Name: Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj metodę natryskiwania mikroprzepływowego do wytwarzania dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych z precyzyjną kontrolą asymetrii błony i inkorporacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Mike'owi Vaheyowi z Laboratorium Fletchera na Uniwersytecie Kalifornijskim w Berkeley za porady dotyczące parametrów mikroodrzutu. Praca ta była sponsorowana przez grant NIH DP2 HL117748-01.

1. Produkcja Komory Nieskończoności
<ol>
	<li>Zaprojektuj komorę nieskończoności (nazwaną tak ze względu na jej kształt) za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) i zapisz plik tak, aby był kompatybilny z wycinarką laserową. Aby utworzyć ten kształt, należy oddzielić dwa okręgi o średnicy 0,183 cala odległością od środka do środka wynoszącą 0,15 cala. Wytnij komorę od 1/8 do 3/16 w przezroczystym akrylu za pomocą wycinarki laserowej. Kształt nieskończoności ułatwia tworzenie dwuwarstwowych warstw i stabilność interfejsu kropel.</li>
	<li>Wywierć otwór 1/16 cala przez krawędź akrylowej komory do studni w kształcie nieskończoności. Powtórz po przeciwnej stronie. Wytnij mały prostokąt z arkusza akrylowego o grubości 0,2 mm za pomocą nożyczek lub wycinarki laserowej, aby służył jako dno studni.</li>
	<li>Nałóż cienką, ale kompletną warstwę szybkoschnącego kleju na jedną stronę akrylu o grubości 0,2 mm i przyklej ją do dna komory. Przytrzymaj akryl o grubości 0,2 mm mocno na miejscu przy dnie komory i dozuj klej na interfejsie, aby klej mógł utworzyć uszczelnienie, ale unikaj zakrywania viewobszar. Pamiętaj, aby wyrównać akryl tak, aby jego krawędź była równo z krawędzią ścianki komory i całkowicie zakrywała wycięcie w komorze nieskończoności. Pozwoli to na wystarczającą penetrację strumienia i zapobiegnie wyciekom ze studni.</li>
	<li>Wytnij dwa małe kawałki kauczuku naturalnego, aby zakryć wywiercone otwory. Nałóż szybkoschnący klej wokół otworu. Umieść gumę na otworze i dociśnij wszystkie obszary za pomocą kleszczy, aby zabezpieczyć. Powtórz te czynności dla obu wywierconych otworów. Upewnij się, że wszystkie połączenia klejone są kompletnymi uszczelnieniami, aby zapobiec wyciekom.</li>
	<li>Za pomocą igły o wadze 23 G, 1 cala przebij otwór w naturalnej gumie po obu stronach komory, aby ułatwić włożenie piezoelektrycznej końcówki do drukarki atramentowej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do eksperymentu
Przechowuj podstawowy roztwór lipidowy w chloroformie w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Do tego badania użyto 1,2-difitanoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DPhPC) lub 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC). W tym protokole zwykle przygotowuje się 2 ml roztworu lipidów o stężeniu 25 mg/ml, który wystarcza na dwa miesiące, jeśli jest przechowywany w temperaturze -20 °C.
<ol>
	<li>Aby ponownie zawiesić lipid w n-dekanie, najpierw przenieś go z fiolki podstawowej do małego szklanego słoika i delikatnie wysusz pod argonem lub azotem. Podczas suszenia trzymaj słoik pod kątem, aby wystawić większą powierzchnię na działanie gazu, umożliwiając szybsze wyschnięcie lipidów.</li>
	<li>Trzymając tylko lekko przykręconą nakrętkę słoika, pozostaw wysuszony roztwór w próżni w eksykatorze na 1-2 godziny. Następnie dodaj n-dekan, aby rozpuścić lipid w stężeniu 25 mg/ml. Krótko zmieszać roztwór lipidowy i poddać go sonikacji w kąpieli sonikatora przez 15 minut. Odtworzony lipid należy przechowywać w n-dekanie w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotuj podstawowy roztwór sacharozy. Do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml dodać 900 μl 300 mM sacharozy i 100 μl 1% metylocelulozy (MC). Metyloceluloza jest dodawana w celu zwiększenia lepkości roztworu, co pomaga w natryskiwaniu. Opcjonalny krok: Dodaj opcjonalnie 1 μl ciemnego barwnika spożywczego lub kulek fluorescencyjnych, aby nadać odpowiednio większy kontrast lub fluorescencję podczas obrazowania. Roztwór ten jest roztworem sacharozy o stężeniu 300 mOsm, zaprojektowanym w celu dopasowania osmolarności komórkowej i zapewnienia kontrastu podczas mikrostrumieniowania.</li>
	<li>Pobrać roztwór do jednorazowej plastikowej strzykawki o pojemności 1 ml. Trzymając strzykawkę końcówką skierowaną do góry, kilkakrotnie przesuwaj trzonek, aby usunąć wszelkie pęcherzyki w kierunku końcówki, a następnie naciśnij tłok, aby wyrzucić uwięzione powietrze. Należy pamiętać o usunięciu całego powietrza ze strzykawki przed kontynuowaniem, ponieważ będzie to zakłócać prawidłowy skurcz piezoelektryczny odpowiedzialny za natryskiwanie.</li>
	<li>Zainstalować filtr 0,22 μm na końcu strzykawki. Aby zapobiec uwięzieniu powietrza w filtrze, należy trzymać strzykawkę pionowo i naciskać tłok, aż nad końcówką utworzy się kropla. Uwaga: Stwierdzono, że najlepiej sprawdza się filtr strzykawkowy o średnicy 33 mm, ale w celu zmniejszenia martwej objętości można użyć alternatywnych filtrów, tak małych, jak filtr strzykawkowy o średnicy 3 mm.</li>
	<li>Odkręć żeński adapter Luer drukarki atramentowej i mocno dociśnij go na końcu filtra. Ponownie wyrzuć płyn, aby zapobiec uwięzieniu powietrza. Wkręć górną część drukarki atramentowej. Płyn powinien przedostać się do końcówki drukarki atramentowej po jej całkowitym przymocowaniu.</li>
</ol>
3. Przygotowanie sprzętu
<ol>
	<li>Za pomocą zacisku V clamp zamontuj zespół strzykawki na stoliku mikroskopu. Podłącz przewód z drukarki atramentowej do kontrolera drukarki atramentowej. Uwaga: Dla tego protokołu zbudowano niestandardową scenę; Chociaż projekt stolika może być określony przez użytkownika, bardzo ważne jest, aby mieć niezależną kontrolę XY-Z nad strzykawką i kontrolę X-Y nad uchwytem próbki.</li>
	<li>Określ powiększenie i niezbędną kombinację soczewek, aby uzyskać pożądane obrazowanie. Tutaj używany jest obiektyw 10X i okular 10X.</li>
	<li>Użyj szybkiej kamery (≥1,000 kl./s), aby zobrazować natryskiwanie i generowanie pęcherzyków. Przed przystąpieniem do obrazowania należy przeprowadzić niezbędną kalibrację aparatu. Wykorzystaj automatyczne wyzwalanie oparte na obrazie w oprogramowaniu aparatu, aby zainicjować przechwytywanie obrazu.</li>
	<li>Zamontuj komorę nieskończoności na stoliku mikroskopu. Zabezpiecz komorę, przyklejając ją taśmą na miejscu na scenie.</li>
	<li>Ostrożnie wyrównaj końcówkę drukarki atramentowej z otworem przebitym w kauczuku naturalnym (patrz Rysunek 1b). Aby to zrobić, zbliż drukarkę atramentową do komory i wyreguluj położenie na oko, a następnie dokonaj bardziej precyzyjnych regulacji za pomocą soczewki mikroskopu. Postępuj ostrożnie, ponieważ zgrubne ruchy mogą uszkodzić końcówkę drukarki atramentowej.</li>
	<li>Po wyrównaniu drukarki atramentowej cofnij zespół strzykawki z dala od komory, aby zapobiec uszkodzeniu drukarki atramentowej podczas ładowania studzienek. Upewnij się, że ruch drukarki atramentowej jest jednokierunkowy, tak aby pozostał wyrównany z otworem w membranie.</li>
	<li>Delikatnie nacisnąć tłok zespołu strzykawki, aż na dyszy drukarki atramentowej utworzy się mała kropelka. Zapewni to pewne początkowe ciśnienie wsteczne.</li>
	<li>Wprowadź parametry natryskiwania. W przypadku trapezowej fali bipolarnej należy użyć następujących parametrów: częstotliwość impulsów 20 kHz, czas narastania 3 μs, czas trwania impulsu 35 μs, czas opadania 3 μs, napięcie przyłożone 65 V (amplituda impulsu) i 100 impulsów strumieniowych na wyzwolenie (liczba impulsu). Jednak przyłożone napięcie (amplituda impulsu) i liczba impulsów (impulsy strumieniowe na wyzwalanie) mogą być zmieniane w celu kontrolowania wielkości pęcherzyków.</li>
</ol>
4. Wytwarzanie pęcherzyków
<ol>
	<li>Dodać 25-30 μl roztworu lipidowego zawieszonego w n-dekanie do komory nieskończoności, pokrywając całą powierzchnię obu studzienek.</li>
	<li>Dodać 25 μl glukozy (o takiej samej osmolarności jak roztwór sacharozy) do najbardziej zewnętrznej krawędzi jednego dołka, pipetując powoli i płynnie. Po osadzeniu powinna powstać kropla glukozy, ponieważ roztwór glukozy i lipidów nie mieszają się. Dodaj kolejne 25 μl glukozy do przeciwległej studzienki, która utworzy kolejną kroplę i utworzy dwuwarstwową błonę lipidową na środku komory w ciągu 5-10 minut.</li>
	<li>Włóż atrament przez kauczuk naturalny i ostrożnie poprowadź go w kierunku dwuwarstwy interfejsu kropel. Zbliżaj się do dwuwarstwy powoli, ponieważ wprowadzony druk atramentowy przesunie objętość i może rozerwać dwuwarstwę.</li>
	<li>Gdy drukarka atramentowa znajdzie się w zakresie ~200 μm, zastosuj natryskiwanie z ustawieniami opisanymi w kroku 3.8. Odległość od dwuwarstwy może się różnić przede wszystkim w zależności od napięcia i liczby impulsów, a także innych parametrów. Protokół ten zaleca powolne zwiększanie ustawień (napięcie i liczba impulsów) oraz obserwację deformacji dwuwarstwowej.</li>
</ol>
5. Czyszczenie sprzętu
<ol>
	<li>Odłączyć zespół strzykawki od stolika mikroskopowego i wyrzucić plastikową strzykawkę o pojemności 1 ml oraz filtr.</li>
	<li>Aby wyczyścić drukarkę atramentową, zasysaj kolejno następujące roztwory, zanurzając końcówkę w roztworze 7-10 razy każdy: 70% etanolu, 2% roztworu Neutrad w ciepłej wodzie, 70% etanolu i ddH2O. Jeśli drukarka atramentowa nie przylega bezpiecznie do pipety aspiracyjnej, odetnij końcówkę pipety, aby utworzyć adapter.</li>
	<li>Osusz komorę chusteczką. Umieść komorę nieskończoności w zlewce o pojemności 250 ml z 2% v/v Neutrad w ciepłej wodzie i poddawaj sonikę przez 5-10 minut. Po sonikacji dokładnie wysuszyć studzienki pod sprężonym powietrzem. Wilgoć w studzienkach może zagrozić stabilności dwuwarstwowej membrany lipidowej, dlatego zaleca się również umieszczenie komór w piecu w temperaturze 60 °C na 15 minut.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+under+construction%3A+in+vitro+reconstitution+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).</li>
<li>Yeh, B. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+lessons+from+the+history+of+synthetic+organic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).</li>
<li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition%2C+asymmetry%2C+and+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Soc.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).</li>
<li>Liu, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-induced+bundling+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Phys%22%5BJournal%5D)">Membrane-induced bundling of actin filaments.</a> Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).</li>
<li>Brown, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+tropicalis+egg+extracts+provide+insight+into+scaling+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle.</a> J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320, 789-792 (2008).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Disc.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Liposome electroformation.</a> Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).</li>
<li>Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+Vesicles+as+Biochemical+Compartments%3A+The+Use+of+Microinjection+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques.</a> Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).</li>
<li>Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+emulsion+templated+monodisperse+phospholipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles.</a> Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).</li>
<li>Matosevic, S., Paegel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+Synthesis+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+a+Microfluidic+Assembly+Line%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).</li>
<li>Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Fabrication+of+Asymmetric+Giant+Lipid+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Inter%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles.</a> ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).</li>
<li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+droplet+interface+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).</li>
<li>Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+formation+of+unilamellar+lipid+vesicles+for+cell-like+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation.</a> Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).</li>
<li>Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+unilamellar+vesicle+electroformation+from+lipid+mixtures+to+native+membranes+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions.</a> Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).</li>
<li>Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+control+of+giant+unilamellar+vesicles+prepared+from+inverted+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets.</a> J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).</li>
<li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet Microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li>
<li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).</li>
<li>Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-coated+microdroplet+array+for+in+vitro+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis.</a> Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).</li>
<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+serves+as+a+membrane+domain+switch+in+model+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers.</a> Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opracowano wiele technik generowania pęcherzyków, w tym elektroformację, emulsję i generowanie kropelek14-16. Niezbędne są jednak nowe techniki eksperymentalne, aby umożliwić projektowanie systemów biologicznych o rosnącym podobieństwie do systemów żywych. W szczególności metody mikroprzepływowe zapewniły zwiększony poziom kontroli nad jednowarstwowością błony, monodyspersją wielkości i zawartością wewnętrzną17,18, zbliżając modele pęcherzyków do biologii. Ponadto charakterystyka i eksperymenty z wy...

Staje się coraz bardziej jasne, że biologia komórki to wieloskalowy problem, który wymaga integracji naszego zrozumienia od molekuł do komórek. W związku z tym dokładna wiedza o tym, jak cząsteczki działają indywidualnie, nie wystarcza do zrozumienia złożonych zachowań komórkowych. Wynika to częściowo z istnienia emergentnych zachowań układów wieloskładnikowych, czego przykładem jest odtworzenie interakcji sieci aktynowej z pęcherzykami lipidowymidwuwarstwowymi 4, montaż wrzeciona mitotycznego w ekstrakcie Xenopus 5 oraz dynamika przestrzenna maszynerii podziału komórek bakteryjnych6. Jednym ze sposobów uzupełnienia redukcjonistycznego podejścia do analizowania procesów molekularnych w systemach żywych jest przyjęcie odwrotnego podejścia polegającego na rekonstrukcji zachowań komórkowych przy użyciu minimalnego zestawu składników biologicznych. Kluczowym elementem tego podejścia jest niezawodna enkapsulacja biomolekuł w ograniczonej objętości, co jest kluczową cechą komórki.
Istnieje kilka strategii hermetyzacji biomolekuł do badania systemów biomimetycznych. Najbardziej istotnym biologicznie systemem są dwuwarstwowe błony lipidowe, które naśladują biochemiczne i fizyczne ograniczenia narzucone przez błonę plazmatyczną komórki. Tworzenie gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV) przez elektroformację7, jedną z najczęściej stosowanych technik wytwarzania GUV14, zwykle ma niską wydajność enkapsulacji ze względu na niekompatybilność z buforem o wysokiej zawartości soli8. Elektroformacja wymaga również dużych objętości próbek (>100 μl), co może stanowić problem w pracy z oczyszczonymi białkami i nieefektywnie włącza duże cząsteczki ze względu na trudności w dyfuzji między blisko rozmieszczonymi warstwami lipidowymi. Opracowano kilka mikroprzepływowych podejść do generowania pęcherzyków lipidowych. Metody podwójnej emulsji, które przepuszczają składniki przez dwa interfejsy między warstwami woda-olej-woda (W/O/W), polegają na odparowaniu lotnego rozpuszczalnika w celu stymulowania tworzenia dwuwarstw lipidowych9. Inni wykorzystali mikroprzepływową linię montażową, która wytwarza ciągły strumień dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych10 lub w dwóch niezależnych krokach11. Opracowaliśmy alternatywną technikę opartą na szybkim stosowaniu impulsów płynu do dwuwarstwy12 na granicy kropel w celu wytworzenia GUV o kontrolowanym rozmiarze, składzie i enkapsulacji. Nasze podejście, znane jako natryskiwanie mikroprzepływowe, oferuje połączone korzyści z kilku istniejących technik generowania pęcherzyków, zapewniając podejście do tworzenia funkcjonalnych systemów biomolekularnych do badania różnych problemów biologicznych.

<table><tbody><tr><td>Piezoelektryczna drukarka atramentowa</td><td>MicroFab Technologies</td><td>MJ-AL-01-xxx</td><td>xxx oznacza średnicę kryzy w mikronach</td></tr><tr><td>Sterownik Jet Drive III</td><td>MicroFab Technologies</td><td>CT-M3-02</td><td></td></tr><tr><td>Szybka kamera</td><td>Vision Research</td><td>MiroEX2</td><td></td></tr><tr><td>DPhPC lipid w chloroformie</td><td>Avanti</td><td>850356C</td><td>Zamawiany w małych porcjach w fiolkach</td></tr><tr><td>33 mm PVDF filtry, 0,2 i mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 1 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14823434</td><td></td></tr><tr><td>n-Decane</td><td>Acros Organics</td><td>111871000</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Acros Organics</td><td>410950010</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9084958</td><td></td></tr><tr><td>1/8 cala Akryl</td><td>McMaster Carr</td><td>8560K239</td><td>Projekty CAD dla komory w kształcie nieskończoności są dostępne na życzenie</td></tr><tr><td>0,2 mm Akryl</td><td>Astra Products</td><td>Clarex clear 001</td><td></td></tr><tr><td>Cement akrylowy</td><td>TAP Plastics</td><td>10693</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 495 Superglue</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9011323</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 3494 Wzmacniający UV klej</td><td>Strobele Dostawa</td><td>30765</td><td></td></tr><tr><td>Kauczuk naturalny</td><td>McMaster Carr</td><td>85995K14</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowe projekty CAD na scenie</td> domowej <td>roboty</td><td>są</td><td>dostępne na życzenie</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Biologia syntetyczna z dołu prezentuje nowatorskie podejście do badania i odtwarzania systemów biochemicznych oraz, potencjalnie, minimalnych organizmów. Ta rozwijająca się dziedzina angażuje inżynierów, chemików, biologów i fizyków do projektowania i łączenia podstawowych komponentów biologicznych w złożone, działające systemy od podstaw. Takie oddolne systemy mogłyby doprowadzić do opracowania sztucznych komórek na potrzeby podstawowych badań biologicznych i innowacyjnych terapii1,2. Gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV) mogą służyć jako platforma modelowa dla biologii syntetycznej ze względu na ich strukturę i rozmiar błony przypominającej komórkę. Natryskiwanie mikroprzepływowe lub mikrojetting to technika, która pozwala na generowanie GUV o kontrolowanym rozmiarze, składzie błony, transbłonowym włączeniu białek i enkapsulacji3. Podstawową zasadą tej metody jest wykorzystanie wielu impulsów płynu o wysokiej częstotliwości generowanych przez piezoaktywowane urządzenie atramentowe w celu deformacji zawieszonej dwuwarstwy lipidowej w GUV. Proces ten jest podobny do wydmuchiwania baniek mydlanych z folii mydlanej. Zmieniając skład roztwóru, skład roztworu otaczającego i/lub składniki zawarte w dwuwarstwie, naukowcy mogą zastosować tę technikę do tworzenia niestandardowych pęcherzyków. W artykule opisano procedurę generowania prostych pęcherzyków z dwuwarstwy interfejsu kropelkowego za pomocą mikrostrumieniowania.

Zbudowaliśmy układ mikroprzepływowego strumieniowania na konwencjonalnym odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym z niestandardowym stolikiem złożonym z obrobionych części i mikrometrów ręcznych (Rycina 1). Charakterystyka dyszy atramentowej pozwala zrozumieć proces generowania pęcherzyków. Zmiana odległości między dyszą a dwuwarstwą lipidową wpływa na siłę przyłożoną w celu wywołania deformacji błony. Bliska odległość od dwuwarstwy skupia strumień cieczy i zapobiega rozpraszaniu energii przez błonę poza ...

Mikroprzepływowe natryskiwanie dwuwarstwy lipidowej na granicy kropelek zapewnia niezawodny sposób generowania pęcherzyków z kontrolą nad asymetrią błony, włączeniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiału. Technika ta może być stosowana do badania różnych systemów biologicznych, w których pożądane są biomolekuły podzielone na przedziały.

Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie pęcherzyków z dwuwarstwy fosfolipidowej z lepszą kontrolą nad błoną, szerokością, molarnością, monodyspersyjnością oraz zawartością wewnętrzną. Z wykorzystaniem systemu CAD wykonano komorę z arkuszy akrylowych i naturalnego kauczuku. Zawieszona dwuwarstwa lipidowa jest tworzona poprzez napełnienie komory lipidami i roztworem.Następnie, w urządzeniu do natrysku konfiguruje się dyszę atramentową zawierającą roztwór do enkapsulacji. Po ustaleniu odpowiednich parametrów, impulsy natryskiwanej cieczy utworzą pęcherzyki z dwuwarstwy lipidowej. W rezultacie mikroprzepływowy natrysk pozwala na uzyskanie powtarzalnych, monodyspersyjnych pęcherzyków dwuwarstwowych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak formowanie elektrostatyczne, emulsyfikacja czy generowanie kropli, jest zwiększony poziom kontroli nad błoną, jednostronną molarnością, monodyspersyjnością oraz zawartością wewnętrzną. Procedurę zaprezentuje Johanna Harrow, studentka studiów magisterskich z laboratorium, a wspierać ją będzie Kara Patel, studentka studiów licencjackich. Używając oprogramowania CAD, narysuj kształt komory, którą można wykonać z akrylu za pomocą wycinarki laserowej; następnie wywierć otwory o średnicy 1/16 cala na obu stronach złożonej komory akrylowej. Pozwoli to na odpływ do studzienki w kształcie nieskończoności.Po drugie, wytnij nożyczkami mały prostokąt z arkusza akrylu o grubości 0,2 mm, który będzie służył jako dno kształtu nieskończoności. Przymocuj go w tym miejscu za pomocą szybko schnącego kleju, dbając o to, aby nie zabrudzić klejem obszarów widocznych. Arkusz akrylu powinien przylegać do ścianki komory i być stabilnie przymocowany do jej dna.Po trzecie, użyj szybko schnącego kleju, aby przykleić cienki kawałek arkusza z naturalnego kauczuku nad wywierconymi otworami. Docisnąć je pęsetą. Sprawdzić szczelność wszystkich klejonych szwów.Nie powinno być ich wcale. Na koniec, używając igły o rozmiarze 23 G, należy wykonać otwory w gumie poprzez wywiercone wcześniej otwory; przez te otwory zostanie włożona końcówka piezoelektrycznego drukującego atramentem. Komercyjne fosfolipidy należy rozpuścić w chloroformie i przechowywać w temperaturze -20 °C.W tej demonstracji wykorzystano lipidy D-P-H-P-C lub DOPC. Lipidy rozpuszczone w chloroformie przenosi się do szklanej fiolki, trzymając ją pod kątem, a następnie delikatnie osuszają pod strumieniem argonu lub azotu.Następnie umieść fiolkę z lekko poluzowanym nakrętką w próżni przez jedną do dwóch godzin, aby usunąć pozostałości rozpuszczalnika. Na tym etapie można również zastosować deskryptor. Teraz rozpuść lipidy w odpowiednim buforze, aby uzyskać końcowe stężenie lipidów wynoszące 25 mg/mL.Wymieszaj roztwór w vortexie. Krótko uszczelnij nakrętkę za pomocą parafiny, a następnie poddaj sonikacji przez 15 minut. Przechowuj ten roztwór w temperaturze -20°C.Następnie należy przygotować roztwór zapasowy sacharozy o osmolarności zbliżonej do fizjologicznej. Jest to roztwór do natrysku. W celu zwiększenia kontrastu lub uzyskania fluorescencji można dodać do roztworu kroplę ciemnego barwnika spożywczego lub kuleczki fluorescencyjne.Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem sacharozy, aby usunąć uwięzione powietrze. Stuknij w strzykawkę, aby pęcherzyki powietrza wyniosły się do otworu wlewu i mogły zostać usunięte. Następnie przymocuj do strzykawki filtr o średnicy 33 mm i porach 0,22 µm i wypchnij jedną kroplę przez filtr.Teraz odkręć adapter żeński druku atramentowego i dociśnij go do końca filtra. Wytłocz niewielką ilość cieczy, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Na koniec przymocuj strzykawkę do górnej części cieczy w drukarce atramentowej.Jeśli strzykawka została prawidłowo podłączona, ciecz powinna dotrzeć do końcówki drukarki atramentowej. Najpierw zamocuj zespół strzykawki do stolika mikroskopu i podłącz kontroler drukarki atramentowej dla tego eksperymentu. Stolik i strzykawka wymagają niezależnego sterowania, przy czym oba elementy muszą poruszać się w trzech wymiarach w celu wizualizacji.Przygotuj kamerę wysokich prędkości zdolną do rejestrowania co najmniej 1000 klatek na sekundę. Skonfiguruj ją tak, aby korzystała z automatycznego wyzwalania opartego na obrazie w celu rozpoczęcia nagrań. Następnie przymocuj komorę do stołu za pomocą taśmy i ostrożnie wyrównaj końcówkę drukarki atramentowej z otworem wykonanym w gumowej membranie po boku komory.Najpierw ustawić pozycję „na oko”, a następnie dokonać precyzyjnej regulacji za pomocą mikroskopu. Po wyrównaniu, wycofać strzykawkę wzdłuż jednej osi, aby załadować kształt nieskończoności. Następnie delikatnie nacisnąć tłok, aby na dyszy utworzyła się kropla.Zapewnia to początkowe ciśnienie wsteczne. Należy ustawić parametry strumieniowania. Następnie na ekranie zostaną wyświetlone konkretne wartości dla trapezoidalnej fali bipolarnej; przyłożone napięcie oraz liczba impulsów strumieniowania na wyzwalacz kontrolują rozmiar pęcherzyków.Następnie napełnij komorę od 25 do 30 µL roztworu lipidów w odpowiednim czasie, pokrywając całą powierzchnię kształtu nieskończoności. Następnie do każdej studzienki dodaj 25 µL roztworu glukozy na zewnętrzną krawędź, pipetując powoli i płynnie; glukoza nie powinna zmieszać się z roztworem lipidów. W ciągu 10 minut w centrum komory utworzy się lipidowa dwuwarstwa.Przygotowanie dwuwarstwy jest najkrytyczniejszym etapem, ponieważ jest ona niestabilna i może ulec przerwaniu w zależności od sposobu przygotowania. Należy zachować cierpliwość. Procedura uda się po kilkukrotnym przećwiczeniu napełniania komory.Następnie ostrożnie wprowadź końcówkę drukarki atramentowej z powrotem do komory, gdy końcówka znajduje się w odległości 200 mikronów od interfejsu kropli. Rozpocznij proces wydzielania kropel z dwuwarstwy i zarejestruj dane; wykorzystanie drukarki atramentowej pozwoliło uzyskać wgląd w proces generowania pęcherzyków. Przykładowo, zmiana odległości między dyszą drukarki atramentowej a dwuwarstwą lipidową wpływała na siłę odkształcającą błonę. Zamknij.Bliskość dwuwarstwy skupiła strumień jetu i zapobiegła rozpraszaniu energii przez błonę poza punkt generowania pęcherzyka. Ponadto zasięg wiru zwiększał się wraz z napięciem przyłożonym do aktuatora piezoelektrycznego. Proces tworzenia pęcherzyków zobrazowano jako sekwencję zdarzeń następujących po ich powstaniu.Stabilność pęcherzyków miała tendencję do zmiany w zależności od ich średnicy, przy czym mniejsze pęcherzyki były bardziej stabilne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak generować pęcherzyki lipidowe z wykorzystaniem mikrofluidycznego strumieniowania.

lipid-bilayer-vesicle-generation-using-microfluidic-jetting

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Generowanie Wezykuli Z Dwuwarstwową Warstwą Lipidową Za Pomocą Mikrofluidowego Strumieniowania

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Opisujemy protokół przygotowania dwuwarstw lipidowych i jego charakterystyki za pomocą mikroskopii sił atomowych i spektroskopii sił.

Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Demonstrujemy system tworzenia dwuwarstwowych lipidów, który można przechowywać, przenośny. Dwuwarstwowa błona lipidowa może powstać w ciągu 1 godziny z ponad 80% skutecznością, gdy zamrożony prekursor błony zostanie doprowadzony do temperatury otoczenia. System ten ograniczy pracochłonne procesy i wiedzę specjalistyczną związaną z kanałami jonowymi.

Zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

Tutaj prezentujemy wspieraną dwuwarstwę lipidową w kontekście platformy mikroprzepływowej do badania interakcji białko-fosfoinozytyd przy użyciu metody bezznacznikowej opartej na modulacji pH.

-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Obecny protokół opisuje montaż liposomów wspomagany oktanolem (OLA), technikę mikroprzepływową do generowania biokompatybilnych liposomów. OLA wytwarza monorozproszone liposomy o rozmiarach mikronów z wydajną enkapsulacją, co pozwala na natychmiastowe eksperymentowanie na chipie. Przewiduje się, że protokół ten będzie szczególnie przydatny w biologii syntetycznej i badaniach nad komórkami syntetycznymi.

Wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii

Prezentacja dwuwarstwowego urządzenia opartego na polidimetylosiloksanie (PDMS) do produkcji bibliotek kombinatorycznych w emulsjach (korkach) typu woda w oleju jest przedstawiona. Niezbędny sprzęt i oprogramowanie wymagane do automatyzacji produkcji zatyczek jest szczegółowo opisane w protokole, a także pokazano produkcję ilościowej biblioteki zatyczek fluorescencyjnych.

Dwuwarstwowe urządzenie mikroprzepływowe do kombinatorycznej produkcji korków

Ten artykuł przedstawia metodę przygotowywania złożonych wielowarstwowo-jednowarstwowych pęcherzyków (cGUVs) o strukturze pęcherzyka w pęcherzyku, z dostosowaną przewodnością elektryczną w regionach wewnętrznym, pierścieniowym i zewnętrznym. Elektroformacja syntetyzuje proste GUV, które są przekształcane w stomatocyty i cGUV za pomocą wstrząsu osmotycznego, zapewniając wartościowy model do badania biofizyki komórek z jądrami.

Synteza złożonych gigantycznych jednowarstwowych pęcherzyków: Biomimetyczny model komórek z jądrem

Poznaj metodę natryskiwania mikroprzepływowego do wytwarzania dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych z precyzyjną kontrolą asymetrii błony i inkorporacji białek.

Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Przeglądaj więcej filmów