Dwie metody ustalania pierwotnych ludzkich komórek zrębu endometrium z próbek do histerektomii

Ogólnym celem tej procedury jest ustalenie pierwotnych hodowli komórek zrębu endometrium z wyciętej histerektomii. Osiąga się to poprzez najpierw rozróżnienie i oddzielenie warstw macicy w celu wyizolowania odcinka tkanki endometrium. Drugim krokiem jest wybór techniki izolacji komórek między metodami skrobania i próbowania w przypadku korzystania z metody skrobania.

Siła mechaniczna i skrobanie służą do oddzielania i dysocjacji komórek zrębu endometrium. Alternatywnie, przy zastosowaniu metody trypsyny, aktywność enzymatyczna trypsyny jest wykorzystywana do oddzielania i dysocjacji komórek zrębu endometrium. Ostatecznie mikroskopia służy do obserwacji wzrostu i morfologii komórek, podczas gdy inne techniki omówione w manuskrypcie są wykorzystywane do weryfikacji kultur zrębu endometrium.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania fizjologiczne w zjawiskach pola rozrodczego, takich jak cykl rozrodczy i miesiączka Próbki histerektomii użyte w tym manuskrypcie zostały zebrane zgodnie z uniwersyteckim protokołem etycznym zatwierdzonym przez IRB o numerze I-R-B-H-S-R numer 1 4 4 2 4. Utrzymuj tkankę pochodzącą od pacjenta w 50-mililitrowej probówce zawierającej RPMI lub DMEM z wysokim poziomem glukozy w czterech stopniach Celsjusza nie dłużej niż 24 godziny przed przetworzeniem próbki. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia, umyj próbkę tkanki trzykrotnie jednym XPBS i wyrzuć roztwór między każdym praniem.

Następnie dodaj od czterech do 10 mililitrów pożywki wzrostowej uzupełnionej 10% FBS i 1% streptomycyną penicyliny do próbki tkanki. Dodaj również strefę grzybów do końcowego stężenia 0,25 mikrograma na mililitr i inkubuj przez 30 minut. Następnie wyrzuć pożywkę wzrostową i umyj tkankę dwukrotnie jednym XPBS.

Umieść tkankę na sześciocentymetrowej płytce do hodowli komórkowej i zidentyfikuj warstwę endometrium, korzystając z tych obrazów jako przewodnika. Następnie oddziel endometrium i zachowaj pozostałe warstwy tkanki do wykorzystania w przyszłości. Użyj skalpela lub żyletki, aby przeciąć tkankę na małe kawałki, jednocześnie drapiąc po naczyniu do hodowli komórkowej.

Zadrapania ułatwiają przyczepianie się powstających pierwotnych komórek zrębu endometrium. Następnie delikatnie dodaj dwa mililitry pożywki wzrostowej do podrapanego naczynia. Na tym etapie fragmenty tkanek będą widoczne i unieruchomione od ruchu drapania.

Umieść naczynie w wyznaczonym inkubatorze do hodowli komórkowych, oddzielnie od innych linii komórkowych, aby uniknąć zanieczyszczenia. Codziennie monitoruj komórki za pomocą mikroskopu świetlnego. Szukaj małych populacji komórek, które wyłaniają się z pokrojonej tkanki dwa lub trzy dni co trzy dni.

Delikatnie usuń stare kultury płuczek za pomocą jednego XPBS, a następnie dodaj dwa mililitry świeżej pożywki wzrostowej. Zacznij dodawać cztery mililitry pożywki wzrostowej. Gdy tempo proliferacji wzrośnie podczas etapów mycia, odessaj pozostałe kawałki tkanki.

Jest mało prawdopodobne, aby z tkanki wyłoniły się nowe kolonie. Po tygodniu pasażu wzrostu, komórki za pomocą 0,05% trypsyny. Gdy komórki osiągną płynność od 75 do 80% CO, zamroź jedną płytkę komórek.

Gdy dwie lub trzy płytki są utrzymywane, komórki pierwotne nie mogą być pasażowane w nieskończoność. Aby rozpocząć izolację za pośrednictwem tripsin, umieść mały kawałek tkanki endometrium w stożkowej probówce z dwoma mililitrami 0,25% trypsyny uzupełnionej 0,03 miligrama na mililitr. Mycyna może następnie inkubować tkankę na obrotowej platformie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie krótko zawirować tkankę, a następnie odwirować przy 200 do 400 razy G przez dwie minuty, wyrzucić supernatant i dodać świeżą trypsynę. I może następnie mycyna inkubować tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę podczas obracania. Po inkubacji wiruj tkankę przez pięć do 10 sekund.

Następnie dodaj dwa mililitry pożywki wzrostowej zawierającej 10% FBS i 1% streptomycyny penicyliny. Aby dezaktywować trypsynę, odwiruj komórki w temperaturze od 200 do 400 razy G przez dwie do trzech minut. Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy.

W dwóch mililitrach pożywki wzrostowej umieść zawiesinę komórek na sześciocentymetrowym naczyniu do hodowli komórek i zeskrob płytkę, aby zwiększyć przyczepienie komórek pierwotnych. Codziennie monitoruj wzrost komórek za pomocą mikroskopu świetlnego i zmieniaj pożywkę wzrostową co dwa do trzech dni. Gdy komórki osiągną płynność ko-płynną od 75 do 80%, użyj 0,05% lub 0,25% trypsyny, aby je przejść, izolując komórki zrębu endometrium.

Za pomocą metody skrobania generowane są klastry wcześnie pojawiających się komórek. Wzdłuż zadrapań wywołanych skalpelem komórki zrębu endometrium można zidentyfikować na podstawie morfologii fibroblastów. Metoda trypsyny ma dłuższy czas przygotowania niż metoda skrobania, ale żywe komórki obserwuje się wcześniej.

Metoda tryin generuje również komórki o zgrupowanych i rozproszonych wzorcach wzrostu. Specyficzny tkankowo marker komórek zrębu endometrium nie został jeszcze odkryty. Jednym ze sposobów identyfikacji komórek zrębu endometrium jest pomiar utraty markera.

Dla komórek nabłonkowych, takich jak cytokeratyna. Brak cytokeratyny świadczy o braku komórek nabłonka endometrium. Utrata barwienia cytokeratyną zaobserwowana w pasażu piątym w porównaniu z pasażem drugim potwierdza brak komórek nabłonkowych.

Funkcjonalne dowody na obecność komórek zrębu endometrium można dostarczyć za pomocą testu decelularyzacji. Wzrost stężenia prolaktyny i białka jednego wiążącego insulinopodobny czynnik wzrostu w odpowiedzi na leczenie CAMP i octanem hydroksyprogesteronu wskazuje na pomyślne ustanowienie hodowli zrębu endometrium. Po obejrzeniu tego filmu powinnaś dobrze zrozumieć, jak ustalić pierwotne hodowle komórek zrębu endometrium po wyciętej histerektomii.