Name: Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Poznaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji do identyfikacji ligandów aktywujących osierocone receptory GPCR. Metoda wykorzystuje komórki HEK293T i pozwala na szybki, średnio-przepustowy screening związków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Fundacji Badawczej Flandrii (FWO-Vlaanderen, Belgia, G.0601.11) oraz Fundacji Badawczej KU Leuven GOA/11/002. IB, TJ i LT korzystają ze stypendium FWO-Vlaanderen.

Uwaga: Wszystkie działania, w które zaangażowane są komórki, powinny być wykonywane w sterylnym środowisku poprzez pracę w przepływie laminarnym.
1. Utrzymanie linii komórkowej HEK293T
<ol>
	<li>Hodować HEK293T komórek w kolbie T-75 w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 .</li>
	<li>Przejdź przez komórki, gdy zostanie osiągnięta konfluencja 80%. Uwaga: Zwykle trwa to od 3 do 4 dni. Komórki w hodowli ciągłej pozwalają na 20-25 użytecznych pasaży do przesiewania.
	<ol>
		<li>Sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) firmy Dulbecco bez chlorku wapnia i chlorku magnezu, PBS-trypsyna-etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) (500 ml PBS uzupełniona 10 ml roztworu trypsyny-EDTA i 4,5 ml 4% EDTA) i pożywki wzrostowej (500 ml zmodyfikowanego roztworu Dulbecco o wysokim poziomie glukozy [DMEM] uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą [FBS] i 1 mM penicyliną-streptomycyną [PS]) w temperaturze pokojowej z półgodzinnym wyprzedzeniem.</li>
		<li>Usuń starą pożywkę wzrostową z komórek. Spłukać martwe komórki za pomocą 3 ml PBS i ponownie usunąć PBS.</li>
		<li>Dodać 3 ml PBS-trypsyny-EDTA, inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i usunąć roztwór Uwaga: Morfologia komórek zmieni się z gwiaździstej na kulistą</li>.
		<li>Poluzować komórki z dna kolby przez delikatne stukanie i zebrać komórki, kilkakrotnie spłukując dno 10 ml świeżej pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Przenieść 1 ml kultury komórkowej do nowej kolby T-75 zawierającej 14 ml świeżej pożywki wzrostowej i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Transfekcja przejściowa komórek HEK293T
<ol>
	<li>Hoduj HEK293T komórek w kolbie T-75 na 3 dni przed właściwym testem mobilizacji wapnia. Upewnij się, że używasz trzech kolb T-75, jednej do transfekcji z konstruktem receptorowym, jednej do transfekcji z pustym wektorem ekspresji, jako kontroli negatywnej i jednej do kontroli transfekcji. Uwaga: Pasażowanie komórek odbywa się zgodnie z opisem w kroku 1.2. Gdy konieczne jest przesiewanie wielu płytek 96-dołkowych, można użyć kolb T-150 w celu uzyskania wyższej wydajności komórek (w tym celu należy podwoić wszystkie podane ilości w krokach 1.2.5, 2.3, 3.1.3 i 3.1.4).</li>
	<li>Kolby inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 przez 20-24 godziny, aż kultury komórkowe zbliżą się do 50-70% zbieżności.</li>
	<li>Współtransfekować jedną populację komórek za pomocą wektora ekspresyjnego kodującego interesujący nas GPCR i konstrukt Gα16, drugiej kolby z pustym wektorem i konstruktem Gα16, a trzecią z kontrolą transfekcji i konstruktem Gα16. Uwaga: W tym protokole receptor Drosophila sNPF został sklonowany w wektorze ekspresji ssaków pcDNA3.113. Do przeprowadzenia transfekcji użyto JetPRIME, ale można również użyć innych odczynników do transfekcji.
	<ol>
		<li>Dodać łącznie 7,8 μg DNA (3,9 μg konstruktu receptora lub pustego wektora i 3,9 μg konstruktu ekspresjiGα16) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać 500 μl buforu JetPRIME. Dobrze wymieszaj, obracając rurkę i krótko odwiruj.</li>
		<li>Dodać 37,5 μl odczynnika JetPRIME, wirować i wirować przez 1 minutę w temperaturze 14 000 x g. Inkubować mieszankę transfekcyjną przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodawać mieszaninę do transfekcji kroplami do pożywki do hodowli komórkowych i upewnić się, że pipetujesz bezpośrednio do pożywki, unikając kontaktu ze ściankami kolby hodowlanej. Inkubować kolby w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 przez 20-24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test mobilizacji wapnia
<ol>
	<li>Zbierz transfekowane komórki i umieść je w 96-dołkowych płytkach o czarnych ściankach i przezroczystym dnie.
	<ol>
		<li>Umieść PBS, PBS-Trypsin-EDTA i pożywkę transferową DMEM (500 ml DMEM uzupełnione 10% dializowanym FBS i 1% P-S) w temperaturze pokojowej pół godziny wcześniej.</li>
		<li>Pokryj 96-dołkowe, czarnościenne, przezroczyste płytki dolne 60 μl PBS z fibronektyną (0,0025%) na studzienkę (5,85 ml PBS i 150 μl fibronektyny [0,1%] na płytkę). Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę pod przykryciem. Wyjmij roztwór z dołków i ponownie inkubuj płytki przez 1 godzinę bez pokrywki w temperaturze pokojowej. Alternatywnie możliwe jest użycie wstępnie powlekanych płytek w celu lepszego mocowania komórek.</li>
		<li>Zdjąć starą pożywkę wzrostową z komórek i spłukać martwe komórki za pomocą 3 ml PBS i usunąć PBS.</li>
		<li>Dodać 3 ml PBS-Trypsyny-EDTA, inkubować przez 1 minutę, a następnie usunąć roztwór. Uwaga: Morfologia komórek zmienia się z gwiaździstego na kuliste.</li>
		<li>Poluzować komórki z dna kolby przez delikatne stukanie i zebrać je, kilkakrotnie spłukując 10 ml pożywki transferowej DMEM. Przenieść komórki do probówki Falcon o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Policz liczbę komórek na ml (wykonywane za pomocą NucleoCounter tutaj, ale dopuszczalna jest komora Burkera). Dodać 100 μl kultury komórkowej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodaj 100 μl buforu do lizy i wymieszaj, stukając w probówkę. Dodać 100 μl buforu stabilizującego i wymieszać, stukając.</li>
		<li>Napełnij kasetę nukleokasetową zawiesiną komórek i policz komórki za pomocą licznika. Pomnóż liczbę komórek przez trzy, ponieważ komórki zostały rozcieńczone trzykrotnie podczas dodawania buforu do lizy i stabilizacji w kroku 3.1.6.</li>
		<li>Rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia 600 000 komórek/ml i zasiać 150 μl komórek na basenie w powlekanych płytkach, aby uzyskać gęstość komórek około 90 000 komórek na basenik. Unikaj pęcherzyków powietrza i postukaj w płytkę, aby równomiernie rozłożyć komórki, aby uzyskać ciągłą warstwę komórek. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 przez 16-24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj komórki barwnikiem fluorescencyjnym i przygotuj płytkę złożoną.
	<ol>
		<li>Przygotować zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)/HEPES/Ca2+/bufor albuminy surowicy bydlęcej (BSA): dodać 165 μl roztworu podstawowego CaCl2 (1 M CaCl2 w wodzie destylowanej [dH2O] – przechowywać w temperaturze pokojowej), 500 μl roztworu podstawowego HEPES (1 M HEPES w dH2O, pH 7,4 – przechowywać w temperaturze pokojowej), i 0,05 g BSA do 50 ml HBSS. Należy pamiętać, że BSA bez kwasów tłuszczowych jest używany do oznaczania wapnia, ponieważ kwasy tłuszczowe mogą aktywować określone receptory, osłabiając sygnał wapniowy receptora będącego przedmiotem zainteresowania.</li>
		<li>Przygotować roztwór probenecydu (100x, 250 mM): rozpuścić 0,71 g probenecydu w 5 ml NaOH (1 M) i dodać 50 μl roztworu podstawowego HEPES oraz 5 ml buforu HBSS/HEPES/Ca2+/BSA – zawsze należy przygotować świeży roztwór. Uwaga: Probenecyd hamuje nieorganiczne transportery anionów, które mogą usuwać Fluo-4 z cytoplazmy, zmniejszając w ten sposób sygnał fluorescencyjny. Zaleca się ładowanie barwnika w obecności i bez probenecydu w celu określenia, czy nieorganiczne transportery anionów stanowią potencjalny problem w poszczególnych badanych liniach komórkowych, ponieważ probenecyd może nawet zmniejszać sygnał, w którym pośredniczy agonista.</li>
		<li>Przygotować bufor do przemywania (Wash): dodać 500 μl roztworu probenecydu do 50 ml buforu HBSS/HEPES/Ca2+/BSA, dostosować pH do 7,4 i przefiltrować roztwór buforowy. Zawsze przygotowuj świeży bufor i wymagane jest 50 ml buforu na płytkę.</li>
		<li>Przygotować 10% roztwór kwasu pluronowego: zmieszać 50 μl kwasu pluronowego (20% w/v w dimetylosulfotlenku [DMSO]) z 50 μl DMSO – jeśli dojdzie do krystalizacji, podgrzać do 37 °C i zawsze przygotowywać świeży roztwór.</li>
		<li>Przygotować roztwór Fluo-4 AM (1mM): dodać 44 μl 10% roztworu kwasu pluronowego do fiolki zawierającej 50 μg Fluo-4 AM i wirować aż do całkowitego rozpuszczenia. Unikaj ekspozycji na światło, aby zapobiec wybielaniu fluoroforu.</li>
		<li>Przygotować bufor ładujący: dodać 8,8 ml DMEM uzupełnionego 10 mM HEPES i 2,5 mM probenecydu (pH 7,4) do roztworu Fluo-4 AM (44 μl) i wirować. Zawsze używaj świeżego bufora.</li>
		<li>Wyrzuć pożywkę z komórek, przemyj komórki 200 μl PBS na studzienkę i usuń PBS.</li>
		<li>Dodać 55 μl buforu ładującego do studzienki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Owiń płytkę folią aluminiową, aby zapobiec wystawieniu płytki na działanie światła.</li>
		<li>Upewnij się, że wysuszyłeś związki przed badaniem przesiewowym, jeśli są rozpuszczone w rozpuszczalnikach, które są szkodliwe (np. acetonitryl) dla komórkowego układu ekspresji.</li>
		<li>Rozpuścić peptydy w buforze do przemywania w silikonowanych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Przygotować serię rozcieńczeń w celu przeprowadzenia analizy stężenie-odpowiedź i oznaczenia wartości EC50 liganda. Dodać 70 μl liganda do odpowiedniego dołka płytki złożonej (płytki 96-dołkowe w kształcie litery V) i włączyć kontrole dodatnie (endogennego agonisty) i ujemne (bufor do przemywania się) na każdej płytce. Uwaga: Jeśli związek nie jest rozpuszczalny w buforze do płukania, można wypróbować inne rozpuszczalniki, które nie są szkodliwe dla badanych komórek, takie jak woda lub roztwory emulgujące i rozpuszczające oleje i inne substancje nierozpuszczalne w wodzie (np. Kolliphor EL).</li>
		<li>Zmierzyć wszystkie próbki w trzech egzemplarzach. Należy pamiętać, że 50 μl liganda z płytki złożonej zostanie przeniesione do studzienki ze 100 μl buforem do płukania płytki komórkowej podczas testu, więc przygotuj związki o 3-krotnym pożądanym stężeniu końcowym.</li>
		<li>Wyrzucić bufor ładujący z płytki komory i dodać 100 μl buforu płuczącego do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej i zapobiegać ekspozycji na światło.</li>
		<li>Wyrzucić bufor do przemywania z płytki komory i dodać 100 μl nowego buforu do przemywania do każdej studzienki.</li>
		<li>Inkubować płytkę komórkową, płytkę złożoną i stojak na końcówki (96-dołkowe, końcówki pipet do urządzenia stacyjnego) przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Test na urządzeniu stacji
<ol>
	<li>Utwórz i załaduj żądany plik protokołu za pomocą oprogramowania i aktywuj jednostkę sterującą temperaturą dla komory odczytu. Tutaj mierz reakcje wapnia w temperaturze 37 °C przez 2 minuty, po jednym rzędzie na raz, w odstępie 1,52 sekundy między kolejnymi odczytami (pomiar pełnej płytki 96-dołkowej zajmuje około 25 minut) przy 525 nm. Ustaw wzbudzenie Fluo-4 na 488 nm i przenieś całkowitą objętość 50 μl związku na płytkę kuwe, 18 sekund po rozpoczęciu odczytu, z prędkością dozowania ustawioną na 26 μl/s i wysokością pipety 135 μl.</li>
	<li>Umieść płytkę złożoną i komórkową oraz stojak na końcówki w odpowiednich szufladach urządzenia stacji.</li>
	<li>Wykonaj pojedynczy odczyt płytki ogniwa przy tej samej długości fali wzbudzenia i emisji w trybie ENDPOINT, przed uruchomieniem właściwego ekranu w trybie FLEX. Uwaga: Ten pomiar daje wartości względnych jednostek fluorescencji (RFU) i umożliwia wykrycie zmienności między dołkami płytki. Wartości z zakresu od 20 000 do 40 000 są uważane za dopuszczalne.</li>
	<li>Rozpocznij test i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania.</li>
</ol>

<ol><li>Bockaert, J., Pin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tinkering+of+G+protein-coupled+receptors+an+evolutionary+success%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Molecular tinkering of G protein-coupled receptors an evolutionary success.</a> EMBO J. 18 (7), 1723-1729 (1999).</li>
<li>Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+molecular+mechanisms+involved+in+activation+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors.</a> Endocr Rev. 21 (1), 90-113 (2000).</li>
<li>Drews, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drug discovery a historical perspective.</a> Science. 287 (5460), 1960-1964 (2000).</li>
<li>Marinissen, M. J., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-protein-coupled+receptors+and+signaling+networks+emerging+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">G-protein-coupled receptors and signaling networks emerging paradigms.</a> Trends Pharmacol Sci. 22 (7), 368-376 (2001).</li>
<li>Bendena, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+physiology+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide physiology in insects.</a> Adv Exp Med Biol. 692, 166-191 (2010).</li>
<li>Van Hiel, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+receptors+as+possible+targets+for+development+of+insect+pest+control+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide receptors as possible targets for development of insect pest control agents.</a> Adv Exp Med Biol. 692, 211-226 (2010).</li>
<li>Tang, X. L., Wang, Y., Li, D. L., Luo, J., Liu, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphan+G+protein-coupled+receptors+%28GPCRs%29%3A+biological+functions+and+potential+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets.</a> Acta Pharmacol Sin. 33 (3), 363-371 (2012).</li>
<li>Civelli, O., Reinscheid, R. K., Zhang, Y., Wang, Z., Fredriksson, R., Schiöth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+deorphanizations%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor deorphanizations.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 127-146 (2013).</li>
<li>Mertens, I., Vandingenen, A., Meeusen, T., De Loof, A., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postgenomic+characterization+of+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Postgenomic characterization of G-protein-coupled receptors.</a> Pharmacogenomics. 5 (6), 657-672 (2004).</li>
<li>Brough, S. J., Shah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+aequorin+for+G+protein-coupled+receptor+hit+identification+and+compound+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of aequorin for G protein-coupled receptor hit identification and compound profiling.</a> Methods Mol Biol. 552, 181-198 (2009).</li>
<li>Gee, K. R., Brown, K. A., Chen, W. N. U., Bishop-Stewart, J., Gray, D., Johnson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physiological+characterization+of+fluo-4+Ca2%2B-indicator+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes.</a> Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).</li>
<li>Beets, I., Lindemans, M., Janssen, T., Verleyen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deorphanizing+G+protein-coupled+receptors+by+a+calcium+mobilization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deorphanizing G protein-coupled receptors by a calcium mobilization assay.</a> Methods Mol Biol. 789, 377-391 (2011).</li>
<li>Mertens, I., Meeusen, T., Huybrechts, R., De Loof, A., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+short+neuropeptide+F+receptor+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Characterization of the short neuropeptide F receptor from Drosophila melanogaster.</a> Biochem Biophys Res Commun. 297 (5), 1140-1148 (2002).</li>
<li>Lu, H. -L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcium+bioluminescence+assay+for+functional+analysis+of+mosquito+%28Aedes+aegypti%29+and+tick+%28Rhipicephalus+microplus%29+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors.</a> J. Vis. Exp. (50), e2732(2011).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+a+neuropeptide+F-like+receptor+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of a neuropeptide F-like receptor from Drosophila melanogaster.</a> Eur. J. Neurosci. 18 (2), 227-238 (2003).</li>
<li>Nässel, D. R., Wegener, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+short+and+long+neuropeptide+F+signaling+in+invertebrates+any+similarities+to+vertebrate+neuropeptide+Y+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A comparative review of short and long neuropeptide F signaling in invertebrates any similarities to vertebrate neuropeptide Y signaling.</a> Peptides. 32 (6), 1335-1355 (2011).</li>
<li>Grimmelikhuijzen, C. J. P., Hauser, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review+The+evolution+of+neuropeptide+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Pept%22%5BJournal%5D)">Mini-review The evolution of neuropeptide signaling.</a> Regul Pept. 177, S6-S9 (2012).</li>
<li>Caers, J., Verlinden, H., Zels, S., Vandersmissen, H. P., Vuerinckx, K., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+two+decades+of+research+on+insect+neuropeptide+GPCRs+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%22%5BJournal%5D)">More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs an overview.</a> Front Endocrinol (Lausanne. 3 (151), 1-30 (2012).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+5%E2%80%99-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An analysis of 5’-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs).</a> Nucleic Acids Res. 15 (20), 8125-8148 (1987).</li>
<li>Offermanns, S., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%CE%B115+and+G%CE%B116+couple+a+wide+variety+of+receptors+to+phospholipase%5BTitle%5D)+AND+%22CJ+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gα15 and Gα16 couple a wide variety of receptors to phospholipase.</a> CJ Biol Chem. 270 (25), 15175-15180 (1995).</li>
<li>Ral Conklin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxyl-terminal+mutations+of+Gq%CE%B1+and+Gs%CE%B1+that+alter+the+fidelity+of+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Carboxyl-terminal mutations of Gqα and Gsα that alter the fidelity of receptor activation.</a> Mol Pharmacol. 50 (4), 885-890 (1996).</li>
<li>Kostenis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+G%CE%B116+the+optimal+tool+for+fishing+ligands+of+orphan+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Is Gα16 the optimal tool for fishing ligands of orphan G-protein-coupled receptors.</a> Trends Pharmacol Sci. 22 (11), 560-564 (2001).</li>
<li>Robas, N. M., Fidock, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+orphan+G+protein-coupled+receptor+ligands+using+FLIPR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of orphan G protein-coupled receptor ligands using FLIPR assays.</a> Methods Mol Biol. 306, 17-26 (2005).</li>
<li>Caers, J., Peeters, L., Janssen, T., De Haes, W., Gäde, G., Schoofs, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+studies+of+Drosophila+adipokinetic+hormone+%28AKH%29+by+a+cellular+expression+system+of+dipteran+AKH+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Structure-activity studies of Drosophila adipokinetic hormone (AKH) by a cellular expression system of dipteran AKH receptors.</a> Gen Comp Endocrinol. 177 (3), 332-337 (2012).</li>
<li>Peeters, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pharmacological+study+of+NLP-12+neuropeptide+signaling+in+free-living+and+parasitic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A pharmacological study of NLP-12 neuropeptide signaling in free-living and parasitic nematodes.</a> Peptides. 34 (1), 82-87 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji został z powodzeniem zastosowany w celu potwierdzenia funkcjonalnej charakterystyki peptydgicznego systemu sygnalizacyjnego Drosophila sNPF, co zostało już przeprowadzone przez Mertens i wsp. z testem bioluminescencyjnym i przez Feng i wsp. z oznaczeniem elektrofizjologicznym13,15. Wartości EC50 uzyskane za pomocą testu fluorescencji w HEK293T komórkach są około 10-krotnie mniejsze niż te uzyskane za pomocą testu bioluminescencyjnego przeprowadzonego w komórkach CHO (Drome-sNPF-1: fluo = 2,04 nM, lumi = 51 nM; Drome-sNPF-2: fluo = 5,89 nM, lumi = 42 nM; Drome-sNPF-3: fluo = 5,55 nM, lumi = 31 nM; Drome-sNPF-4: fluo = 0,50 nM, lumi = 75 nM). Różnice te można wytłumaczyć kilkoma czynnikami, w tym faktem, że jeden z używanych systemów ekspresji może być lepiej przystosowany do funkcjonalnej ekspresji danego receptora lub fałdowanie niektórych receptorów może być mniej wydajne w niektórych typach komórek. Wartości EC50 wszystkich czterech peptydów Drome-sNPF mieszczą się w zakresie nanomolowym podczas testowania na ich receptorze zarówno za pomocą testu fluorescencji, jak i bioluminescencji, co ogólnie potwierdza fizjologiczne znaczenie ich interakcji peptyd-receptor in vivo.
Należy zauważyć, że żadna kontrola transfekcji z receptorem, dla którego znany jest ligand aktywujący, nie została uwzględniona w przedstawionym tutaj ekranie, ponieważ system sygnalizacyjny Drosophila sNPF jest zwykle kontrolą transfekcji w konfiguracjach eksperymentalnych. Do badania przesiewowego włączono kontrolę pozytywną z endogennym ligandem komórek HEK293T (PAR1) oraz kontrolę ujemną (bufor do płukania). Wyniki PAR1 wykazały, że komórki były w dobrym stanie. Kontrola ujemna (bufor do płukania) nie wywołała sygnału fluorescencyjnego, co wskazuje, że pożywka, w której rozpuszczone są peptydy, była wolna od jakichkolwiek zanieczyszczeń, które mogłyby wpłynąć na wyniki.
Wcześniej scharakteryzowany system sygnalizacji Drosophila sNPF został tutaj wykorzystany do wyjaśnienia testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji. W tym celu natychmiast przetestowano szeregi stężeń ligandów aktywujących. Jednakże, gdy receptor sierocy jest doprowadzany do nadekspresji w teście przesiewowym w celu przetestowania biblioteki zawierającej setki związków, zaleca się najpierw badanie przesiewowe ze stosunkowo wysokimi końcowymi stężeniami ligandów (np. 10 lub 1 μM). Po wykryciu związku aktywującego, seria rozcieńczeń tego związku może być badana przesiewowo w celu skomponowania krzywej stężenie-odpowiedź i określenia wartości EC50 .
Po określeniu liganda aktywującego receptor, wewnątrzkomórkowy szlak sygnałowy może być dalej badany poprzez dostosowanie protokołu. Test można przeprowadzić w sposób opisany powyżej, ale bez jednoczesnej transfekcji podjednostki Gα16 . Kiedy mierzona jest odpowiedź wapniowa, oznacza to, że receptor łączy się z endogenną podjednostką Gαq komórkowego systemu ekspresji. Gdy nie obserwuje się sygnału fluorescencyjnego, można zastosować protokoły pomiaru zmian stężeń innych przekaźników wtórnych (np. cAMP).
Można również przeprowadzić badania zależności struktura-aktywność (SAR) w celu zdefiniowania sekwencji rdzenia peptydu wymaganej do aktywacji receptora. Po pierwsze, okrojone sekwencje są oceniane w celu zdefiniowania minimalnej sekwencji aminokwasowej peptydu, która nadal jest w stanie aktywować receptor. Następnie można przebadać peptydy, w których systematycznie każdy aminokwas został podstawiony przez resztę alaniny. Badanie serii substytucji syntetycznej alaniny na receptorze pozwala określić znaczenie każdego z aminokwasów dla aktywacji receptora24,25.
Pomimo częstego stosowania i udowodnionej skuteczności, należy podkreślić, że opisany tutaj test może wymagać pewnych adaptacji, aby uzyskać optymalne wyniki dla określonych receptorów będących przedmiotem zainteresowania. Podjednostka Gα16 ma tę zaletę, że wiąże się z większością GPCR, ale może również mieć dominująco-negatywny wpływ na receptory, które endogennie sprzęgają się poprzez Gαq22. W takim przypadku przydatne może być przetestowanie różnych kombinacji białek G podczas optymalizacji nowego testu wapnia i porównanie wyników dla receptorów sprzężonych zG α q przy braku lub obecności Gα16. Można również przeprowadzić alternatywne testy, które są niezależne od oddziałującego białka G w celu wykrycia aktywacji receptora, takie jak translokacja aresztyny znakowanej GFP lub wykrywanie zmian potencjału błonowego (np. za pomocą zestawu do oznaczania potencjału błonowego FLIPR). Oprócz zastosowanego tutaj Fluo-4 AM, dostępna jest szeroka gama innych wrażliwych na wapń fluoroforów, z których każdy ma swoje własne właściwości widmowe i chemiczne. Najbardziej odpowiedni fluorofor można wybrać na podstawie GPCR, typu ogniwa i dostępnego czytnika płytek, ale konieczna jest weryfikacja eksperymentalna. Ilości transfekowanego DNA i stosunek DNA/odczynnika do transfekcji muszą być określone dla każdej kombinacji receptor-odczynnik do transfekcji-linia komórkowa. Na koniec należy pamiętać, że komórki w hodowli ciągłej pozwalają na przeprowadzenie testów przesiewowych tylko 20-25 użytecznych pasaży.

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) stanowią jedną z największych i najbardziej zróżnicowanych rodzin spośród wszystkich białek powierzchniowych komórek. Ich obecność u kręgowców, bezkręgowców, roślin, drożdży i śluzowców, a także u pierwotniaków i najwcześniejszych diploblastycznych Metazoa wskazuje, że GPCR należą do najstarszych cząsteczek związanych z transdukcją sygnału1. Ich naturalne ligandy aktywujące obejmują szeroką gamę bodźców zewnętrznych, w tym peptydy, aminy biogenne, substancje zapachowe, glikoproteiny i fotony2. W związku z tym systemy sygnalizacyjne receptor-ligand są zaangażowane w ogromną różnorodność procesów fizjologicznych. Szerokie spektrum funkcjonalne sprawia, że są one idealnie odpowiednie do opracowywania leków terapeutycznych obejmujących szeroki zakres ludzkich schorzeń. Około 50-60% obecnych celów terapeutycznych reprezentują GPCR3,4. Poza dużym znaczeniem w przemyśle farmaceutycznym, GPCR są również w centrum uwagi przy opracowywaniu nowej generacji gatunkowo specyficznych insektycydów5,6 i pestycydów w ogóle. Ponieważ naturalne ligandy wielu GPCR pozostają niezidentyfikowane, są one klasyfikowane jako sieroce receptory GPCR. Deorfanizacja tych receptorów pozwoli lepszego zrozumieć ich role fizjologiczne w organizmach i może ujawnić potencjalne cele dla nowych zastosowań terapeutycznych7.

Od czasu ery genomiki strategia farmakologii odwrotnej jest szeroko stosowana w celu deorphanizacji receptorów GPCR8. Podejście to polega na wykorzystaniu receptora sierocego jako „haczyka” do „wyłowienia” jego aktywującego ligandu z ekstraktu biologicznego lub biblioteki związków syntetycznych. W związku z tym interesujący receptor GPCR jest klonowany, a następnie transfekowany do komórkowego systemu ekspresyjnego. W najczęściej stosowanych metodach aktywację receptora określa się poprzez pomiar zmian w stężeniu cząsteczek drugiego przekaźnika9. Główne testy przesiewowe receptorów opierają się na białkach bioluminescencyjnych wrażliwych na wapń (np. aequorin)10 lub fluorescencyjnych wskaźnikach wapnia (np. Fluo-4)11. Testy oparte na fluorescencji, w których komórki wykazujące ekspresję receptora są nasycane fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia przed przesiewaniem ligandów, mają tę zaletę, że pozwalają na wysokoprzepustowe badania dzięki łatwości użycia, krótki czas odczytu oraz możliwość badania wielu receptorów sierocych na jednej płytce12.

W niniejszym materiale szczegółowo opisano i zilustrowano test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji, wykorzystując proces deorfanizacji receptora krótkiego neuropeptydu F (sNPF) u Drosophila melanogaster. Ten neuropeptydowy system sygnalizacyjny został pierwotnie scharakteryzowany przez Mertensa et al. w 2002 roku13 za pomocą testu bioluminescencji wapnia przeprowadzonego w komórkach jajnika chomika syryjskiego (CHO)14 oraz przez Fenga et al. w 2003 roku za pomocą testu elektrofizjologicznego z wykorzystaniem oocytów Xenopus15. Obecność systemu sygnalizacyjnego sNPF wydaje się być ograniczona do typu Arthropoda, gdzie jest on zaangażowany w szeroki zakres procesów, w tym w regulację żywienia, wzrostu, reakcji stresowych, lokomocji oraz rytmów okołodobowych16.

Badania nad systemami sygnalizacji neuropeptydergicznej u owadów mogą nie tylko prowadzić do wyznaczenia nowych celów dla opracowywania insektycydów, ale wiedza o ich funkcjonowaniu może być również ekstrapolowana na inne organizmy, ponieważ wiele systemów sygnalizacyjnych jest ogólnie dobrze zachowanych w toku ewolucji17. W ostatniej dekadzie dokonano dużego postępu w procesie deorfanizacji neuropeptydowych receptorów GPCR u owadów. Pomimo tych wysiłków, tylko niewielka liczba receptorów została dopasowana do ich kognatywnych ligandów, a dzięki dynamicznemu rozwojowi genomiki dostępna stała się ogromna ilość informacji sekwencyjnych dla nowych sierocych receptorów GPCR18. Dostępność metod przesiewowych o średniej i wysokiej przepustowości, takich jak oparty na fluorescencji test mobilizacji wapnia, który okazał się techniką szeroko stosowaną9,18, jest zatem nieoceniona.

Opisany tutaj fluorescencyjny test mobilizacji wapnia jest przeprowadzany na linii komórkowej ludzkich embrionalnych nerek 293T (HEK293T) i wykorzystuje sondę fluorescencyjną do określania zmian w wewnątrzkomórkowych stężeniach wapnia po aktywacji receptora. Aby zagwarantować wysoki poziom ekspresji i translacji receptora, do końca 5’ sekwencji kodującej receptor dodaje się konsensusową sekwencję Kozaka19, która następnie jest klonowana w wektorze ekspresyjnym (np. seria wektorów pcDNA dla linii komórkowych ssaków). Ponieważ na podstawie samych informacji o sekwencji trudno jest przewidzieć endogenne sprzęganie z białkiem G sierocych receptorów GPCR, cząsteczki drugiego przekaźnika (np. wapń lub cAMP), które są modulowane po aktywacji receptora, często pozostają nieznane przed identyfikacją ligandu. Aby rozwiązać ten problem, można współekspresować20,21,22 niespecyficzne białka G z rodziny Gq (np. mysi Gα15 lub ludzki Gα16 [użyty tutaj]) lub chimeryczne białka G (np. Gαqi5), które oddziałują z większością GPCR i indukują uwalnianie wapnia. Po związaniu ligandu z receptorem, GPCR ulega zmianie konformacyjnej, która prowadzi do aktywacji specyficznych szlaków wewnątrzkomórkowych. Cząsteczka guanozynodifosforanu (GDP), związana w warunkach spoczynkowych z podjednostką Gα16, zostanie zastąpiona cząsteczką guanozynotrifosforanu (GTP). Powoduje to dysocjację heterotrymerycznego białka G na podjednostkę Gα16 oraz podjednostkę Gβγ. Podjednostka Gα16 aktywuje fosfolipazę Cβ (PLCβ), która z kolei hydrolizuje związany z błoną fosfatydyloinozytobisfosforan (PIP2), co prowadzi do powstania diacyloglicerolu (DAG) i inozytolo-trifosforanu (IP3). IP3 rozprzestrzenia się w cytoplazmie i aktywuje zależne od IP3 kanały wapniowe obecne w błonie retikulum endoplazmatycznego, co indukuje uwalnianie wapnia do cytoplazmy.

Uwalnianie wapnia po aktywacji receptora następuje w ciągu kilku sekund i może być wykrywane poprzez załadowanie komórek przed testem przesiewowym barwnikiem wrażliwym na wapń, takim jak Fluo-4 acetometyl (AM)11. Grupa estrowa AM umożliwia fluoroforowi przenikanie przez błonę komórkową i jest odcinana przez esterazy cytoplazmatyczne po dostaniu się do wnętrza komórki. W konsekwencji ładunki ujemne barwnika fluorescencyjnego zostają odsłonięte, co zapobiega jego dyfuzji na zewnątrz komórki i pozwala na oddziaływanie z jonami wapnia. Sygnał fluorescencyjny Fluo-4 jest pomijalny w komórkach w stanie spoczynku, w których stężenia wapnia znajdują się jedynie w zakresie nanomolarnym. Jednakże, gdy wapń zostaje uwolniony po aktywacji receptora, sygnał może wzrosnąć zależnie od stężenia ponad 100-krotnie, co zapewnia wysoki stosunek sygnału do szumu. Fluo-4 wykazuje również szeroki zakres dynamiczny w raporcie [calcium] przy Kd(calcium) wynoszącym 345 nM, co czyni go odpowiednim do pomiaru fizjologicznie istotnych zmian poziomu wapnia w szerokim zakresie komórek. Wzbudzenie Fluo-4 zachodzi przy 488 nm, a fluorescencję emisyjną mierzy się przy 525 nm11. Fluorymetry, takie jak fluorescencyjny obrazujący czytnik płytek (FLIPR)23, NOVOstar lub FlexStation (urządzenie stacjonarne)12, to systemy o średniej lub wysokiej przepustowości, które umożliwiają jednoczesne dodawanie związków i detekcję sygnału Fluo-4 po aktywacji receptora dla każdej studzienki na płytce testowej. Opisany tutaj test mobilizacji wapnia opiera się na stacjonarnym systemie mikropłytek 96-dołkowych.

Oprogramowanie SoftMax Pro (oprogramowanie) służy do obsługi urządzenia stacji oraz do analizy danych. Program natychmiast wyświetla wyniki w formie grafów w formacie 96-dołkowym. Można jednocześnie wybrać wiele dołków, aby porównać ich wyniki na jednym wykresie. Wartości względnych jednostek fluorescencji (RFU) w każdym dołku każdej kolumny są mierzone jednocześnie przez dwie minuty, zaczynając przed dodaniem związków do dołków i kontynuując po pomiarze sygnału fluorescencyjnego następującego po aktywacji receptora. Zazwyczaj trend krzywej agonisty pokrywa się z linią bazową aż do momentu dodania związku aktywującego do komórek, co skutkuje gwałtownym wzrostem sygnału fluorescencyjnego. Wysokość piku koreluje z końcową stężeniem agonisty w dołku. Po piku sygnał fluorescencyjny powoli opada w stronę poziomu linii bazowej. Pomiary RFU można przekształcić w krzywe zależności odpowiedzi od stężenia, aby wyznaczyć wartość EC50 (półmaksymalne stężenie efektywne) liganda. Generalnie, aby sporządzić wiarygodną krzywą zależności odpowiedzi od stężenia, należy przeprowadzić co najmniej trzy niezależne badania przesiewowe, z których każde obejmuje trzy powtórzenia serii stężeń.

Zaleca się uwzględnienie w projekcie eksperymentalnym kilku kontroli pozytywnych i negatywnych. Przede wszystkim należy przeprowadzić kontrolę transfekcji, t.j. wdrożenie receptora z znanym ligandem. Pozwala to zweryfikować, czy czynnik transfekcyjny był aktywny. Zaleca się również włączenie eksperymentu kontrolnego z agonistą endogennego receptora danej linii komórkowej oraz kontroli negatywnej (np. bufor do płukania), aby monitorować stan i żywotność komórek oraz wykluczyć możliwość zanieczyszczenia buforu do płukania czynnikiem, który mógłby wywołać odpowiedź autofluorescencyjną. Często stosowanymi agonistami są peptyd pochodzący od receptora aktywowanego przez proteazę-1 (PAR1), który działa jako selektywny agonista PAR1, lub karbachol, który aktywuje receptor acetylocholiny. Należy również przetestować komórki transfekowane pustym wektorem ekspresyjnym, aby wykluczyć oddziaływanie aktywnych związków z endogennymi receptorami komórki. W przypadku różnych układów sygnałowych może być wymagana optymalizacja kilku parametrów opisanych w poniższym protokole. Schematyczna figura pełnego testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji przedstawiona jest na Rysunku 1.
<img alt="Równowaga statyczna w teście fluorescencyjnym; schemat systemu hodowli komórkowych; kinetyka aktywacji białek G." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ogólny schemat testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji. Zautomatyzowana obsługa cieczy i jednoczesne pomiary fluorescencji są wykonywane za pomocą czytnika płytek mikrotitracyjnych stacji roboczej, sterowanej przez oprogramowanie. Stacja robocza zawiera trzy wysuwy: jedną dla płytki z komórkami, jedną dla płytki z związkami oraz jedną dla statywu z końcówkami. Wbudowana pipeta przenosi związki z jednej kolumny płytki z związkami do odpowiadającej jej kolumny płytki z komórkami (krok 1). Każda studzienka płytki z komórkami zawiera monowarstwę komórek HEK293T, które zostały współtransfekowane badanym GPCR oraz niespecyficzną podjednostką Gα16. Gdy związek aktywuje receptor, GDP związany z Gα16 zostaje zastąpiony przez GTP. Podjednostka Gα16 następnie dysocjuje z kompleksu Gβγ i aktywuje fosfolipazę Cβ (PLCβ), która z kolei hydrolizuje fosfatydyloinozytobisfosforan (PIP2), prowadząc do powstania diacyloglicerylu (DAG) i inozytolotrifosforanu (IP3). IP3 aktywuje zależne od IP3 kanały wapniowe obecne w błonie retikulum endoplazmatycznego, indukując uwalnianie wapnia do cytoplazmy. Oddziaływanie wapnia z Fluo-4 (którym komórki są obciążone przed dodaniem związku) skutkuje sygnałem fluorescencyjnym (krok 2). Oprogramowanie prezentuje wyniki jako wartości relatywnych jednostek fluorescencji (RFU) w funkcji czasu, a wysokości szczytów korelują ze stężeniem ligandu w sposób zależny od stężenia. Dane te mogą być następnie przekształcone w krzywą zależność odpowiedź-stężenie w celu wyznaczenia wartości EC50 dla pary ligand-receptor (krok 3).

<table><tbody><tr><td>HEK293T komórki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA (0,25%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuwodna (EDTA)</td><td>MP Biomedicals</td><td>195173</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoka poziom glukozy&nbsp; (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (P-S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>jetPRIME</td><td>Transfekcja</td><td>Polyplus 114-01</td><td>Odczynnik do transfekcji FuGENE HD (Promega); Lipofectamina LTX & Plus Odczynnik (technologie życia)</td></tr><tr><td>Dializowana płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0392</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna z ludzkiego osocza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik A100, Bufor do lizy</td><td>Chemometec</td><td>910-0003</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik B, Bufor stabilizujący</td><td>Chemometec</td><td>910-0002</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HBSS: Zrównoważony roztwór soli</td><td>Hanka Sigma-Aldrich</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Probenecyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (1 M)</td><td>Vel</td><td>2781</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pluronowy</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td>Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Zieleń wapniowa-1, ... (Invitrogen)</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych TPP (T-75 i T-150)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503 i Z707554</td><td></td></tr><tr><td>urządzenie FlexStation</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td>NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)</td></tr><tr><td>Czarnościenne płytki polistyrenowe (96 dołków) z przezroczystym dnem</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td>Corning 96-dołkowe płaskie przezroczyste dno czarne mikropłytki pokryte polistyrenem poli-D-lizyną</td></tr><tr><td>NucleoCassette</td><td>Chemometec</td><td>941-0001</td><td></td></tr><tr><td>NucleoCounter NC-100</td> Probówki do mikrowirówek <td>Chemometec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, silikonowane</td><td>BioCision</td><td>BCS-2470</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowe płytki 96-dołkowe w kształcie litery V</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651101</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe, końcówki do pipet FlexStation</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>9000-0912</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Soft Max Pro</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem g za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Przez ponad 20 lat, farmakologia odwrotna była najważniejszą strategią odkrywania ligandów aktywujących receptory sprzężone z sierocym białkiem G (GPCR). Początek odwrotnego testu farmakologicznego polega na klonowaniu, a następnie transfekcji GPCR będącego przedmiotem zainteresowania w komórkowym systemie ekspresji. Heterologiczny receptor eksprymowany jest następnie poddawany próbie wykorzystania złożonej biblioteki ligandów kandydujących w celu zidentyfikowania liganda (ligandów) aktywującego receptor. Aktywację receptora można ocenić, mierząc zmiany w stężeniu cząsteczek reporterowych drugiego przekaźnika, takich jak wapń lub cAMP. Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest często stosowanym średnioprzepustowym testem farmakologii odwrotnej. Sierocy GPCR ulega przejściowej ekspresji w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych 293T (HEK293T), a rozwiązły konstrukt Gα16 jest kotransfekowany. Po związaniu liganda aktywacja podjednostki Gα16 indukuje uwalnianie wapnia z retikulum endoplazmatycznego. Przed badaniem przesiewowym ligandów komórki wykazujące ekspresję receptora są ładowane fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia, Fluo-4 acetoksymetylowym. Sygnał fluorescencyjny Fluo-4 jest znikomy w komórkach w warunkach spoczynku, ale może być wzmocniony ponad 100-krotnie po interakcji z jonami wapnia, które są uwalniane po aktywacji receptora. Opisana technika nie wymaga czasochłonnego tworzenia stabilnie transfekowanych linii komórkowych, w których transfekowany materiał genetyczny jest integrowany z genomem komórki gospodarza. Zamiast tego przejściowa transfekcja, generująca tymczasową ekspresję genu docelowego, jest wystarczająca do przeprowadzenia testu przesiewowego. Konfiguracja umożliwia średnioprzepustowe badania przesiewowe setek związków. Kotransfekcja rozwiązłego Gα16, który łączy się z większością GPCR, umożliwia przekierowanie wewnątrzkomórkowego szlaku sygnałowego w kierunku uwalniania wapnia, niezależnie od natywnego szlaku sygnałowego w warunkach endogennych. Komórki HEK293T są łatwe w obsłudze i przez lata udowodniły swoją skuteczność w testach desierotyzacji receptorów. Jednak optymalizacja testu dla określonych receptorów może pozostać konieczna.

Dla wszystkich czterech peptydów sNPF Drosophila (Drome-sNPF-1: AQRSPSLRLRFamide, Drome-sNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-sNPF-3: PQRLRWamide, Drome-sNPF-4: PMRLRWamide) przetestowano serie stężeń w zakresie od 50 µM do 0,001 nM na komórkach HEK293T przejściowo wykazujących ekspresję receptora sNPF Drosophila oraz niespecyficznej podjednostki Gα16. GPCR był aktywowany przez wszystkie cztery peptydy w stężeniach końcowych do 0,1 nM, a aktywacja receptora była zależna od stężenia. Rycina 2 przedstawia wykresy odpowiadające jednej z trzech powtórzeń serii stężeń Drome-sNPF-1. Kontrola negatywna (bufor płuczący) nie wywołała sygnału fluorescencyjnego, natomiast kontrola pozytywna (PAR1 – 1 µM) wywołała silną aktywację endogennego receptora aktywowanego proteazą-1, co doprowadziło do uzyskania wysokiego sygnału fluorescencyjnego (± 30 000 RFU). Należy zauważyć, że odchylenie od typowej krzywej może wskazywać na nieprawidłowości. Na przykład ciągły wzrost krzywej bez powrotu do poziomu bazowego może być związany z sygnałami niezależnymi od receptora, takimi jak obecność ionoforów wapnia lub uszkodzona dwuwarstwa lipidowa powodująca wycieki jonów wapnia.
Oprogramowanie umożliwia wprowadzanie formuł służących m.in. do wyznaczania procentu aktywacji lub błędów standardowych dla różnych stężeń. Uzyskane dane są wykorzystywane do sporządzenia wstępnych krzywych koncentracyjno-odpowiedzi w celu oszacowania wartości EC50, co przedstawiono dla czterech peptydów Drome-sNPF na Rysunku 3. Krzywe na Rysunku 3 zawierają również dane dla kontroli negatywnej, w której serie stężeń peptydów Drome-sNPF testowano na komórkach HEK293T przetransfekowanych pustym wektorem pcDNA3.1. Wyniki wskazują, że dodanie peptydów do tych komórek nie wpływa na receptory endogenne, lecz rzeczywiście aktywuje badany receptor. Test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji powtórzono następnie trzykrotnie w niezależnych próbach. Na podstawie wstępnych krzywych koncentracyjno-odpowiedzi z pierwotnego przesiewu dostosowano testowane stężenia tak, aby objęły zakres dynamiczny krzywej (Rysunek 4). Wartości EC50 dla Drome-sNPF-1 (2,04 ± 1,48 nM [95% przedział ufności]), Drome-sNPF-2 (5,89 ± 3,74 nM), Drome-sNPF-3 (5,55 ± 3,95 nM) oraz Drome-sNPF-4 (0,50 ± 1,01 nM) są zbliżone, co wskazuje na ich równą skuteczność w aktywacji receptora.
<img alt="Wykres kinetycznego pomiaru fluorescencji pokazujący RFU w funkcji czasu dla wielu stężeń (od 0,05 do 50 µM)." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wynik graficzny z oprogramowania dla odpowiedzi fluorescencyjnej zależnej od receptora dla serii stężeń. Przetestowano dwanaście końcowych stężeń (w zakresie od 50 µM do 0,001 nM) peptydu Drome-sNPF-1 na receptorze Drome-sNPF. Aktywację wyrażono w wartościach względnych jednostek fluorescencji (RFU). Górny wykres przedstawia wyniki dla sześciu najwyższych stężeń, a dolny wykres dla sześciu najniższych stężeń. Kontrolą dodatnią (+) jest PAR1 (1 µM), a kontrolą ujemną (-) bufor płuczący.
<img alt="Krzywe dawka-odpowiedź aktywacji sNPFR; wykres; wartości EC₅₀; stężenie vs. % aktywacji." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Wstępne krzywe zależność-stężenie dla peptydów sNPF Drosophila wyznaczone za pomocą pojedynczego fluorescencyjnego testu mobilizacji wapnia. Krzywe zależność-stężenie dla receptora sNPF Drosophila przejściowo wyrażonego w komórkach HEK293T dla czterech peptydów sNPF Drosophila przedstawiono w kolorze niebieskim. Dla kontroli negatywnych (przedstawione w kolorze czerwonym) peptydy testowano na komórkach HEK293T transfekowanych pustym wektorem pcDNA3.1. Odpowiedzi fluorescencyjne przedstawiono jako wartości względne (%) w stosunku do wartości najwyższej (100% aktywacji). Krzywe są wynikiem jednego eksperymentu, w którym każda seria stężeń była mierzona w trzech powtórzeniach. Pionowe słupki reprezentują błędy standardowe średniej (SEM), które czasami są mniejsze niż zastosowane symbole (w takim przypadku przedstawiono tylko symbole).
<img alt="Krzywe dawka-odpowiedź dla aktywacji receptorów; wartości EC50 na wykresie czteroczęściowym przedstawiającym logarytm stężenia." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Krzywe stężenie-odpowiedź i odpowiadające im wartości EC50 peptydów sNPF z Drosophila wyznaczone w trzech niezależnych testach mobilizacji wapnia opartych na fluorescencji. Krzywe stężenie-odpowiedź receptora sNPF z Drosophila przejściowo wykazanego w komórkach HEK293T dla czterech peptydów sNPF z Drosophila stanowią wynik trzech niezależnych pomiarów, z których każdy wykonano w trzech powtórzeniach (n ≥ 9). Odpowiedzi fluorescencyjne przedstawiono jako wartości względne (%) względem wartości najwyższej (100% aktywacji). Gwiazdki oznaczają stężenia, dla których n ≤ 9. Słupki błędów wskazują SEM, które niekiedy są mniejsze niż użyte symbole (w takim przypadku przedstawiono tylko symbole). Wartości EC50 przedstawiono wraz z 95-procentowymi przedziałami ufności.

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zidentyfikowanie funkcjonalnie aktywujących ligandów osieroconych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR). Osiąga się to poprzez przejściową transfekcję interesującego białka GPCR oraz współtransfekcję niespecyficznego konstruktu G alpha 16 w systemie ekspresji komórkowej, aby uzyskać tymczasową heterologiczną ekspresję obu białek. W drugim kroku do transfekowanych komórek wprowadza się czuły na wapń barwnik Fluo-4, który wykrywa uwalnianie wapnia z magazynów wewnątrzkomórkowych poprzez wzrost sygnału fluorescencyjnego w wyniku oddziaływania z wapniem.Następnie przeprowadza się fluorescencyjny test mobilizacji wapnia, polegający na poddaniu receptora wyrażonego heterologicznie działaniu biblioteki związków będących potencjalnymi ligandami, aby zidentyfikować związki aktywujące receptor i wywołujące wewnątrzkomórkową kaskadę sygnałową, która prowadzi do uwalniania wapnia z retikulum endoplazmatycznego, co można zmierzyć jako sygnał fluorescencyjny. Otrzymane wyniki pozwalają wyznaczyć krzywą zależności odpowiedzi od stężenia wraz z połowicznym maksymalnym stężeniem efektywnym ligandu aktywującego, co opiera się na detekcji różnych sygnałów fluorescencyjnych w zależności od stężeń ligandów podanych do systemu ekspresji komórkowej. Główną zaletą zastosowania transfekcji przejściowej w celu uzyskania tymczasowej ekspresji GPCR w porównaniu do wykorzystania stabilnych linii komórkowych klonalnych jest brak konieczności czasochłonnego tworzenia takich stabilnie transfektowanych linii komórkowych.Transfekcja niespecyficznej podjednostki G alpha 16 może przekierować wewnątrzkomórkową ścieżkę sygnalizacyjną większości receptorów GPCR w kierunku uwalniania wapnia, niezależnie od rodzimej ścieżki sygnalizacyjnej w warunkach endogennych. Dzięki temu układ ten umożliwia średnioprzepustowe przesiewanie setek związków na wybranych receptorach GPCR w krótkim czasie. Procedurę tę zademonstrują yellow gas, doktorant, oraz Nick Su, technik z naszego laboratorium. Przez trzy dni przed właściwym testem mobilizacji wapnia hoduj komórki HEK 2 93 T w kolbach T 75, dokonując pasażowania komórek po osiągnięciu 80% konfluencji. Przygotuj jedną kolbę T 75 do transfekcji konstruktem receptora oraz jedną do transfekcji pustym wektorem ekspresyjnym jako kontrolę negatywną.Inkubuj kolby w temperaturze 37°C w nawilżonym inkubatorze z 5%CO2 przez 20 do 24 godzin, aż kultury komórkowe osiągną 50 do 70% konfluencji, jak pokazano tutaj. Następnie do probówki mikroodśrodkowej o pojemności 1,5 ml dodaj 3,9 µg konstruktu receptora lub pustego wektora oraz 3,9 µg konstruktu ekspresyjnego G alpha 16. Dodaj 500 µl buforu JetPrime.Wymieszać dokładnie, wirując probówkę w wstrząsarzu typu vortex, a następnie krótko wirować w wirówce. Następnie dodać 37,5 µL odczynnika jet prime, wymieszać w wstrząsarzu typu vortex i wirować przez jedną minutę z maksymalną prędkością. Inkubować mieszaninę do transfekcji przez 10 minut.W temperaturze pokojowej oznacz jedną populację komórek jako transfekowaną wektorem ekspresyjnym kodującym interesujący GPCR oraz konstrukt G alpha 16, a drugą kolbę wektorem pustym oraz konstrukt G alpha 16. Po inkubacji dodawaj mieszaninę transfekcyjną kroplami do pożywki hodowlanej, pamiętając o pipetowaniu bezpośrednio do pożywki i unikaniu kontaktu ze ściankami kolby hodowlanej. Inkubuj kolby w temperaturze 37 °C w humidyfikowanym inkubatorze z 5% CO2 przez 20 do 24 godzin przed wykonaniem testu mobilizacji wapnia.Ztransfectedowane komórki zbiera się i wysiewa do czarnych płytek 96-dołkowych z przezroczystym dnem. Najpierw pokrywa się dołki 60 µL w temperaturze pokojowej.Fosforanowy bufor solny z fibronektyną. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę z zamkniętą pokrywą. Odpić roztwór z dołków i ponownie inkubować płytki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej bez pokrywy.W międzyczasie usuń z komórek zużytą pożywkę wzrostową. Przepłucz martwe komórki 3 mL PBS, a następnie usuń PBS. Następnie dodaj 3 mL PBS z trypsyną i EDTA w temperaturze pokojowej, inkubuj przez jedną minutę, a po tym czasie usuń roztwór.Na tym etapie morfologia komórek zmienia się z gwiaździstej na sferyczną. Odczep komórki od dna kolby poprzez delikatne opukanie, a następnie zbierz je, płucząc kilkakrotnie 10 mililitrami pożywki transferowej DM w temperaturze pokojowej.Przenieś komórki do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml. Aby określić liczbę komórek na mililitr, dodaj 100 µl hodowli komórkowej do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Następnie dodaj 100 µl buforu lizującego i wymieszaj, opukując probówkę.Na koniec należy dodać 100 µL buforu stabilizującego i wymieszać poprzez delikatne opukiwanie. Napełnić kasetę Nucleo zawiesiną komórkową i policzyć komórki za pomocą licznika. Oprogramowanie NucleoView automatycznie mnoży liczbę komórek przez trzy, ponieważ komórki zostały rozcieńczone trzykrotnie.Podczas dodawania buforu lizującego i stabilizującego, rozcieńcz komórki do końcowego stężenia 600 000 komórek na mililitr i nanieś 150 µL zawiesiny komórek do każdego dołka w powlekonych płytkach. Aby uzyskać gęstość komórek wynoszącą około 90 000 komórek na dołek, unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza i delikatnie stuknij płytkę, aby równomiernie rozprowadzić komórki. W celu uzyskania ciągłej warstwy komórek, inkubuj płytki w temperaturze 37 °C w humidyfikowanym inkubatorze z 5% CO2 przez 16 do 24 godzin.Odpiąć pożywkę z komórek. Przemyć komórki 200 µL PBS na dołek, a następnie usunąć PBS. Należy pamiętać, że wszystkie kolejne kroki obejmujące operacje na komórkach powinny być wykonywane w ciemności, ponieważ od tego momentu komórki będą obciążone fluoro four.Do każdej dołka należy dodać 55 µL buforu do ładowania, a następnie owinąć płytkę folią aluminiową, aby zapobiec naświetlaniu, i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie należy wykorzystać bufor do płukania w celu rozpuszczenia wysuszonych peptydów w silikonizowanych probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Należy przygotować szereg rozcieńczeń, aby przeprowadzić analizę zależności odpowiedzi od stężenia i wyznaczyć wartość EC 50 liganda.Należy pamiętać, że podczas badania 50 µL ligandu z płytki z związkami zostanie przeniesionych do dołka zawierającego 100 µL buforu płuczącego na płytce z komórkami, dlatego związki należy przygotować w trzykrotności pożądanego stężenia końcowego. Następnie należy dodać 70 µL ligandu do odpowiadających im dołków na płytce z związkami w trzech powtórzeniach. Na każdej płytce należy uwzględnić kontrole pozytywne i negatywne.Odlej bufor do ładowania z płytki z komórkami i dodaj 100 µL buforu do mycia do każdego dołka, zapobiegając ekspozycji na światło. Inkubuj płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odlej bufor do mycia z płytki z komórkami i dodaj do każdego dołka 100 µL świeżego buforu do mycia.Inkubuj płytkę z komórkami, płytkę z przeciwciała oraz statyw z końcówkami przez 15 minut w temperaturze 37°C. Utwórz i wgraj do oprogramowania odpowiedni plik protokołu, a następnie uruchom jednostkę kontroli temperatury dla komory odczytu. Odpowiedzi wapniowe są mierzone w temperaturze 37°C przez dwie minuty, przetwarzając po jednym rzędzie naraz, z odstępem 1,52 sekundy między kolejnymi odczytami przy 525 nm.Ustaw wzbudzenie dla flu oh four na 488 nanometrów i przenieś całkowitą objętość 50 µL związku na płytkę z komórkami. Odczyt następuje po 18 sekundach. Rozpocznij z prędkością dozowania ustawioną na 26 µL/s i wysokością pipety wynoszącą 135 µL.Umieść płytkę z substancją, płytkę z komórkami oraz statyw z końcówkami w odpowiednich szufladach urządzenia stacyjnego. Przed rozpoczęciem właściwego przesiewu w trybie flex, wykonaj pojedynczy odczyt płytki z komórkami przy tej samej długości fali wzbudzenia i emisji w trybie końcowym (endpoint). Uruchom test, a następnie przejdź do analizy danych przy użyciu przedstawionego oprogramowania.Poniżej przedstawiono wykresy odpowiadające jednej z trzech powtórzeń serii stężeń doofus short NPF one. Kontrola negatywna nie wywołała sygnału fluorescencyjnego. Z kolei kontrola pozytywna spowodowała silną aktywację endogennego receptora aktywowanego przez proteazy 1, co doprowadziło do uzyskania wysokiego sygnału fluorescencyjnego.Oprogramowanie umożliwia wprowadzanie formuł służących m.in. do wyznaczania procentowego stopnia aktywacji lub błędów standardowych dla poszczególnych stężeń. Uzyskane dane są wykorzystywane do sporządzenia wstępnych krzywych zależności odpowiedzi od stężenia w celu oszacowania wartości EC 50, co przedstawiono dla czterech krótkich peptydów NPF z przełyku. Krzywe zawierają również dane dla kontroli negatywnej, w której serie stężeń krótkich peptydów NPF z drosofil testowano na komórkach transfekowanych pustym wektorem.Wyniki wskazują, że dodanie peptydów do tych komórek nie wpływa na receptory endogenne, ale rzeczywiście aktywuje badany receptor. Przeprowadzono wstępne krzywe zależności odpowiedzi od stężenia w teście mobilizacji wapnia opartym na fluorescencji, a przetestowane stężenia dostosowano tak, aby objęły zakres dynamiczny krzywej. Wartości EC 50 dla drosophila short npf 1, 2, 3 oraz four są zbliżone, co wskazuje, że wykazują one równą skuteczność w aktywacji receptora zgodnie z przyjętą procedurą.W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, które aminokwasy peptydu są kluczowe dla aktywacji receptora, można przeprowadzić inne metody, takie jak badania zależności struktura-aktywność. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania mobilizacji wapnia opartej na fluorescencji jako metody identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów receptorów sprzężonych z białkiem G. Obejmuje to utrzymanie systemów ekspresyjnych w stabilnych liniach, a następnie transfekcję systemu komórkowego receptorem będącym przedmiotem zainteresowania.Po utrwaleniu można przeprowadzić test mobilizacji wapnia.

characterization-g-protein-coupled-receptors-fluorescence-based

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G poprzez test ruchliwości wapnia oparty na fluorescencji

Wykorzystując system obrazowania z dwufotonową mikroskopią o rozdzielczości spektralnej, uzyskano mapy wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli dla komórek ekspresujących receptory błonowe, w których przypuszcza się tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych. Na podstawie map wydajności FRET możliwe jest oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanego kompleksu oligomeru.

In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

W niniejszej pracy opisujemy szczegółowe metody obrazowania żywych komórek służące do badania chemotaksji. Przedstawiamy metody mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania dynamiki czasowo-przestrzennej zdarzeń sygnalizacyjnych w migrujących komórkach. Pomiar zdarzeń sygnalizacyjnych pozwala nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób sieć sygnalizacyjna GPCR umożliwia wyczuwanie gradientu chemoatraktantów i kontroluje kierunkową migrację komórek eukariotycznych.

Obrazowanie zdarzeń sygnalizacyjnych pośredniczonych przez receptory sprzężone z białkiem G (GPCR), które kontrolują chemotaksję Dictyostelium discoideum

Proste metody wykrywania selektywnej aktywacji białek G przez receptory sprzężone z białkiem G pozostają wyjątkowym wyzwaniem w sygnalizacji komórkowej. W tym przypadku biosensory rezonansowego transferu energii (FRET) Fӧrster zostały opracowane poprzez parowanie peptydów GPCR z białkiem G w celu zbadania zmian konformacyjnych w kontrolowanych stężeniach w żywych komórkach.

Selektywne dla białka G konformacje GPCR mierzone za pomocą czujników FRET w teście fluorometrycznym zawiesiny żywych komórek

Wiązanie trifosforanu guanozyny (GTP) jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń aktywacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR). Protokół ten opisuje, jak farmakologicznie scharakteryzować specyficzne interakcje GPCR-ligand poprzez monitorowanie wiązania znakowanego radioaktywnie analogu GTP, [35S]guanozyno-5'-O-(3-tio)trifosforanu ([35S]GTPγS), w odpowiedzi na interesujący ligand.

Pomiar sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G poprzez znakowane radioaktywnie wiązanie GTP

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Opracowano ulepszony protokół testu mobilizacji wapnia z komórkami śródbłonka, używanego do identyfikacji ligandów receptorów aktywowanych proteazą (PAR). Nowy protokół skraca całkowity czas oznaczania o 90-120 minut i pozwala uzyskać powtarzalne krzywe stężenie-odpowiedź.

Charakterystyka modulatorów receptorów aktywowanych proteazą za pomocą testu mobilizacji wapnia za pomocą czytnika płytek

Protokół ten opisuje wykorzystanie biosensorów opartych na BRET do pomiaru aktywacji białka G w czasie rzeczywistym w żywych komórkach HEK293 po stymulacji ligandów sprzężonych z białkiem G. Tutaj receptor β2-adrenergiczny oraz receptor kannabinoidowy typu 1 służą jako przykłady do wykazania efektywności czujników dla kilku podtypów białek G oraz w różnych GPCR.

Biosensory białka G oparte na BRET do pomiaru aktywności receptorów sprzężonych z białkiem G w komórkach żywych

Opisano metodę szacowania stałej powinowactwa agonisty do stanu aktywnego (Kb) receptora sprzężonego z białkiem G. Analiza dostarcza bezwzględnych lub względnych wartości Kb w zależności od tego, czy konstytutywna aktywacja receptora jest mierzalna. Nasza metoda ma zastosowanie do różnych odpowiedzi występujących w kaskadzie sygnałowej po aktywacji receptora.

Kwantyfikacja aktywności agonistycznej receptorów sprzężonych z białkiem G

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Poznaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji do identyfikacji ligandów aktywujących osierocone receptory GPCR. Metoda wykorzystuje komórki HEK293T i pozwala na szybki, średnio-przepustowy screening związków.

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Przeglądaj więcej filmów