Name: Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji in utero do selektywnego targetowania podtypów interneuronów w rozwijającym się mózgu myszy. Technika ta umożliwia precyzyjną ekspresję genów w określonych populacjach neuronów korowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Lihong Yin za pomoc techniczną. NVD jest laureatem nagrody NARSAD Young Investigator Award, a także jest wspierany przez granty z NIH (5 K99 MH095825-02). Badania w laboratorium Fishell są wspierane przez Narodowy Instytut Zdrowia, Narodowy Instytut Zdrowia Psychicznego (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Narodowy Instytut Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972-01A1) oraz Fundację Simonsa.

Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z przepisami i wytycznymi Instytucjonalnej Komisji ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Szkoły Medycznej NYU.
Szczepy myszy 
Do eksperymentów wykorzystano samice myszy Swiss Webster dostarczone przez TACONIC. W celu specyficznego celowania w interneurony warstwy powierzchownej wykorzystano zarodki e15.5.
Uwaga: Plazmid użyty w tej pracy (plazmid Dlx5/6.eGFP 3 μg/μl) został wygenerowany przy użyciu standardowych technik klonowania. CDNA eGFP sklonowano do plazmidu Dlx5/6-Pmin-polyA. Ten plazmid jest dostępny na życzenie (demarn02@nyumc.org).
1. Przygotowanie pipet do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Ustaw ściągacz Heat #2 na 860.</li>
	<li>Umieść i zabezpiecz szklaną kapilarnę w pobliżu żarnika. Sprawdź, czy średnica zewnętrzna (OD) pipety wynosi około 30 μm.</li>
	<li>Naciśnij przycisk "pull".</li>
	<li>Ostrożnie usuń kapilarę. Dolna część to igła. Wyrzuć górną część.</li>
</ol>
2. Procedura anestezjologiczna
<ol>
	<li>Przygotować komorę zawierającą izofluran. Uwaga: Izofluran jest preferowanym środkiem znieczulającym ze względu na szybkie działanie i niską częstość występowania działań niepożądanych. Pentobarbital to inna opcja; Jednak tolerancja tego leku jest zmienna i może prowadzić do większej śmiertelności niż izofluranu.</li>
	<li>Ustawić przepływ izofluranu na 4-5% w 0,5-1 l/min O2.</li>
	<li>Upewnij się, że zawór komory jest otwarty, podczas gdy zawór adaptera głowicy jest zamknięty.</li>
	<li>Umieść ciężarną mysz w komorze.</li>
	<li>Pozwól myszy przejść pod wpływem znieczulenia. Zajmie to około 2-3 minut. Sprawdź częstość oddechów. Jeśli mysz zacznie hiperwentylować, zmniejsz dawkę izofluranu.</li>
	<li>Po znieczuleniu myszy należy ją niezwłocznie wyjąć z komory. Umieść go brzuszną stroną do góry na poduszce grzewczej i włóż głowę do maski, która będzie nadal dostarczać izofluran przez cały czas trwania operacji. Upewnij się, że przepływ izofluranu został przełączony z komory do rurki łączącej adapter głowicy. Wlej kroplę lubrykantu do oczu do każdego oka i zamknij oczy.</li>
	<li>Ustaw poduszkę grzewczą na 36 °C stopni, aby zminimalizować hipotermię.</li>
	<li>Sprawdź, czy nie ma odruchów łapy i ogona, ściskając tylne łapy i ogon.</li>
</ol>
3. Chirurgia
<ol>
	<li>Oczyść skórę pokrywającą brzuch 70% etanolem.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby pociągnąć skórę do góry. Po każdym zabiegu umyj wszystkie narzędzia detergentem i wodą i wysterylizuj w temperaturze 72 °C O/N.</li>
	<li>Wykonaj małe pionowe nacięcie (około 2 cm) wzdłuż linii środkowej, zaczynając w połowie drogi między trzecią a czwartą parą gruczołów sutkowych. Używaj cienkich nożyczek chirurgicznych. Uważaj, aby nie uszkodzić ściany brzucha.</li>
	<li>Delikatnie oddziel skórę od otrzewnej.</li>
	<li>Wizualizuj tętnice i żyły na ścianie brzucha. Wykonaj kolejne 2 cm pionowe nacięcie przez otrzewną (omijając naczynia), aby odsłonić jamę brzuszną.</li>
	<li>Zaciśnij skórę i ścianę brzucha z każdej strony, unikając zaciskania tętnic. Uwaga: W przypadku przypadkowego przebicia tętnic należy natychmiast złożyć zwierzę w ofierze, wykonując zwichnięcie szyjki macicy lub przedawkowanie izofluranu.</li>
	<li>Wstępnie podgrzej sterylny PBS do 37 °C. Przykryj zaciski wilgotnymi chusteczkami PBS Kim.</li>
	<li>Nawilż odsłoniętą jamę brzuszną za pomocą PBS. Powtórz ten krok kilka razy podczas wykonywania zabiegu.</li>
	<li>Za pomocą okrągłych kleszczy delikatnie odciągnij łańcuch embrionalny (e15.5) od jamy ustnej. Pozwól łańcuchowi spocząć na mokrych chusteczkach. Zacznij od odsłonięcia najpierw jednej połowy macicy. Gdy zarodki w nim zostaną poddane elektroporacji, przynieś je z powrotem do środka, a następnie pracuj nad drugą połową.</li>
</ol>
4. Elektroporacja
<ol>
	<li>Kontynuuj używanie okrągłych kleszczy do manipulowania zarodkami.</li>
	<li>Wizualizuj komory boczne. Komory boczne biegną wzdłuż linii środkowej (ryc. 1b).</li>
	<li>Dodaj Fast Green (Stock: 10% w/v) do roztworu DNA, aby uzyskać mieszaninę w stosunku 1:20, aby uwidocznić ją podczas wstrzyknięcia. Przygotuj roztwór DNA, rozpuszczając osad otrzymany ze standardowego protokołu oczyszczania maxi-prep w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Za pomocą wstępnie wyciągniętych mikropipet z tłokiem wstrzyknąć 1 ml roztworu DNA (Dlx5/6-eGFP, 3 μg/μl) z Fast Green. Przed załadowaniem pipety należy odciąć końcówkę mikropipety cienkim kleszkiem #5 (Dumont), aby pozostawić 6 mm długości od początku ramienia do końca końcówki igły. Przytrzymaj główkę zarodka okrągłą pęsetą. Wprowadź pipetę do mózgu pod kątem 45°, celując w komorę boczną znajdującą się w pobliżu linii środkowej. Jeśli igła przebije się przez komorę, powoli wsuwaj pipetę, używając tłoka do wstrzykiwania DNA. Komora powinna zmienić kolor na zielony, gdy roztwór zacznie ją wypełniać. W tym momencie przestań poruszać pipetą i wstrzyknij 1 ml DNA. Delikatnie wyjmij pipetę.</li>
	<li>Ustaw elektroporator CUY21 na pięć impulsów 45 V po 50 ms w odstępach 950 ms.</li>
	<li>Do zarodków e15.5 należy stosować elektrody łopatkowe o średnicy 5 mm. Zanurz elektrody w PBS, aby zapewnić wydajną transmisję prądu.</li>
	<li>Umieść łopatki elektrod wokół głowy zarodka, a łopatki dodatnie na komorze zawierającej roztwór DNA. Nieco obniż dodatnią łopatkę w stosunku do ujemnej, aby wytworzyć prąd brzuszny przez wypukłości zwojowe. Ta manipulacja zminimalizuje ekspresję ektopową w komórkach piramidowych.</li>
	<li>Po umieszczeniu elektrod dostarcz impuls, naciskając raz pedał nożny.</li>
	<li>Wyjmij elektrody i wytrzyj je do czysta. Powtórz kroki 4.6-4.9 dla każdego zarodka.</li>
	<li>Po elektroporowaniu wszystkich zarodków wlej 3 ml PBS do jamy brzusznej i wróć do jamy brzusznej.</li>
	<li>Najpierw zszyj ścianę brzucha zakrzywioną igłą i jedwabnym szwem 5-0, a następnie skórę. Nałóż lidokainę (4%) na ranę. Podawać 120 mg/kg aspiryny dotrzewnie w celu znieczulenia. 
	Uwaga: Cała procedura powinna być wykonana w ciągu 20 minut lub mniej. Zaleca się, aby początkujący elektropostacyjni tylko kilka zarodków, aby czas operacji był krótki. Długotrwałe operacje zmniejszą przeżywalność zarodków.</li>
	<li>Wyjmij zwierzę z rurki anestezjologicznej i pozwól dojść do siebie na poduszce grzewczej na papierowej chusteczce.</li>
	<li>Umieść zwierzę z powrotem w klatce, trzymaj je na poduszce grzewczej w temperaturze 37 °C i monitoruj stan zdrowia. Zwierzęta na ogół dobrze znoszą operację i zaczynają poruszać się powoli wkrótce po wyjęciu z rurki anestezjologicznej. W przypadku zaobserwowania nadmiernego krwawienia lub letargu, należy natychmiast złożyć zwierzę w ofierze, wykonując zatwierdzone przez IACUC procedury eutanazji, takie jak zwichnięcie szyjki macicy lub przedawkowanie znieczulenia.</li>
	<li>Wróć klatkę do wiwarium. Samice rodzą naturalnie.</li>
</ol>

<ol><li>Fishell, G., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+inhibition+within+the+telencephalon%3A+%26%2334%3Bwhere+the+wild+things+are%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of inhibition within the telencephalon: &#34;where the wild things are&#34;.</a> Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).</li>
<li>Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+distinct+progenitor+populations+in+the+lateral+ganglionic+eminence%3A+implications+for+striatal+and+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis.</a> J Neurosci. 23, 167-174 (2003).</li>
<li>Eisenstat, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DLX-1%2C+DLX-2%2C+and+DLX-5+expression+define+distinct+stages+of+basal+forebrain+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation.</a> J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).</li>
<li>Batista-Brito, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+integration+of+cortical+interneurons+into+a+functional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The developmental integration of cortical interneurons into a functional network.</a> Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).</li>
<li>Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologically+distinct+temporal+cohorts+of+cortical+interneurons+arise+from+telencephalic+Olig2-expressing+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors.</a> J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).</li>
<li>Miyoshi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate+mapping+reveals+that+the+caudal+ganglionic+eminence+produces+a+large+and+diverse+population+of+superficial+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons.</a> J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Dlx-2+%28Tes-1%29+gene+is+expressed+in+spatially+restricted+domains+of+the+forebrain%2C+face+and+limbs+in+midgestation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos.</a> Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+Dlx-1%2C+Dlx-2+%28Tes-1%29%2C+Gbx-2%2C+and+Wnt-3+in+the+embryonic+day+12.5+mouse+forebrain+defines+potential+transverse+and+longitudinal+segmental+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries.</a> J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).</li>
<li>Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+a+member+of+a+new+family+of+murine+Distal-less+homeobox+genes+in+the+developing+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+biologist%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain.</a> The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).</li>
<li>Close, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb1+is+an+activity-modulated+transcription+factor+required+for+the+terminal+differentiation+and+connectivity+of+medial+ganglionic+eminence-derived+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons.</a> J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472, 351-355 (2011).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239(2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ograniczenia techniki
Chociaż technika ta pozwala na autonomiczną analizę procesów komórkowych, nie nadaje się do analizy populacyjnej. Elektroporacje są bardzo rzadkie, a na mózg przypada mniej niż tysiąc komórek wyładowanych elektropoturą. W związku z tym technika ta nie może być stosowana do oceny konsekwencji behawioralnych wynikających z manipulacji genetycznej interneuronów pochodzących z CGE.
Podczas gdy elektroporacje przeprowadzane w e13.5-e14.5 są ukierunk...

Większość korowych interneuronów GABA-ergicznych pochodzi z dwóch przejściowych struktur embrionalnych zwanych wypukłościami przyśrodkowymi i ogonowymi (odpowiednio MGE i CGE)4. Interneurony eksprymujące parwalbuminę i somatostatynę pochodzą z MGE, podczas gdy interneurony eksprymujące kalretyninę (Cr), peptyd naczyniowo-jelitowy (VIP) i reelinę (Re) pochodzą z CGE. Te podtypy interneuronów można rozróżnić na podstawie ich dat urodzenia. Podtypy pochodzące od MGE są urodzone między 9,5 dniem embrionalnym (e9,5) a e16,55,6. W przeciwieństwie do tego, interneurony pochodzące z CGE rodzą się od e12.5 do e18.5, a ich produkcja osiąga szczyt przy e15.56. Genetyczne ukierunkowanie tej późno urodzonej populacji pozostaje jednak nieuchwytne.
Mysie geny bez dystalu (Dlx) ulegają ekspresji wyłącznie w rozwijającej się brzusznej części przodomózgowia3. Interneurony GABA-ergiczne i neurony projekcyjne prążkowia, ale nie korowe komórki piramidalne, wyrażają geny Dlx1,2,5 i 6 we wczesnych stadiach rozwojowych3. Rzeczywiście, geny Dlx ulegają ekspresji w strefie podkomorowej MGE i CGE (SVZ) we wszystkich progenitorach GABA-ergicznych. Ekspresja tych genów zostaje ograniczona do wybranych podtypów w stadiach postmitotycznych7-9. Wcześniejsze dowody eksperymentalne wykazały, że element wzmacniający Dlx5 / 6 pozwala na selektywne celowanie w linie GABA-ergiczne w transgenicznych modelach myszy2. Przetestowaliśmy użycie jednego z tych elementów wzmacniających w kontekście ekspresji episomalnej w rozwijającym się mózgu myszy. Sklonowaliśmy element wzmacniający Dlx5 / 6 wraz z minimalnym promotorem i wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji (eGFP) w plazmidzie szkieletowym bluescript (BS) (Figura 1). Wprowadziliśmy plazmid za pomocą elektroporacji in utero w e15.5, aby selektywnie celować w podtypy Cr, VIP i Re-3,8,10. Nasza technika pozwala na uzyskanie rzadkiej elektroporacji, co ułatwia odbudowę cech morfologicznych pojedynczych komórek. Ponadto wyjątkowo wysoki poziom ekspresji genów w korowych neuronach GABA-ergicznych pozwala na badania funkcjonalne. Przeprowadziliśmy badania nad utratą i zyskiem funkcji przy użyciu kilku genów typu dzikiego i dominującegoujemnego 11.

<table><tbody><tr><td>Elektroportator&nbsp; z pedałem</td><td>Protech International</td><td>CUY21</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody łopatkowe 5 mm&nbsp;</td><td>Protech International</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza&nbsp;</td><td>Ściągacz Kent Scientific</td><td>DCT-15</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Instruments P30&nbsp;</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>3282322</td><td></td></tr><tr><td>Systemy anestezjologiczne Fluovac</td><td>Aparat Harvard</td><td>726425</td><td></td></tr><tr><td>Delikatne nożyczki operacyjne 4,75" Proste Ostre/Ostre</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Jedwabny warkocz 18" C-1 Pudełko 36&nbsp;</td><td>Roboz</td><td>SUT-1073-21</td><td></td></tr><tr><td>Micro Clip Kleszcze do nakładania 5,5 "</td><td>Roboz</td><td>RS-5410</td><td></td></tr><tr><td>2 Nożyczki zaciskowe</td><td>Roboz</td><td>RC-4894</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze trzymające&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11031-15</td><td></td></tr><tr><td>Szklana rurka kapilarna&nbsp;</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td>Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne PBS</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr></tbody></table>

elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Badanie dojrzewania ośrodkowego układu nerwowego (OUN) opiera się na genetycznym ukierunkowaniu populacji neuronów. Jednak zadanie ograniczenia ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania do określonych podtypów neuronów okazało się niezwykle trudne ze względu na względny niedobór określonych elementów promotorowych. Interneurony GABA-ergiczne stanowią populację neuronów o dużej różnorodności genetycznej i morfologicznej. Rzeczywiście, w korze myszy 1 scharakteryzowano ponad 11 różnych podtypów interneuronów GABA-ergicznych1. W tym miejscu przedstawiamy dostosowany protokół selektywnego kierowania na populacje GABA-ergiczne. Osiągnęliśmy selektywne celowanie w podtyp interneuronów GABA-ergicznych, wykorzystując element wzmacniający czynników transkrypcyjnych homeoboksu Dlx5 i Dlx6, homologów genu Drosophila disstal-less (Dll)2,3, w celu napędzania ekspresji określonych genów poprzez elektroporację in utero.

Zaadaptowaliśmy technikę elektroporacji in utero, aby uzyskać specyficzne dla typu komórek celowanie w dojrzewające neurony. W celu indukowania ekspresji eGFP w interneuronach pochodzących z CGE wykorzystaliśmy element wzmacniacza Dlx5/6 i ograniczyliśmy iniekcje do etapu e15.5, kiedy generowana jest większość interneuronów pochodzących z CGE. Analizy przeprowadziliśmy w dniach P8 i P15 11(Rysunki 1 i 2). Potwierdziliśmy brzuszne pochodzenie elektroporowanych...

Ta procedura pokazuje, jak celować w interneurony w rozwijającym się przodomózgowiu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Technika ta okazała się szczególnie skuteczna w osiąganiu selektywnej ekspresji genów w podtypach interneuronów przeznaczonych do powierzchownych warstw kory mózgowej.

Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ukierunkowanie na neurony pośrednie w rozwijającym się mózgu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Jest to realizowane poprzez przygotowanie igieł do wstrzykiwania, a w kolejnym kroku poprzez usunięcie łańcucha zarodkowego od znieczulonego zwierzęcia.Następnie w mózgu wykonuje się iniekcję DNA oraz elektroporację. Ostatnim krokiem jest umożliwienie zwierzęciu rekonwalescencji po zabiegu. W rezultacie elektroporacja in utero jest wykorzystywana w celu selektywnego targetowania podtypów neuronów pośredniczących.Przewagą tych metod nad naszymi istniejącymi technikami, takimi jak nieswoista elektroporacja in utero, jest to, że umożliwiają one przeprowadzenie analizy autonomiczności komórkowej podzbioru neuronów interneuronów korowych. Wysoki poziom ekspresji GFP pozwala na wizualizację i analizę pojedynczych interneuronów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na fundamentalne pytania w dziedzinie rozwoju neurologicznego, takie jak zasady rządzące integracją dojrzewających interneuronów.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować pipetę do mikroiniekcji, wyciągając kapilarę szklaną za pomocą wyciągacza do pipet. Następnie ostrożnie wyjmij kapilarę i pobierz dolną igłę do mikroiniekcji. Teraz umieść znieczuloną mysz w ciąży na podkładce grzewczej stroną brzuszną do góry.Załóż na pysk maskę, która będzie zapewniać stały dopływ izofluranu przez cały czas trwania operacji. Następnie zastosuj lubrykant do oczu w obu oczach. Ustaw podgrzewalną matę na 36 °C, aby zapobiec późniejszej hipotermii.Sprawdź brak odruchów stopy i ogona, ściskając tylne łapy lub ogon. Następnie oczyść skórę na brzuchu 70% etanolem. Za pomocą pęsety odciągnij skórę do góry.Następnie wykonaj niewielkie, dwucentymetrowe nacięcie pionowe wzdłuż linii środkowej, zaczynając w połowie drogi między trzecią a czwartą parą gruczołów mlekowych. Używając pęsety okrągłej, zachowaj ostrożność, aby nie uszkodzić ściany brzusznej. Delikatnie odsuń łańcuch embrionalny od jamy ciała.Pozostaw łańcuch na wilgotnych chusteczkach. Rozpocznij od odsłonięcia jednej połowy macicy. Następnie przeprowadź elektroporację embrionów, zanim przejdziesz do drugiej połowy.W tej procedurze należy przygotować roztwór DNA poprzez rozpuszczenie osadu otrzymanego z standardowego protokołu oczyszczania maxi prep w wodzie destylowanej. Następnie do roztworu DNA należy dodać fast green w stosunku 1:20, aby umożliwić wizualizację podczas wstrzykiwania. Następnie, za pomocą precyzyjnych pęset, należy odciąć końcówkę wcześniej przygotowanej mikropipety, tak aby od początku barku do końca końcówki pozostało sześć milimetrów.Następnie nabierz do mikropipety 1 µL roztworu DNA z fast green do iniekcji. Przytrzymaj głowę embrionu za pomocą pęsety okrągłej. Wprowadź pipetę do mózgu pod kątem 45 stopni, celując w komorę boczną znajdującą się w pobliżu linii środkowej.Jeśli igła przebije komorę, należy powoli wycofać pipetę. Komora powinna zmienić kolor na zielony w momencie, gdy roztwór zacznie ją wypełniać. W tym punkcie należy przestać poruszać pipetą i wstrzyknąć 1 µL DNA.Następnie ostrożnie wyjmij pipetę. Ustaw elektroporator ECM na 5 impulsów o napięciu 45 V i czasie trwania 50 ms, z odstępem międzyimpulsowym wynoszącym 950 ms. Zanurz pięciomilimetrowe elektrody płytkowe w PBS, aby zapewnić efektywny przepływ prądu.Następnie umieść elektrody wokół głowy zarodka, tak aby elektroda dodatnia znajdowała się na komorze zawierającej roztwór DNA. Umieść elektrodę dodatnią nieco niżej niż ujemną, aby wytworzyć prąd brzuszny przechodzący przez eminencje zwojowe. Pozwoli to zminimalizować ekspresję ektopową w komórkach parametalnych.Następnie podaj impuls, naciskając raz pedał nożny, po czym wyjmij elektrody i przetrzyj je do czystości. Powtórz te kroki dla każdego z embrionów. Po przeprowadzeniu elektroporacji wszystkich embrionów.Wlej trzy mililitry PBS do jamy brzusznej i umieść w niej ponownie embriony. Następnie zaszyj ścianę brzuszną za pomocą zakrzywionej igły i nici jedwabnej 5-0, a potem skórę. Na ranę nałóż lidokainę i w celu przeciwbólowego działania podaj początkowo 120 mg/kg aspiryny.Odłącz zwierzę od przewodów anestezji i pozwól mu dojść do siebie na podkładce grzewczej wyłożonej ręcznikiem papierowym. Następnie przenieś zwierzę do klatki. Utrzymuj je na podkładce grzewczej w temperaturze 37 °C i monitoruj stan zdrowia.W tym eksperymencie elektroporowane interneurony są wyznaczane poprzez ekspresję markerów podtypów pochodzących z CGE. Obraz ten pokazuje, że interneurony pochodzące z CGE zostały elektroporowane plazmidem DLX five six EGFP. Obraz ten przedstawia interneuron wykazujący ekspresję VIP w dniu P eight.Ekspresja EGFP obrysowuje całe drzewo dendrytyczne i arboryzację aksonalną pojedynczych neuronów; tutaj przedstawiono neuron pośredniczący wykazujący ekspresję NPY w dniu P8. Ekspresja NPY wyznacza komórki glejowe o formie neuroglejowej. Na koniec, tutaj znajduje się neuron pośredniczący wykazujący ekspresję NPY w dniu P15.Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje 20 minut. Dzięki połączeniu zastosowania specyficznego plazmidu i genetycznie zmodyfikowanych linii myszy możliwe jest uzyskanie czasowej i przestrzennej kontroli ekspresji interesujących genów. W niektórych eksperymentach stosujemy plazmid A-D-L-X-T-T-A w celu indukcji ekspresji transgenów zależnych od AU.W niniejszych eksperymentach wyciszamy ekspresję transgenu poprzez podanie doksycykliny.

subtype-selective-electroporation-of-cortical-interneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Selektywna względem podtypów elektroporacja interneuronów kory

In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Ten film demonstruje protokół elektroporacji pojedynczych komórek genów zarówno w neuronach pobudzających, jak i hamujących w różnych kulturach in vitro w warstwach hipokampa. Technika ta jest przydatna do badania specyficznych funkcji molekularnych i fizjologicznych neuronów, w tym autonomicznych mechanizmów komórkowych i interakcji białek transsynaptycznych.

Elektroporacja pojedynczych komórek w organotypowych kulturach wycinków mózgu: technika in vitro dostarczania plazmidów do docelowych neuronów w wycinkach hipokampa mózgu

Źródło: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineerical Interneuron Pregenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę wstrzykiwania wektora plazmidowego przenoszącego interesujący nas gen do progenitorów interneuronów w embrionalnym wycinku mózgu, a następnie elektroporacji w celu wejścia plazmidu i ekspresji genu. Te zmodyfikowane komórki progenitorowe mogą być później wykorzystane do leczenia zaburzeń mózgu.

Transfer genów wspomagany elektroporacją osadzony w agarozie w progenitorach interneuronów kory myszy

Powierzchnia pial to unikalna strefa progenitorowa w OUN, której poświęca się coraz więcej uwagi.  W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy metodę szybkiej manipulacji genetycznej tej strefy progenitorowej przy użyciu zmodyfikowanej metody elektroporacji.  Procedura ta może być stosowana do badań komórkowych i molekularnych linii komórkowych i szlaków sygnałowych zaangażowanych w różnicowanie komórek oraz do wyjaśnienia losów i właściwości komórek potomnych.

Elektroporacja powierzchni pialu noworodków

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy protokół, zaprojektowany do wykorzystania narzędzi chemogenetycznych do manipulowania aktywnością komórek progenitorowych interneuronów korowych przeszczepionych do kory mózgowej myszy po urodzeniu.

Przeszczepienie chemogenetycznie zmodyfikowanych progenitorów interneuronów korowych do wczesnych postnatalnych mózgów myszy

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Prezentowany tutaj jest protokół elektroporacji pojedynczej komórki, który może dostarczyć geny zarówno w neuronach pobudzających, jak i hamujących w różnych epokach hodowli in vitro w warstwach hipokampa. Nasze podejście zapewnia precyzyjną i wydajną ekspresję genów w poszczególnych komórkach, które można wykorzystać do badania funkcji autonomicznych i międzykomórkowych.

Elektroporacja jednokomórkowa w różnych organotypowych kulturach warstwowych mysich neuronów pobudzających hipokampa i specyficznych dla klasy neuronów hamujących

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Tutaj prezentujemy ostrą manipulację genetyczną pokrojonych ludzkich organoidów korowych za pomocą elektroporacji. Te korowe modele organoidów są szczególnie podatne na wstrzykiwanie, ponieważ struktury podobne do komór można łatwo zidentyfikować po pokrojeniu, co umożliwia funkcjonalne badanie rozwoju kory mózgowej człowieka, zaburzeń neurorozwojowych i ewolucji kory mózgowej.

Elektroporacja pokrojonych w plasterki organoidów korowych człowieka do badań funkcji genów

Poznaj metodę elektroporacji in utero do selektywnego targetowania podtypów interneuronów w rozwijającym się mózgu myszy. Technika ta umożliwia precyzyjną ekspresję genów w określonych populacjach neuronów korowych.

Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych

Przeglądaj więcej filmów