Name: Dwie metody ustalania pierwotnych ludzkich komórek zrębu endometrium z próbek do histerektomii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Poznaj dwie metody izolacji pierwotnych ludzkich komórek zrębu endometrium z próbek do histerektomii: mechaniczną i trypsynową. Protokoły obejmują walidację qPCR i immunofluorescencją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy wspólnym wysiłkom dr Thao Dang i członków jej laboratorium za korzystanie z ich sprzętu do obrazowania i mikroskopu. Dziękujemy również rdzeniowi Biorepository and Tissue Research Facility (BTRF), Jeffowi Harperowi, oraz mieszkańcom Uniwersytetu Wirginii za dostarczenie nam tkanki macicy. Dziękujemy Karolowi Szlachcie za pomoc w przygotowaniu Przeglądu Schematów.

Próbki histerektomii użyte w tym manuskrypcie zostały zebrane zgodnie z zatwierdzonym przez IRB protokołem etycznym o numerze IRB-HSR #14424.
1. Pobieranie próbki ze źródła klinicznego
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem należy uzyskać wytyczne etyczne i dokumenty zatwierdzające oparte na rządach i instytucjach.</li>
	<li>Wszystkie kroki należy wykonywać w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Tkankę pobraną od pacjenta należy przechowywać w pożywce (RPMI lub DMEM/o wysokiej zawartości glukozy) w probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C, jeżeli próbki nie można natychmiast przetworzyć w hodowli. Próbki mogą być przechowywane w tym stanie maksymalnie przez 24 godziny.</li>
	<li>Umyj próbkę tkanki trzykrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i wyrzuć roztwór między płukaniami.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pierwotnych linii komórkowych za pomocą metody skrobania
<ol>
	<li>Dodać 4-10 ml pożywki wzrostowej (RPMI lub DMEM/High Glucose uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną) do tkanki i dodać Fungizone (0,25 μg/ml stężenia końcowego) przez 30 min.</li>
	<li>Wyrzuć pożywkę wzrostową.</li>
	<li>Umyj chusteczkę dwukrotnie 1X PBS.</li>
	<li>Umieść tkankę na 6 cm płytce do hodowli komórkowej, aby rozróżnić warstwy mięśniówki macicy i endometrium (patrz rysunki 2A-2C w celu uzyskania dalszego opisu). Oddziel błonę śluzową macicy.</li>
	<li>Za pomocą skalpela lub żyletki przetnij tkankę na małe kawałki, drapiąc jednocześnie 6-centymetrową miskę do hodowli komórek. Zadrapania te ułatwiają przyczepianie się pojawiających się pierwotnych komórek endometrium. W porównaniu z metodą trypsyny potrzeba więcej tkanki (patrz rysunek 2D w przybliżeniu).</li>
	<li>Delikatnie dodaj 2 ml pożywki wzrostowej do podrapanego naczynia (fragmenty tkanek będą widoczne i najlepiej unieruchomione od ruchu drapania).</li>
	<li>Przenieść płytkę (płytki) do wyznaczonego inkubatora do hodowli komórkowych (37 °C i 5 % CO2 ). Wyznacz miejsce na pierwszorzędowe linie komórkowe, z dala od innych naczyń do hodowli komórkowych. Kultury pierwotne są bardziej wrażliwe na infekcje i zanieczyszczenia.</li>
	<li>Codziennie badaj komórki pod mikroskopem świetlnym. Małe populacje komórek powinny pojawić się w drugim lub trzecim dniu z okolic pokrojonych tkanek (patrz ryc. 3B).</li>
	<li>Aby utrzymać kultury, delikatnie przemyj 1X PBS i dodawaj świeże podłoże wzrostowe (2 ml) co trzy dni. Gdy szybkość namnażania wzrasta, do 6 cm płytki hodowlanej można dodać dodatkowe pożywki wzrostowe (3-4 ml). 
	Uwaga: Podczas mycia i wymiany pożywki kawałki tkanki prawdopodobnie zostaną zassane. Nie wpłynie to na wzrost przylegających komórek. Fragmenty tkanki należy odessać w kolejnym etapie (2.10), ponieważ jest mało prawdopodobne, aby nowe kolonie pojawiły się po tygodniu.</li>
	<li>Gdy płytka o średnicy 6 cm jest w około 75 - 80% zlewająca się (patrz rysunek 3B), pasaż przy użyciu 0,05% trypsyny. Komórki pierwotne nie mogą być pasażowane w nieskończoność - zamroź jedną płytkę komórek, gdy tylko dwie lub trzy płytki zostaną utrzymane. Jeśli wymaganych jest więcej fragmentów, postępuj zgodnie z protokołem unieśmiertelnienia (omówionym w Ref 3).</li>
</ol>
3. Przygotowanie pierwotnych linii komórkowych metodą trypsyny
<ol>
	<li>Umieścić mały kawałek tkanki endometrium (patrz rysunek 2D w przybliżeniu) w 2 ml 0,25% trypsyny uzupełnionej kanamycyną (końcowe stężenie 0,03 mg/ml).</li>
	<li>Inkubować tkankę w temperaturze 37 °C na platformie obrotowej przez 30 minut.</li>
	<li>Krótko odwiruj tkankę.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 200-400 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodaj świeżą trypsynę i kanamycynę.</li>
	<li>Inkubować tkankę w temperaturze 37 °C, obracając ją przez godzinę.</li>
	<li>Wiruj tkankę przez 5-10 sekund.</li>
	<li>Dodaj 2 ml pożywki wzrostowej (uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliny-streptomycyny), aby dezaktywować trypsynę.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 200-400 x g przez 2-3 min.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i dodać 2 ml pożywki wzrostowej do granulowanych komórek.</li>
	<li>Ułożyć płytkę na 6 cm naczyniu do hodowli komórkowych. Skrobanie płytki jak w kroku 2.5 przygotowania pierwotnych linii komórkowych przy użyciu metody skrobania nie jest konieczne, ale zwiększa przyczepianie i wyrastanie kultur pierwotnych.</li>
	<li>Codziennie monitoruj komórki pod mikroskopem świetlnym. Komórki są zwykle widoczne pod mikroskopem świetlnym po 24-48 godzinach (patrz rysunek 3C).</li>
	<li>Aby utrzymać hodowle, monitoruj komórki i zmieniaj pożywkę co 2-3 dni, jak w kroku 2.9.</li>
	<li>Aby przejść przez komórki, użyj 0,05% lub 0,25% trypsyny, gdy komórki osiągną 75-80% konfluencji (patrz ryc. 3C).</li>
</ol>
4. Oszczędzanie dodatkowej tkanki do analizy (szybkie zamrażanie i utrwalanie formaliny)
<ol>
	<li>Umyć próbkę dwukrotnie 1X PBS.</li>
	<li>Zassać jak najwięcej płynu.</li>
	<li>W przypadku zamrażania zatrzaskowego umieść próbkę tkanki endometrium w probówce wirówkowej 1.7 (patrz rysunki 2F i 2G). Umieść probówkę wirówkową 1.7 w ciekłym azocie na 10 sekund lub do momentu, gdy będzie widać, że tkanka zamarzła. 
	Uwaga: Należy uważać, aby nie dotykać bezpośrednio ciekłego azotu podczas przygotowywania próbek. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania lub analizy.</li>
	<li>W celu utrwalenia formaliny wytnij mały kawałek tkanki endometrium (patrz ryc. 2H) i zanurz w 10% buforowanej formalinie cynkowej. Po 24 godzinach wyrzuć formalinę i dodaj 70% etanolu do próbek tkanek do czasu dalszego przetwarzania.</li>
</ol>
5. Immunofluorescencja (IF)
<ol>
	<li>Utrwalanie komórek
	<ol>
		<li>Przygotuj komórki na szkiełku hodowlanym lub płytce.</li>
		<li>Delikatnie umyj komórki 1X PBS.</li>
		<li>Dodać wstępnie schłodzony (4 °C) metanol i aceton (zmieszane w stosunku 1:1) przez 5 minut.</li>
		<li>Wysuszyć szkiełko na powietrzu przed kontynuowaniem. W razie potrzeby szkiełko można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1-2 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie IF
	<ol>
		<li>Nawadniaj komórki za pomocą 1X PBS przez 10 min. W poniższych krokach 1-6 przeprowadź wszystkie mycia i inkubacje na obrotowej platformie.</li>
		<li>Blokuj za pomocą 1X PBS uzupełnionego 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 1% surowicą specyficzną dla gatunku (źródło przeciwciała 2nd) przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Inkubować w przeciwciałie pierwszorzędowym (patrz zalecenia producenta dotyczące rozcieńczania przeciwciał). Zapoznaj się z sekcją Materiały, aby uzyskać informacje o konkretnych przeciwciałach. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w świeżym buforze blokującym, jak w kroku 5.2.2. Inkubację można prowadzić przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyj 3 razy 1X PBS przez 5 minut każdy.</li>
		<li>Inkubować w przeciwciałie drugorzędowym (patrz zalecenia producenta dotyczące rozcieńczeń przeciwciał). Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w świeżym buforze blokującym, jak w kroku 5.2.2. Aby zapobiec wybielaniu fotograficznemu, ważne jest, aby przeprowadzić ten i kolejne kroki przy braku światła.</li>
		<li>Umyj 3 razy 1X PBS przez 5 minut każdy.</li>
		<li>Dokładnie wysusz szkiełka.</li>
		<li>Dodaj media montażowe i roztwór do barwienia DAPI.</li>
		<li>Nałóż szkiełko nakrywkowe i uszczelnij krawędzie za pomocą szczeliwa (szczeliwa). Szkiełka można przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do 2 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Osad 1 x 107 komórek przez odwirowanie. Wszystkie materiały i odczynniki w tym protokole powinny być wolne od RNAzy.</li>
	<li>Lizować komórki w 1 ml odczynnika TRIZOL i inkubować homogenizowane próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej do całkowitej dysocjacji kompleksów nukleoproteinowych.</li>
	<li>Dodać 200 μl chloroformu na 1 ml TRIZOLU. Wstrząsać energicznie ręką przez 15 sekund i inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować z maksymalną prędkością (15 000 x g) przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Powstaną trzy warstwy.</li>
	<li>Przenieś górną fazę wodną do świeżej probówki do mikrowirówki. Dodać 1 μl glikogenu, aby zwiększyć wydajność RNA; jednak ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy przewiduje się niewielką ilość RNA.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml alkoholu izopropylowego do warstwy wodnej i odwrócić próbki 3-5 razy. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Aby zwiększyć wydajność, próbki można umieszczać w temperaturze -20 °C lub -80 °C na 30 minut.</li>
	<li>Wirować z maksymalną prędkością przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W tym momencie powinna być widoczna niewielka osadka RNA. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przemyć RNA 1 ml 75% etanolu.</li>
	<li>Wirować z maksymalną prędkością przez 5 minut i wyrzucić supernatant. Próbki można ponownie umyć w celu usunięcia zanieczyszczeń nieorganicznych, ale ten krok nie jest konieczny.</li>
	<li>Krótko wysuszyć osad RNA, aż pastylka RNA wyschnie (zwykle trwa to 7-10 minut). 
	Uwaga: Można zastosować jeden dodatkowy krok, aby zmniejszyć ilość materii nieorganicznej i skrócić czas schnięcia. Po wyrzuceniu supernatantu z płuczki etanolem należy wirować próbki z maksymalną prędkością przez dodatkową minutę i odessać pozostałą ciecz. Uważaj, aby nie zassać granulatu.</li>
	<li>Rozpuść RNA w wodzie wolnej od RNaz, w zależności od wielkości osadu RNA. Objętości zwykle wahają się od 10 do 50 μl.</li>
	<li>Inkubować próbki w temperaturze 55 °C przez 10 minut i mierzyć stężenie RNA.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego przetwarzania.</li>
</ol>
7. Odwrotna transkrypcja
<ol>
	<li>Doprowadzić próbkę RNA (1-3 μg) do objętości 9 μl za pomocąH2O.</li>
	<li>Podgrzewać RNA do temperatury 70 °C przez 10 min.</li>
	<li>Aby wygenerować główną mieszankę AMV, połącz następujące odczynniki: 5 μl dNTP (stężenie robocze 50 μM), 5 μl oligonukleotydów N6 DNA (stężenie robocze 80 μM), 5 μl buforu 5X AMV i 1 μl AMV. Ten roztwór mieszania wzorcowego jest przeznaczony dla jednej próbki.</li>
	<li>Dodać 16 μl mieszanki wzorcowej do podgrzanego RNA. Końcowa objętość reakcji wyniesie 25 μl reakcji.</li>
	<li>Do odwrotnej transkrypcji należy stosować następujące warunki PCR: (Etap 1) 42 °C przez 90 minut, (Etap 2) 95 °C przez 5 minut i (Etap 3) 4 °C do dalszego przetwarzania.</li>
</ol>
8. PCR w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Przeprowadzaj reakcje PCR przy użyciu starterów, temperatur wyżarzania, numerów cykli i odczynników znajdujących się w tabeli 1. 
	Uwaga: Idealnie jest postępować zgodnie z instrukcjami producenta podczas używania odczynników PCR (patrz numer firmy i numer katalogowy w Materiałach).</li>
</ol>
9. Protokół decydualizacji in vitro (Pochodzi z Ref 4 i 5)
<ol>
	<li>Płytkie komórki endometrium.</li>
	<li>Dorastaj do zbiegu 75-85%.</li>
	<li>Po tym, jak komórki zaczną się zlewać, przemyj raz 1X PBS.</li>
	<li>Szybko dodaj pożywkę bez hormonów (RPMI bez fenolu uzupełnioną 5% paskiem węgla drzewnego FBS i 1% penicyliną-streptomycyną).</li>
	<li>Po 24 godzinach dodać pożywkę wolną od hormonów uzupełnioną octanem medroksyprogesteronu (MPA) o końcowym stężeniu 1 μM i 3',5'-cyklicznym monofosforanem 8-bromoadenozyny (cAMP) o końcowym stężeniu 0,5 mM.</li>
	<li>Po upływie co najmniej 48 godzin należy przerwać reakcję i zachować płytkę (płytki) do dalszej obróbki.</li>
</ol>

<ol><li>Heller, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeller%2C+D+%22in+The+endometrium%3A+a+clinicopathologic+approach%22">in The endometrium: a clinicopathologic approach</a>. Heller, D. , 56-75 (1994).</li>
<li>Emera, D., Romero, R., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+menstruation%3A+a+new+model+for+genetic+assimilation%3A+explaining+molecular+origins+of+maternal+responses+to+fetal+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The evolution of menstruation: a new model for genetic assimilation: explaining molecular origins of maternal responses to fetal invasiveness.</a> Bioessays. 34, 26-35 (2011).</li>
<li>Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+protocols+used+in+cell+culture+models+of+human+breast+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis.</a> Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).</li>
<li>Brosens, J. J., Hayashi, N., White, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+regulates+decidual+prolactin+expression+in+differentiating+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).</li>
<li>Jones, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+SUMO+pathway+sensitizes+differentiating+human+endometrial+stromal+cells+to+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of the SUMO pathway sensitizes differentiating human endometrial stromal cells to progesterone.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 16272-16277 (2006).</li>
<li>Salamonsen, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+the+human+endometrium+and+uterine+fluid%3A+a+pathway+to+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Proteomics of the human endometrium and uterine fluid: a pathway to biomarker discovery.</a> Fertil Steril. 99, 1086-1092 (2013).</li>
<li>Haouzi, D., Dechaud, H., Assou, S., De Vos, J., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+human+endometrial+receptivity+from+transcriptomic+and+proteomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Insights into human endometrial receptivity from transcriptomic and proteomic data.</a> Reprod Biomed Online. 24, 23-34 (2012).</li>
<li>Chen, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+midproliferative+and+midsecretory+human+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of midproliferative and midsecretory human endometrium.</a> J Proteome Res. 8, 2032-2044 (2009).</li>
<li>Talbi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+human+endometrium+distinguishes+menstrual+cycle+phases+and+underlying+biological+processes+in+normo-ovulatory+women%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of human endometrium distinguishes menstrual cycle phases and underlying biological processes in normo-ovulatory women.</a> Endocrinology. 147, 1097-1121 (2006).</li>
<li>Punyadeera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oestrogen-modulated+gene+expression+in+the+human+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Oestrogen-modulated gene expression in the human endometrium.</a> Cell Mol Life Sci. 62, 239-250 (2005).</li>
<li>Ponnampalam, A. P., Weston, G. C., Susil, B., Rogers, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+human+endometrium+during+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Aust+N+Z+J+Obstet+Gynaecol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of human endometrium during the menstrual cycle.</a> Aust N Z J Obstet Gynaecol. 46, 154-158 (2006).</li>
<li>Zhang, L., Rees, M. C., Bicknell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+long-term+culture+of+normal+human+endometrial+epithelium+and+stroma.+Expression+of+mRNAs+for+angiogenic+polypeptides+basally+and+on+oestrogen+and+progesterone+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The isolation and long-term culture of normal human endometrial epithelium and stroma. Expression of mRNAs for angiogenic polypeptides basally and on oestrogen and progesterone challenges.</a> J Cell Sci. 108 (1), 323-331 (1995).</li>
<li>Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+cells+from+term+human+decidua+closely+resemble+endometrial+stromal+cells%3A+induction+of+prolactin+and+insulin-like+growth+factor+binding+protein-1+expression%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression).</a> Biol Reprod. 52, 609-615 (1995).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+and+progesterone+receptor+cross-talk+in+human+endometrium%3A+a+decidualizing+affair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP and progesterone receptor cross-talk in human endometrium: a decidualizing affair.</a> J Endocrinol. 178, 357-372 (2003).</li>
<li>Marsh, M. M., Hampton, A. L., Riley, S. C., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+endothelin+released+by+human+endometrial+epithelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of endothelin released by human endometrial epithelial cells in culture.</a> J Clin Endocrinol Metab. 79, 1625-1631 (1994).</li>
<li>Siegfried, J. M., Nelson, K. G., Martin, J. L., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+identification+of+cultured+cells+from+human+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Histochemical identification of cultured cells from human endometrium.</a> In Vitro. 20, 25-32 (1984).</li>
<li>Rawdanowicz, T. J., Hampton, A. L., Nagase, H., Woolley, D. E., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+production+by+cultured+human+endometrial+stromal+cells%3A+identification+of+interstitial+collagenase%2C+gelatinase-A%2C+gelatinase-B%2C+and+stromelysin-1+and+their+differential+regulation+by+interleukin-1+alpha+and+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase production by cultured human endometrial stromal cells: identification of interstitial collagenase, gelatinase-A, gelatinase-B, and stromelysin-1 and their differential regulation by interleukin-1 alpha and tumor necrosis factor-alpha.</a> J Clin Endocrinol Metab. 79, 530-536 (1994).</li>
<li>Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+11+advances+progesterone-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 8, 636-643 (2002).</li>
<li>Sakai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+histone+acetylation+in+ovarian+steroid-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Involvement of histone acetylation in ovarian steroid-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> J Biol Chem. 278, 16675-16682 (2003).</li>
<li>Logan, P. C., Ponnampalam, A. P., Steiner, M., Mitchell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cyclic+AMP+and+estrogen%2Fprogesterone+on+the+transcription+of+DNA+methyltransferases+during+the+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of cyclic AMP and estrogen/progesterone on the transcription of DNA methyltransferases during the decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 19, 302-312 (2013).</li>
<li>Tamura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IGFBP-1+expression+by+cAMP+is+associated+with+histone+acetylation+status+of+the+promoter+region+in+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Induction of IGFBP-1 expression by cAMP is associated with histone acetylation status of the promoter region in human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 153, 5612-5621 (2012).</li>
<li>American Society for Reproductive Medicine: Quick facts about infertility. , Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.asrm.org/detail.aspx?id=2322">http://www.asrm.org/detail.aspx?id=2322</a> (2013).</li>
<li>Salker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+selection+of+human+embryos%3A+impaired+decidualization+of+endometrium+disables+embryo-maternal+interactions+and+causes+recurrent+pregnancy+loss%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Natural selection of human embryos: impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Inne grupy opisały i dostosowały metodologię przygotowania kultur zrębu endometrium, z których większość wykorzystuje kolagenazę 4,12,13,15-18. W tym manuskrypcie przedstawiliśmy metodologię i dowody na dwie uproszczone metody pierwotnej hodowli zrębu endometrium, z których obie są wykorzystywane przez nasze laboratorium ze względów ekonomicznych i wygodnej dostępności trypsyny i / lub żyletki.
Porównując nasze dwie metody, obie z powodzeniem generują żywotne kultury pierwotne. Nasz...

Ciało ludzkiej macicy składa się z trzech warstw: perimetrium (lub surowiczej), mięśniówki macicy i endometrium. Rozróżnienie każdej z tych warstw jest ważnym krokiem w kierunku ustalenia linii komórek endometrium. Perimetrium jest najbardziej zewnętrzną warstwą macicy i składa się z cienkich, surowiczych komórek. Mięśniówka macicy to gruba, środkowa warstwa macicy składająca się z komórek mięśni gładkich. Endometrium jest identyfikowane jako wewnętrzna warstwa macicy i obejmuje populacje komórek nabłonka i zrębu.
Endometrium jest dalej dzielone na warstwę podstawną, której populacja komórek macierzystych jest przypuszczalnie rezapulowana warstwą funkcjonalną mniej więcej co 28 dni 1. Warstwa funkcjonalna ludzkiego endometrium ulega znaczącym zmianom biochemicznym i morfologicznym w odpowiedzi na krążące hormony. Hormony te pochodzą z przysadki mózgowej i jajników.
Skoordynowana produkcja i uwalnianie hormonów powoduje cykl reprodukcyjny. Cykl rozrodczy ma na celu przygotowanie błony śluzowej macicy do potencjalnych zdarzeń implantacji zarodka. U ludzi cykl rozrodczy jest znany jako "cykl menstruacyjny" i dzieli się na trzy fazy – proliferacyjną, wydzielniczą i menstruacyjną. Faza proliferacyjna polega na proliferacji funkcjonalnej warstwy endometrium, podczas gdy faza wydzielnicza charakteryzuje się dojrzewaniem funkcyjnym. W szczególności zmiany zewnątrzkomórkowe, wydzieliny i różnicowanie komórkowe sygnalizują potencjalną implantację. Jeśli implantacja nie nastąpi przed końcem fazy wydzielniczej, funkcjonalna warstwa endometrium jest złuszczana w fazie miesiączkowej. Znaczenie menstruacji i wydarzeń, które powodują zrzucanie warstwy funkcjonalnej, są nadal przedmiotem dyskusji. U ludzi postawiono, że miesiączka jest wynikiem specyficznego zdarzenia różnicowania w środkowej fazie wydzielniczej, znanego jako "spontaniczne decydualizowanie" 2. W tym manuskrypcie przedstawiamy szczegółową metodologię zarówno metod izolacji komórek zrębu endometrium, jak i wykorzystujemy kombinację immunofluorescencji i obrazów cyfrowych, aby wykazać skuteczność tych podejść. Ponadto stosujemy powszechnie stosowany model spontanicznej decydualizacji in vitro w celu potwierdzenia izolacji komórek zrębu endometrium.

<table><tbody><tr><td>0,25 trypsyny lub 0,05% trypsyny&nbsp;</td>Rurka wirówkowa <td>SH3023602 hyklonowa</td><td>lub SH30004202</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mikro&nbsp; &nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-272A</td><td></td></tr><tr><td>1 &mikro; l, 20 i mikro; l, 200 ml oraz 1 000 &mikro; l Pipeta&nbsp; &nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-401,24-402, 24-412, 24-430</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 15 ml&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurka stożkowa&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Naczynie do hodowli komórkowych&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>12-556-002</td><td></td></tr><tr><td>Komory 8-dołkowe&nbsp;</td><td>Octan Thermo Scientific</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>C4-100</td><td></td></tr><tr><td>AMV RT Enzym/bufor&nbsp;</td><td>Bio Labs</td><td>M077L</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1605-100</td><td></td></tr><tr><td>Buforowana formalina cynkowa&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>59201ZF</td><td></td></tr><tr><td>Taśma węglowa FBS&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>NC9019735</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe&nbsp;</td><td>Marka Fisher</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>Cykliczny wzmacniacz (cAMP)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B7880</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Wysoki poziom glukozy&nbsp;</td><td>Hydrokon</td><td>SH30243FS</td><td></td></tr><tr><td>dNTP&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Osioł Anty Koza -TRITC&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-3855</td><td></td></tr><tr><td>Serum z osła&nbsp;</td><td>Jacksona' s lab</td><td>017-000-002</td><td></td></tr><tr><td>E Przeciwciało kadherynowe&nbsp; &nbsp;</td><td>Epitomika</td><td>1702-1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-1</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dla płodu (FBS)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-600-511</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone Amfoterycyna B&nbsp;</td><td>Sonda Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH&nbsp;</td><td>Technologie życia</td><td>HS99999905</td><td></td></tr><tr><td>glikogen&nbsp;</td><td>5Prime</td><td>2301440</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti Mouse - FITC&nbsp;</td><td>Jacksona' s Lab</td><td>115-096-003</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna&nbsp; &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Octan medroksyprogesteronu (MPA)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M1629</td><td></td></tr><tr><td>MeOH (metanol)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4-08-1</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik montażowy (z DAPI)&nbsp;</td><td>Wektorowe laboratoria</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>N6 DNA Oligos&nbsp;</td><td>Skrobak Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>numer 15&nbsp; &nbsp;</td><td>BD</td><td>371615</td><td></td></tr><tr><td>Pan Cytokeratin&nbsp; Mysz mAB&nbsp;</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4545</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-399-4</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna Roztwór Glutaminy 100X&nbsp; &nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30082.01</td><td></td></tr><tr><td>PML Anti Goat Anti body&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9862</td><td></td></tr><tr><td>Podkład(y)&nbsp;</td><td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI&nbsp;</td><td>Hyclon</td><td>SH30027FS</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (bez fenolu)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11835</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Zielony&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>Taqman&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>AB-4138</td><td></td></tr><tr><td>Trizol&nbsp;</td><td>Technologie życia</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciała wimentyny&nbsp;</td><td>Epitomika</td><td>4211-1</td><td></td></tr></tbody></table>

dwie metody ustalania pierwotnych ludzkich komórek zrębu endometrium z próbek do histerektomii

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Wiele wysiłku zostało włożone w stworzenie systemów hodowli komórkowych in vitro. Systemy te są przeznaczone do modelowania ogromnej liczby procesów in vivo. Systemy hodowli komórkowych powstałe z próbek ludzkiego endometrium nie są wyjątkiem. Zastosowania obejmują zarówno normalne cykliczne procesy fizjologiczne, jak i patologie endometrium, takie jak nowotwory ginekologiczne, choroby zakaźne i niedobory rozrodcze. W tym miejscu przedstawiamy dwie metody ustalania pierwotnych komórek zrębu endometrium z chirurgicznie wyciętych próbek histerektomii endometrium. Pierwsza metoda jest określana jako "metoda skrobania" i obejmuje mechaniczne skrobanie za pomocą ostrzy chirurgicznych lub żyletek, podczas gdy druga metoda jest określana jako "metoda trypsyny". Ta ostatnia metoda wykorzystuje aktywność enzymatyczną trypsyny do promowania separacji komórek i pierwotnego wzrostu komórek. Metodologię krok po kroku ilustrujemy za pomocą obrazów cyfrowych i mikroskopii. Podajemy również przykłady walidacji linii komórek zrębu endometrium za pomocą ilościowych reakcji łańcuchowych polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) i immunofluorescencji (IF).

Zgodnie z podkreślonymi w sekcji Protokół zaleceniami, należy upewnić się, że wszystkie metody są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi rządowymi, instytucjonalnymi i etycznymi w zakresie obchodzenia się z tkankami ludzkimi i ich przygotowania.
W niniejszym manuskrypcie zamieszczono ilustrację ogólnego schematu działania „metody skrobania” (Rycina 1A) oraz „metody trypsynowej” (Rycina 1B) stosowanych do hodowli pierwotnych kultur endometrium. Me...

Ustalenie pierwotnych systemów hodowli komórek zrębu endometrium na podstawie próbek z histerektomii jest cenną techniką biologiczną i kluczowym krokiem przed realizacją szerokiego wachlarza celów badawczych. W tym miejscu opisujemy dwie metody stosowane do ustanawiania kultur zrębu z chirurgicznie wyciętych tkanek endometrium u ludzi.

Dwie metody ustalania pierwotnych ludzkich komórek zrębu endometrium z próbek do histerektomii

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ustanowienie pierwotnych kultur komórek zrębu błony śluzowej endometrium z wyciętych podczas histerektomii tkanek. Osiąga się to najpierw poprzez rozróżnienie i oddzielenie warstw macicy w celu wyizolowania fragmentu tkanki endometrium. Drugim krokiem jest wybór techniki izolacji komórek pomiędzy metodą skrobania a metodą trypsynizacji przy zastosowaniu metody skrobania.W celu oddzielenia i dysocjacji komórek macierzy endometrium stosuje się siłę mechaniczną oraz skrobanie. Alternatywnie, w metodzie z użyciem trypsyny, wykorzystuje się aktywność enzymatyczną trypsyny do oddzielenia i dysocjacji komórek macierzy endometrium. Ostatecznie, do obserwacji wzrostu i morfologii komórek wykorzystuje się mikroskopię, natomiast inne techniki omówione w manuskrypcie służą do weryfikacji kultur komórek macierzy endometrium.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania fizjologiczne w dziedzinie reprodukcji, dotyczące takich zjawisk jak cykl rozrodczy i menstruacja. Próbki z histerektomii wykorzystane w niniejszym opracowaniu zostały pobrane zgodnie z zatwierdzonym przez uniwersytecką komisję IRB protokołem etycznym o numerze I-R-B-H-S-

two-methods-for-establishing-primary-human-endometrial-stromal-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Dwie metody hodowli ludzkich komórek stromy endometrium z podstawowych komórek uzyskanych z próbek po histerektomii

Ten film opisuje protokół izolacji pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka od próbki ludzkiej sieci komórkowej. Komórki międzybłonka można wykorzystać do stworzenia modelu raka jajnika in vitro w celu zbadania adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Izolacja komórek międzybłonkowych: technika izolowania pierwotnych komórek międzybłonka z próbki ludzkiej tkanki sieci

To badanie opisuje szczegółową metodę izolacji i charakterystyki komórek pierwotnego raka jajnika z litych próbek klinicznych. Próbki kliniczne raka jajnika są poddawane trawieniu enzymatycznemu w celu uzyskania żywotnych, wolnych od fibroblastów komórek nabłonkowego raka jajnika (EOC), które doskonale nadają się do dalszych zastosowań.

Metoda pozyskiwania komórek pierwotnego raka jajnika z próbek litych

Tutaj prezentujemy protokół do budowy trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej, składającego się z pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka i fibroblastów pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową, jako narzędzie do badania adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Modelowanie wczesnych etapów rozsiewu raka jajnika w organotypowym posiewie ludzkiej jamy otrzewnowej

To badanie przedstawia standaryzowaną i zweryfikowaną metodę izolacji i hodowli pierwotnych komórek zrębu i nabłonka endometrium myszy, które mogą być używane w systemie kokultury do badania decydualizacji in vitro.

Izolacja komórek nabłonka endometrium i zrębu myszy w celu dencdualizacji in vitro

To badanie przedstawia zweryfikowaną i zoptymalizowaną procedurę izolacji i hodowli ludzkich komórek zrębu endometrium do przeprowadzenia testu decydualizacji in vitro. Co więcej, badanie to dostarcza szczegółowej metody skutecznego knockdown określonego genu za pomocą siRNA w ludzkich komórkach zrębu endometrium.

Izolacja ludzkich komórek zrębu endometrium do dendualizacji in vitro

Celem tej metodologii jest identyfikacja komórek macierzystych raka (CSC) w liniach komórek rakowych i pierwotnych próbkach guzów ludzkich za pomocą protokołu formowania kuli, w solidny sposób, przy użyciu testów funkcjonalnych i charakterystyki fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej i Western blot.

Pozyskiwanie kulek komórek macierzystych raka z guzów ginekologicznych i raka piersi

Przedstawiono protokół generowania ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych, które składają się z komórek nabłonkowych i zrębowych oraz zachowują cechy natywnej tkanki endometrium. Protokół ten opisuje metody od pozyskania tkanki macicy do histologicznego przetwarzania organoidów endometrialnych.

Wytwarzanie wielokomórkowych ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych

Ten protokół opisuje metodologie tworzenia organoidów nabłonka endometrium myszy do ekspresji genów i analiz histologicznych.

Ustalanie organoidów endometrialnych 3D z macicy myszy

Ten protokół demonstruje niezawodną i skuteczną technikę izolowania pierwotnych fibroblastów z przedmenopauzalnej lub pomenopauzalnej ludzkiej tkanki pochwy. Istniejące protokoły izolacji fibroblastów pochwy nie uwzględniają wyzwań związanych z izolacją komórek z tkanki starczej. Tkankę pochwy pozyskano od kobiet po operacji wypadania narządów miednicy.

Przetwarzanie tkanek i izolacja pierwotnych fibroblastów z ludzkiej pochwy

Protokół pokazuje nowatorski model eksperymentalny in vitro, który może podsumować biologię dwóch rodzajów przylegających linii komórkowych za pomocą trójwymiarowego (3D) wydrukowanego rusztowania. Opisano budowę tego modelu i procedury operacyjne, od przygotowania komórek i hodowli komórek po analizę i ocenę.

Model kohodowli z wykorzystaniem dwóch typów przylegających linii komórkowych

Poznaj dwie metody izolacji pierwotnych ludzkich komórek zrębu endometrium z próbek do histerektomii: mechaniczną i trypsynową. Protokoły obejmują walidację qPCR i immunofluorescencją.

Dwie metody ustalania pierwotnych ludzkich komórek zrębu endometrium z próbek do histerektomii

Przeglądaj więcej filmów