Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych

Ta procedura pokazuje, jak celować w interneurony w rozwijającym się przodomózgowiu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Technika ta okazała się szczególnie skuteczna w osiąganiu selektywnej ekspresji genów w podtypach interneuronów przeznaczonych do powierzchownych warstw kory mózgowej.

Ogólnym celem tej procedury jest celowanie w neurony wewnętrzne w rozwijającym się mózgu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie igieł do wstrzykiwań. Drugim krokiem jest usunięcie łańcucha embrionalnego ze znieczulonego zwierzęcia.

Następnie w mózgu przeprowadza się iniekcję DNA i elektroporację. Ostatnim krokiem jest umożliwienie zwierzęciu powrotu do zdrowia po operacji. Ostatecznie, w macicy, elektroporacja jest stosowana, aby umożliwić selektywne celowanie w podtypy neuronów międzyneuronowych.

Zaletą tych metod naszych istniejących technik, podobnie jak niespecyficzna operacja elektro in utero, jest to, że zapewnia środki do przeprowadzenia autonomicznej analizy komórek podzbioru neuronów korowych między neuronami. Wysoki poziom ekspresji GFP pozwala na wizualizację i analizę pojedynczego interu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na fundamentalne pytania w dziedzinie neurorozwoju, takie jak zasady rządzące integracją dojrzewania.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować pipetę do mikroiniekcji, pociągając szklaną kapilarnę za pomocą ściągacza do pipet. Następnie ostrożnie usuń kapilę i zbierz dolną igłę do mikroiniekcji. Teraz umieść znieczuloną ciężarną mysz brzuszną stroną do góry na poduszce grzewczej.

Przykryj jego los maską, która będzie nadal dostarczać fluor przez cały czas trwania operacji. Następnie nałóż lubrykant do oczu na oba oczy. Ustaw poduszkę grzewczą na 36 stopni Celsjusza, aby zapobiec późniejszej hipotermii.

Sprawdź, czy nie ma odruchów łap i ogona, ściskając tylne łapy lub ogon. Następnie oczyść skórę na brzuchu 70% etanolem. Użyj kleszczy, aby pociągnąć skórę do góry.

Następnie wykonaj dwucentymetrowe małe pionowe nacięcie wzdłuż linii środkowej, zaczynając w połowie drogi między trzecią a czwartą parą gruczołów sutkowych. Uważaj, aby nie uszkodzić ściany brzucha za pomocą okrągłych kleszczy. Delikatnie odciągnij łańcuch embrionalny od jamy.

Pozwól łańcuchowi spocząć na mokrych chusteczkach. Zacznij od odsłonięcia jednej połowy macicy. Następnie przejdź do elektroporacji zarodków, zanim przejdziesz do drugiej połowy.

W tej procedurze należy przygotować roztwór DNA, rozpuszczając osad uzyskany ze standardowego protokołu oczyszczania maxi prep w wodzie destylowanej. Następnie dodaj szybko zieloną warstwę do roztworu DNA w stosunku od 1 do 20, aby umożliwić wizualizację podczas wstrzykiwania. Następnie odetnij końcówkę wstępnie wyciągniętej mikropipety za pomocą cienkich kleszczyków, aby pozostawić sześć milimetrów od początku ramienia do końca końcówki.

Następnie załaduj mikropipetę jednym mikrolitrem roztworu DNA z szybkim zielonym środkiem do wstrzykiwań. Przytrzymaj główkę zarodka okrągłą pęsetą. Włóż pipetę do mózgu pod kątem 45 stopni, celując w boczną komorę znajdującą się w pobliżu linii środkowej.

Jeśli igła przebije się przez komorę, powoli wycofaj pipetę. Komora powinna zmienić kolor na zielony, gdy roztwór zacznie ją wypełniać. W tym momencie przestań poruszać pipetą i wstrzyknij jeden mikrolitr DNA.

Następnie delikatnie wyjmij pipetę. Ustaw ECM osiem 30 ator na 5 impulsów 45 V po 50 milisekund w odstępach 950 milisekund między impulsami. Zanurz pięciomilimetrowe elektrody łopatkowe w PBS, aby zapewnić wydajną transmisję prądu.

Następnie umieść łopatki elektrod wokół głowy zarodka z dodatnią łopatką na komorze zawierającej roztwór DNA. Umieść dodatnią łopatkę nieco niżej niż ujemną, aby wytworzyć prąd brzuszny przez wypukłości zwojowe. Zminimalizuje to ekspresję ektopową w komórkach parametalicznych.

Teraz dostarcz impuls, naciskając raz pedał nożny, a następnie wyjmij elektrody i wytrzyj je do czysta. Powtórz kroki dla każdego z zarodków. Po elektro peracji wszystkich zarodków.

Wlej trzy mililitry PBS do jamy brzusznej i zwróć zarodki do jamy brzusznej. Następnie zszyj ścianę brzucha zakrzywioną igłą i pięcioma jedwabnymi szwami, a następnie skórę. Nałóż lidokainę na ranę i podawaj 120 miligramów na kilogram aspiryny początkowo w celu znieczulenia.

Wyjmij zwierzę z rurki anestezjologicznej i pozwól dojść do siebie na poduszce grzewczej na papierowej chusteczce. Następnie włóż zwierzę z powrotem do klatki. Trzymaj go na poduszce grzewczej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i monitoruj stan zdrowia.

W tym eksperymencie elektroporowane neurony inter neurony są wyznaczane przez ekspresję markerów podtypu pochodzącego z CGE E. Ten obraz pokazuje, że neurony pośrednie pochodzące z CGE są elektroporowane plazmidem DLX pięć sześć EGFP. Ten obraz pokazuje VIP wyrażający neuron inter w P osiem.

Wyrażenie EGFP wyznacza całe drzewo dendrytyczne i altanę aksonalną pojedynczych neuronów, a oto NPY wyrażający neuron międzyneuronowy w P osiem. Wyrażenie NP y wyznacza komórki neurogleju. Wreszcie, oto NPY wyrażający neuron inter neuron w P 15.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 20 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Łącząc użycie specyficznego plazmidu i genetycznie zmodyfikowanych linii myszy, możliwe jest osiągnięcie czasowej i specjalnej kontroli w ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania. W niektórych eksperymentach używamy plazmidu A-D-L-X-T-T-A do indukowania ekspresji transgenów zależnych od AU.

W tych eksperymentach po cichu stwierdzamy ekspresję transgenu poprzez podanie doksycykliny.