoda ekstruzji z kontrolowanym stałym ciśnieniem do przygotowania nano-rozmiarowych pęcherzyków lipidowych

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Opisujemy protokół przygotowania dwuwarstw lipidowych i jego charakterystyki za pomocą mikroskopii sił atomowych i spektroskopii sił.

Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Demonstrujemy system tworzenia dwuwarstwowych lipidów, który można przechowywać, przenośny. Dwuwarstwowa błona lipidowa może powstać w ciągu 1 godziny z ponad 80% skutecznością, gdy zamrożony prekursor błony zostanie doprowadzony do temperatury otoczenia. System ten ograniczy pracochłonne procesy i wiedzę specjalistyczną związaną z kanałami jonowymi.

Zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu

Tutaj prezentujemy wspieraną dwuwarstwę lipidową w kontekście platformy mikroprzepływowej do badania interakcji białko-fosfoinozytyd przy użyciu metody bezznacznikowej opartej na modulacji pH.

-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Obecny protokół opisuje montaż liposomów wspomagany oktanolem (OLA), technikę mikroprzepływową do generowania biokompatybilnych liposomów. OLA wytwarza monorozproszone liposomy o rozmiarach mikronów z wydajną enkapsulacją, co pozwala na natychmiastowe eksperymentowanie na chipie. Przewiduje się, że protokół ten będzie szczególnie przydatny w biologii syntetycznej i badaniach nad komórkami syntetycznymi.

Wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii

Prezentacja dwuwarstwowego urządzenia opartego na polidimetylosiloksanie (PDMS) do produkcji bibliotek kombinatorycznych w emulsjach (korkach) typu woda w oleju jest przedstawiona. Niezbędny sprzęt i oprogramowanie wymagane do automatyzacji produkcji zatyczek jest szczegółowo opisane w protokole, a także pokazano produkcję ilościowej biblioteki zatyczek fluorescencyjnych.

Dwuwarstwowe urządzenie mikroprzepływowe do kombinatorycznej produkcji korków

Ten artykuł przedstawia metodę przygotowywania złożonych wielowarstwowo-jednowarstwowych pęcherzyków (cGUVs) o strukturze pęcherzyka w pęcherzyku, z dostosowaną przewodnością elektryczną w regionach wewnętrznym, pierścieniowym i zewnętrznym. Elektroformacja syntetyzuje proste GUV, które są przekształcane w stomatocyty i cGUV za pomocą wstrząsu osmotycznego, zapewniając wartościowy model do badania biofizyki komórek z jądrami.

Synteza złożonych gigantycznych jednowarstwowych pęcherzyków: Biomimetyczny model komórek z jądrem

Poznaj metodę natryskiwania mikroprzepływowego do wytwarzania dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych z precyzyjną kontrolą asymetrii błony i inkorporacji białek.

Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Przeglądaj więcej filmów