Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest identyfikacja funkcjonalnie aktywujących ligandów receptorów sprzężonych z sierocym białkiem G lub G PCR. Osiąga się to poprzez przejściową transekcję, A-G-P-C-R będącą przedmiotem zainteresowania i COT transektującą rozwiązły konstrukt G alfa 16 w komórkowym systemie ekspresji w celu uzyskania tymczasowej heterologicznej ekspresji obu białek. W drugim etapie transfekowane komórki są ładowane wrażliwym na wapń barwnikiem grypy oh four, który wykrywa uwalnianie wapnia z zapasów wewnątrzkomórkowych poprzez wzrost sygnału fluorescencyjnego po interakcji z wapniem.

Następnie przeprowadza się test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji, rzucając wyzwanie heterologicznemu receptorowi ekspresyjnemu za pomocą biblioteki związków kandydujących ligandów w celu określenia związków, które aktywują receptor i wywołują wewnątrzkomórkową kaskadę sygnalizacyjną powodującą uwolnienie wapnia z retikulum endoplazmatycznego, co można zmierzyć jako sygnał fluorescencyjny. Uzyskuje się wyniki, które pokazują krzywą stężenie-odpowiedź z połową maksymalnego skutecznego stężenia liganda aktywującego, która opiera się na wykrywaniu różnych sygnałów fluorescencyjnych w zależności od stężeń ligandów podawanych do komórkowego układu ekspresyjnego. Główną zaletą wykonywania przejściowej transfekcji w celu uzyskania tymczasowej ekspresji GPCR w porównaniu z użyciem stabilnych klonalnych linii komórkowych jest to, że nie wymaga to czasochłonnego tworzenia takich stabilnie transfekowanych linii komórkowych

Transfekcja rozwiązłej podjednostki G alfa 16 może przekierować wewnątrzkomórkowy szlak sygnałowy większości GPCR w kierunku uwalniania wapnia, niezależnie od natywnego szlaku sygnałowego w warunkach endogennych. W związku z tym konfiguracja ta umożliwia średnioprzepustowe badania przesiewowe setek związków na interesujących nas GPCR w krótkim czasie, wykazując, że procedura będzie żółtym gazem, doktorant i Nick Su, technik z naszego laboratorium Hoduj limfocyty T HEK 2 93 w kolbach T 75 na trzy dni przed faktycznym testem mobilizacji wapnia, przejść przez komórki, gdy osiągnięte zostanie zbieg 80%. Przygotować jedną kolbę T 75 do transfekcji z konstruktem receptorowym i jedną do transfekcji z pustym wektorem ekspresji jako kontrolą ujemną.

Inkubować kolby w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 przez 20 do 24 godzin, aż kultury komórkowe zbliżą się do 50 do 70% konfluencji, jak pokazano tutaj. Następnie dodaj 3,9 mikrograma konstruktu receptora lub pustego wektora i 3,9 mikrograma konstruktu ekspresji G alfa 16 do 1,5 mililitrowej mikrorurki fuge. Dodać 500 mikrolitrów bufora jet prime.

Dobrze wymieszaj, obracając rurkę, a następnie krótko wirując. Następnie dodaj 37,5 mikrolitra wiru odczynnika jet prime i wiruj przez jedną minutę z maksymalną prędkością. Inkubować mieszankę transfekcyjną przez 10 minut.

W temperaturze pokojowej oznaczyć jedną populację komórek jako transfekowaną wektorem wyrażenia, kodując interesujący nas GPCR i konstrukt G alfa 16, a drugą kolbę pustym wektorem i konstruktem G alfa 16. Po inkubacji dodać mieszaninę do transfekcji kroplami do pożywki do hodowli komórkowej, upewniając się, że pipetujesz bezpośrednio do pożywki i unikając kontaktu ze ściankami kolby hodowlanej. Inkubować kolby w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 przez 20 do 24 godzin w celu przeprowadzenia testu mobilizacji wapnia.

Transfekowane komórki są zbierane i wysiewane do 96. Dobrze czarne ścianki przezroczyste płyty dolne. Najpierw pokryj płytki 60 mikrolitrami na studzienkę o temperaturze pokojowej.

Sól fizjologiczna buforowana fosforanami z fibronektyną. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez godzinę pod przykryciem. Usuń roztwór z dołków i ponownie inkubuj płytki przez godzinę bez pokrywki w temperaturze pokojowej.

W międzyczasie zdejmij starą pożywkę wzrostową z komórek. Spłucz martwe komórki trzema mililitrami PBS i usuń PBS. Następnie dodaj trzy mililitry PBS o temperaturze pokojowej, spróbuj EDTA, inkubuj przez jedną minutę przed usunięciem roztworu.

W tym momencie morfologia komórek zmienia się z gwiaździstego na kulisty. Poluzuj komórki z dna kolby przez delikatne stukanie i zbierz je, kilkakrotnie spłukując 10 mililitrami temperatury pokojowej. Nośnik transferowy DM em.

Przenieś komórki do 50-mililitrowej probówki sokoła. Aby policzyć liczbę komórek na mililitr, dodaj 100 mikrolitrów kultury komórkowej do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy i wymieszaj, stukając w probówkę.

Na koniec dodaj 100 mikrolitrów buforu stabilizującego i wymieszaj, stukając. Napełnij kasetę nukleo zawiesiną komórek i policz komórki za pomocą licznika. Oprogramowanie do podglądu nukleo automatycznie mnoży liczbę komórek przez trzy, ponieważ komórki zostały rozcieńczone trzykrotnie.

Dodając bufor do lizy i stabilizacji, rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia 600 000 komórek na mililitr i wysiać 150 mikrolitrów komórek na studzienkę w powlekanych płytkach. Aby uzyskać gęstość komórek około 90 000 komórek na studzienkę, unikaj pęcherzyków powietrza i postukaj w płytkę, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Aby uzyskać ciągłą warstwę komórek, inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 przez 16 do 24 godzin.

Wyrzuć pożywkę z komórek. Umyj komórki 200 mikrolitrami PBS na studzienkę i usuń PBS. Zwróć uwagę, że wszystkie poniższe kroki, które obejmują operacje na komórkach, powinny być wykonywane w ciemności, ponieważ od tego momentu komórki będą ładowane fluorową czwórką.

Dodać 55 mikrolitrów buforu ładującego na studzienkę, owinąć płytkę folią aluminiową, aby zapobiec wystawieniu płytki na działanie światła i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie użyj buforu do płukania, aby rozpuścić wysuszone peptydy w silikonowanych 1,5-mililitrowych mikroprobówkach wirówkowych. Przygotować serię rozcieńczeń w celu przeprowadzenia analizy stężenie-odpowiedź i oznaczyć wartość EC 50 liganda.

Należy pamiętać, że 50 mikrolitrów liganda z płytki złożonej zostanie przeniesione do studzienki ze 100 mikrolitrami buforu płuczącego na płytce komórkowej podczas testu, więc przygotuj związki w trzykrotnym ich pożądanym stężeniu końcowym. Następnie dodaj 70 mikrolitrów liganda do odpowiedniego dołka płytki złożonej w trzech powtórzeniach. Na każdej płytce należy umieścić kontrole dodatnie i ujemne.

Wyrzuć bufor ładujący z płytki komory i dodaj 100 mikrolitrów buforu płuczącego do każdej studzienki, zapobiegając ekspozycji na światło. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzucić bufor do przemywania z płytki komory i dodać do każdego z nich 100 mikrolitrów nowego buforu do przemywania (ang. soap buffer).

Dobrze inkubuj płytkę komórkową, płytkę złożoną i stojak na końcówki przez 15 minut. W temperaturze 37 stopni Celsjusza utwórz i załaduj żądany plik protokołu za pomocą oprogramowania i aktywuj tutaj jednostkę kontrolującą temperaturę dla komory odczytu. Reakcje wapnia są mierzone w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty, rząd po rzędzie z 1,52-sekundowym odstępem między kolejnymi odczytami na głębokości 525 nanometrów.

Ustaw wzbudzenie grypy oh cztery na 488 nanometrów i przenieś całkowitą objętość 50 mikrolitrów związku na płytkę komórkową. 18 sekund po odczycie. Zacznij od prędkości dozowania ustawionej na 26 mikrolitrów na sekundę i wysokości pipety 135 mikrolitrów.

Umieść płytkę złożoną i komórkową oraz stojak na końcówki w odpowiednich szufladach urządzenia stacji. Wykonaj pojedynczy odczyt płytki ogniwa przy tej samej długości fali wzbudzenia i emisji w trybie punktu końcowego przed uruchomieniem rzeczywistego ekranu w trybie flex. Rozpocznij test i przystąp do analizy danych za pomocą przedstawionego oprogramowania.

Poniżej znajdują się wykresy odpowiadające jednej z trzech replik krótkiej serii stężeń NPF doofus. Kontrola ujemna nie indukowała sygnału fluorescencyjnego. Podczas gdy kontrola pozytywna wywołała silną aktywację endogennego receptora aktywowanego proteazą, co prowadziło do wysokiego sygnału fluorescencyjnego.

Oprogramowanie umożliwia wprowadzanie wzorów w celu określenia m.in. procentu aktywacji lub błędów standardowych różnych stężeń. Uzyskane dane wykorzystuje się do skomponowania wstępnych krzywych stężenie-odpowiedź w celu oszacowania wartości EC 50, jak pokazano dla czterech krótkich peptydów NPF przełyku. Krzywe zawierają również dane dotyczące kontroli ujemnej, w której szeregi stężeń krótkich peptydów NPF z rodziny drosophila badano na komórkach transfekowanych pustym wektorem.

Wyniki wskazują, że dodanie peptydów do tych komórek nie ma wpływu na receptory endogenne, ale wręcz aktywuje receptor będący przedmiotem zainteresowania. Przeprowadzono wstępne krzywe stężenie-odpowiedź w teście mobilizacji wapnia na podstawie fluorescencji, a badane stężenia dostosowano do zakresu dynamicznego krzywej. Wartości EC 50 dla Drosophila short npf 1, 2, 3 i four są podobne, co wskazuje, że są one równie silne w aktywacji receptora Po tej procedurze.

Inne metody, takie jak aktywność struktury, badania relacji, mogą być przeprowadzone w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, które aminokwasy peptydu są kluczowe dla aktywacji receptora. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić mobilizację wapnia w oparciu o fluer sense w celu identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów receptorów sprzężonych z białkiem G. Obejmuje to utrzymanie systemów ekspresji słonecznej, a następnie transfekcję systemu komórkowego przez receptor będący przedmiotem zainteresowania.

Po sztywnym teście mobilizacji wapnia można przeprowadzić test