Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego
21 lutego 2014
Mikroprzepływowe natryskiwanie dwuwarstwy lipidowej na granicy kropelek zapewnia niezawodny sposób generowania pęcherzyków z kontrolą nad asymetrią błony, włączeniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiału. Technika ta może być stosowana do badania różnych systemów biologicznych, w których pożądane są biomolekuły podzielone na przedziały.
Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie dwuwarstwowych pęcherzyków fosfolipidowych o zwiększonej kontroli nad błoną, unla, molowością, monodyspersją i zawartością wewnętrzną. Za pomocą cad komora jest wytwarzana z arkuszy akrylowych i kauczuku naturalnego. Zawieszona dwuwarstwa lipidowa jest wytwarzana przez obciążenie komory lipidami i roztworem.
Następnie drukarka atramentowa zawierająca roztwór, który ma być kapsułkowana, jest ustawiana za pomocą aparatu do natryskiwania. Po ustaleniu odpowiednich ustawień, impulsy płynu będą wytwarzać dwuwarstwowe pęcherzyki lipidowe. Ostatecznie, natryskiwanie mikroprzepływowe daje powtarzalne mono rozproszone pęcherzyki dwuwarstwowe.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak elektroformacja, emulsja lub generowanie kropel, jest zwiększony poziom kontroli nad membraną, jednostronną molowością, monodyspersją i zawartością wewnętrzną. Procedurę zademonstruje Johanna Harrow, doktorantka z laboratorium, a asystować jej będzie Kara Patel, studentka studiów licencjackich Korzystając z oprogramowania CAD, narysuj kształt komory, który można wykonać z akrylu za pomocą pierwszego wiertła do wycinarki laserowej, jeden 16-calowy otwór po obu stronach zmontowanej komory akrylowej. To spłynie do nieskończoności w kształcie studni.
Po drugie, wytnij mały prostokąt nożyczkami z arkusza akrylowego o grubości 0,2 milimetra, aby posłużył jako spód kształtu nieskończoności. Dobrze zabezpiecz to na miejscu za pomocą szybkoschnącego kleju, uważając, aby nie dostać się klejem do viewobszary. Arkusz akrylowy należy zlicować ze ścianą komory i przymocować do dna komory.
Po trzecie, użyj szybkoschnącego kleju, aby przykleić cienki kawałek arkusza kauczuku naturalnego na wywiercone otwory. Dociśnij je na miejsce pęsetą. Przetestuj wszystkie klejone szwy pod kątem wycieków.
Nie powinno ich być. Na koniec, za pomocą igły o rozmiarze 23, wbij otwory w gumie przez wywiercone otwory, piezoelektryczna końcówka atramentowa zostanie włożona przez te otwory. Podstawowe fosfolipidy należy rozpuścić w chloroformie i przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.
D-P-H-P-C lub DOPC. W tej demonstracji wykorzystano lipidy. Lipidy rozpuszczone w chloroformie przenosi się do szklanej fiolki, trzymając fiolkę pod kątem, delikatnie wysuszyć lipidy pod argonem lub azotem.
Następnie umieścić fiolkę z lekko luźnym wieczkiem w próżni na jedną do dwóch godzin, aby usunąć pozostałości rozpuszczalnika. Na tym etapie można również użyć środka osuszającego. Teraz rozpuść lipidy w końcowym tarasie, aby uzyskać końcowe stężenie lipidów 25 miligramów na mililitr.
Wiruj roztwór. Na krótko uszczelnij nakrętkę za pomocą param, a następnie sonikuj przez 15 minut. Przechowuj ten roztwór w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.
Następnie przygotuj podstawowy roztwór sacharozy o fizjologicznej osmolarności. To jest rozwiązanie do natryskiwania. Rozważ dodanie kropli ciemnego barwnika spożywczego lub koralików fluorescencyjnych do roztworu, aby uzyskać dodatkowy kontrast lub fluorescencję.
Załaduj roztwór sacharozy do jednomililitrowej strzykawki, aby usunąć uwięzione powietrze. Potrząśnij strzykawką, aby wszelkie bąbelki uniosły się do otworu przynęty i mogły zostać wydalone. Następnie podłącz 33-milimetrowy filtr 0,22 mikrona do strzykawki i wypchnij jedną kroplę przez filtr.
Teraz odkręć żeński adapter przynęty atramentowej i dociśnij go do końca filtra. Wypchnij trochę płynu, aby usunąć uwięzione powietrze. Na koniec przymocuj strzykawkę do górnej części płynu do drukarek atramentowych.
Powinien przesunąć się do końcówki drukarki atramentowej, jeśli strzykawka została prawidłowo podłączona. Najpierw zamontuj zespół strzykawki na stoliku mikroskopu i podłącz kontroler drukarki atramentowej do tego eksperymentu. Stolik i strzykawka wymagają niezależnego sterowania, przy czym stolik i strzykawka poruszają się w trzech wymiarach w celu wizualizacji.
Skonfiguruj kamerę o dużej szybkości, która może rejestrować co najmniej 1000 klatek na sekundę. Ustaw go tak, aby używał automatycznego wyzwalania opartego na obrazie do inicjowania nagrań. Teraz przymocuj komorę do stolika taśmą i ostrożnie wyrównaj końcówkę atramentu z otworem wykonanym w gumowym arkuszu z boku komory.
Najpierw wyreguluj na oko, a następnie dokonaj precyzyjnych regulacji za pomocą mikroskopu. Po wyrównaniu wysuń strzykawkę wzdłuż jednego wymiaru, aby załadować kształt nieskończoności. Cóż, następnie delikatnie dociśnij tłok, aby na dyszy utworzyła się kropla.
Zapewnia to pewne początkowe ciśnienie wsteczne. Należy ustawić parametry natryskiwania. Kolejne konkretne wartości dla trapezoidalnej fali bipolarnej są prezentowane na ekranie napięcia przyłożonego do napięcia i liczby impulsów strumieniowych na wielkość pęcherzyka sterującego spustem.
Teraz załaduj komorę 25 do 30 mikrolitrami roztworu lipidowego pod koniec dekady, pokrywając całą powierzchnię ukształtowanej nieskończoności. Cóż, do każdego z nich dodaj 25 mikrolitrów roztworu glukozy do najbardziej zewnętrznej krawędzi, pipetując powoli i płynnie, glukoza nie powinna mieszać się z roztworem lipidowym. W ciągu 10 minut w środku komory utworzy się dwuwarstwa lipidowa.
Ustawienie dwuwarstwy jest najbardziej krytycznym krokiem, ponieważ dwuwarstwa jest niestabilna i może się zepsuć w zależności od przygotowania. Uzbrój się w cierpliwość. To zadziała, gdy poćwiczysz napełnianie komory kilka razy.
Teraz ostrożnie włóż końcówkę atramentową z powrotem do komory, gdy końcówka znajdzie się w odległości 200 mikronów od interfejsu kropli. Dwuwarstwowy, rozpocznij proces natryskiwania i zapisz dane za pomocą drukarki atramentowej, która zapewnia wgląd w proces generowania pęcherzyków. Na przykład zmiana odległości między dyszą atramentową a dwuwarstwą lipidową wpłynęła na siłę, która deformuje membranę. Zamykać.
Bliskość dwuwarstwy skupiała prąd strumieniowy i zapobiegała rozpraszaniu energii przez membranę z dala od punktu powstawania pęcherzyków. Również ruch wirowy zwiększał się wraz z napięciem przyłożonym do siłownika elektrycznego pizo. Powstawanie pęcherzyków zostało zobrazowane jako sekwencja zdarzeń następujących po ich powstaniu.
Stabilność pęcherzyków miała tendencję do zmieniania się w zależności od średnicy pęcherzyka, przy czym mniejsze pęcherzyki były bardziej stabilne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować pęcherzyki naruszające lipidy za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł omawia metodę generowania pęcherzyków dwuwarstwy lipidowej za pomocą przepływu mikrofluidalnego przeciwko interfejsowi kropli dwuwarstwy lipidowej. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę nad asymetrią błony, wbudowywaniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiałów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biofizyka
- Biotechnologia
Tło
- Pęcherzyki dwuwarstwy lipidowej są niezbędne do badania skomponowananych biocząsteczek.
- Techniki mikrofluidalne poprawiają powtarzalność i kontrolę formowania pęcherzyków.
- Zrozumienie właściwości błon jest kluczowe dla różnych zastosowań biologicznych.
- Technologia przepływu może usprawnić proces generowania pęcherzyków.
Cel badania
- Generowanie pęcherzyków o kontrolowanych właściwościach błony.
- Ułatwienie wbudowywania określonych białek w dwuwarstwie.
- Umożliwienie enkapsulacji różnych materiałów do celów badawczych.
Zastosowane metody
- Wykonanie komory z arkuszy akrylu i naturalnej gumy.
- Wytworzenie zawieszonej dwuwarstwy lipidowej przez załadowanie komory lipidami i roztworem.
- Ustawienie urządzenia drukującego atramentami do enkapsulacji roztworów.
- Ustalenie odpowiednich ustawień dla impulsów płynu wtryskowanego w celu utworzenia pęcherzyków.
Główne wyniki
- Przepływ mikrofluidalny produkuje powtarzalne, jednorodne pęcherzyki dwuwarstwy.
- Metoda umożliwia precyzyjną kontrolę nad właściwościami pęcherzyków.
- Enkapsulacja materiałów jest osiągana skutecznie.
- Pęcherzyki mogą być dostosowane do różnych badań biologicznych.
Wnioski
- Przepływ mikrofluidalny jest niezawodną techniką do generowania pęcherzyków.
- Kontrola nad asymetrią błony i wbudowywaniem białek jest zwiększona.
- Ta metoda ma istotne znaczenie dla badania skomponowananych biocząsteczek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Microfluidic jetting enables precise control over lipid bilayer vesicle generation, supporting reproducible production of giant unilamellar vesicles (GUVs) with defined membrane composition and encapsulation capacity. This capability addresses a key challenge in synthetic biology and drug delivery research by providing a tunable platform for modeling cellular systems and testing bioactive compounds. The method enhances predictive confidence in early-stage target validation by allowing systematic interrogation of membrane-dependent processes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled membrane asymmetry and transmembrane protein incorporation.
- Operational Value: Supports functional target validation by generating reproducible vesicle systems for pathway clarification.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative readouts on lipid-protein interactions and encapsulation efficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by producing mono-dispersed vesicles with tunable size and internal content.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through precise jetting parameters that control vesicle formation.
- Screening Readiness: Highlights platform scalability and reuse for reliable compound evaluation across multiple conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through the use of physiological-like osmolarity solutions and fluorescent tracking for vesicle monitoring.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling encapsulation of therapeutic candidates for stability and release studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decision-making by providing measurable outputs on vesicle stability and diameter-dependent performance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification, particularly in assays requiring controlled membrane environments and encapsulated compound delivery.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by enabling systematic variation of lipid composition and transmembrane protein incorporation to clarify pathway dependencies.
- Screening: Describes assay readiness through the generation of mono-dispersed vesicles that ensure consistent compound exposure and reproducible readouts.
- Analytics: Highlights quantitative measurements such as vesicle size, formation rate, and encapsulation efficiency that help teams compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling encapsulation of drugs or biomolecules for stability testing and release profiling.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, adaptable across multiple projects requiring synthetic vesicle platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in membrane-related mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of vesicle production for high-throughput applications.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early de-risking of delivery mechanisms.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on vesicle performance data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, lipid handling, and microscopy for chamber assembly and bilayer formation.
- Depends on instrumentation including piezo-actuated inkjet devices, high-speed cameras, and vacuum drying systems.
- Necessitates cross-team standardization of lipid solutions, jetting parameters, and chamber alignment procedures.
- Involves adaptation considerations for different lipid types, transmembrane proteins, and encapsulation agents across model systems.
- Includes practical limitations such as bilayer instability during setup and sensitivity to environmental vibrations during jetting.
