Name: Elektroprzędzenie Czynnik wzrostu uwalniający mikrosfery do włóknistych rusztowań (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-16T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj elektroprzędzenie mikrosfer z czynnikiem wzrostu do włóknistych rusztowań w inżynierii tkankowej nerwowej. Ta metoda wspiera wzrost i regenerację neuronów z wykorzystaniem zarodkowych gangliów korzeniowych kurczaka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana przez Fundację Richarda Barbera i Thomas Rumble Fellowship (TJW).

1. Produkcja mikrosfer w postaci podwójnej emulsji woda/olej/woda
<ol>
	<li>Najpierw należy przygotować 2% i 0,5% w/v roztwory alkoholu poliwinylowego (PVA) w wodzie dejonizowanej. Mieszać roztwory w temperaturze 50 °C do czasu ich całkowitego przejrzystości, co może zająć kilka godzin. Przygotować roztwór 2% v/v alkoholu izopropylowego w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Przygotować wodny roztwór wybranego białka hydrofilowego. W poniższej tabeli przedstawiono przykładowe formulacje.</li>
	</ol>
	<img alt="Tabela stężeń białek; BSA, NGF w rozcieńczalniku PBS; uwagi do analizy, niewystarczające uwalnianie." src="/files/ftp_upload/51517/51517table1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
	Tabela 1: Przykładowe roztwory białek. Poniższe roztwory białek zostały z sukcesem enkapsulowane i poddane elektroprzędzeniu zgodnie z tym protokołem. W razie potrzeby można zastosować inne hydrofilowe roztwory białek.
	
	<ol start="3">
	<li>Przenieś 40 ml 0,5% roztworu PVA do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odstaw.</li>
	<li>W probówce wirówkowej o pojemności 15 ml rozpuść 300 mg kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA) o proporcjach 65:35 w 3 ml dichlorometanu. Aby przyspieszyć rozpuszczanie PLGA, można użyć miksera vortex.</li>
	<li>Połącz 200 µl roztworu białka i 4 µl 2% roztworu PVA. Wlej mieszaninę białka do roztworu PLGA (krok 1.4). Roztwory pozostaną w większości rozdzielone.</li>
	<li>Umieść probówkę w zlewce z lodową wodą. Używając sonikatora ręcznego przy mocy ~10 W (RMS), mieszaj roztwór przez kilka sekund (5-10), aż powstanie jednorodna, kremowo-biała emulsja.</li>
	<li>Wlej emulsję do probówki 50 ml zawierającej 0,5% PVA (krok 1.3). Mieszaj roztwór z dużą prędkością za pomocą miksera vortex przez ~20 s. Roztwór stanie się mętny.</li>
	<li>Przenieś emulsję do zlewki o pojemności 200 ml i umieść na mieszalniku magnetycznym przy 350 rpm przez 2 min. Dodaj do zlewki na mieszalniku 50 ml 2% alkoholu izopropylowego. Pozostaw mieszaninę w mieszaniu przez minimum 1 h, aby umożliwić odparowanie DCM i utwardzenie PLGA.</li>
	<li>Przenieś roztwór mikrosfer do probówek wirówkowych.</li>
	<li>Wiruj przy 425 x g przez 3 min. Mikrosfery osadzą się na dnie probówki i będą miały biały kolor. Ostrożnie usuń nadmiar cieczy znad mikrosfer i przechowuj w butelce o pojemności 500 ml.</li>
	<li>Wypłucz mikrosfery wodą dejonizowaną, napełniając probówkę w trzech czwartych jej objętości i wstrząsając nią, aby ponownie zawiesić mikrosfery w cieczy.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.10 i 1.11 cztery razy.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu ponownie usuń nadmiar cieczy i przelej do butelki 500 ml z pozostałymi próbkami. Zamroź mikrosfery zebrane w probówce wirówkowej, a następnie liofilizuj przez co najmniej 24 h.</li>
	<li>Obejrzyj mikrosfery pod mikroskopem świetlnym lub skaningowym mikroskopem elektronowym. Mikrosfery o rozmiarze nieprzekraczającym 60 µm nadają się do efektywnego elektroprzędzenia. Jeśli mikrosfery są zbyt duże, w kroku 1.6 lub 1.7 może być wymagany dłuższy czas sonikacji lub mieszania w vortexie.</li>
	<li>Przechowuj wysuszone mikrosfery w zamrażarce w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Opcjonalnie: Zastosuj test ilościowy białka, zgodnie z instrukcją producenta, aby zbadać ilość białka w butelce 500 ml z kroku 1.1030. Służy to do obliczenia procentowej zawartości białka zamkniętego w mikrosferach poprzez odjęcie ilości białka w roztworze od ilości użytej w procesie produkcji.</li>
</ol>
Uwaga: Aby zwizualizować lokalizację białka w mikrosferze, należy dodać Rodaminę 2 µg/ml do roztworu PLGA31 i enkapsulować białko sprzężone z FITC. Rycina 1 przedstawia przykład.
2. Elektroprzędzenie z mikrosferami
<ol>
	<li>Przed przygotowaniem roztworu do elektroprzędzenia należy przygotować 0,5% w/v roztwór fotoinicjatora w wodzie dejonizowanej poprzez rozpuszczanie w temperaturze 37 °C. Proces ten może trwać kilka godzin.</li>
	<li>Przygotować roztwór w wodzie dejonizowanej zawierający 2% w/v metakrylowanego kwasu hialuronowego (MeHA) (metoda syntezy opisana w Burdick et al. )29, 3% w/v poli(tlenku etylenu) (PEO) o masie 900 kD oraz 0,05% w/v fotoinicjatora. 
	<ol>
		<li>Obliczyć odpowiednią ilość MeHA i PEO dla pożądanego objętości. Na przykład 10 ml roztworu do elektroprzędzenia wymaga 200 mg MeHA i 300 mg PEO.</li>
		<li>Rozpuścić PEO w wodzie dejonizowanej, stanowiącej 90% końcowej pożądanej objętości (9 ml w tym przykładzie). Może to zająć kilka godzin; w celu przyspieszenia procesu można zastosować podgrzewany mieszadło magnetyczne lub kąpiel wodną w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Następnie dodać MeHA i mieszać roztwór za pomocą miksera wortex do uzyskania klarowności. Zajmie to tylko kilka minut.</li>
		<li>Na koniec dodać 0,5% roztwór fotoinicjatora, aby uzupełnić pozostałe 10% objętości (1 ml w tym przykładzie). </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać mikrosfery w pożądanym stężeniu do 400 mg/ml. Mieszać roztwór na mikserze wortex, aż mikrosfery zostaną równomiernie rozłożone w roztworze.</li>
	<li>Przenieść roztwór do strzykawki i założyć tępo zakończoną igłę o rozmiarze 18 gauge i długości 6 cali.</li>
	<li>Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej i ustawić prędkość podawania na 1,2 ml/hr. </li>
	<li>Przymoczyć za pomocą taśmy warstwę folii aluminiowej do płyty kolektora lub trzpienia. Umożliwia to łatwe czyszczenie i przechowywanie gotowego rusztowania. Obracający się trzpień jest stosowany do tworzenia włókien uporządkowanych. Płaska płyta lub stacjonarny trzpień spowodują powstanie włókien rozmieszczonych losowo.</li>
	<li>Podłączyć przewód uziemiający z wysokonapięciowego źródła zasilania do aparatury kolektora. Pozytywny przewód podłączyć do igły.</li>
	<li>Ustawić pompę strzykawkową i powierzchnię kolektora tak, aby odległość między końcówką igły a powierzchnią kolektora wynosiła 15 cm.</li>
	<li>Uruchomić pompowanie polimeru; gdy roztwór pojawi się na końcu igły, włączyć źródło napięcia i ustawić je na 24 kV. UWAGA: Po włączeniu napięcia nie wolno dotykać żadnej metalowej części układu. Ładunek może przeskoczyć na krótkich dystansach z naelektryzowanych części na skórę.</li>
	<li>Podawać roztwór do momentu uzyskania pożądanej grubości rusztowania. Po zakończeniu wyłączyć źródło napięcia i pompę strzykawkową. </li>
	<li>Zdjąć folię z przymocowanym rusztowaniem. Gotowe rusztowania zawierające białko przechowuje się w zamrażarce w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Testy bioaktywności białka
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórkowej. Do pożywki Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium dodać 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% v/v L-glutaminy oraz 1% v/v penicyliny-streptomycyny.</li>
	<li>Wybrać szklane laminki pasujące w całości do dołków płytki wielodołkowej.</li>
	<li>Użyć 3-(trimetoksysilylo)propyl metakrylanu do modyfikacji laminek zgodnie z instrukcją producenta. Metakrylowanie poprawia przyleganie rusztowania do laminek.</li>
	<li>Przed elektroprzędzeniem przymocować zmetylowane laminki do obszaru zbierania elektroprzędarki za pomocą usuwalnej taśmy dwustronnej. Przędzenie bezpośrednio na laminki ułatwia manipulację i obserwację.</li>
	<li>Przeprowadzić elektroprzędzenie do uzyskania pożądanej grubości, zgodnie z powyższym opisem.</li>
	<li>Po elektroprzędzeniu ostrożnie zdjąć laminki z trzpienia. Umieścić laminki pokryte rusztowaniem w przezroczystej komorze z azotem i upewnić się, że cały tlen został usunięty.</li>
	<li>Naświetlać komorę i rusztowanie światłem o długości fali 365 nm i mocy 10 mW/cm2 przez 15 min. Po sieciowaniu umieścić próbki w odpowiednio dobranej płytce wielodołkowej. Należy upewnić się, że strona z rusztowaniem jest skierowana do góry.</li>
	<li>Umieścić rusztowania pod lampą bakteriobójczą na 30 min w celu sterylizacji. W razie potrzeby można zastosować fibronektynę lub inne białko jako powłokę zwiększającą adhezję komórek. Powłokowanie rusztowań przeprowadzić zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wyizolować zwoje korzeni grzbietowych (DRG) zgodnie z metodą opisaną wcześniej przez Hollenbecka32. Do każdej testowanej laminki pokrytej rusztowaniem będzie potrzebny jeden zwoj DRG.</li>
	<li>Nanieść 100-200 µl pożywki na każde rusztowanie w płytce wielodołkowej. Ostrożnie umieścić jeden zwoj DRG na każdym rusztowaniu w kropli pożywki. W przypadku grubych rusztowań może być potrzebne więcej pożywki; zwoje DRG muszą być całkowicie zanurzone i nie mogą pływać na powierzchni.</li>
	<li>Inkubować rusztowanie i DRG w temperaturze 37 °C przez 4 hr, aby umożliwić przyleganie komórek do rusztowania.</li>
	<li>Dopełnić pożywkę do odpowiedniego poziomu w dołku i ponownie umieścić płytkę w inkubatorze. Kontynuować inkubację przez 4-6 dni.</li>
	<li>Po okresie inkubacji ostrożnie usunąć pożywkę z każdego dołka i delikatnie wypłukać raz roztworem PBS. Utwierdzić komórki przez 30 min w 4% w/v paraformaldehydzie.</li>
	<li>Przebarwić komórki przy użyciu przeciwciał przeciwko neurofilamentom. Pozwoli to na wizualizację i ilościowe określenie wzrostu neurytów. Do obrazowania jąder komórkowych można użyć DAPI. Przykładowy protokół barwienia został opisany przez Sundararaghavana i współpracowników14.</li>
	<li>Wizualizować komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
	<ol>
		<li>Umieścić płytkę wielodołkową na stole mikroskopu.</li>
		<li>Zlokalizować skupisko komórek, korzystając z filtrów i ustawień wzbudzenia dla DAPI.</li>
		<li>Po zlokalizowaniu komórek przełączyć filtr na FITC, aby zwizualizować wydłużone neuryty. Korzystając z funkcji łączenia obrazów (stitch) w mikroskopie, zebrać i połączyć tyle zdjęć, ile jest konieczne do obejrzenia całej struktury. Powtórzyć procedurę dla DAPI, FITC oraz w świetle przechodzącym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+migration+in+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Directed migration in neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part B Rev. , (2013).</li>
<li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tissue+engineering%3A+strategies+for+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).</li>
<li>Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li>
<li>Madduri, S., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+delivery+systems+and+repair+strategies+for+damaged+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves.</a> J Control Release. 161, 274-282 (2012).</li>
<li>Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+tissue+engineering+and+novel+therapeutic+approaches+to+axonal+regeneration+following+spinal+cord+injury+using+polymer+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds.</a> Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+growth+in+3D+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).</li>
<li>Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+strategies+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Plast+Surg%22%5BJournal%5D)">Engineering strategies for peripheral nerve repair.</a> Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).</li>
<li>Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+growth+factor+delivery+promotes+axonal+regeneration+in+long+gap+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair.</a> Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).</li>
<li>Bronzino, J. D., Peterson, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBronzino%2C+JD+%22The+Biomedical+Engineering+Handbook%2C+Third+Edition+-+3+Volume+Set%3A+Tissue+Engineering+and+Artificial+Organs%22">The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs</a>. , 3 edition edn, CRC Press. (2006).</li>
<li>Bell, J. H. A., Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+nerve+guides%3A+materials%2C+fabrication%2C+growth+factors%2C+and+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery.</a> Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).</li>
<li>Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+ideal+conduits+for+peripheral+nerve+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgical+focus%22%5BJournal%5D)">Designing ideal conduits for peripheral nerve repair.</a> Neurosurgical focus. 26, (2009).</li>
<li>Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+nanotubes+and+nanofibres+in+nerve+repair.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review.</a> Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).</li>
<li>Gunn, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyblend+nanofibers+for+biomedical+applications%3A+perspectives+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges.</a> Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+generation+of+haptotactic+gradients+through+3D+collagen+gels+for+enhanced+neurite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth.</a> Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multiscale+and+photopatterned+porosity%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity.</a> Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).</li>
<li>Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+strategies+for+creating+artificial+cell-instructive+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Material strategies for creating artificial cell-instructive niches.</a> Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).</li>
<li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+highly+porous+crosslinked+elastin+hydrogels+and+their+interaction+with+fibroblasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro.</a> Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).</li>
<li>Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+technology+in+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrospinning technology in tissue regeneration.</a> Methods Mol. Biol. 811, 127-140 (2012).</li>
<li>Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+release+of+proteins+from+electrospun+biodegradable+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers.</a> Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).</li>
<li>Han, D., Gouma, P. -I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+bioscaffolds+that+mimic+the+topology+of+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix.</a> Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).</li>
<li>Prabhakaran, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+biocomposite+nanofibrous+scaffolds+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering.</a> Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).</li>
<li>Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibers+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibers for neural tissue engineering.</a> Nanoscale. 2, 35-44 (2010).</li>
<li>Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orienting+neurite+growth+in+electrospun+fibrous+neural+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+B+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).</li>
<li>Sill, T. J., von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning%3A+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li>
<li>Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+fibrous+polymer+scaffolds+for+tissue+engineering+and+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+with+depth+in+electrospun+fibrous+scaffolds+for+directed+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior.</a> Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).</li>
<li>Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+matrices+for+localized+drug+delivery%3A+current+technologies+and+selected+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications.</a> Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).</li>
<li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+electrospun+scaffolds+delivering+growth+factors+and+genes+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications.</a> Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).</li>
<li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li>
<li>Péan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+HSA+and+NGF+encapsulation+yields+in+PLGA+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles.</a> International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).</li>
<li>Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Uptake+and+Intracellular+Fate+of+PLGA+Nanoparticles+in+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells.</a> Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).</li>
<li>Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , Gulf Professional Publishing. (2003).</li>
<li>Boer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+sciatic+nerve+repair+with+a+poly-lactic-co-glycolic+acid+scaffold+and+nerve+growth+factor+releasing+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres.</a> Microsurgery. 31, 293-302 (2011).</li>
<li>Pujic, Z., Goodhill, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+compartment+diffusion+chamber+for+studying+axonal+chemotaxis+in+3D+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen.</a> Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).</li>
<li>Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+controlled+co-delivery+of+synergistic+neurotrophic+factors+on+early+nerve+regeneration+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats.</a> Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphoester+microspheres+for+sustained+release+of+biologically+active+nerve+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor.</a> Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).</li>
<li>Yan, Q., Yin, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+new+PLGL-RGD-NGF+nerve+conduits+for+promoting+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration.</a> Biomed Eng Online. 11, (2012).</li>
<li>Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+growth+factor+loaded+microspheres+into+polymeric+electrospun+nanofibers+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+proteins+in+poly%28L-lactide-co-caprolactone%29+fibers+by+emulsion+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).</li>
<li>Wang, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+aligned+core-shell+nanofibres+delivering+NGF+on+the+promotion+of+sciatic+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Sci+Polym+Ed%22%5BJournal%5D)">The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).</li>
<li>Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+regeneration+using+composite+poly%28lactic+acid-caprolactone%29%2Fnerve+growth+factor+conduits+prepared+by+coaxial+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning.</a> J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wiele badań wykazało, że komórki nerwowe mogą być kierowane przez wskazówki topograficzne (wyrównanie włókien) i sygnały chemiczne (czynniki wzrostu)1,2,10,11,35. Elektroprzędzenie to łatwa metoda tworzenia wyrównanych włókien. Czynniki wzrostu stymulują wzrost nerwów, ale aby włączyć je do przewodów nerwowych (NC), wymagana jest metoda przedłużonego uwalniania. Aby stworzyć bardziej niezawodny system z obiema wskazówkami, te dwa sygnały powinny być połączone. Wcześniej badano kilka metod mających na celu zape...

Jednym z bieżących wyzwań w inżynierii tkanek nerwowych jest stworzenie kanału nerwowego (NC), który naśladuje matrycę pozakomórkową, w której nerwy rosną naturalnie. Badania wykazały, że komórki reagują na kilka czynników w swoim środowisku, w tym sygnały mechaniczne, topograficzne, adhezyjne i chemiczne1-3. Jednym z głównych wyzwań w tej dziedzinie jest określenie odpowiedniej kombinacji sygnałów i wyprodukowanie systemu, który może utrzymywać sygnały przez dłuższy czas, aby wspierać wzrost komórek4. Wiadomo, że neurony obwodowe preferują miękkie podłoże, są kierowane przez wyrównane włókna i reagują na czynnik wzrostu nerwów (NGF)5-7. Wykazano, że NC, które mogą dostarczać sygnałów chemicznych przez tygodnie, zapewniają lepszą regenerację funkcjonalną bliższą temu, jak w przypadku przeszczepów allogenicznych, obecnego złotego standardu naprawy nerwów8,9.
Różne materiały i metody produkcji mogą być używane do wytwarzania mechanicznych i topograficznych wskazówek10-13. Wskazówki mechaniczne są nieodłącznie związane z wybranym materiałem, co sprawia, że wybór odpowiedniego materiału do zastosowania ma kluczoweznaczenie 1,13. Metody produkcji do kontrolowania wskazówek topograficznych obejmują separację faz, samoorganizację i elektroprzędzenie1,13. Do zastosowań w mikroskali można również stosować mikrofluidykę, fotowzory, trawienie, ługowanie soli lub pianki gazowe14-17. Elektroprzędzenie stało się najpopularniejszym sposobem inżynierii włóknistych substratów do hodowli tkankowych ze względu na jego elastyczność i łatwość produkcji13,18-23. Elektroprzędzone nanowłókna są wytwarzane przez przyłożenie wysokiego napięcia do roztworu polimeru, powodując jego odpychanie się i rozciąganie w poprzek krótkiej szczeliny, aby się rozładować24. Wyrównane rusztowanie można utworzyć, zbierając włókna na uziemionym trzpieniu obrotowym, a niewyrównane rusztowania są zbierane na nieruchomej płycie25. Sygnalizację adhezyjną można osiągnąć poprzez pokrycie włóknistego rusztowania fibronektyną lub sprzężenie peptydu adhezyjnego, takiego jak RGD, z HA przed elektroprzędzeniem26.
Sygnały chemiczne, takie jak czynniki wzrostu, są najtrudniejsze do utrzymania przez dłuższy czas, ponieważ potrzebują źródła do kontrolowanego uwalniania. Wiele systemów próbowano dodać kontrolowane uwalnianie do elektroprzędzonych sieci włóknistych z różnym powodzeniem. Metody te obejmują elektroprzędzenie mieszanki, elektroprzędzenie emulsyjne, elektroprzędzenie powłoki rdzenia i koniugację białek27. Ponadto elektroprzędzenie odbywa się tradycyjnie w lotnym rozpuszczalniku, co może wpływać na żywotność białka28, dlatego należy wziąć pod uwagę utrzymanie bioaktywności białka.
To podejście dotyczy w szczególności łączenia sygnałów mechanicznych, topograficznych, chemicznych i adhezyjnych w celu stworzenia przestrajalnego rusztowania dla wzrostu nerwów obwodowych. Mechanika rusztowania jest precyzyjnie kontrolowana przez syntezę metakrylowanego kwasu hialuronowego (HA). Miejsca metakrylacji służą do dołączania fotoreaktywnych środków sieciujących. Usieciowany materiał nie jest już rozpuszczalny w wodzie i jest rozkładany wyłącznie przez enzymy29. Ilość usieciowania zmienia szybkość degradacji, mechanikę i inne właściwości fizyczne materiału. Użycie HA z 30% metakrylacją, która ma moduł wytrzymałości na rozciąganie ~500 Pa, tworzy miękkie podłoże, które jest zbliżone do natywnej mechaniki tkanki nerwowej i jest zwykle preferowane przez neurony26,29. Elektroprzędzenie na obracającym się trzpieniu służy do tworzenia wyrównanych włókien dla wskazówki topograficznej. Korzystanie z elektroprzędzenia wraz z mikrosferami dostarcza sygnały chemiczne w rusztowaniu przez dłuższy czas. Aby wspomóc wzrost neurytów, mikrosfery zawierające NGF są używane do tworzenia sygnału chemicznego. W przeciwieństwie do większości materiałów elektroprzędzonych, kwas hialuronowy jest rozpuszczalny w wodzie, dzięki czemu NGF nie napotyka ostrych rozpuszczalników podczas produkcji. Aby dodać sygnał adhezyjny, rusztowanie jest pokryte fibronektyną. Gotowy system zawiera wszystkie cztery typy sygnałów opisane powyżej: miękkie (mechaniczne) wyrównane (topograficzne) włókna z NGF uwalniające mikrosfery (chemiczne) pokryte fibronektyną (klej). Produkcja i testowanie tego systemu jest opisane w niniejszym protokole.
Proces rozpoczyna się od produkcji mikrosfer za pomocą podwójnej emulsji typu woda w oleju w wodzie. Emulsja jest stabilizowana środkiem powierzchniowo czynnym, alkoholem poliwinylowym (PVA). Wewnętrzna faza wodna zawiera białko. Dodawany do fazy olejowej, zawierającej materiał otoczki PLGA rozpuszczony w dichlorometanie (DCM), surfaktant tworzy barierę między fazami chroniąc białko przed DCM. Emulsja ta jest następnie dyspersjonowana w innej fazie wodnej zawierającej PVA w celu wytworzenia zewnętrznej powierzchni mikrosfer. Stabilną emulsję miesza się, aby umożliwić odparowanie DCM. Po spłukaniu i liofilizacji pozostają suche mikrosfery zawierające białko.
Po zakończeniu mikrosfer są one gotowe do elektroprzędzenia w rusztowania. Najpierw przygotowujesz roztwór do elektroprzędzenia. Lepkość roztworu ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego tworzenia włókien. Roztwory czystego kwasu hialuronowego nie spełniają tego wymogu; PEO jest dodawany jako polimer nośny, aby umożliwić elektroprzędzenie. Mikrosfery są dodawane do roztworu i przędzone elektrolitycznie, w wyniku czego powstaje włókniste rusztowanie z mikrosferami rozmieszczonymi w całym roztworze.
Po zakończeniu produkcji, białko powinno zostać przetestowane w celu sprawdzenia jego żywotności. Aby to zrobić, można użyć komórki pierwotnej, która reaguje na NGF. W protokole tym wykorzystuje się zwoje korzenia grzbietowego (DRG) z 8-10-dniowych zarodków kurczaków. Wiązki komórek wysiewa się na rusztowaniach zawierających mikrosfery wypełnione NGF lub puste. Jeśli NGF jest nadal żywotny, powinieneś zauważyć zwiększony wzrost neurytów na rusztowaniach zawierających NGF. Jeśli NGF nie jest już żywotny, nie będzie sprzyjał rozszerzaniu się neurytów i powinien wyglądać podobnie do kontroli.
Dokładna procedura opisana tutaj skupia się na wsparciu neuronalnym, jednak dzięki prostym modyfikacjom materiału, metody elektroprzędzenia i białek system może być zoptymalizowany dla różnych typów komórek i tkanek.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF</td><td>24650-42-8</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>PEO 900 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>189456</td><td></td></tr><tr><td>Metakryloksetylotiokarbamoilo rodamina B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591-100</td><td>Przygotuj roztwór podstawowy w</td></tr><tr><td>pompie strzykawkowej</td> DMSO <td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>Źródło zasilania</td><td>Gamma Wysokie napięcie</td><td>ES30P-5W</td><td></td></tr><tr><td>Silniki</td><td>elektryczne Triem, Inc</td><td>0132022-15</td><td>Musi być przymocowany do niestandardowo zbudowanego trzpienia</td></tr><tr><td>Obrotomierz</td><td>Magazyn narzędzi sieciowych</td><td>ESI-330</td><td>Służy do monitorowania prędkości</td></tr> <tr><td>trzpieniaOmnicure UV Spot Cure System z adapterem kolimacyjnym</td><td>EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>Igły</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-16H</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol poliwinylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izoporopylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>BSA-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>080M7400</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Czynnik wzrostu nerwów (NGF)</td><td>R& D Systems</td><td>1156-NG</td><td></td></tr><tr><td>65:35 Kwas polimlekowo-glikolowy (PLGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001554270</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34856-2L</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Test białka</td><td>Thermo Scientific</td><td>1856209</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimetoksysililo)propylu metakrylan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001558456</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyklon</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

elektroprzędzenie czynnik wzrostu uwalniający mikrosfery do włóknistych rusztowań

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

Ta procedura opisuje metodę wytwarzania wielopłaszczyznowego substratu do kierowania wzrostem komórek nerwowych. System ten łączy w sobie sygnały mechaniczne, topograficzne, adhezyjne i chemiczne. Właściwości mechaniczne są kontrolowane przez rodzaj materiału użytego do wytworzenia włókien elektroprzędzonych. W tym protokole używamy 30% metakrylowanego kwasu hialuronowego (HA), który ma moduł wytrzymałości na rozciąganie ~500 Pa, aby wytworzyć miękkie włókniste rusztowanie. Elektroprzędzenie na obracającym się trzpieniu wytwarza wyrównane włókna, aby stworzyć wskazówkę topograficzną. Adhezja uzyskuje się poprzez pokrycie rusztowania fibronektyną. Podstawowym wyzwaniem, o którym mowa w niniejszym dokumencie, jest zapewnienie sygnału chemicznego na całej głębokości rusztowania przez dłuższy czas. Ta procedura opisuje wytwarzanie mikrosfer poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA), które zawierają czynnik wzrostu nerwów (NGF) i bezpośrednie impregnowanie rusztowania tymi mikrosferami podczas procesu elektroprzędzenia. Ze względu na trudne warunki produkcyjne, w tym duże siły nachylenia i ładunki elektryczne, żywotność białek jest mierzona po produkcji. System zapewnia uwalnianie białka przez ponad 60 dni i wykazano, że wspomaga pierwotny wzrost komórek nerwowych.

Mikrosfery o średnicy 50±14 µm z wydajnością enkapsulacji białka powyżej 85% były systematycznie wytwarzane i elektroprzędzone w rusztowania. Wielkość określono poprzez obrazowanie próbek mikrosfer z trzech oddzielnych partii produkcyjnych. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu optycznego, a długości zmierzono przy użyciu komercyjnego oprogramowania laboratoryjnego. Rysunek 1 przedstawia histogram rozkładu wielkości. Stopień enkapsulacji przetestowano również w trzech oddzielnych partiach mikrosfer, ilośc...

Ten protokół łączy elektroprzędzenie i mikrosfery w celu opracowania rusztowań inżynierii tkankowej do kierowania neuronami. Czynnik wzrostu nerwów zamknięto w mikrosferach PLGA i elektroprzędzono w rusztowania włókniste z kwasem hialuronowym (HA). Bioaktywność białka badano poprzez wysiewanie rusztowań pierwotnymi zwojami korzenia grzbietowego piskląt i hodowlę przez 4-6 dni.

Elektroprzędzenie Czynnik wzrostu uwalniający mikrosfery do włóknistych rusztowań

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie wielofunkcyjnego środowiska wspierającego wzrost i regenerację nerwów. Jest to osiągane najpierw poprzez enkapsulację czynników wzrostu w biodegradowalnych mikrosferach. Drugim krokiem jest przygotowanie materiału wspierającego dla głównej masy środowiska.Następnie mikrosfery oraz materiał nośny zostają połączone i poddane elektroprzędzeniu w celu utworzenia uporządkowanego rusztowania włóknistego. Ostatnim etapem jest przetestowanie rusztowania z użyciem neuronów z zwojów korzeni grzbietowych kurczaka. W końcowej fazie wykorzystuje się mikroskopię immunofluorescencyjną, aby wykazać, że wzrost i kierunek neurytów są przyspieszone w porównaniu z grupami kontrolnymi.Choć system ten został zaprojektowany dla tkanki nerwowej, to przy niewielkich zmianach w stosowanych białkach i materiałach można go zastosować również w przypadku różnych typów tkanek, w tym serca, płuc i kości. Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować niezbędne odczynniki: 2% oraz 0,5% (masowy/objętościowy) roztwory alkoholu poliwinylowego (PVA) w wodzie dejonizowanej, roztwór 2% (objętościowy/objętościowy) alkoholu izopropylowego i wody dejonizowanej oraz wodny roztwór wybranego białka hydrofilowego. Należy przelać 40 ml 0,5% roztworu PVA do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, a w małej fiolce rozpuścić 300 mg kopolimeru kwasu polimlekowego i glikolowego (PLGA) w stosunku 65:35 w 3 ml dichlorometanu.Do przyspieszenia rozpuszczania PLGA można użyć mieszadła wiroksowego, łącząc 200 µL roztworu białka i 4 µL 2% roztworu PVA. Wlej mieszaninę białka i PVA do roztworu PLGA. Roztwory pozostaną w większości rozdzielone.Umieść fiolkę w zlewce z wodą z lodem i za pomocą urządzenia W ator przy mocy około 10 watów mieszaj roztwór przez 5 do 10 sekund, aż powstanie jednorodna, kremowo-biała emulsja. Przelej emulsję do wcześniej przygotowanej probówki o pojemności 50 mililitrów zawierającej 0,5% PVA. Wymieszaj roztwór z dużą prędkością w mieszalniku wirowirującym przez około 20 sekund.Roztwór stanie się mętny. Przenieść emulsję do zlewki o pojemności 200 ml i umieścić na mieszadle magnetycznym przy 350 RPM na dwie minuty. Dodać do zlewki na mieszadle 50 ml 2% alkoholu izopropylowego.Kontynuować mieszanie mieszaniny przez minimum jedną godzinę, aby umożliwić odparowanie chlorku metylenu i stwardnienie PLGA. Następnie przenieść roztwór mikrosfer do probówek do wirowania i wirować z prędkością 425 ×g przez trzy minuty. Mikrosfery zbiorą się na dnie probówki i będą miały biały kolor. Ostrożnie usunąć nadosad z probówki znad mikrosfer i przechowywać go w butelce o pojemności 500 ml.Przepłucz mikrosfery wodą dejonizowaną, napełniając każdą probówkę do trzech czwartych wysokości i wstrząsając nią w celu ponownego zawieszenia mikrosfer w cieczy. Po ostatnim płukaniu powtórz proces wirowania, usuwania naddatku i płukania mikrosfer wodą dejonizowaną jeszcze cztery razy. Usuń naddatek i przelej go do butelki o pojemności 500 ml z pozostałymi próbkami.Zamrozić mikrosfery zebrane w probówkach do wirówki w temperaturze -20 °C przez noc, a następnie liofilizować przez co najmniej 24 h. Poniższy roztwór do elektroprzędzenia należy przygotować wcześniej w wodzie dejonizowanej: 2% w/v zmodyfikowanego kwasu hialuronowego (miha) z 3% w/v tlenku polietylenu (PEO) o masie 900 kDa oraz 0,05% w/v roztworu fotoinicjatora.Po przygotowaniu pożądanej objętości roztworu do elektroprzędzenia, należy dodać mikrosfery w wybranym stężeniu, maksymalnie do 400 mg/mL. Mieszaj roztwór na mikserze wierzchołkowym (vortexie) do momentu równomiernego rozprzestrzenienia mikrosfer w roztworze. Przenieś roztwór do strzykawki i zamocuj sześciocalową tępą igłę o rozmiarze 18 G.Umieść strzykawkę w pompie strzykawkowej i ustaw prędkość dozowania na 1,2 milliliters per hour. Oklej trzpień warstwą folii aluminiowej. Ułatwi to czyszczenie oraz przechowywanie gotowego rusztowania.Do tworzenia wyrównanych włókien wykorzystuje się obrotowy trzpień. Przewód uziemiający z wysokonapięciowego źródła zasilania należy podłączyć do aparatury zbierającej. Aby zapewnić pomyślne elektroprzędzenie, należy podłączyć przewód dodatni do igły.Niezwykle ważne jest zweryfikowanie poprawności wszystkich połączeń i ustawień. Należy rozpocząć pompowanie polimeru, a gdy roztwór pojawi się na końcówce strzykawki, włączyć źródło napięcia i ustawić je na 24 kilovolts. Podawać roztwór do momentu uzyskania pożądanej grubości rusztowania.Po zakończeniu wyłącz źródło napięcia i pompę strzykawkową. Przed rozpoczęciem procesu elektroprzędzenia, należy przymocować odpowiednie szkiełka nakrywkowe do obszaru zbierania elektroprzędarki za pomocą usuwalnej taśmy dwustronnej. Przędzenie bezpośrednio na szkiełka nakrywkowe ułatwia manipulację i obserwację próbek po uzyskaniu pożądanej grubości warstwy.Jak pokazano w poprzednim fragmencie wideo, ostrożnie zdejmij szkiełka nakrywkowe z trzpienia. Umieść szkiełka nakrywkowe pokryte rusztowaniem w przezroczystej komorze azotowej i upewnij się, że cały tlen został usunięty. Umieść komorę z rusztowaniem pod światłem o długości fali 365 nm i mocy 10 mW/cm² na 15 minut.Po usieciowaniu umieść szkiełka podstawowe w płytce wielodołkowej o odpowiednim rozmiarze. Upewnij się, że strona z rusztowaniem jest skierowana do góry. Ostrożnie nanieś od 100 do 200 µL pożywki na każde rusztowanie w płytce.Umieść jedno zwoje korzeni grzbietowych (DRG) na każdym rusztowaniu w kropli pożywki. W przypadku grubego rusztowania może być wymagana większa ilość pożywki. DRG musi być całkowicie zanurzony i nie może pływać na powierzchni.Inkubować rusztowanie i DRG w temperaturze 37 °C przez cztery godziny, aby umożliwić przyleganie komórek do rusztowania. Następnie dopełnić pożywkę do odpowiedniego poziomu w dołku. Przenieść płytkę z powrotem do inkubatora i inkubować przez okres od czterech do sześciu dni po zakończeniu wstępnego etapu inkubacji.Ostrożnie usuń medium z każdej studni i delikatnie przemyj raz PBS. Utrwal komórki przez 30 minut, stosując 4% w/v paraformaldehydu, a następnie zabarw neurofilamenty i jądra komórkowe zgodnie z ustalonym protokołem.Aby zwizualizować komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, należy umieścić płytkę wielodołkową na stoliku mikroskopu i zlokalizować masę komórkową, korzystając z ustawień filtra i wzbudzenia dla dpi. Po zidentyfikowaniu komórki należy przełączyć filtr na zi. W celu wizualizacji wydłużonych neurytów należy użyć funkcji stitch w mikroskopie, aby zebrać i połączyć tyle obrazów, ile jest koniecznych do obejrzenia całej struktury.Powtórz procedurę dla mikrosfer dpi, fite i brightfield. Zgodnie z tym protokołem konsekwentnie otrzymywano mikrosfery o średnicy 50 ± 14 µm z enkapsulacją białka powyżej 85%, które następnie elektroprządo w rusztowania. Ten obraz fluorescencyjny przedstawia reprezentatywne mikrosfery z Rod Domine w powłoce PLGA oraz enkapsulowanym wewnątrz BSA fits.Aby ocenić stopień enkapsulacji, mikrosfery wypełniono BSA, a następnie badano uwalnianie białka przez ponad 60 dni przy użyciu metody Bradforda. Uwalnianie rozpoczyna się od początkowego gwałtownego wyrzutu (initial burst), a następnie trwa w miarę rozkładu mikrosfer po procesie elektroprzędzenia. Mikrosfery są widoczne w całej trójwymiarowej strukturze włóknistej.Na tym obrazie SEM kompletnego rusztowania widoczne są sfery ułożone w wielu warstwach, wskazanych strzałkami. Ten obraz o dużym powiększeniu przedstawia jedną mikrosferę z nanofibrami z powyżej znajdującego się rusztowania.Do przetestowania żywotności czynnika wzrostu nerwów (NGF) w mikrosferach wewnątrz rusztowania wykorzystano zwoje korzeni grzbietowych (DRG). Przedstawiono tutaj DRG osadzone na rusztowaniu zawierającym mikrosfery. Obok mikrosfery bez białka pokazano mikrosferę załadowaną NGF. Dłuższe wypustki neurytowe wyrastające z DRG na rusztowaniu z NGF wskazują, że NGF jest aktywny i może promować wzrost.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak enkapsulować białka w mikrosferach oraz jak wbudowywać je w rusztowania włókniste.

electrospinning-growth-factor-releasing-microspheres-into-fibrous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Elektrowspuniecie mikrosfer uwalniających czynniki wzrostu do włóknistych szkieletów

W niniejszym artykule omówiono proces elektroprzędzenia polimerów do inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych. W szczególności opisano elektroprzędzenie makromerów fotoreaktywnych z dodatkowymi możliwościami przetwarzania w postaci fotopatronowania oraz elektroprzędzenia wielopolimerowego.

Elektroprzędzenie włóknistych rusztowań polimerowych do inżynierii tkankowej i hodowli komórkowych

Uporządkowane włókna otrzymane metodą elektroprzędzenia kierują wzrostem neuronów in vitro i stanowią potencjalny komponent rusztowań do regeneracji nerwów. Opisujemy procedurę przygotowania podłoży z włókien elektroprzędzionych oraz bezsurowiczą hodowlę pierwotnych neuronów sensorycznych (DRG) i ruchowych szczura w stadium E15. Uwzględniono również wizualizację neuronów za pomocą immunocytochemii.

Hodowla pierwotnych neuronów ruchowych i sensorycznych w zdefiniowanych mediach na rusztowaniach z nanowłókien z poli-L-laktydu otrzymanych metodą elektroprzędzenia

Rusztowania otrzymane metodą elektroprzędzenia mogą być poddawane obróbce po produkcji w celu zastosowania ich w inżynierii tkankowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody przędzenia złożonych rusztowań (poprzez przędzenie sekwencyjne), tworzenia rusztowań o większej grubości (poprzez nakładanie wielu warstw z wykorzystaniem wyżarzania termicznego lub parowego), zapewniania sterylności (produkcja aseptyczna lub sterylizacja po produkcji) oraz uzyskiwania odpowiednich właściwości...

Obróbka potransprodukcyjna włókien otrzymywanych metodą elektroprzędzenia do inżynierii tkankowej

Biokompatybilne nanoczujniki zol-żel reagujące na pH mogą być wbudowane w elektrowirowane rusztowania z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA). Wyprodukowane rusztowania samoraportujące mogą być wykorzystywane do monitorowania warunków mikrośrodowiskowych in situ podczas hodowli komórek na rusztowaniu. Jest to korzystne, ponieważ konstrukt komórkowy 3D może być monitorowany w czasie rzeczywistym bez zakłócania eksperymentu.

Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Opisano metodę otrzymywania nanowłókien i złożonych nanostruktur z pojedynczych lub wielu białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje interakcje białko-powierzchnia do tworzenia wolnostojących materiałów na bazie białek o przestrajalnym składzie i architekturze do wykorzystania w różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej i biotechnologii.

Nanowłókna i nanostruktury białkowe ECM zaprojektowane przy użyciu montażu inicjowanego powierzchniowo

Zgłoszono syntezę i wytwarzanie długich włókien elektroprzędzionych obejmujących większy obszar złoża za pomocą nowo zaprojektowanego kolektora z nowego biodegradowalnego polimeru o nazwie poli(dodekanian glicerolu) (PGD). Włókna były w stanie wspierać wzrost komórek pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych myszy.

Elektroprzędzone rusztowania włókniste z poli(dodekanodianu glicerolu) do inżynierii tkanek nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania elektroprzędzonych rusztowań z nanowłókien o stopniowanej organizacji włókien i badamy ich zastosowania w regulacji morfologii/orientacji komórek. Gradienty w odniesieniu do właściwości fizycznych i chemicznych rusztowań z nanowłókien oferują szeroką gamę zastosowań w dziedzinie biomedycyny.

Rusztowania z nanowłókien elektroprzędzonych z gradacją w organizacji włókien

Postępy w technologiach biomateriałów umożliwiają rozwój trójwymiarowych konstruktów wielokomórkowych. Opracowaliśmy protokoły elektroprzędzenia w celu wytworzenia trzech pojedynczych rusztowań do hodowli głównych komórek strukturalnych dróg oddechowych, aby zapewnić model 3D in vitro ściany oskrzelików dróg oddechowych.

Dostosowanie procesu elektroprzędzenia w celu zapewnienia trzech unikalnych środowisk dla trójwarstwowego modelu ściany dróg oddechowych in vitro

Ten protokół służy jako kompleksowa wytyczna do wytwarzania rusztowań za pomocą elektroprzędzenia z polimerami stopionymi w trybie bezpośredniego zapisu. Systematycznie nakreślamy proces i definiujemy odpowiednie ustawienia parametrów w celu osiągnięcia docelowych architektur rusztowań.

Zapis elektroprzędzenia ze stopu trójwymiarowych rusztowań poli(ε-kaprolaktonu) z kontrolowanymi morfologiami do zastosowań w inżynierii tkankowej

Ten artykuł demonstruje technikę rozbudowy tradycyjnej, dwuwymiarowej (2D) elektroprzędzonej maty z nanowłókien w trójwymiarowe (3D) rusztowanie poprzez rozhermetyzowanie podkrytycznego płynu CO2. Te rozszerzone rusztowania są 3D, ściśle naśladują komórkowe wskazówki nanotopograficzne i zachowują funkcje cząsteczek biologicznych zamkniętych w nanowłóknach.

Ekspansja dwuwymiarowych mat z nanowłókien elektroprzędzonych do rusztowań trójwymiarowych

Poznaj elektroprzędzenie mikrosfer z czynnikiem wzrostu do włóknistych rusztowań w inżynierii tkankowej nerwowej. Ta metoda wspiera wzrost i regenerację neuronów z wykorzystaniem zarodkowych gangliów korzeniowych kurczaka.

Elektroprzędzenie Czynnik wzrostu uwalniający mikrosfery do włóknistych rusztowań

Przeglądaj więcej filmów