Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych
18 sierpnia 2014
Ta procedura pokazuje, jak celować w interneurony w rozwijającym się przodomózgowiu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Technika ta okazała się szczególnie skuteczna w osiąganiu selektywnej ekspresji genów w podtypach interneuronów przeznaczonych do powierzchownych warstw kory mózgowej.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest ukierunkowanie na neurony pośrednie w rozwijającym się mózgu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Jest to realizowane poprzez przygotowanie igieł do wstrzykiwania, a w kolejnym kroku poprzez usunięcie łańcucha zarodkowego od znieczulonego zwierzęcia.
Następnie w mózgu wykonuje się iniekcję DNA oraz elektroporację. Ostatnim krokiem jest umożliwienie zwierzęciu rekonwalescencji po zabiegu. W rezultacie elektroporacja in utero jest wykorzystywana w celu selektywnego targetowania podtypów neuronów pośredniczących.
Przewagą tych metod nad naszymi istniejącymi technikami, takimi jak nieswoista elektroporacja in utero, jest to, że umożliwiają one przeprowadzenie analizy autonomiczności komórkowej podzbioru neuronów interneuronów korowych. Wysoki poziom ekspresji GFP pozwala na wizualizację i analizę pojedynczych interneuronów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na fundamentalne pytania w dziedzinie rozwoju neurologicznego, takie jak zasady rządzące integracją dojrzewających interneuronów.
Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować pipetę do mikroiniekcji, wyciągając kapilarę szklaną za pomocą wyciągacza do pipet. Następnie ostrożnie wyjmij kapilarę i pobierz dolną igłę do mikroiniekcji. Teraz umieść znieczuloną mysz w ciąży na podkładce grzewczej stroną brzuszną do góry.
Załóż na pysk maskę, która będzie zapewniać stały dopływ izofluranu przez cały czas trwania operacji. Następnie zastosuj lubrykant do oczu w obu oczach. Ustaw podgrzewalną matę na 36 °C, aby zapobiec późniejszej hipotermii.
Sprawdź brak odruchów stopy i ogona, ściskając tylne łapy lub ogon. Następnie oczyść skórę na brzuchu 70% etanolem. Za pomocą pęsety odciągnij skórę do góry.
Następnie wykonaj niewielkie, dwucentymetrowe nacięcie pionowe wzdłuż linii środkowej, zaczynając w połowie drogi między trzecią a czwartą parą gruczołów mlekowych. Używając pęsety okrągłej, zachowaj ostrożność, aby nie uszkodzić ściany brzusznej. Delikatnie odsuń łańcuch embrionalny od jamy ciała.
Pozostaw łańcuch na wilgotnych chusteczkach. Rozpocznij od odsłonięcia jednej połowy macicy. Następnie przeprowadź elektroporację embrionów, zanim przejdziesz do drugiej połowy.
W tej procedurze należy przygotować roztwór DNA poprzez rozpuszczenie osadu otrzymanego z standardowego protokołu oczyszczania maxi prep w wodzie destylowanej. Następnie do roztworu DNA należy dodać fast green w stosunku 1:20, aby umożliwić wizualizację podczas wstrzykiwania. Następnie, za pomocą precyzyjnych pęset, należy odciąć końcówkę wcześniej przygotowanej mikropipety, tak aby od początku barku do końca końcówki pozostało sześć milimetrów.
Następnie nabierz do mikropipety 1 µL roztworu DNA z fast green do iniekcji. Przytrzymaj głowę embrionu za pomocą pęsety okrągłej. Wprowadź pipetę do mózgu pod kątem 45 stopni, celując w komorę boczną znajdującą się w pobliżu linii środkowej.
Jeśli igła przebije komorę, należy powoli wycofać pipetę. Komora powinna zmienić kolor na zielony w momencie, gdy roztwór zacznie ją wypełniać. W tym punkcie należy przestać poruszać pipetą i wstrzyknąć 1 µL DNA.
Następnie ostrożnie wyjmij pipetę. Ustaw elektroporator ECM na 5 impulsów o napięciu 45 V i czasie trwania 50 ms, z odstępem międzyimpulsowym wynoszącym 950 ms. Zanurz pięciomilimetrowe elektrody płytkowe w PBS, aby zapewnić efektywny przepływ prądu.
Następnie umieść elektrody wokół głowy zarodka, tak aby elektroda dodatnia znajdowała się na komorze zawierającej roztwór DNA. Umieść elektrodę dodatnią nieco niżej niż ujemną, aby wytworzyć prąd brzuszny przechodzący przez eminencje zwojowe. Pozwoli to zminimalizować ekspresję ektopową w komórkach parametalnych.
Następnie podaj impuls, naciskając raz pedał nożny, po czym wyjmij elektrody i przetrzyj je do czystości. Powtórz te kroki dla każdego z embrionów. Po przeprowadzeniu elektroporacji wszystkich embrionów.
Wlej trzy mililitry PBS do jamy brzusznej i umieść w niej ponownie embriony. Następnie zaszyj ścianę brzuszną za pomocą zakrzywionej igły i nici jedwabnej 5-0, a potem skórę. Na ranę nałóż lidokainę i w celu przeciwbólowego działania podaj początkowo 120 mg/kg aspiryny.
Odłącz zwierzę od przewodów anestezji i pozwól mu dojść do siebie na podkładce grzewczej wyłożonej ręcznikiem papierowym. Następnie przenieś zwierzę do klatki. Utrzymuj je na podkładce grzewczej w temperaturze 37 °C i monitoruj stan zdrowia.
W tym eksperymencie elektroporowane interneurony są wyznaczane poprzez ekspresję markerów podtypów pochodzących z CGE. Obraz ten pokazuje, że interneurony pochodzące z CGE zostały elektroporowane plazmidem DLX five six EGFP. Obraz ten przedstawia interneuron wykazujący ekspresję VIP w dniu P eight.
Ekspresja EGFP obrysowuje całe drzewo dendrytyczne i arboryzację aksonalną pojedynczych neuronów; tutaj przedstawiono neuron pośredniczący wykazujący ekspresję NPY w dniu P8. Ekspresja NPY wyznacza komórki glejowe o formie neuroglejowej. Na koniec, tutaj znajduje się neuron pośredniczący wykazujący ekspresję NPY w dniu P15.
Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje 20 minut. Dzięki połączeniu zastosowania specyficznego plazmidu i genetycznie zmodyfikowanych linii myszy możliwe jest uzyskanie czasowej i przestrzennej kontroli ekspresji interesujących genów. W niektórych eksperymentach stosujemy plazmid A-D-L-X-T-T-A w celu indukcji ekspresji transgenów zależnych od AU.
W niniejszych eksperymentach wyciszamy ekspresję transgenu poprzez podanie doksycykliny.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza procedura przedstawia sposób celowania w interneurony w rozwijającym się przedmózgowiu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Technika ta umożliwia selektywną ekspresję genów w podtypach interneuronów przeznaczonych do warstw powierzchownych kory.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwojowa
- Ekspresja genów
Wprowadzenie
- Interneurony odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu kory mózgowej.
- Celowanie w konkretne podtypy interneuronów może pomóc w lepszym zrozumieniu ich funkcji.
- Elektroporacja in utero jest potężną techniką manipulacji genetycznej.
- Metoda ta pozwala na precyzyjną kontrolę ekspresji genów w rozwijającym się mózgu.
Cel badania
- Zaprezentowanie metody celowania w interneurony w przednim mózgu myszy.
- Osiągnięcie selektywnej ekspresji genów w konkretnych podtypach interneuronów.
- Przedstawienie protokołu, który może zostać powtórzony w innych badaniach.
Zastosowane metody
- Przygotowanie igieł do iniekcji.
- Usunięcie łańcucha embrionalnego z znieczulonego zwierzęcia.
- Iniekcja DNA do mózgu.
- Elektroporacja w celu ułatwienia ekspresji genów.
Główne wyniki
- Skuteczne celowanie w podtypy interneuronów w rozwijającym się przedmózgowiu.
- Efektywna ekspresja genów uzyskana dzięki opisanemu protokołowi.
- Wykazany potencjał do dalszych badań nad interneuronami korowymi.
- Dostarczenie niezawodnej metody dla przyszłych badań w dziedzinie neurobiologii rozwoju.
Wnioski
- Elektroporacja in utero jest skuteczną metodą celowania w interneurony.
- Technikę tę można wykorzystać do badania funkcji genów w specyficznych populacjach neuronalnych.
- Protokół ten może być dostosowany do różnych projektów badawczych w dziedzinie neuronauki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Selektywne celowanie w podtypy interneuronów korowych umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka podczas walidacji celów neurorozwojowych. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania poprzez powiązanie manipulacji genetycznych z określonymi populacjami neuronalnymi. Odnosi się ono do kluczowego punktu zwrotnego w selekcji portfela projektów, w którym specyficzność biologiczna redukuje ryzyko niepowodzeń na późnych etapach badań.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych w określonych podtypach interneuronów GABAergicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia redukcję ryzyka biologicznego poprzez funkcjonalną walidację specyficzną dla danego podtypu.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność prognostyczną i ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez izolację mechanizmów przyczynowych w systemach istotnych dla danej choroby.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszego przesiewania związków z rozdzielczością na poziomie podtypów.
- Wartość operacyjna: Poprawa standaryzacji i powtarzalności analiz dzięki ekspresji reportera indukowanej elektroporacją.
- Wartość strategiczna: Umożliwienie wiarygodnej oceny związków w kontekstach neuronalnych istotnych dla przebiegu chorób.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje istotność w kontekście choroby poprzez dopasowanie podtypów interneuronów korowych do patofizjologii człowieka.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki zastosowaniu spójnej strategii celowania.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez powiązanie oddziaływania na cel z wynikami fenotypowymi w określonych obwodach.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w ciąg procesów odkrywania leków – od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną, umożliwiając iteracyjne udoskonalanie modeli mechanistycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków w podtypach interneuronów korowych.
- Screening: Zapewnia gotowość do przeprowadzania analiz oraz ilościowe wyniki poprzez ekspresję fluorescencyjnego raportora w komórkach poddanych elektroporacji.
- Analityka: Dostarcza mierzalne odczyty (np. intensywność GFP, lokalizacja subkomórkowa) w celu porównania warunków genetycznych lub farmakologicznych.
- Badania translacyjne: Łączy z ciągłością przedkliniczną dzięki konserwowanym markerom interneuronów pomiędzy gatunkami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do czasowej i przestrzennej kontroli genów w wielu celach i modelach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach rozwoju neurologicznego.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dostarczania genów specyficznych dla danego podtypu.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane biologiczne ryzyko na późnych etapach programów badawczych nad OUN.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o rozwoju skorygowane o ryzyko, w oparciu o zaangażowanie celu specyficznego dla podtypu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie chirurgii embrionalnej, mikrochirurgii oraz technik elektroporacji in utero.
- Zależy od specjalistycznego instrumentarium, w tym od wyciągaczy do pipet, elektroporatorów i systemów obrazowania fluorescencyjnego.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie chirurgii zwierząt, biologii molekularnej i grup obrazowania.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania procedur do różnych szczepów myszy, harmonogramów dni gestation oraz konstruktów plazmidowych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują żywotność embrionów po zabiegu oraz zmienność efektywności elektroporacji pomiędzy miotami.
