Elektroprzędzenie Czynnik wzrostu uwalniający mikrosfery do włóknistych rusztowań

Ten protokół łączy elektroprzędzenie i mikrosfery w celu opracowania rusztowań inżynierii tkankowej do kierowania neuronami. Czynnik wzrostu nerwów zamknięto w mikrosferach PLGA i elektroprzędzono w rusztowania włókniste z kwasem hialuronowym (HA). Bioaktywność białka badano poprzez wysiewanie rusztowań pierwotnymi zwojami korzenia grzbietowego piskląt i hodowlę przez 4-6 dni.

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie wieloaspektowego środowiska wspierającego wzrost i naprawę nerwów. Osiąga się to poprzez najpierw zamknięcie czynników wzrostu w degradowalnych mikrosferach. Drugim krokiem jest przygotowanie materiału podporowego dla większości środowiska.

Następnie mikrosfery i materiał nośny są łączone i elektroprzędzone w wyrównane włókniste rusztowanie. Ostatnim krokiem jest przetestowanie rusztowania za pomocą neuronów zwojów zwojów korzenia grzbietowego piskląt. Ostatecznie mikroskopia immunofluorescencyjna służy do wykazania, że wzrost i kierunek neurytów jest przyspieszony w porównaniu z kontrolami.

Chociaż system ten jest przeznaczony do tkanki nerwowej z niewielkimi zmianami w użytych białkach i materiałach, może być również stosowany do różnych typów tkanek, w tym serc, płuc i kości. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować niezbędne odczynniki, roztwory alkoholu poliwinylowego lub PVA o stężeniu 2% i 0,5% w wodzie dejonizowanej, roztwór o stężeniu 2% objętości alkoholu izopropylowego i wody dejonizowanej oraz wodny roztwór pożądanego białka hydrofilowego. Miejsce. 40 mililitrów 0,5% roztworu PVA do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i odstawić w małej fiolce rozpuszczonej 300 miligramów 65 do 35 polimlekowego kwasu glikolowego lub PLGA i trzech mililitrów di chlorometanu.

Mieszalnik wirowy może być użyty do przyspieszenia rozpuszczania PLGA w połączeniu z 200 mikrolitrami roztworu białkowego i czterema mikrolitrami 2% roztworu PVA. Wlej mieszaninę białek PVA do roztworu PLGA. Rozwiązania pozostaną w większości odrębne.

Umieścić fiolkę w zlewce z lodowatą wodą za pomocą W o mocy około 10 watów, mieszać roztwór przez pięć do 10 sekund, aż powstanie jednolita kremowo-biała emulsja. Wlej emulsję do wcześniej przygotowanej 50 mililitrowej tubki zawierającej 0,5% PVA. Mieszaj roztwór z dużą prędkością na mieszalniku wirowym przez około 20 sekund.

Roztwór będzie miał mętny wygląd. Przenieś emulsję do zlewki o pojemności 200 mililitrów i umieść na płytce mieszającej z prędkością 350 obr./min na dwie minuty. Dodaj 50 mililitrów 2% alkoholu izopropylowego do zlewki na płytce mieszającej.

Pozostawić mieszaninę do dalszego mieszania przez co najmniej jedną godzinę, aby umożliwić odparowanie chlorometanu i stwardnienie PLGA. Następnie przenieś roztwór mikrosfery do probówek wirówkowych, wiruj przy 425 razy G przez trzy minuty. Mikrosfery zbierają się na dnie probówki i wydają się białe Ostrożnie usuń supernatant z probówki nad mikrosferami i przechowuj w butelce o pojemności 500 mililitrów.

Przepłucz mikrosfery wodą dejonizowaną, napełniając każdą probówkę do trzech czwartych i potrząsając nią, aby ponownie rozprowadzić mikrosfery w cieczy. Powtórzyć odwirowanie, usunięcie supernatantu i przepłukanie mikrosfer wodą dejonizowaną cztery razy po ostatnim płukaniu. Usunąć supernatant i umieścić go w butelce o pojemności 500 ml wraz z innymi próbkami.

Mikrosfery zebrane w probówkach wirówkowych należy zamrozić w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza przez noc, a następnie liofilizować przez co najmniej 24 godziny. Następujący roztwór do przędzenia elektrycznego należy przygotować wcześniej w wodzie dejonizowanej, 2% wagowo na objętość, kwasie hialuronowym związanym z metamfetaminą lub miha o 3% wagowym na objętość, 900 kilodaltonowym tlenku polietylenu lub PEO i 0,05% masy na objętość. Rozwiązanie inicjatora zdjęć.

Po zrobieniu żądanej objętości roztworu do przędzenia elektrycznego dodaj mikrosfery o pożądanym stężeniu do 400 miligramów na mililitr. Wymieszaj roztwór na mieszalniku wirowym, aż mikrosfery zostaną równomiernie rozprowadzone w roztworze. Przenieś roztwór do strzykawki i przymocuj igłę z końcówką o średnicy 18 cali.

Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej i ustawić ją na dozowanie z prędkością 1,2 mililitra na godzinę. Przyklej warstwę folii aluminiowej do trzpienia. Pozwala to na łatwe czyszczenie i przechowywanie gotowego rusztowania.

Obrotowy trzpień służy do tworzenia wyrównanych włókien. Podłącz przewód uziemiający z wysokiego napięciatagŹródło zasilania do urządzenia zbierającego. Podłącz dodatni przewód do igły, aby zapewnić udane wirowanie elektryczne.

Bardzo ważne jest, aby sprawdzić, czy wszystkie połączenia i ustawienia są poprawne. Rozpocznij pompowanie polimeru, a gdy roztwór będzie widoczny na końcu strzykawki, włącz źródło napięcia i ustaw napięcie na 24 kilowolty. Uruchom roztwór, aż zostanie osiągnięta żądana grubość rusztowania.

Po zakończeniu wyłącz źródło napięcia i pompę strzykawkową. Aby rozpocząć tę procedurę, przed elektrowirowaniem przymocuj odpowiednie szkiełka nakrywkowe do obszaru zbierania elektro spinnera za pomocą usuwalnej taśmy dwustronnej. Wirowanie na szkiełkach nakrywkowych ułatwia obsługę i oglądanie po elektro wirowaniu do żądanej grubości.

Jak pokazano w poprzednim segmencie filmu, ostrożnie zdejmij szkiełka nakrywkowe z trzpienia. Umieść pokryte rusztowaniem zsuwki pokrywy w przezroczystej komorze azotowej i upewnij się, że cały tlen został usunięty. Umieść komorę i rusztowanie pod 10-miliwatowym centymetrem kwadratowym 365 nanometrów na 15 minut.

Po usieciowaniu pokrywę wsuwa się w płytę studzienkową o odpowiedniej wielkości. Upewnij się, że strona rusztowania jest skierowana do góry. Umieść od 100 do 200 mikrolitrów pożywki na każdym rusztowaniu w płycie studzienki. Ostrożnie.

Umieść jeden zwoje korzenia grzbietowego lub DRG na każdym rusztowaniu w kropli pożywki. W przypadku grubego rusztowania może być potrzebnych więcej mediów. DRG musi być całkowicie zanurzony i nie może unosić się na wodzie.

Inkubować rusztowanie i DRG w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny, aby komórka mogła przylgnąć do rusztowania. Następnie napełnij pożywkę do poziomu odpowiedniego dla studni. Włożyć płytkę z powrotem do inkubatora i inkubować przez cztery do sześciu dni po okresie inkubacji.

Ostrożnie wyjmij pożywkę z każdej studzienki i delikatnie umyj ją raz PBS. Utrwalaj komórki przez 30 minut, używając 4% wagi na objętość. Para formaldehyd następnie barwi komórki na włókna i jądra nerwowe zgodnie z ustalonym protokołem.

Aby uwidocznić komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, umieść płytkę studzienkową na stoliku mikroskopu i zlokalizuj masę komórkową za pomocą ustawień filtra i wzbudzenia dla dpi. Po zidentyfikowaniu komórki przełącz filtr na zi. Aby uwidocznić rozszerzone neuryty, użyj funkcji ściegu w mikroskopie, aby zebrać i połączyć tyle obrazów, ile jest to konieczne, aby zobaczyć całą strukturę.

Powtórz dla mikrosfer dpi, fite i jasnego pola. 50 plus minus 14 mikrometrów średnicy z ponad 85% enkapsulacją białka było konsekwentnie produkowane, a elektro przędzone w rusztowania za pomocą tego protokołu. Ten fluorescencyjny obraz pokazuje reprezentatywne mikrosfery z prętem Domine w powłoce PLGA i zamkniętymi w niej pasowaniami BSA.

Aby ocenić enkapsulację, mikrosfery wypełniono BSA i testowano pod kątem uwalniania białka przez ponad 60 dni za pomocą testu białka Bradforda. Uwalnianie rozpoczyna się od początkowego wybuchu, a następnie jest kontynuowane, gdy mikrosfery rozpadają się po elektrowirowaniu. Mikrosfery można zobaczyć w całej strukturze włóknistej 3D.

Na tym obrazie SEM kompletnego rusztowania. Kule można zobaczyć w wielu warstwach oznaczonych strzałkami. Ten obraz w dużym powiększeniu przedstawia jedną mikrosferę z nanowłóknami z rusztowania nad nią.

Zwoje korzenia grzbietowego lub DRG wykorzystano do zbadania żywotności czynnika wzrostu nerwów lub NGF w mikrosferach w rusztowaniu. Oto DRG siedzący na rusztowaniu zawierającym mikrosfery. Obciążony NGF jest pokazany obok jednej mikrosfery bez białka w dłuższym neurycie Rozszerzenia rozciągające się od DRG na rusztowaniu NGF wskazują, że NGF jest żywotny i może promować wzrost.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak kapsułkować białko w mikrosfery i włączać je do włóknistych rusztowań.